Car-t细胞的检测用单克隆抗体、试剂盒及应用
阅读说明：本技术 Car-t细胞的检测用单克隆抗体、试剂盒及应用 (Monoclonal antibody for detecting CAR-T cells, kit and application ) 是由 陈鑫 冯冬歌 何薇 余学军 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种用于与CAR分子特异性结合的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体包括轻链和重链,所述轻链包括氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示的CDR区,所述重链包括氨基酸序列如SEQ ID NO：5-7所示的CDR区。采用本发明所述的单克隆抗体或CAR-T细胞的检测试剂盒,CAR-T细胞检测的步骤简洁,检测时间短,对细胞状态要求低,灵敏度高,分辨效果好,检测结果稳定。本专利发明的anti-FMC63 ScFv抗体可大大降低检测通用anti-CD19 CAR-T细胞的成本。(The invention belongs to the field of molecular biology, and particularly relates to a monoclonal antibody specifically bound with CAR molecules, which is characterized by comprising a light chain and a heavy chain, wherein the light chain comprises an amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 1-3, and the heavy chain comprises a CDR region having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5-7. By adopting the detection kit for the monoclonal antibody or the CAR-T cell, the CAR-T cell detection has the advantages of simple steps, short detection time, low requirement on cell state, high sensitivity, good resolution effect and stable detection result. The anti-FMC63 ScFv antibody disclosed by the invention can greatly reduce the cost for detecting the universal anti-CD19 CAR-T cells.)
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种CAR-T细胞的检测用单克隆抗体、试剂盒及应用。
背景技术
CD19分子是B细胞表面标记之一，又称之为B4或Leu-12，CD19是跨膜糖蛋白，CD19分子从骨髓B细胞开始表达，并持续整个B细胞成熟期。CD19 CAR-T(chimeric antigenreceptor T，嵌合抗原受体T)细胞是经过人工改造的T细胞，这种改造通过基因工程修饰的方法使得T细胞表面表达能够识别CD19的CAR(嵌合抗原受体)称之为anti-CD19 CAR，从而使得CD19 CAR-T细胞能够识别表达CD19的肿瘤B细胞，目前CD19 CAR-T细胞已经应用于临床，用于治疗CD19表达阳性的B细胞恶性血液肿瘤。
CD19 CAR-T细胞应用于临床方面存在诸多难题，困难之一便是CD19 CAR-T细胞的检测成本太高，因CD19 CAR-T表面所表达的anti-CD19 CAR是用于识别CD19分子的，故而传统检测CD19 CAR-T是通过CD19分子来检测的，但使用人CD19抗原来检测CD19CAR-T细胞表面的anti-CD19 CAR的特异性不高，试验条件复杂，抗原蛋白加入量高的问题。除这种方法外，另有用于临床CAR-T细胞感染效率的检测，除CD19以外的靶标都使用QPCR检测法，该方法不能精确定量感染效率，因此，需要一种新的CAR-T细胞的检测试剂。
发明内容
