阅读说明：本技术 一种低致敏性蛋清粉的制备方法 (Preparation method of hypoallergenic egg white powder ) 是由 顾璐萍 陈杰 杨严俊 李俊华 苏宇杰 常翠华 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种低致敏性蛋清粉的制备方法,包括以下步骤：(1)分离蛋清；(2)蛋清预处理；(3)树脂吸附；(4)酶解；(5)浓缩；(6)发酵；(7)灭菌、干燥。本发明采用等电点沉淀、树脂吸附、定向酶解等技术有针对性地去除蛋清中的主要过敏原,进一步采取发酵、浓缩工艺,最后采用低温喷雾干燥或电离喷雾干燥等手段制备低致敏性蛋清粉。相对于现有技术,本发明技术针对性去除蛋清中过敏原,致敏性降低至5％,并使得卵白蛋白发生适度水解,基本保留了蛋清原有的功能特性,同时去除了蛋腥味,可作为食品原料或者配料应用到固体饮料、保健食品、功能食品等产品的开发,具有广阔的市场应用前景。(The invention discloses a preparation method of hypoallergenic egg white powder, which comprises the following steps: (1) separating egg white; (2) egg white pretreatment; (3) resin adsorption; (4) carrying out enzymolysis; (5) concentrating; (6) fermenting; (7) sterilizing and drying. The invention specifically removes main allergens in egg white by adopting the technologies of isoelectric precipitation, resin adsorption, directional enzymolysis and the like, further adopts the processes of fermentation and concentration, and finally adopts the means of low-temperature spray drying or ionization spray drying and the like to prepare the hypoallergenic egg white powder. Compared with the prior art, the technology disclosed by the invention can specifically remove the allergen in the egg white, reduce the allergenicity to 5%, enable the egg white to be moderately hydrolyzed, basically keep the original functional characteristics of the egg white, remove the fishy smell of the egg, be used as a food raw material or an ingredient to be applied to the development of products such as solid beverages, health-care foods and functional foods, and have wide market application prospects.)

一种低致敏性蛋清粉的制备方法

技术领域

本发明涉及一种低致敏性蛋清粉的制备方法，属于食品加工技术领域。

背景技术

鸡蛋营养价值丰富，其中富含多种人体必需氨基酸与矿物质，人体对鸡蛋蛋白质的吸收率可高达98％。此外，鸡蛋不仅物美价廉，成为日常生活中重要食物，还常作为一种食品配料添加于各类食品中，如烘焙产品、肉制品、豆制品等。尽管鸡蛋营养价值丰富，且具有优异的功能特性，如溶解性、乳化性、凝胶性等，但鸡蛋是世界公认的八大食物过敏原之一，过敏原主要存在于蛋清中，目前发现蛋清中过敏原主要是卵类黏蛋白(11％，Mw:28kDa)、卵白蛋白(54％，Mw:45kDa)、卵转铁蛋白(12％～13％，Mw:77.7kDa)和溶菌酶(3.4％～3.5％，Mw:14.3～14.6kDa)。据研究报道，以体外IgG结合能力为指标，这4种过敏原的致敏性由高到低依次为：溶菌酶＞卵转铁蛋白＞卵白蛋白＞卵类黏蛋白，可以看出，溶菌酶和卵转铁蛋白致敏性较高。目前，鸡蛋过敏尚无特效疗法，鸡蛋过敏患者唯有严格避免进食含鸡蛋的食物才可避免发生过敏反应。这对于鸡蛋过敏患者，不仅失去了日常生活中一种重要的营养来源，饮食上完全避免接触鸡蛋过敏原也成为了一种挑战。

降低蛋清致敏性的加工方法有物理法、化学法、生物法三种。物理法，如加热、辐照、高压、超声、微波等方法，操作简单有效，但仅破坏蛋白质的构象表位，不能完全消除蛋白质的致敏性；化学法，如糖基化法，会破坏某些致敏表位，降低蛋清的致敏性，但安全性无法保障；生物法，如酶解法，是一种温和安全的处理方式，可以破坏蛋白质的线性表位，进而破坏蛋白质的构象表位，是较为有效的降低鸡蛋致敏性的加工方法，但目前报道的酶解技术对底物选择性不强，要获得较高的过敏原去除率，需要对蛋清进行深度水解，则会很大程度破坏蛋白结构，尤其是主要成分卵白蛋白，导致食物质构和口感较差及蛋白质的功能性质显著下降甚至丧失，同时产生苦味。因此，亟需开发一种新工艺，可针对性地去除过敏原，同时保留蛋清原有的功能性质和营养价值。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种低致敏性蛋清粉的制备方法，通过采用蛋白酶和脂肪酶复合酶解蛋清，特异性协同去除蛋清液中的卵转铁蛋白，同时适当水解卵白蛋白，以达到降低蛋清粉中过敏原，同时保留原蛋清的营养价值与功能特性的目的。

