一种能够识别斜带石斑鱼两种IgM重链的单克隆抗体的制备方法
阅读说明：本技术 一种能够识别斜带石斑鱼两种IgM重链的单克隆抗体的制备方法 (Preparation method of monoclonal antibody capable of identifying two IgM heavy chains of Epinephelus coioides ) 是由 李言伟 但学明 赖学礼 莫泽权 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明旨在解决斜带石斑鱼两种IgM重链同时识别难的问题,提供了一种能够识别斜带石斑鱼两种IgM重链的单克隆抗体的制备方法,通过构建独特的IgM原核表达载体,表达纯化了IgM重组蛋白,制备的单抗能同时识别斜带石斑鱼血清中两条条带80kDa和50kDa,该单抗能够有效标记斜带石斑鱼头肾切片中的B细胞,为进一步研究斜带石斑鱼两种IgM重链的功能打下了基础。(The invention aims to solve the problem that two IgM heavy chains of Epinephelus coioides are difficult to simultaneously identify, and provides a preparation method of a monoclonal antibody capable of identifying the two IgM heavy chains of Epinephelus coioides.)
技术领域
本发明属于单抗的制备及应用领域，具体涉及一种能够识别斜带石斑鱼两种IgM重链的单克隆抗体的制备方法。
背景技术
斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)属鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)，是我国以及东南亚地区主要养殖名贵海水鱼类。近年来，由于养殖密度过大和养殖环境恶化等原因，导致疾病频频爆发，已经严重威胁到石斑鱼产业的发展。寄生虫病害中以刺激隐核虫病最为严重，每年造成的经济损失不计其数。免疫防治刺激隐核虫病被认为是有效的方法。然而，由于缺乏B细胞特异性marker的抗体，阻碍了刺激隐核虫感染引起的宿主特异性体液免疫应答机制的研究。
目前，关于制备石斑鱼免疫球蛋白抗体已有一些报道，如用从赤点石斑鱼(陈红燕等，2011)和美洲黑石斑鱼(郑磊等，2011)血清纯化的Ig免疫动物制备多抗或单抗，用从斜带石斑鱼血清中纯化的Ig或原核表达的IgM重链恒定区免疫动物制备多抗(Cheng et al.，2006；Yambot et al.，2006；Ou-yang et al.，2012；葛辉等，2017)。然而，以上方法制备的抗体存在两方面的技术风险：1.鱼类有IgM、IgT和IgT 3种抗体，而用目前方法纯化出的鱼类Ig可能包含3种，那么用纯化的Ig制备出来的多抗可能同时识别鱼类的3种抗体，而制备出来的单抗也有可能识别鱼类3种抗体中的一种，具体识别哪种靠概率；2.无论用纯化的1g还是表达的IgM片段制备的多抗，其特异性相较单抗低，存在识别其他蛋白的风险。
我们课题研究组前期利用原核表达的斜带石斑鱼IgM重链恒定区制备了多克隆抗体，用该抗体对斜带石斑鱼血清进行western blot分析，结果在约80kD和50kD处都有阳性信号，质谱分析发现这两个条带都是IgM，说明斜带石斑鱼中存在两种类型的IgM重链。然而，目前报道的抗体都未发现能标记斜带石斑鱼两种IgM重链。基于此，我们利用原核表达的IgM重链恒定区免疫小鼠，制备单抗。筛选得到1株杂交瘤细胞，其产生的单抗能同时识别80kD和50kD两种重链，该单抗可以帮助我们研究斜带行斑鱼这两种IgM重链的功能。
