一种黄酮类化合物及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种黄酮类化合物及其制备方法和用途 (Flavonoid compound and preparation method and application thereof ) 是由 李青山 张朕 韩际宏 段亚君 龚克 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种黄酮类化合物及其制备方法和用途,其中黄酮类化合物包括黄酮类化合物FLM-1-24、黄酮衍生物FLM-25-40和异黄酮衍生物FLM-41-48。本发明黄酮类化合物可用于制备对人肝癌细胞系Huh7细胞的Nogo-B表达具有调节作用的调节剂,具体地说,本发明黄酮类化合物对人肝癌细胞系Huh7细胞的Nogo-B表达具有良好的抑制活性。(The invention discloses a flavonoid compound and a preparation method and application thereof, wherein the flavonoid compound comprises a flavonoid compound FLM _1-24, a flavone derivative FLM _25-40 and an isoflavone derivative FLM _ 41-48. The flavonoid compound can be used for preparing a regulator with a regulating effect on Nogo-B expression of human hepatoma cell line Huh7 cells, and particularly has good inhibitory activity on Nogo-B expression of human hepatoma cell line Huh7 cells.)
技术领域
本发明涉及一种黄酮类化合物及其制备方法和用途。本发明中涉及的黄酮类化合物对人肝癌细胞系Huh7细胞的Nogo-B表达具有良好的抑制活性。
背景技术
黄酮类化合物(flavonoids)是指两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物的总称，即具有C6-C3-C6结构的一类化合物的总称。其广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有的以游离形式存在。其结构类型可分为：黄酮类、异黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、双黄酮类等。
研究表明，黄酮类化合物、衍生物及其类似物具有多种生物功能。黄酮类化合物有提高动物机体抗氧化及清除自由基的能力，在防治心血管疾病，如防止动脉硬化、降低血脂和胆固醇、降低血糖、舒张血管和改善血管通透性及减少冠心病发病率等方面均具有良好的效果。同时，几乎所有类黄酮对很多微生物都具有程度不等的抑菌活性。黄酮类化合物还能够诱发癌细胞和肿瘤细胞的凋亡，发挥抗癌抗肿瘤作用，而对正常组织细胞的凋亡起延缓作用。黄酮类化合物可提高机体免疫机能，促进机体健康。
Nogo-B是网状蛋白Nogo超家族成员之一。Nogo家族除Nogo-B之外，还有Nogo-A、Nogo-C等成员。这些成员在体内组织中的分布上存在明显的特异性：Nogo-A在中枢神经系统中高表达，Nogo-C在骨骼肌中高表达，而Nogo-B则在大部分组织中均有表达，如肝脏，血管，心脏，肾脏，神经系统等组织中均能检测到Nogo-B的存在。功能上发现Nogo-B是一种内质网(endoplasmic reticulum，ER)驻留蛋白，调节ER的结构和功能。Nogo-B在肝脏中与多种病理过程相关，参与肝细胞增殖和肝再生、酒精性肝病、肝纤维化及其终末期肝硬化等。2020年，有研究发现Nogo-B表达的缺失能明显减缓胆汁淤积性肝病的症状；Nogo-B通过调控碳水化合物作用元件结合蛋白(ChREBP)和胰岛素通路参与肝脏糖脂代谢过程，减少Nogo-B表达可降低高葡萄糖或高果糖食物诱导的炎症、细胞凋亡、内质网应激现象的出现并激活能量代谢过程，从而有效拮抗由高葡萄糖或果糖食物诱发的代谢紊乱，因此Nogo-B可能是一个潜在的治疗糖脂代谢紊乱的重要靶点，能够作为药物设计和筛选的靶基因。