为解决现有问题，本发明提供一种CAR-T细胞的检测用单克隆抗体、试剂盒及应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一方面，提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQ IDNO：5-7所示的CDR区。
本发明第二方面，提供一种多核苷酸，其编码前述的用于与CAR分子特异性结合的单克隆抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。
本发明第三方面，提供一种构建体，所述构建体由前述的多核苷酸***到表达载体的多克隆位点构建而成。
本发明第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有前述构建体、或者染色体中整合有前述的多核苷酸。
本发明第五方面，提供前述用于与CAR分子特异性结合的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述单克隆抗体的条件下，培养前述的宿主细胞，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。
本发明第六方面提供前述单克隆抗体在制备CAR-T细胞的检测试剂中的用途。
本发明的第七方面，提供一种CAR-T细胞的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括捕获配体和检测配体，所述捕获配体包括相连的第一配体和第一配体标记物，所述第一配体为前述的单克隆抗体；所述检测配体包括第二配体，所述第二配体用于识别所述捕获配体。
本发明第八方面提供前述的用于与CAR分子特异性结合的单克隆抗体、多核苷酸、构建体、宿主细胞或CAR-T细胞的检测试剂盒在CAR-T细胞检测中的应用。
本发明第九方面提供一种CAR-T细胞的检测方法，包括以下步骤：
1)向待测样本中加入前述单克隆抗体或试剂盒中的捕获配体，孵育后离心得第一沉淀；
2)向所述第一沉淀中加入用于识别前述单克隆抗体的检测配体或试剂盒中的检测配体，孵育后离心得到第二沉淀；
3)对所述第二沉淀进行流式检测，获得待测样本中CAR-T细胞含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
采用本发明所述的单克隆抗体或CAR-T细胞的检测试剂盒，CAR-T细胞检测的步骤简洁，检测时间短，对细胞状态要求低，灵敏度高，分辨效果好，检测结果稳定。目前商业化抗原检测anti-CD19 CAR使用蛋白用量较多、成本高(约120元/test)，本专利发明的anti-FMC63 ScFv抗体可大大降低检测通用anti-CD19 CAR-T细胞的成本，可低至20元/test，降低6倍。
附图说明
图1：实施例1所述单克隆抗体的制备流程图。
图2：本发明一实施例中说明比较实验组抗体和对照组CD19蛋白结合antiCD19CAR-T细胞的特异性CytoFlex检测结果的散点图。其中，左图为实验组，右图为对照组，下图为同型对照组。
图3：本发明一实施例中说明比较实验组抗体和对照组CD19蛋白结合antiCD19CAR-T细胞的特异性CytoFlex检测结果的直方图，其中，左图为实验组，右图为对照组，下图为同型对照组。
图4：本发明一实施例中的实验组抗体和对照组CD19蛋白各3次结合antiCD19CAR-T细胞CytoFlex检测的平均结果。其中，左图为实验组，右图为对照组。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来产生抗体。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε链，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9或12个。例如在本发明的双功能抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的C端连接另一个抗体的ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来获得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature,256:495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(Kd)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”是指特异性结合。