发明内容
本发明旨在解决斜带石斑鱼两种IgM重链同时识别难的问题，提供了一种能够识别斜带石斑鱼两种IgM重链的单克隆抗体的制备方法，通过构建独特的IgM原核表达载体，表达纯化了IgM重组蛋白，制备的单抗能同时识别斜带石斑鱼血清中两条条带80kDa和50kDa，该单抗能够有效标记斜带石斑鱼头肾切片中的B细胞，为进一步研究斜带石斑鱼两种IgM重链的功能打下了基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种能够识别斜带石斑鱼两种IgM重链的单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
一、IgM原核表达载体的构建
(1)、IgM重链恒定区片段扩增
根据斜带石斑鱼IgM重链恒定区序列，设计扩增引物IgM-HCF：CCACTCCAAATGCACCAACTGTG和IgM-HCR：GTGCTTACTTACATGCAAGACTATAAGTTT：以斜带石斑鱼脾脏cDNA为模板，进行PCR扩增，反应程序为：98℃，10s；55℃，15s；72℃，2min；35个循环，72℃延伸5min；PCR结束后，胶回收反应产物；
(2)、产物与载体连接
A、取4μL回收产物与1μL pEASY-Blunt Cloning Vector混合，于25℃下连接30min；
B、连接产物加入到100μL细菌感受态细胞中，冰浴30min；
C、42℃热激30s后，立即冰浴2min；
D、加入900μL培养液，于37℃下180rpm振荡培养1h；
E、4000g离心5min，吸出800μL培养液，重悬离心管底部的细菌；
F、把剩余菌液涂布于卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养12h；
G、挑取单菌落于10μL无菌水中混匀，取1μL为模板，进行PCR反应鉴定阳性菌落，并测序；
(3)、表达载体构建
以测序正确的阳性菌落为模板，以32a-IgMF：caccaccaccaccacggtaccGAGGGCACCGAGACTACCTT和32a-IgMR：ttgtcgacggagctcgaattcTTAATGTTCAACAATGCAGATGAACT为引物扩增表达片段，并进行胶回收；同时，从大肠杆菌中提取去除TRX编码基因的pET32a质粒，并对质粒进行酶切，于37℃反应30min，反应体系为：质粒2μl、10×QuickCutBuffer 10μl、EcoRI 2μl、Kpn I 2μl、H2O 84μl；酶切产物跑凝胶电泳，进行胶回收；然后使用重组酶对胶回收的扩增产物和酶切产物于37℃进行重组连接30min，反应体系如下：酶切产物3μl、扩增产物2μl、5×CE II Buffer 4μl、Exnase II 2μl、H2O 9μl；反应完成后置于冰上冷却，转化细菌感受态细胞，挑选阳性克隆菌进行测序，从测序正确的阳性克隆菌中提取质粒，并转化进大肠杆菌BL21中。
二、IgM重组蛋白的表达与纯化
(1)、挑取pET32a-IgM阳性的大肠杆菌BL21于含有氨苄的LB培养液中，37℃、180rpm震荡培养；
(2)、当OD600＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG继续培养2h；
(3)、把菌液放入4℃之中静置12h，待菌液沉淀至瓶底后吸出上层液体，收集底部沉淀菌液并加入50mL Lyse buffer重悬，于冰上超声破碎；上述Lyse buffer含50mMNaH2PO4、300mM NaCl、10mM Imidazole；
(4)、超声破碎产物经8000g离心10min后弃去上清，收集沉淀；