双荧光素酶报告基因报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛应用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。通常将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控Firefly luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，Firefly luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renillaluciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性。比如，培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率。通常实验报告基因偶联到调控的启动子，研究调控基因的结构和生理基础，因此经过不同药物处理后通过比较偶联启动子的报告基因的荧光值高低，能够从启动子水平判断药物对相关基因的转录激活作用，从而筛选对目的基因表达促进或抑制的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄酮类化合物及其制备方法和用途。本发明黄酮类化合物对人肝癌细胞系Huh7细胞的Nogo-B表达具有良好的抑制活性。
所述Huh7细胞是一种分化良好的肝细胞来源的细胞癌细胞系，常常用于体外研究肝细胞癌发病机制、肝脏代谢性疾病、药物代谢、体外肝毒性实验等。同时Huh7细胞能够高度表达正常肝实质细胞中不表达的Nogo-B，以便确认黄酮类化合物对肝细胞Nogo-B表达的抑制活性。
本发明黄酮类化合物包括5-羟基黄酮(FLM_1)、6-羟基黄酮(FLM_2)、7羟基黄酮(FLM_3)、3-甲氧基黄酮(FLM_4)、5-甲氧基黄酮(FLM_5)、6-甲氧基黄酮(FLM_6)、7-甲氧基黄酮(FLM_7)、3-甲基-8-羧基黄酮(FLM_8)、6-甲基黄酮(FLM_9)、6-氨基黄酮(FLM_10)、7-氨基黄酮(FLM_11)、3’,5,7-三羟基-4-甲氧基黄酮(FLM_12)、白藜芦醇(FLM_13)、黄酮醇(FLM_14)、7-羟基异黄酮(FLM_15)、7-异丙氧基异黄酮(FLM_16)、豆苷(FLM_17)、3’,7-二甲氧基异黄酮(FLM_18)、3’,6,7-三甲氧基异黄酮(FLM_19)、3’,7-二羟基异黄酮(FLM_20)、3’-甲氧基-7-羟基异黄酮(FLM_21)、3’-硝基-7-羟基异黄酮(FLM_22)、3’-甲氧基-5,7-二羟基异黄酮(FLM_23)、3’,5,7-三羟基异黄酮(FLM_24)、黄酮衍生物(FLM_25-40)、异黄酮衍生物(FLM_41-48)。其中化合物FLM_1-24均从MCE(MedChemExpress)官方或探索试剂公司购得，其结构确认准确无误。
本发明中的黄酮衍生物(FLM_25-40)，具有如下通式：
其中，R1选自5-OC2H5、5-OC4H9、5-OC2H4CH＝CH2、5-OCH2CH(CH3)2、5-OCH(CH3)2、5-OCOCH3、5-OCOC2H5、5-OCOC3H7、6-OC2H5、6-OC4H9、6-OC2H4CH＝CH2、6-OCH2CH(CH3)2、6-OCH(CH3)2、6-OCOCH3、6-OCOC2H5或6-OCOC3H7。
具体地，所述黄酮衍生物(FLM_25-40)的结构式优选如下：
本发明中的异黄酮衍生物(FLM_41-48)，具有如下通式：
其中，R2选自C2H5、C4H9、C2H4CH＝CH2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)2、COCH3、COC2H5或COC3H7。
具体地，所述异黄酮衍生物(FLM_41-48)的结构式优选如下：
本发明黄酮类衍生物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：向反应瓶中加入2,6-二羟基苯乙酮(20mmol)和无水碳酸钾(140mmol)，再加入丙酮(120mL)作为溶剂，加热到55℃回流反应并在搅拌下缓慢滴加苯甲酰氯(40mmol)，滴毕，回流反应12h；冷却，抽滤，滤饼用少量丙酮洗涤，收集所得滤液并将其真空浓缩，然后将浓缩后的固体加入到含有10％乙酸(300mL)的烧瓶中，充分搅拌，此时有大量CO2气体放出，并有黄色固体沉淀析出，继续搅拌2小时至沉淀完全；抽滤，滤饼用水洗涤，干燥后用丙酮进行重结晶，得到中间体A——3-羟基-2-(3-氧代-3-苯基丙酰基)苯甲酸苯酯，为黄色固体。步骤1中，苯甲酰氯滴加速度不能过快，要缓慢滴加，控制速度为2mL/min。