本发明提供的用于与CAR分子特异性结合的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQ ID NO：5-7所示的CDR区。
所述重链和轻链可通过二硫键连接。
一种实施方式中，所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4。
一种实施方式中，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
所述单克隆抗体是鼠源性的。
所述的单克隆抗体包括非CDR区。
进一步的，所述单克隆抗体亚类为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3。
进一步的，所述单克隆抗体能够结合在CAR分子scFv结构域上。
本发明提供的多核苷酸，其编码前述的用于与CAR分子特异性结合的单克隆抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。
本发明提供的构建体，所述构建体由前述的多核苷酸***到表达载体的多克隆位点构建而成。
所述表达载体具体可以是本领域的技术人员所熟知的现有常用的表达载体，具体可采用的表达载体包括但不限于：pET系列表达载体、pGEX系列表达载体、pcDNA系列表达载体等。
本发明提供的一种宿主细胞，所述宿主细胞含有前述构建体、或者染色体中整合有前述的多核苷酸。
任何适用于表达载体(构建体)进行表达本专利所述抗体的细胞都可以作为宿主细胞。例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可采用的细胞系包括但不限于：中国仓鼠的卵巢细胞(CHO系列)、幼仓鼠的肾脏细胞(BHK,ATCC CCL 10)、幼鼠的塞尔托利细胞(Sertolicells)、猴的肾脏细胞(COS细胞)、通过SV40(COS-7,ATCC CRL 165 1)转化的猴的肾脏CVI细胞、人的胚肾细胞(HEK-293系列)、猴肾脏细胞(CVI，ATCC CCL-70)、非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人的子***细胞(HELA,ATCC CCL-2)等。
本发明提供的前述用于与CAR分子特异性结合的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述单克隆抗体的条件下，培养前述的宿主细胞，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。
在获得编码本发明的抗体的核酸序列后，可按照以下方法制备生产目的抗体。例如将含有编码目标抗体的核酸的载体直接导入宿主细胞，细胞在适当的条件下进行培养，从而诱导出被编码抗体的表达。本发明中所用的表达载体和宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的10％FBS的1640培养基亦为各种常规的哺乳细胞培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的1640培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达，或分泌到细胞外。一旦获得本发明所说的单克隆抗体，就可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化所述单克隆抗体。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供前述单克隆抗体在制备CAR-T细胞的检测试剂中的用途。
本发明提供的CAR-T细胞的检测试剂盒，包括捕获配体和检测配体，所述捕获配体包括相连的第一配体和第一配体标记物，所述第一配体为前述的单克隆抗体；所述检测配体包括第二配体，所述第二配体用于识别所述捕获配体。
进一步的，所述捕获配体能够结合在CAR分子scFv结构域上。
一种实施方式中，所述第一配体标记物选自生物素或碱性磷酸酶。
一种实施方式中，所述检测配体结合有荧光分子。
一种实施方式中，所述第二配体选自链霉亲和素、IgG(包括但不仅限于山羊、鼠、兔、鸡、人和猴等来源)中的一种或多种。
一种实施方式中，所述试剂盒中还包括下列中的一种或多种：1)支持介质；2)终止液；3)稀释液；4)洗涤液；5)封闭液；6)阴性对照；7)阳性对照。
所述试剂盒中，所述支持介质可事先包被有所述捕获配体，也可以只提供空白的支持介质，在检测前由操作者自行采用常规方法在支持介质上包被捕获配体。