本发明的第一个目的是提供一种去除蛋清中卵转铁蛋白的方法，所述方法是采用蛋白酶和脂肪酶复合酶解蛋清，特异性去除蛋清液中的卵转铁蛋白。

在本发明一种实施方式中，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶。

在本发明一种实施方式中，所述蛋白酶和脂肪酶复配比例为1:5～1:10，总酶量为1000～8000U/g蛋清。

在本发明一种实施方式中，酶解条件为pH为6～10，温度为30～60℃，酶解时间为0.5～4.5h。

本发明的第二个目的是提供一种上述方法在降低蛋清致敏性方面的应用。

本发明的第三个目的是提供一种制备低致敏性蛋清粉的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)蛋清分离：取新鲜鸡蛋数枚洗净，将其破壳，分开蛋清和蛋黄，弃去蛋黄，保留蛋清备用；

(2)原料预处理：将步骤(1)分离出的蛋清液采用磁力搅拌器缓慢搅拌至均匀；用食品酸度调节剂调节蛋清液pH，离心或者过滤去除沉淀卵类黏蛋白，收集上清液保存于0～4℃备用；

(3)树脂吸附：将步骤(2)预处理得到的蛋清液通过离子交换树脂层析柱，吸附去除蛋液中的溶菌酶；

(4)酶解：将步骤(3)所得剩余蛋清液调节pH后加入蛋白酶和脂肪酶进行酶解，特定条件下水解卵转铁蛋白，并适当水解卵白蛋白；

(5)浓缩：将步骤(4)所得蛋清酶解液经过超滤设备浓缩；

(6)发酵：将步骤(5)所得蛋清酶解浓缩液通入发酵罐发酵，除去蛋腥味，并脱除单糖、二糖，防止蛋清粉在后续干燥过程中发生褐变现象；

(7)灭菌、干燥：将步骤(6)所得发酵后蛋清液经巴氏灭菌后，再干燥制得低致敏性蛋清粉。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中食品酸度调节剂可选用醋酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸钾等，调节蛋清液pH至3.5～4.5，所述离心为采用转速为5000～8000g的蝶式离心机。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所使用的树脂为弱酸性阳离子交换树脂，树脂用量为蛋清液体积的30％～60％，搅拌吸附时间为4～9h，洗脱液为10～20％(NH₄)₂SO₄溶液，洗脱时间为0.5～2.5h，洗脱次数为1～5次。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中酶解选用的是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等中的一种与脂肪酶进行复配，pH为6～10，温度为35～55℃，酶解时间为0.5～4.5h，酶量为1000～8000U/g，复配比例为1:5～1:10。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中浓缩至固形物含量为20％～25％。

在本发明的一种实施方式中，步骤(6)中发酵菌种采用乳酸菌与酵母菌混合发酵，接种量在0.1～0.5％，发酵时间3～6h，发酵温度40～45℃。

在本发明的一种实施方式中，步骤(7)中巴氏灭菌条件为65～68℃，3min。干燥方式为低温喷雾干燥或者电离喷雾干燥等，进风温度为110～140℃，出风温度为55～65℃。

本发明的第四个目的是提供一种上述方法制备得到的蛋清粉。

本发明的第五个目的是提供一种上述蛋清粉在制备固体饮料、保健食品或功能食品中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用离子交换吸附法及定向水解法，并采用低温喷雾干燥或者电离喷雾干燥方式，有针对性地去除蛋清中的主要过敏原，卵类黏蛋白和溶菌酶完全被去除，卵转铁蛋白基本被去除，卵白蛋白发生适度水解，保留蛋清原有的功能性质和营养价值，蛋清致敏性最低降低至5％。产品可作为食品原料或者配料应用到固体饮料、保健食品、功能食品等产品的开发。

(2)本发明工艺中涉及发酵技术，有以下几种有利作用：1)去除蛋腥味；2)去除单糖、二糖，防止蛋清粉在后续干燥过程中发生褐变现象；3)进一步降低蛋清致敏性。

(3)本发明的副产品溶菌酶可作为天然防腐剂，也是婴儿功能食品的良好辅料。另外，还可应用于医药制药行业，如抗菌素生产行业。

附图说明

图1一种低致敏性蛋清粉的工艺流程图；

图2实施例1-3和对比例1-2制备得到的样品的凝胶电泳图，其中，条带1：对比例1；条带2：对比例2；条带3：实施例1；条带4：实施例2；条带5：实施例3。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