(5)、先使用2M的尿素溶液洗涤沉淀，离心后分别收集上清液和沉淀；收集的沉淀再使用4M的尿素溶液洗涤，离心后分别收集上清液和沉淀；然后收集的沉淀再使用6M的尿素溶液洗涤，离心后分别收集上清液和沉淀；最后，收集的沉淀再使用8M的尿素溶液洗涤，离心后收集上清液；
(6)、把上述2M、4M、6M和8M尿素溶液洗涤沉淀后收集的上清液，分别与5×Loadingbuffer按4∶1比例混合，水浴煮沸10min；
(7)、将四种混合液进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测IgM重组蛋白最佳溶解条件；发现在4M尿素溶液下IgM重组蛋白溶解度最高，重组蛋白大小约为37kDa。
(8)、将4M尿素溶解的IgM重组蛋白溶解液进行尿素梯度浓度透析至1M尿素溶液中，获得IgM重组蛋白溶液，于-20℃中保存。
三、小鼠免疫
(1)、将步骤二中获得的IgM重组蛋白溶液于无菌生理盐水中稀释至2mg/mL，得到IgM重组蛋白稀释液，再按1∶1比例混合弗氏完全佐剂，获得混合液一，每只小鼠注射混合液一100μl，采用皮下多点注射；
(2)、两周后进行加强免疫，将步骤二中获得的IgM重组蛋白溶液于无菌生理盐水中稀释至2mg/mL，得到IgM重组蛋白稀释液，按1∶1比例混合弗氏不完全佐剂，获得混合液二，每只小鼠注射混合液二100μl，采用皮下多点注射；共进行四次加强免疫，每次加强免疫间隔两周；
(3)、取小鼠尾血并用生理盐水进行梯度稀释，使用包被了IgM重组蛋白的ELISA板进行检测，若尾血效价达到104，则判断该小鼠适合用于细胞融合制备单克隆抗体；
(4)、细胞融合三天前，对效价达到104的小鼠腹腔注射IgM重组蛋白液，该IgM重组蛋白液由步骤二中获得的IgM重组蛋白溶液加入无菌生理盐水稀释而成，该IgM重组蛋白液含IgM重组蛋白30μg。
四、细胞融合
(1)、无菌分离小鼠脾脏并且通过筛网研磨至单个细胞悬液；
(2)、把小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行混合，比例为1∶1至4∶1，并且用6.4mL融合溶液重悬细胞，融合溶液为ECF Buffer；
(3)、把细胞悬液转移至细胞电击融合仪中进行电击融合；
(4)、使用1640HAT培养基重悬融合细胞后，并置于37℃培养箱中修复10min；
(5)、最后把细胞悬液转移至96孔细胞培养板中，并于37℃培养箱中进行培养。
五、阳性细胞株筛选与亚克隆
(1)、待孔内细胞长至5％聚合度时更换为HT培养基，2天后对每孔的细胞培养上清液进行ELISA检测，挑选出阳性细胞株；
(2)、对初次筛选的阳性孔进行培养基补液，每孔加入100μL，1天后对阳性孔进行ELISA检测复筛；
(3)、细胞亚克隆：重悬阳性细胞孔内的细胞，并且根据有限稀释法把一个孔内细胞转移至另一块96孔细胞培养板之中，分别每孔加入100μL培养基进行下一轮培养；
(4)、5天后对细胞孔内进行补液加入100μL培养基，待孔内细胞聚合度到达10％时对细胞培养上清液进行ELISA检测，对阳性细胞株进行下一轮的细胞亚克隆：
(5)、待阳性杂交瘤细胞株抗体分泌能力稳定后，扩增培养至24孔细胞培养板，再扩增至6孔细胞培养板中，最后将得到的杂交瘤细胞进行冻存。
六、抗体制备及纯化
(1)、取8周龄以上BALB/C小鼠，腹腔注射0.5mL石蜡油提前致敏；
(2)、用生理盐水重悬上一步骤获得的杂交瘤细胞，密度为每毫升1×106～2×106个杂交瘤细胞；
(3)、取8周龄以上已致敏的BALB/C小鼠，每只腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞悬液，在无菌动物房中继续饲养；
(4)、7天后观察小鼠腹部膨胀情况，若膨胀明显则采集小鼠腹腔腹水，10000rpm离心15min后取中间层液体；