步骤1中，乙酸的百分含量不易过高，10％为最佳。
步骤2：向反应瓶中加入步骤1所得中间体A和浓硫酸(30mL)，在冰浴冷却下搅拌反应4小时；反应结束后，将反应液倒入大量的冰水中，置于低温环境中，析出白色固体，抽滤，收集滤饼；然后将滤饼加入到5％碳酸钾溶液(130mL)中，加热到120℃将其煮沸1小时；冷却，析出固体，抽滤，收集滤饼，将滤饼用二氯甲烷溶解，然后用适当的洗脱剂(乙酸乙酯：石油醚＝1：15，v/v)进行柱层析分离，分离得到的粗产物用乙醇进行重结晶，得到中间体B——5-羟基黄酮，为黄色固体。
步骤3：将中间体B(2mmol)置于反应瓶中，二氯甲烷(50mL)作为溶剂，加入碳酸钾(6mmol)，再加入取代烷烃C1-8(3mmol)，常温下反应，并用TLC检测反应进度，反应4-6小时后，反应完成，用洗脱剂(洗脱剂根据不同取代基的极性大小而定，乙酸乙酯：石油醚＝1:8-1:4，v/v)进行柱层析分离，分离后的粗产物用乙醇进行重结晶，得到目标化合物FLM_25-32。
所述取代烷烃C1-8的结构式为：
I-R或Br-R，
其中R选自OC2H5、OC4H9、OC2H4CH＝CH2、OCH2CH(CH3)2、OCH(CH3)2、OCOCH3、OCOC2H5或OCOC3H7。
步骤4：将6-羟基黄酮(D)(2mmol)置于反应瓶中，二氯甲烷(50mL)作为溶剂，加入碳酸钾(6mmol)，再加入取代烷烃C1-8(3mmol)，常温下反应，并用TLC检测反应进度，反应4-6小时后，反应完成，用洗脱剂(洗脱剂根据不同取代基的极性大小而定，乙酸乙酯：石油醚＝1:8-1:4，v/v)进行柱层析分离，分离后的粗产物用乙醇进行重结晶，得到目标化合物FLM_33-40。
所述取代烷烃C1-8的结构式为：
I-R或Br-R
其中R选自OC2H5、OC4H9、OC2H4CH＝CH2、OCH2CH(CH3)2、OCH(CH3)2、OCOCH3、OCOC2H5或OCOC3H7。
所述6-羟基黄酮(D)的结构式为：
步骤5：将7-羟基-3-(4-甲氧基苯基)-4氢-色烯-4-酮(E)(2mmol)置于反应瓶中，二氯甲烷(50mL)作为溶剂，加入碳酸钾(6mmol)，再加入取代烷烃C1-8(3mmol)，常温下反应，并用TLC检测反应进度，反应4-6小时后，反应完成，用洗脱剂(洗脱剂根据不同取代基的极性大小而定，乙酸乙酯：石油醚＝1:8-1:4，v/v)进行柱层析分离，分离后的粗产物用乙醇进行重结晶，得到目标化合物FLM_41-48。
所述取代烷烃C1-8的结构式为：
I-R或Br-R
其中R选自OC2H5、OC4H9、OC2H4CH＝CH2、OCH2CH(CH3)2、OCH(CH3)2、OCOCH3、OCOC2H5或OCOC3H7。
所述7-羟基-3-(4-甲氧基苯基)-4氢-色烯-4-酮(E)的结构式为：
步骤1中，2,6-二羟基苯乙酮与无水碳酸钾的物质的量之比为1:3。
步骤1中，2,6-二羟基苯乙酮与苯甲酰氯的物质的量之比为1:2。
步骤3中，中间体B和取代烷烃C1-8的物质的量比为1:1.5。
步骤4中，6-羟基黄酮(D)和取代烷烃C1-8的物质的量比为1:1.5。
步骤5中，7-羟基-3-(4-甲氧基苯基)-4氢-色烯-4-酮(E)和取代烷烃C1-8的物质的量比为1:1.5。
步骤3、4、5中，进行重结晶选用乙醇溶剂，也可以加入少量1-2mL乙酸乙酯助溶。
本发明黄酮类化合物的用途，是用于制备对人肝癌细胞系Huh7细胞的Nogo-B表达具有抑制活性的调节抑制剂。
本发明黄酮类化合物对Huh7细胞Nogo-B表达具有调节作用。具体的，本发明中黄酮类化合物对Huh7细胞Nogo-B的表达具有显著的抑制作用。
附图说明
图1是黄酮类化合物FLM_1-24对Huh7细胞Nogo-B转录活性的影响。
图2是黄酮类化合物FLM_25-48对Huh7细胞Nogo-B转录活性的影响。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1：5-乙氧基-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_25)的制备