其中，所述支持介质与试剂接触面上可有微孔滤膜。因此，所述支持介质为微孔滤膜板。所述微孔滤膜板可为各种常见规格的微孔滤膜板，如96孔滤膜板。更优选地，所述支持介质为披覆PVDF薄膜微孔培养板。其中，优选地，所述支持介质与试剂接触面上有PVDF膜。
本发明所述的终止液、稀释液、洗涤液、封闭液、阴性对照、阳性对照，均是抗体检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此既可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。
所述洗涤液可为检测试剂盒中的常用洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
所述封闭液可为包被微孔滤膜板常用的封闭液，如PBS、乙酸、甲醇、吐温、蔗糖、脱脂乳液、FBS、BSA或酪蛋白。
所述阴性对照可以为non-antiCD19 antigen的重组蛋白(厂家：NovusBiologicals，货号：NBP2-25199)或IgG。
可选的，阴性对照的序列如SEQ ID NO：9所示，具体为：
MPTPLVHPHLPISSPRVSPFPPPAFQKASSIVYKKEGEQVEFSFPLAFTVEKLTGSGELWWQAERASSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGNLTLALEAKTGKLHQEVNLVVMRATQLQKNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVSKREKAVWVLNPEAGMWQCLLSDSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEKKTCQCPHRFQKTCSPI。
所述阳性对照可以为FMC63 scFv重组蛋白(厂家：Novus Biologicals，货号：NBP2-52688)或IgG。
可选的，阳性对照的序列如SEQ ID NO：10所示，具体为：EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT。
通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
本发明还提供前述用于与CAR分子特异性结合的单克隆抗体、多核苷酸、构建体、宿主细胞或CAR-T细胞的检测试剂盒在CAR-T细胞检测中的应用。
本发明提供的CAR-T细胞的检测方法，包括以下步骤：
1)向待测样本中加入前述单克隆抗体或试剂盒中的捕获配体，孵育后离心得第一沉淀；
2)向所述第一沉淀中加入用于识别前述单克隆抗体的检测配体或试剂盒中的检测配体，孵育后离心得到第二沉淀；
3)对所述第二沉淀进行流式检测，获得待测样本中CAR-T细胞的CAR+细胞含量。
优选的，所述方法具体包括以下步骤：
1)在流式缓冲液中将待检样本与结合有第一配体标记物的第一配体混合，于2-8℃结合15-45分钟后进行第一次离心，得到第一沉淀物；
2)将第一沉淀物洗涤后利用流式缓冲液重悬，再加入结合有荧光分子的检测配体，并于2-8℃结合15-45分钟后进行第二次离心，得到第二沉淀物；
3)将第二沉淀物洗涤后离心，并将所得沉淀利用流式缓冲液重悬后进行流式检测。
实施例1.杂交瘤细胞株的获取以及单克隆抗体的制备
制备流程如图1所示，具体的制备方法为：
一、蛋白生产
1、质粒大量抽提
200ul菌液接种在含有50ug/ml氨苄青霉素的mLYT培养基中，37℃摇床培养6个小时后离心收集沉淀。用12ml RES缓冲液重悬沉淀，充分混匀，加入12ml LYS裂解缓冲液，充分颠倒混匀，在室温下放置2min。加入NEU中和液12ml，立即颠倒混匀。在含有滤膜的平衡柱中，加入35ml EQU缓冲液。将缓冲液加在滤膜边缘，并确保可以润湿整个滤膜。EQU在重力作用下滤过后，加入颠倒混匀的裂解后溶液，防止堵塞滤膜。用10ml EQU润洗滤膜。待平衡柱中的液体流尽后，倒置平衡柱，弃去滤膜。用90ml Endo缓冲液，第一次清洗柱子。待液体流尽后再加入45ml Wash缓冲液，第二次清洗柱子。再向柱子中加45ml ELU缓冲液，将洗脱液收集在50mL离心管中。加入10.5ml室温下的异丙醇，混匀，在室温下静止5min，将质粒DNA沉淀。将上述溶液过滤在滤膜中，并用5ml 70％乙醇清洗滤膜。将乙醇完全从滤膜中去除后，加入1ml水在滤膜中，溶解DNA在1.5ml冻存管中。对抽提好的质粒进行测序。
2、3G11-scFv和FMC63-scFv蛋白的表达