(5)、使用磁分选仪纯化腹水中的抗体，放入PBS溶液中4℃条件下透析12h，获得单抗溶液；
(6)、使用ELISA检测纯化后抗体的效价，当终浓度稀释至1μg/mL时，单抗的效价均达到105；
七、Western blotting检测单抗的特异性
(1)、斜带石斑鱼用丁香酚麻醉后，从尾部进行抽血，室温下放置2h后8000rpm离心10min，分离上层的血清；
(2)、分别取步骤二中获得的IgM重组蛋白溶液和上一步骤获得的斜带石斑鱼血清进行SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶按照点样泳道切割成适当大小浸泡在转膜缓冲液中；
(3)、将PVDF膜裁剪成与凝胶相匹配的大小，浸泡在转膜缓冲液中；
(4)、按照黑板、泡沫垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、泡沫垫、白板的顺序固定凝胶和PVDF膜，注意排除气泡；
(5)、将装置放入转印槽中，加入转膜缓冲液，100V转膜42min；
(6)、取出PVDF膜后浸泡于5％脱脂奶粉中封闭2h；
(7)、加入终浓度1μg/mL的步骤六中获得的单抗溶液，室温下反应1h后，弃去抗体溶液并用TBST洗涤5次；
(8)、加入终浓度1μg/mL的二抗溶液，室温下反应1h后，弃去二抗并用TBST洗涤5次；
(9)、使用化学发光法进行显示拍照，结果如图2所示，单抗能够识别IgM原核表达的重组蛋白，也能够识别斜带石斑鱼血清中的IgM；该单抗能同时识别斜带石斑鱼血清中两条条带，分别为80kDa和50kDa，与多抗识别的两个条带大小吻合。
八、免疫荧光检测单抗标细胞能力
(1)、分离斜带石斑鱼的头肾组织，浸泡于波恩氏液中24h；
(2)、取固定后的头肾组织依次放于70％、80％、90％酒精和无水乙醇中各脱水30min；
(3)、转移至1/2二甲苯+1/2酒精中脱水15min；
(4)、最后转移至二甲苯中10min；
(5)、放入石蜡包埋机之中，用石蜡液浸泡2h后，包埋进入组织包埋盒之中；
(6)、使用切片机切出5mm的组织石蜡片，放入40℃水浴锅中展片后粘贴于载玻片上，转移至60℃烘箱中干燥6h以上；
(7)、先把片置于二甲苯中15min，再依次浸泡于1/2二甲苯+1/2酒精、无水乙醇、95％酒精、85％酒精和75％酒精各5min进行脱蜡复水；
(8)、放入1×EDTA溶液之中并置于微波炉之中，中高火5min和低火15min进行抗原修复，然后自然冷却至室温；
(9)、10％出羊血清封闭1h；
(10)、加入步骤六中获得的单抗溶液反应1h，用PBS洗涤3次；
(11)、加入二抗反应1h，避光下加入1μg/mL DAPI溶液反应5min，然后用PBS洗涤三次；
(12)、使用荧光显微镜进行观察，单抗能够有效标记斜带石斑鱼头肾切片中的细胞，细胞的形态与B细胞相符。
进一步地，其中，检测小鼠免疫效果、筛选单克隆抗体阳性细胞株以及检测单克隆抗体效价所使用的ELISA具体操作步骤如下：
(1)、用抗原包被液稀释待测抗原至2μg/mL，在96孔ELISA板中每孔加入100μL，37℃下包被3h，PBST洗涤1次；
(2)、每孔中加入200μL封闭液37℃孵育2-3h或者4℃过夜；PBST洗涤1次，配制完成后可在4℃中短期保存；
(3)、使用样品稀释液按照1∶10比例进行连续的梯度稀释抗体样品，每孔加入100μL稀释后的抗体样品，37℃下反应30min后用PBST洗涤3次；
(4)、每孔加入100μL稀释后的二抗溶液，37℃下反应30min后用PBST洗涤3次；
(5)、每孔加入100μL TMB显色液，37℃下避光反应10min，待显色完成后加入5％硫酸终止液终止显色反应，然后进行吸光值读数。
附图说明