1、取一个250mL圆底烧瓶，将2,6-二羟基苯乙酮(3.04g，20mmol)和无水碳酸钾(19.34g，140mmol)溶于120mL丙酮溶剂中，加热到55℃回流反应并在搅拌下缓慢滴加苯甲酰氯(5.62g，40mmol)，滴毕，使其回流反应12h。然后冷却，抽滤，滤饼用少量丙酮洗涤，收集所得滤液并将其真空浓缩。再将浓缩后的固体加入到含有10％乙酸(300mL)的烧瓶中，常温下充分搅拌，此时有大量CO2气体放出，并有黄色固体沉淀析出，继续搅拌2小时至沉淀完全。抽滤，滤饼用水洗涤，干燥后用丙酮进行重结晶，得到黄色固体中间体3-羟基-2-(3-氧代-3-苯基丙酰基)苯甲酸苯酯(A)。
2、取一个150mL圆底烧瓶，将中间体3-羟基-2-(3-氧代-3-苯基丙酰基)苯甲酸苯酯(A)溶于浓硫酸(30mL)中，在冰浴冷却下使其搅拌反应4小时。反应结束后，将反应液倒入大量的冰水中，置于低温环境中，静置，析出白色固体，抽滤，收集滤饼。然后将滤饼加入到5％碳酸钾溶液(130mL)中，加热到120℃将其煮沸1小时。冷却，析出固体，抽滤，收集滤饼，将滤饼用二氯甲烷溶解，然后用适当的洗脱剂(乙酸乙酯：石油醚＝1：15，v/v)进行柱层析分离，分离得到的粗产物用乙醇进行重结晶，得到黄色固体中间体5-羟基黄酮(B)。
3、取一个150mL圆底烧瓶，将中间体5-羟基黄酮(B)(0.48g，2mmol)溶于二氯甲烷(50mL)溶剂中，并加入碳酸钾(0.83g，6mmol)，再加入碘乙烷(0.47g，3mmol)，常温下反应，并用TLC检测反应进度，约4-6小时后，反应完成。用适当的洗脱剂(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)进行柱层析分离，分离后的粗产物用乙醇进行重结晶，得到目标化合物FLM_25。产物FLM_25为白色固体，产率为32.6％，熔点99-102℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.92–7.89(m,2H),7.58–7.49(m,4H),7.13(dd,J＝8.4,1.0Hz,1H),6.83(dd,J＝8.3,0.9Hz,1H),6.72(s,1H),4.22(q,J＝7.0Hz,2H),1.59(t,J＝7.0Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd for C17H14O3,[M+H]+,267.1021；found 267.1010.
实施例2：5-丁氧基-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_26)的制备
制备方法同实施例1。以碘丁烷代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为29.7％，熔点92-95℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.96–7.86(m,2H),7.64–7.47(m,4H),7.12(dd,J＝8.4,0.9Hz,1H),6.83(dd,J＝8.3,1.0Hz,1H),6.71(s,1H),4.14(t,J＝6.6Hz,2H),2.01–1.89(m,2H),1.63(m,J＝14.8,7.4Hz,2H),1.03(t,J＝7.4Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd forC19H18O3,[M+H]+,295.1334；found 295.1313.
实施例3：5-(丁-3-烯-1-基氧基)-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_27)的制备
制备方法同实施例1。以碘丁烯代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为34.2％，熔点94-97℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.92(dd,J＝6.8,2.9Hz,2H),7.64–7.44(m,4H),7.15(d,J＝8.4Hz,1H),6.83(d,J＝8.2Hz,1H),6.72(s,1H),6.06(m,J＝17.1,10.3,6.8Hz,1H),5.26(dd,J＝17.1,1.9Hz,1H),5.17(dd,J＝10.4,1.8Hz,1H),4.18(t,J＝6.9Hz,2H),2.74(q,J＝6.9Hz,2H).HR-MS(ESI):calcd for C19H16O3,[M+H]+,293.1178；found293.1154.