FMC63是传统anti-CD19 CAR，3G11是突变的anti-CD19 CAR(所涉专利申请号201710357213.3)。
各取1.5mg KL20629-2和KL20743-1质粒用PEI法转染293-6E细胞，37摄氏度滚瓶培养7天，收取细胞用于抗体纯化。
3、3G11-scFv和FMC63-scFv抗体的纯化
将细胞培养产物3G11-scFv-Fc和FMC63-scFv-Fc离心后取上清，再用sartopore2(Sartorius)过滤除去细胞碎片，收集过滤后的澄清液。使用10ml Mabselect SuRe纯化收集目的蛋白。把收集到的目的蛋白用Centrifugal Filter Units 15ml 30K离心浓缩目的蛋白，离心后经Millex-GP Filter Unit 0.22μm Sterile过滤，用NanoDrop2000测定A280的方法分别确定亲和产量。再用440ml superdex200分子筛柱进一步纯化，根据出峰情况收集主要目的蛋白，经Millex-GP Filter Unit 0.22μm Sterile过滤，用NanoDrop2000测定A280的方法分别确定最终抗体产量。用SDS-PAGE、SEC-HPLC和LAL method进行QC，分析最终产品质量。
二、小鼠免疫和血清效价检测
1、Hock免疫法
每只小鼠抗原量为10ug，抗原和TiterMax佐剂比例为1:1。针对Group2-3两组10只Balb/c小鼠和Group5-6两组10只SJL小鼠进行hock免疫。随后进行抗原的乳化。打开胶囊式银汞调合器开关，将盛有抗原、佐剂还有PBS混合物的1.5ml离心管放入胶囊式银汞调合器中，涡旋震荡乳化，待抗原完全乳化，达到油包水的状态即可。将乳化好的抗原和佐剂混合物吸入到1ml无菌注射器中，用75％酒精棉球擦拭消毒小鼠双脚脚踝部位，注射器针尖斜面向上，有刻度面朝向自己，平行于脚踝进针，缓慢注入抗原和佐剂混合物。免疫完成后进行至少2小时观察。
2、腹腔注射免疫法
根据免疫程序计算出该次免疫所需的抗原量。抗原和佐剂比例为1:1，按照要求用PBS稀释抗原到相应浓度。Group1组的5只Balb/c小鼠和Group4组的5只SJL小鼠进行腹腔注射免疫。随后进行抗原的乳化。打开胶囊式银汞调合器开关，将盛有抗原、佐剂还有PBS混合物的1.5ml离心管放入胶囊式银汞调合器中，涡旋震荡乳化，待抗原完全乳化，达到油包水的状态即可。将乳化好的抗原和佐剂混合物转移到2.0ml无菌注射器中，注意排空气泡。右手抓住小鼠尾巴，左手的大拇指和食指轻轻抓住小鼠的头颈部皮肤，腹腔向上，用75％酒精棉球擦拭小鼠右侧腹部注射部位。将事先吸好抗原药物的注射器针尖斜面向上，小鼠头部向下，平行刺入皮内后，注射器与腹腔呈45度角刺入小鼠腹腔，缓慢注入抗原和佐剂混合物，免疫完成后进行至少4h观察。
3、小鼠血清的收集
将每只小鼠对应的血清管号做好标记，检查小鼠耳钉号，单手抓取小鼠，通过小鼠面部颌下静脉采取大约200ul全血，将收集的全血样品室温静置大约1h后离心收集离心管上部血清。一周内可将血清存放于4℃冰箱，用于抗体效价等相关实验检测。若长期保存血清可置于-80℃冰箱，避免反复冻融。
4、免疫小鼠ELISA血清效价测定
实验开始前将96孔板做好相应的标记，以1ug/ml抗原浓度，每孔50ul,4℃冰箱过夜包被。次日，将前天包被好的抗原板取出，洗板机清洗一次(清洗液：1x PBST)。清洗后以1X PBST配置的1％BSA封闭液37℃封闭1小时。1x PBST清洗液洗板3次后，加入不同稀释浓度的待检血清37℃温箱，孵育1小时。1x PBST清洗液洗板3次后，加入羊抗鼠二抗，37℃温箱孵育0.5小时洗板后，取TMB显色液A液和B液1：1比例混合后显色。15分钟用1N盐酸终止显色反应。在Spectra Max M5多功能读板机上，检测450nm的荧光值。
5、免疫小鼠FACS血清效价测定
CART和PBMC细胞悬液离心后以含0.1％BSA的PBS重悬细胞后计数，加入各组免疫小鼠的待测血清，室温孵育40分钟后清洗细胞三次后加入Anti-Mouse IgG(Fc specific)-FITC二抗，避光室温孵育30分钟后清洗细胞三次，用含0.1％BSA的PBS轻轻重悬细胞，上机检测。
三、杂交瘤细胞的融合和筛选
1、PEG融合技术
