本发明公开了甲型流感病毒PB1蛋白T细胞表位多肽片段及其应用。本发明首先提供了氨基酸序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11的甲型流感病毒PB1蛋白T细胞表位多肽。本发明进一步提供了上述多肽在制备流感疫苗中的应用。本发明筛选并鉴定出甲型流感病毒PB1蛋白T细胞表位多肽片段,在接种该抗原表位时,以gp96蛋白作为免疫佐剂,极大激发病毒特异性T细胞免疫反应,能有效引起针对不同亚型的流感病毒株的交叉免疫保护,这为将来研发具有交叉保护功能的新型流感病毒疫苗奠定基础。