实施例4：5-异丁氧基-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_28)的制备
制备方法同实施例1。以1-碘-2-甲基丙烷代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为31.6％，熔点76-79℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.98–7.86(m,2H),7.60–7.47(m,4H),7.12(dd,J＝8.4,1.0Hz,1H),6.81(dd,J＝8.3,1.0Hz,1H),6.70(s,1H),3.89(d,J＝6.7Hz,2H),2.31(m,J＝13.4,6.7Hz,1H),1.15(d,J＝6.8Hz,6H).HR-MS(ESI):calcd for C19H18O3,[M+H]+,295.1334；found 295.1330.
实施例5：5-异丙氧基-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_29)的制备
制备方法同实施例1。以碘化异丙烷代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为33.6％，熔点85-87℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.00–7.81(m,2H),7.53(m,J＝7.2,4.9,2.2Hz,4H),7.13(d,J＝8.1Hz,1H),6.86(d,J＝8.2Hz,1H),6.69(d,J＝2.1Hz,1H),4.66(m,J＝6.0,2.1Hz,1H),1.48(dd,J＝6.0,2.1Hz,6H).HR-MS(ESI):calcd for C18H16O3,[M+H]+,281.1178；found 281.1118.
实施例6：4-氧代-2-苯基-4H-色烯-5-基乙酸酯(化合物FLM_30)的制备
制备方法同实施例1。以乙酰氯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为31.3％，熔点130-133℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.96–7.86(m,2H),7.69(t,J＝8.2Hz,1H),7.64–7.47(m,4H),7.06(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),6.71(s,1H),2.48(s,3H).HR-MS(ESI):calcdfor C17H12O4,[M+H]+,281.0814；found 281.0791.
实施例7：4-氧代-2-苯基-4H-色烯-5-基丙酸酯(化合物FLM_31)的制备
制备方法同实施例1。以丙酰氯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为29.3％，熔点124-126℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.97–7.85(m,2H),7.68(t,J＝8.2Hz,1H),7.61–7.45(m,4H),7.05(dd,J＝7.8,1.1Hz,1H),6.70(s,1H),2.82(q,J＝7.5Hz,2H),1.36(t,J＝7.5Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd for C18H14O4,[M+H]+,295.0970；found 295.0963.
实施例8：4-氧代-2-苯基-4H-色烯-5-基丁酸酯(化合物FLM_32)的制备
制备方法同实施例1。以丁酰氯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为33.6％，熔点117-120℃。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.91–7.87(m,2H),7.67(dd,J＝8.5,7.9Hz,1H),7.60–7.45(m,4H),7.04(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),6.69(s,1H),2.77(t,J＝7.5Hz,2H),1.89(m,J＝7.4Hz,2H),1.11(t,J＝7.4Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd for C19H16O4,[M+H]+,309.1127；found 309.1107.
实施例9：6-乙氧基-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_33)的制备
1、取一个150mL圆底烧瓶，将6-羟基黄酮(D)(0.48g，2mmol)溶于二氯甲烷(50mL)溶剂中，并加入碳酸钾(0.83g，6mmol)，再加入碘乙烷(0.47g，3mmol)，常温下反应，并用TLC检测反应进度，约4-6小时后，反应完成。用适当的洗脱剂(乙酸乙酯：石油醚＝1：6，v/v)进行柱层析分离，分离后的粗产物用乙醇进行重结晶，得到目标化合物FLM_33。产物FLM_33为白色固体，产率为30.5％，熔点126-129℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)7.95–7.89(m,2H),7.57(d,J＝3.1Hz,1H),7.55–7.47(m,4H),7.31–7.24(m,2H),6.81(s,1H),4.14(q,J＝7.0Hz,2H),1.45(t,J＝7.0Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd for C17H14O3,[M+H]+,267.1021；found 267.1013.