图1为斜带石斑鱼IgM重链重组表达的尿素纯化结果；
图2为单抗特异性识别检测结果；
图3为头肾切片免疫荧光结果。
具体实施方式
一种能够识别斜带石斑鱼两种IgM重链的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
一、IgM原核表达载体的构建
(1)、IgM重链恒定区片段扩增
根据斜带石斑鱼IgM重链恒定区序列，设计扩增引物IgM-HCF：CCACTCCAAATGCACCAACTGTG和IgM-HCR：GTGCTTACTTACATGCAAGACTATAAGTTT：以斜带石斑鱼脾脏cDNA为模板，进行PCR扩增，反应程序为：98℃，10s；55℃，15s；72℃，2min；35个循环，72℃延伸5min；PCR结束后，胶回收反应产物；
(2)、产物与载体连接
A、取4μL回收产物与1μL pEASY-Blunt Cloning Vector混合，于25℃下连接30min；
B、连接产物加入到100μL细菌感受态细胞中，冰浴30min；
C、42℃热激30s后，立即冰浴2min；
D、加入900μL培养液，于37℃下180rpm振荡培养1h；
E、4000g离心5min，吸出800μL培养液，重悬离心管底部的细菌；
F、把剩余菌液涂布于卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养12h；
G、挑取单菌落于10μL无菌水中混匀，取1μL为模板，进行PCR反应鉴定阳性菌落，并测序；
(3)、表达载体构建
以测序正确的阳性菌落为模板，以32a-IgMF：caccaccaccaccacggtaccGAGGGCACCGAGACTACCTT和32a-IgMR：ttgtcgacggagctcgaattcTTAATGTTCAACAATGCAGATGAACT为引物扩增表达片段，并进行胶回收；同时，从大肠杆菌中提取去除TRX编码基因的pET32a质粒，并对质粒进行酶切，于37℃反应30min，反应体系为：质粒2μl、10×QuickCut Buffer 10μl、EcoRI 2μl、Kpn I 2μl、H2O 84μl；酶切产物跑凝胶电泳，进行胶回收；然后使用重组酶对胶回收的扩增产物和酶切产物于37℃进行重组连接30min，反应体系如下：酶切产物3μl、扩增产物2μl、5×CE II Buffer 4μl、Exnase II 2μl、H2O 9μl；反应完成后置于冰上冷却，转化细菌感受态细胞，挑选阳性克隆菌进行测序，从测序正确的阳性克隆菌中提取质粒，并转化进大肠杆菌BL21中。
二、IgM重组蛋白的表达与纯化
(1)、挑取pET32a-IgM阳性的大肠杆菌BL21于含有氨苄的LB培养液中，37℃、180rpm震荡培养；
(2)、当OD600＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG继续培养2h；
(3)、把菌液放入4℃之中静置12h，待菌液沉淀至瓶底后吸出上层液体，收集底部沉淀菌液并加入50mL Lyse buffer重悬，于冰上超声破碎；上述Lyse buffer含50mMNaH2PO4、300mM NaCl、10mM Imidazole；
(4)、超声破碎产物经8000g离心10min后弃去上清，收集沉淀；
(5)、先使用2M的尿素溶液洗涤沉淀，离心后分别收集上清液和沉淀；收集的沉淀再使用4M的尿素溶液洗涤，离心后分别收集上清液和沉淀；然后收集的沉淀再使用6M的尿素溶液洗涤，离心后分别收集上清液和沉淀；最后，收集的沉淀再使用8M的尿素溶液洗涤，离心后收集上清液；
(6)、把上述2M、4M、6M和8M尿素溶液洗涤沉淀后收集的上清液，分别与5×Loadingbuffer按4∶1比例混合，水浴煮沸10min；