1.体外IgG结合能力的测定

将酶解蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/mL，取100μL至96孔酶标板A中，于4℃包被过夜；次日去除缓冲液，每孔加入300μL PBST洗液，洗涤3次，每次5min；然后向每孔加入250μL3％脱脂乳，于37℃孵育1h。另外准备一块酶标板B，加入250μL 3％脱脂乳进行封阻，37℃孵育1h；洗涤同上，加入60μL不同浓度的原蛋清蛋白(竞争抗原)和60μL稀释的兔血清(1:60000)，于37℃孵育1h；取出板A，洗涤同上，吸取100μL B板中的反应液至板A，于37℃孵育1h；洗涤板A，每孔加入100μL HRP标记羊抗兔IgG(1:5000)，37℃孵育1h；洗涤板A，每孔加入100μL TMB显色液，于37℃避光孵育15min；每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止显色反应，于450nm下测定OD值。计算公式如下：

IgG抑制率(％)＝(1-B/B₀)*100

B:有竞争蛋白对应的OD值；

B₀:无竞争蛋白对应的OD值。

2.生物材料

木瓜蛋白酶，酶活为2×10⁵U/g；中性蛋白酶，酶活为3×10⁵U/g；碱性蛋白酶，酶活为2×10⁵U/g，均来源于安琪酵母股份有限公司。

脂肪酶，酶活为9×10⁴U/g，来源于日本天野酶制剂公司。

实施例1：

(1)蛋清分离：取新鲜鸡蛋数枚洗净，将其破壳，分开蛋清和蛋黄，弃去蛋黄，保留蛋清备用。

(2)原料预处理：将步骤(1)分离出的蛋清液采用磁力搅拌器缓慢搅拌至均匀；采用柠檬酸调节蛋清液pH至4.1，离心(6000g)去除沉淀卵类黏蛋白，收集上清液保存于0～4℃备用。

(3)树脂吸附：将步骤(2)预处理得到的蛋清液通过离子交换树脂层析柱，吸附去除蛋液中的溶菌酶。树脂用量为蛋清液体积的40％，搅拌吸附时间为7h，洗脱液为浓度15％的(NH₄)₂SO₄溶液，洗脱时间为1h，洗脱次数为3次。

(4)酶解：将步骤(3)所得剩余蛋清液调节pH至7.5，加入木瓜蛋白酶和脂肪酶(1:5)，酶量为2000U/g，酶解温度为40℃，酶解时间为1h。

(5)浓缩：将步骤(4)所得蛋清酶解液经过超滤设备浓缩至固形物含量20％；

(6)发酵：将步骤(5)所得蛋清酶解浓缩液通入发酵罐发酵，发酵菌种采用乳酸菌与酵母菌混合发酵，接种量在0.2％，发酵时间4h，发酵温度43℃。

(7)灭菌、干燥：将步骤(6)所得发酵后蛋清液经65℃，3min巴氏灭菌后，再采用低温喷雾干燥(进风温度为120℃，出风温度为60℃)制得低致敏性蛋清粉。

实施例2

(1)蛋清分离：取新鲜鸡蛋数枚洗净，将其破壳，分开蛋清和蛋黄，弃去蛋黄，保留蛋清备用。

(2)原料预处理：将步骤(1)分离出的蛋清液采用磁力搅拌器缓慢搅拌至均匀；采用柠檬酸调节蛋清液pH至4.1，离心(6500g)去除沉淀卵类黏蛋白，收集上清液保存于0～4℃备用。

(3)树脂吸附：将步骤(2)预处理得到的蛋清液通过离子交换树脂层析柱，吸附去除蛋液中的溶菌酶。树脂用量为蛋清液体积的40％，搅拌吸附时间为7h，洗脱液为浓度18％的(NH₄)₂SO₄溶液，洗脱时间为1.5h，洗脱次数为3次。