实施例10：6-丁氧基-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_34)的制备
制备方法同实施例9。以碘丁烷代替碘乙烷，得到白色固体，产率为29.6％，熔点84-87℃。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)7.93–7.88(m,2H),7.57(d,J＝3.1Hz,1H),7.55–7.46(m,4H),7.30–7.24(m,1H),6.80(s,1H),4.06(t,J＝6.5Hz,2H),1.84–1.75(m,2H),1.51(m,J＝7.4Hz,2H),0.98(t,J＝7.4Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd for C19H18O3,[M+H]+,295.1334；found 295.1321.
实施例11：6-(丁-3-烯-1-基氧基)-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_35)的制备
制备方法同实施例9。以碘丁烯代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为32.6％，熔点98-101℃。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.94(m,J＝6.7,2.8,2.2Hz,2H),7.61(d,J＝3.1Hz,1H),7.57–7.51(m,4H),7.32(dd,J＝9.1,3.1Hz,1H),6.84(s,1H),5.94(m,J＝17.0,10.2,6.7Hz,1H),5.27–5.11(m,2H),4.15(t,J＝6.7Hz,2H),2.61(m,J＝6.7,1.4Hz,2H).HR-MS(ESI):calcd for C19H16O3,[M+H]+,293.1178；found 293.1187.
实施例12：6-异丁氧基-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_36)的制备
制备方法同实施例9。以1-碘-2-甲基丙烷代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为35.2％，熔点92-96℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.96–7.92(m,2H),7.59(d,J＝3.1Hz,1H),7.56–7.51(m,4H),7.32(dd,J＝9.1,3.1Hz,1H),6.84(s,1H),3.85(d,J＝6.6Hz,2H),2.14(m,J＝13.3,6.7Hz,1H),1.07(d,J＝6.7Hz,6H).HR-MS(ESI):calcd for C19H18O3,[M+H]+,295.1334；found 295.1318.
实施例13：6-异丙氧基-2-苯基-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_37)的制备
制备方法同实施例9。以碘化异丙烷代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为33.7％，熔点91-94℃。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.96–7.92(m,2H),7.62(d,J＝3.2Hz,1H),7.58–7.50(m,4H),7.30–7.25(m,1H),6.83(s,1H),4.72(m,J＝6.1Hz,1H),1.40(d,J＝6.0Hz,6H).HR-MS(ESI):calcd for C18H16O3,[M+H]+,281.1178；found 281.1132.
实施例14：4-氧代-2-苯基-4H-色烯-6-基乙酸酯(化合物FLM_38)的制备
制备方法同实施例9。以乙酰氯代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为33.7％，熔点91-94℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)7.94–7.91(m,3H),7.60(d,J＝9.0Hz,1H),7.58–7.50(m,3H),7.45(dd,J＝9.0,2.8Hz,1H),6.82(s,1H),2.35(s,3H).HR-MS(ESI):calcdfor C17H12O4,[M+H]+,281.0814；found 281.0800.
实施例15：4-氧代-2-苯基-4H-色烯-6-基丙酸酯(化合物FLM_39)的制备
制备方法同实施例9。以丙酰氯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为32.6％，熔点109-110℃。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.30(s,1H),7.94(d,J＝8.7Hz,1H),7.54–7.44(m,2H),7.00–6.95(m,2H),6.91(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),6.82(d,J＝2.2Hz,1H),3.77(s,3H),2.48(m,J＝1.9Hz,2H).HR-MS(ESI):calcd for C18H14O4,[M+H]+,295.0970；found295.0959.
实施例16：4-氧代-2-苯基-4H-色烯-6-基丁酸酯(化合物FLM_40)的制备
制备方法同实施例9。以丁酰氯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为35.3％，熔点124-127℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.96–7.92(m,3H),7.62(d,J＝9.0Hz,1H),7.60–7.52(m,3H),7.46(dd,J＝9.0,2.8Hz,1H),6.84(s,1H),2.60(t,J＝7.4Hz,2H),1.83(m,J＝7.4Hz,2H),1.09(t,J＝7.4Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd for C19H16O4,[M+H]+,309.1127；found 309.1097.