(7)、将四种混合液进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测IgM重组蛋白最佳溶解条件；发现在4M尿素溶液下IgM重组蛋白溶解度最高，如图1所示，目的蛋白大小大约为37kDa。图1中，M为Marker，1为2M尿素溶液，2为4M尿素溶液，3为6M尿素溶液，4为8M尿素溶液，方框内为目的表达重组蛋白，在4M尿素溶液情况下为最佳溶解浓度。
(8)、将4M尿素溶解的IgM重组蛋白溶解液进行尿素梯度浓度透析至IM尿素溶液中，获得IgM重组蛋白溶液，于-20℃中保存。
三、小鼠免疫
(1)、将步骤二中获得的IgM重组蛋白溶液于无菌生理盐水中稀释至2mg/mL，得到IgM重组蛋白稀释液，再按1∶1比例混合弗氏完全佐剂，获得混合液一，每只小鼠注射混合液一100μl，采用皮下多点注射；
(2)、两周后进行加强免疫，将步骤二中获得的IgM重组蛋白溶液于无菌生理盐水中稀释至2mg/mL，得到IgM重组蛋白稀释液，按1∶1比例混合弗氏不完全佐剂，获得混合液二，每只小鼠注射混合液二100μl，采用皮下多点注射；共进行四次加强免疫，每次加强免疫间隔两周；
(3)、取小鼠尾血并用生理盐水进行梯度稀释，使用包被了IgM重组蛋白的ELISA板进行检测，若尾血效价达到104，则判断该小鼠适合用于细胞融合制备单克隆抗体；
(4)、细胞融合三天前，对效价达到104的小鼠腹腔注射IgM重组蛋白液，该IgM重组蛋白液由步骤二中获得的IgM重组蛋白溶液加入无菌生理盐水稀释而成，该IgM重组蛋白液含IgM重组蛋白30μg。
四、细胞融合
(1)、无菌分离小鼠脾脏并且通过筛网研磨至单个细胞悬液；
(2)、把小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行混合，比例为1∶1至4∶1，并且用6.4mL融合溶液重悬细胞，融合溶液为ECF Buffer；
(3)、把细胞悬液转移至细胞电击融合仪中进行电击融合；
(4)、使用1640HAT培养基重悬融合细胞后，并置于37℃培养箱中修复10min；
(5)、最后把细胞悬液转移至96孔细胞培养板中，并于37℃培养箱中进行培养。
五、阳性细胞株筛选与亚克隆
(1)、待孔内细胞长至5％聚合度时更换为HT培养基，2天后对每孔的细胞培养上清液进行ELISA检测，挑选出阳性细胞株；
(2)、对初次筛选的阳性孔进行培养基补液，每孔加入100μL，1天后对阳性孔进行ELISA检测复筛；
(3)、细胞亚克隆：重悬阳性细胞孔内的细胞，并且L根据有限稀释法把一个孔内细胞转移至另一块96孔细胞培养板之中，分别每孔加入100μL培养基进行下一轮培养；
(4)、5天后对细胞孔内进行补液加入100μL培养基，待孔内细胞聚合度到达10％时对细胞培养上清液进行ELISA检测，对阳性细胞株进行下一轮的细胞亚克隆；
(5)、待阳性杂交瘤细胞株抗体分泌能力稳定后，扩增培养至24孔细胞培养板，再扩增至6孔细胞培养板中，最后将得到的杂交瘤细胞进行冻存。
六、抗体制备及纯化
(1)、取8周龄以上BALB/C小鼠，腹腔注射0.5mL石蜡油提前致敏；
(2)、用生理盐水重悬上一步骤获得的杂交瘤细胞，密度为每毫升1×106～2×106个杂交瘤细胞；
(3)、取8周龄以上已致敏的BALB/C小鼠，每只腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞悬液，在无菌动物房中继续饲养；
(4)、7天后观察小鼠腹部膨胀情况，若膨胀明显则采集小鼠腹腔腹水，10000rpm离心15min后取中间层液体；
(5)、使用磁分选仪纯化腹水中的抗体，放入PBS溶液中4℃条件下透析12h，获得单抗溶液；
(6)、使用ELISA检测纯化后抗体的效价，当终浓度稀释至1μg/mL时，单抗的效价均达到105；