(4)酶解：将步骤(3)所得剩余蛋清液调节pH至7.0，加入中性蛋白酶和脂肪酶(1:7)，酶量为5000U/g，酶解温度为45℃，酶解时间为2h。

(5)浓缩：将步骤(4)所得蛋清酶解液经过超滤设备浓缩至固形物含量23％；

(6)发酵：将步骤(5)所得蛋清酶解浓缩液通入发酵罐发酵，发酵菌种采用乳酸菌与酵母菌混合发酵，接种量在0.3％，发酵时间3.5h，发酵温度42℃。

(7)灭菌、干燥：将步骤(6)所得发酵后蛋清液经66℃，3min巴氏灭菌后，再采用低温喷雾干燥(进风温度为120℃，出风温度为60℃)制得低致敏性蛋清粉。

实施例3

(1)蛋清分离：取新鲜鸡蛋数枚洗净，将其破壳，分开蛋清和蛋黄，弃去蛋黄，保留蛋清备用。

(2)原料预处理：将步骤(1)分离出的蛋清液采用磁力搅拌器缓慢搅拌至均匀；采用柠檬酸调节蛋清液pH至4.1，离心(7000g)去除沉淀卵类黏蛋白，收集上清液保存于0～4℃备用。

(3)树脂吸附：将步骤(2)预处理得到的蛋清液通过离子交换树脂层析柱，吸附去除蛋液中的溶菌酶。树脂用量为蛋清液体积的40％，搅拌吸附时间为7h，洗脱液为浓度20％的(NH₄)₂SO₄溶液，洗脱时间为2h，洗脱次数为3次。

(4)酶解：将步骤(3)所得剩余蛋清液调节pH至8.0，加入碱性蛋白酶和脂肪酶(1:10)，酶量为8000U/g，酶解温度为45℃，酶解时间为4h。

(5)浓缩：将步骤(4)所得蛋清酶解液经过超滤设备浓缩至固形物含量20％；

(6)发酵：将步骤(5)所得蛋清酶解浓缩液通入发酵罐发酵，发酵菌种采用乳酸菌与酵母菌混合发酵，接种量在0.3％，发酵时间3.5h，发酵温度42℃。

(7)灭菌、干燥：将步骤(6)所得发酵后蛋清液经66℃，3min巴氏灭菌后，再采用低温喷雾干燥(进风温度为120℃，出风温度为60℃)制得低致敏性蛋清粉。

对比例1

省略实施例3中的步骤(3)～(5)，其他条件或者参数与实施例3一致。

对比例2

省略实施例3中的步骤(4)和(5)，其他条件或者参数与实施例3一致。

对比例3

省略实施例3中的步骤(4)中蛋白酶，其他条件或者参数与实施例3一致。

对比例4

省略实施例3中的步骤(4)中脂肪酶，其他条件或者参数与实施例3一致。

表1不同处理方式对蛋清致敏性和卵转铁蛋白去除率的影响

由表1可知，采用等电点沉淀法和离子交换树脂吸附法针对性地去除卵类黏蛋白和溶菌酶后，蛋清致敏性降低至39％，进一步采用酶解技术对剩余蛋清进行处理，随着酶量的增加，蛋清致敏性显著下降，当酶量为8000U/g时，蛋清致敏性降至5.43％。

实施例3和对比例3、4的对照结果显示：对比例3单独采用脂肪酶进行酶解，得到的卵转铁蛋白的去除率相对于对比例2提高了49.55％，致敏性降低了19.11％；对比例4单独采用蛋白酶进行酶解，得到的卵转铁蛋白的去除率相对于对比例2提高了21.19％，致敏性降低了12.53％；实施例3采用蛋白酶和脂肪酶进行复合酶解，得到的卵转铁蛋白的去除率相对于对比例2提高了93.33％，致敏性降低了34.26％，较单独脂肪酶和单独蛋白酶酶解的效果之和(卵转铁蛋白的去除率的总和为70.74％，致敏性总和为31.64％)更优越，说明脂肪酶和蛋白酶在水解卵转铁蛋白方面相互作用，具有一定的协同作用。

由图2可知，蛋清经过预处理后，卵类黏蛋白已完全去除，剩余蛋清的主要成分为卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶(条带1，对比例1)；经过树脂吸附，溶菌酶基本被清除，剩余蛋清液以卵白蛋白和卵转铁蛋白为主(条带2，对比例2)；进一步酶解，结果表明，随着酶量的增加，酶反应时间的延长，卵转铁蛋白被定向酶解程度越高(条带3～5，实施例1～3)，当酶量为8000U/g，酶解时间为4h时，卵转铁蛋白基本被去除，而卵白蛋白发生适度水解，基本保留了蛋清原有的功能特性。这说明脂肪酶可针对性水解卵转铁蛋白，蛋白酶无针对性，可同时水解卵转铁蛋白和卵白蛋白，两者复配使用，可使得卵转铁完全水解，卵白适度水解。同时，对产品进行感官评定，产品颜色为白色，未出现明显的褐色，且无显著的蛋腥味。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。