实施例17：7-乙氧基-3-(4-甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_41)的制备
1、取一个150mL圆底烧瓶，将将7-羟基-3-(4-甲氧基苯基)-4氢-色烯-4-酮(E)(2mmol)(0.54g，2mmol)溶于二氯甲烷(50mL)溶剂中，并加入碳酸钾(0.83g，6mmol)，再加入碘乙烷(0.47g，3mmol)，常温下反应，并用TLC检测反应进度，约4-6小时后，反应完成。用适当的洗脱剂(乙酸乙酯：石油醚＝1：5，v/v)进行柱层析分离，分离后的粗产物用乙醇进行重结晶，得到目标化合物FLM_41。产物FLM_41为浅黄色固体，产率为29.5％，熔点122-125℃。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.19(d,J＝8.9Hz,1H),7.90(s,1H),7.52–7.47(m,2H),6.98–6.94(m,3H),6.82(d,J＝2.4Hz,1H),4.12(q,J＝7.0Hz,2H),3.83(s,3H),1.47(t,J＝7.0Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd for C18H16O4,[M+H]+,297.1127；found 297.1123.
实施例18：7-丁氧基-3-(4-甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_42)的制备
制备方法同实施例17。以碘丁烷代替碘乙烷，得到白色固体，产率为37.5％，熔点124-127℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)8.19(d,J＝8.9Hz,1H),7.91(s,1H),7.53–7.46(m,2H),7.00–6.94(m,3H),6.83(d,J＝2.4Hz,1H),4.06(t,J＝6.5Hz,2H),3.84(s,3H),1.82(m,J＝7.9,6.5Hz,2H),1.56–1.50(m,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).HR-MS(ESI):calcdfor C20H20O4,[M+H]+,325.1440；found 325.1395.
实施例19：7-(丁-3-烯-1-基氧基)-3-(4-甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_43)的制备
制备方法同实施例17。以碘丁烯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为32.9％，熔点128-130℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.23(d,J＝8.9Hz,1H),7.94(s,1H),7.60–7.45(m,2H),7.05–6.95(m,3H),6.87(d,J＝2.4Hz,1H),5.94(m,J＝17.0,10.2,6.7Hz,1H),5.26–5.15(m,2H),4.14(t,J＝6.7Hz,2H),3.87(s,3H),2.63(m,J＝6.7,1.4Hz,2H).HR-MS(ESI):calcd for C20H18O4,[M+H]+,323.1283；found 323.1274.
实施例20：7-异丁氧基-3-(4-甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_44)的制备
制备方法同实施例17。以1-碘-2-甲基丙烷代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为32.9％，熔点129-131℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.22(d,J＝8.9Hz,1H),7.93(s,1H),7.60–7.46(m,2H),7.09–6.92(m,3H),6.85(d,J＝2.4Hz,1H),3.86(s,3H),3.84(d,J＝6.5Hz,2H),2.16(m,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.09(d,J＝6.7Hz,6H).HR-MS(ESI):calcd forC20H20O4,[M+H]+,325.1440；found 325.1413.
实施例21：7-异丁氧基-3-(4-甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(化合物FLM_45)的制备
制备方法同实施例17。以1-碘-2-甲基丙烷代替碘乙烷，得到浅黄色固体，产率为32.9％，熔点129-131℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)8.20(d,J＝8.9Hz,1H),7.92(s,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.02–6.93(m,3H),6.83(s,1H),4.68(m,J＝5.9Hz,1H),3.85(s,3H),1.41(d,J＝6.0Hz,6H).HR-MS(ESI):calcd for C19H18O4,[M+H]+,311.1283；found311.1281.
实施例22：3-(4-甲氧基苯基)-4-氧-4H-色烯-7-基乙酸酯(化合物FLM_46)的制备
制备方法同实施例17。以乙酰氯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为36.5％，熔点155-158℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)8.33(dd,J＝8.7,1.0Hz,1H),7.99(d,J＝1.1Hz,1H),7.54–7.48(m,2H),7.31(dd,J＝2.3,1.0Hz,1H),7.17(m,J＝8.8,2.2,1.1Hz,1H),7.01–6.96(m,2H),3.85(d,J＝1.1Hz,3H),2.37(d,J＝1.1Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd forC18H15O5,[M+H]+,311.0919；found 311.0902.