七、Western blotting检测单抗的特异性
(1)、斜带石斑鱼用丁香酚麻醉后，从尾部进行抽血，室温下放置2h后8000rpm离心10min，分离上层的血清；
(2)、分别取步骤二中获得的IgM重组蛋白溶液和上一步骤获得的斜带石斑鱼血清进行SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶按照点样泳道切割成适当大小浸泡在转膜缓冲液中；
(3)、将PVDF膜裁剪成与凝胶相匹配的大小，浸泡在转膜缓冲液中；
(4)、按照黑板、泡沫垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、泡沫垫、白板的顺序固定凝胶和PVDF膜，注意排除气泡；
(5)、将装置放入转印槽中，加入转膜缓冲液，100V转膜42min；
(6)、取出PVDF膜后浸泡于5％脱脂奶粉中封闭2h；
(7)、加入终浓度1μg/mL的步骤六中获得的单抗溶液，室温下反应1h后，弃去抗体溶液并用TBST洗涤5次；
(8)、加入终浓度1μg/mL的二抗溶液，室温下反应1h后，弃去二抗并用TBST洗涤5次；
(9)、使用化学发光法进行显示拍照，结果如图2所示，单抗能够识别IgM原核表达的重组蛋白，也能够识别斜带石斑鱼血清中的IgM；该单抗能同时识别斜带石斑鱼血清中两条条带，分别为80kDa和50kDa，与多抗识别的两个条带大小吻合。图2中，泳道M表示Marker，泳道1表示重组表达的IgM，泳道2表示石斑鱼血清，左边第一个方框内为单克隆抗体识别IgM重组蛋白，上边两个方框为单克隆抗体识别石斑鱼血清中IgM的重链部分。
八、免疫荧光检测单抗标细胞能力
(1)、分离斜带石斑鱼的头肾组织，浸泡于波恩氏液中24h；
(2)、取固定后的头肾组织依次放于70％、80％、90％酒精和无水乙醇中各脱水30min；
(3)、转移至1/2二甲苯+1/2酒精中脱水15min；
(4)、最后转移至二甲苯中10min；
(5)、放入石蜡包埋机之中，用石蜡液浸泡2h后，包埋进入组织包埋盒之中；
(6)、使用切片机切出5mm的组织石蜡片，放入40℃水浴锅中展片后粘贴于载玻片上，转移至60℃烘箱中干燥6h以上；
(7)、先把片置于二甲苯中15min，再依次浸泡于1/2二甲苯+1/2酒精、无水乙醇、95％酒精、85％酒精和75％酒精各5min进行脱蜡复水；
(8)、放入1×EDTA溶液之中并置于微波炉之中，中高火5min和低火15min进行抗原修复，然后自然冷却至室温；
(9)、10％山羊血清封闭1h；
(10)、加入步骤六中获得的单抗溶液反应1h，用PBS洗涤3次；
(11)、加入二抗反应1h，避光下加入1μg/mL DAPI溶液反应5min，然后用PBS洗涤三次；
(12)、使用荧光显微镜进行观察，结果如图3所示，单抗能够有效标记斜带石斑鱼头肾切片中的细胞，细胞的形态与B细胞相符。图3中，箭头所指处为单克隆抗体阳性标记。
另外：其中，检测小鼠免疫效果、筛选单克隆抗体阳性细胞株以及检测单克隆抗体效价所使用的ELISA具体操作步骤如下：
(1)、用抗原包被液稀释待测抗原至2μg/mL，在96孔ELISA板中每孔加入100μL，37℃下包被3h，PBST洗涤1次；
(2)、每孔中加入200μL封闭液37℃孵育2-3h或者4℃过夜；PBST洗涤1次，配制完成后可在4℃中短期保存；
(3)、使用样品稀释液按照1∶10比例进行连续的梯度稀释抗体样品，每孔加入100μL稀释后的抗体样品，37℃下反应30min后用PBST洗涤3次；
(4)、每孔加入100μL稀释后的二抗溶液，37℃下反应30min后用PBST洗涤3次；
(5)、每孔加入100μL TMB显色液，37℃下避光反应10min，待显色完成后加入5％硫酸终止液终止显色反应，然后进行吸光值读数。