实施例23：3-(4-甲氧基苯基)-4-氧-4H-色烯-7-基丙酸酯(化合物FLM_47)的制备
制备方法同实施例17。以丙酰氯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为33.5％，熔点111-113℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)8.33(d,J＝8.7Hz,1H),7.99(s,1H),7.51(d,J＝8.6Hz,2H),7.31(d,J＝2.1Hz,1H),7.17(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),7.01–6.96(m,2H),3.85(s,3H),2.66(m,J＝7.5Hz,2H),1.30(t,J＝7.5Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd for C19H16O5,[M+H]+,325.1076；found 325.1034.
实施例24：3-(4-甲氧基苯基)-4-氧-4H-色烯-7-基丁酸酯(化合物FLM_48)的制备
制备方法同实施例17。以丁酰氯代替碘乙烷，得到白色固体，产率为29.3％，熔点112-114℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)8.33(d,J＝8.7Hz,1H),7.98(s,1H),7.52–7.49(m,2H),7.30(d,J＝1.9Hz,1H),7.19–7.13(m,1H),7.02–6.96(m,2H),3.85(s,3H),2.61(t,J＝7.4Hz,2H),1.82(m,J＝7.3Hz,2H),1.08(t,J＝7.4Hz,3H).HR-MS(ESI):calcd forC20H18O5,[M+H]+,339.1232；found 339.1209.
实施例22：对Huh7细胞的培养
我们选取人肝癌细胞系Huh7细胞进行培养。将Huh7细胞在含10％的新生小牛血清及100U/mL青霉素、链霉素的DMEM高糖培养液中进行培养，培养箱培养条件设定为5％CO2，37℃，隔天换液，每日观察细胞的生长状况。待Huh7细胞生长至70～80％融合度时，弃去旧的细胞培养液，并用PBS洗涤细胞2次，加入0.25％的胰蛋白酶，于倒置显微镜下观察细胞形态变化，当细胞出现胞质回缩，胞体变圆，细胞间隙变大时，弃去消化液，立即加入含10％血清的细胞培养液终止消化，用吸管吸取培养液，反复轻柔吹打贴壁的细胞使之脱落并悬浮，调整细胞至合适密度后接种于新的培养皿中，置于5％CO2，37℃培养箱中培养。
实施例23：黄酮类化合物对Huh7细胞Nogo-B转录活性的检测
我们使用双荧光素酶报告基因系统测定了黄酮类和异黄酮类化合物对Huh7细胞Nogo-B转录活性的影响。将Huh7细胞接种于48孔板中，培养约10-24h，直至孔板中细胞的汇合度达到80％。按照说明书，将一定量的报告基因空白质粒或含Nogo-B启动子的报告基因质粒与内参质粒(pGL4.70)和转染试剂混合，并静置30min，使之形成转染复合物，将转染复合物均匀滴加至孔板上相应的细胞液表面。37℃培养箱中培养细胞。转染约6-8h后，弃掉含有转染复合物的培养基，换成新鲜的无血清培养基，使用10μM的黄酮类和异黄酮类化合物对细胞进行处理，处理时间约为24h。用荧光素酶报告基因检测试剂盒提供的细胞裂解液裂解细胞，裂解液上清用于荧光素酶活性检测。将细胞蛋白提取液进行一定量的稀释后加入96孔板中，然后将96孔板置入化学发光仪中，设置程序，开始测定荧光素酶的活性。计算相对荧光强度，并与空载对照进行比较，计算各个药物对Huh7细胞Nogo-B转录活性的影响。
首先对FLM_1-24共计24个黄酮类化合物进行筛选，根据双荧光素酶报告基因系统的结果(图1)，接下来再次通过双荧光素酶报告基因系统测定FLM_25-48对Huh7细胞Nogo-B转录活性的影响。如图2所示，化合物FLM_33和FLM_34对Huh7细胞Nogo-B转录活性也具有明显的抑制作用。从图1中可以看出，黄酮类化合物FLM_5、FLM_6、FLM_9、FLM_18对Huh7细胞Nogo-B转录活性均着不同程度的抑制效果。从图2中也可以看出，在10μM的作用浓度下，化合物FLM_33、FLM_34也对Nogo-B转录活性有着良好的抑制效果，因此这些化合物可以作为Nogo-B抑制剂用以开发相关肝脏疾病治疗的药物。
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