融合前一周将SP2/0进行复壮筛选，于10％DMEM培养基中进行扩大培养。将已处死的小鼠于生物安全柜中摘取脾脏和***于培养皿中进行冲洗研磨，混合收集于50mL离心管中，1000rpm离心5min去上清。将扩大培养后的SP2/0收集于50mL离心管中，1000rpm离心5min去上清。将SP2/0和淋巴细胞分别用无血清DMEM培养基重悬后计数，SP2/0用Countstar细胞自动计数仪计数，淋巴细胞用血球计数板计数。将SP2/0和淋巴细胞按1:4的比例混合，1000rpm离心去上清。将细胞弹散后加入1.5ml 37℃预热的PEG,1min内匀速加完，边加边转动。静置1.5min后，用含15％FBS的DMEM终止融合，静置5min后，1000rpm离心5min去上清。用含1×HAT的20％FBS DMEM培养基调整脾细胞浓度为0.5×106cell/mL，按200μL/孔铺于96孔板中。将96孔板于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天观察细胞状态，融合后5天统计细胞融合率。融合后9-14天对融合的杂交瘤细胞进行筛选，挑选阳性孔细胞于24孔板中扩大培养。
2、电融合技术
融合前一周将SP2/0进行复壮筛选，于10％DMEM培养基中进行扩大培养。将已处死的小鼠于生物安全柜中摘取脾脏和***于培养皿中进行冲洗研磨，混合收集于50mL离心管中，1000rpm离心5min去上清。加入2ml红细胞裂解液，4℃裂解3分钟后加入含10％FBS的DMEM培养基至50ml进行裂红终止。收集状态良好的SP2/0和淋巴细胞分别置于50ml离心管中离心弃上清，分别用无血清DMEM重悬后计数，SP2/0用Count star细胞自动计数仪计数，淋巴细胞用血球计数板计数。将SP2/0和淋巴细胞按1:2的比例混合，1000rpm离心去上清。用温育过的Cytofusion Medium C 10ml重悬混合细胞，洗3次后，以6ml CytofusionMedium C重悬细胞。启动电融合仪，按照设定程序进行融合。融合后细胞铺于96孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养，每天观察细胞状态，融合后5天统计细胞融合率。融合后9-14天对融合的杂交瘤细胞进行筛选，挑选阳性孔细胞于24孔板中扩大培养。
3、有限稀释法对融合细胞进行亚克隆
配制含15％FBS的HT培养基，将需要亚克隆的细胞株自24孔培养孔中重悬起来，并使用Countstar IC1000型细胞计数仪分别进行计数。用20ml配置好的HT培养基稀释每株细胞株的细胞浓度至5-10个/ml,将稀释好的细胞悬液加入15cm一次性培养皿中，于96孔培养板中每孔加0.2ml，每孔含细胞为1-2个。将铺好细胞的96孔板放进37°，5％CO2培养箱中培养。7-10天后根据细胞的生长情况对亚克隆板进行检测筛选，并挑选阳性克隆至24孔进行进一步阳性确认。
4、融合细胞的ELISA筛选
1)抗原包被
a)准备好两个干净的250ml低吸附力贮液瓶，和96孔酶标板上一样提前写好相关信息(如项目号、样品名称、浓度、日期和操作人等)；
b)分别用移液管取12.5ml的20XPBS到两个贮液瓶内,加入237.5ml的ddH2O稀释成1XPBS；
c)从样品管取200ul的3G11-scFv-hFc(1.25mg/ml)加入到其中一个贮液瓶，161.3ul的NC-scFv-hFc(1.55mg/ml)到另一个贮液瓶，分别摇匀，使终浓度为1ug/ml；
d)尽快的将上述溶液分别加入到对应96孔酶标板里，放到4℃冰箱过夜孵育。
2)洗板
a)取250ml的20X PBS到5L的专用容器，加入4750ml的ddH2O稀释成5L的1XPBS溶液；
b)加入2.5ml的吐温20，配置成0.05％吐温20含量的1X PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)；
c)将配好的1X PBST溶液充分混匀后加入到洗板机对应的贮液瓶，以便后续使用；
d)检查洗板机状况，确保仪器能正常运行并且没有任何堵塞；
e)调出洗板机的相应清洗程序，以300ul/well的1X PBST将包被过的ELISA板清洗一遍；
f)全部清洗完成后再次检查仪器状况，确认没有堵塞后启动相应维护程序。
3)封闭
a)取50ml的20X PBS到标记过的1L贮液瓶，加入950ml的ddH2O稀释成1L的1XPBS溶液；
b)用天平称取10.00g的BSA，加入贮液瓶后摇匀使BSA充分溶解；
c)吸出500ul的吐温20，加入到上述溶液中，混匀后即是封闭液和稀释缓冲液，后续需要时同理配置(1×PBS+0.05％Tween20+1％BSA)；
d)将封闭液按照250ul/well加入到ELISA板，37℃恒温箱孵育1.5小时封闭结束后弃掉封闭液，封闭好的ELISA板可以放入-20℃保存。
4)加一抗
a)将封闭好的ELISA板放入37℃恒温箱解冻，清洗一遍后依照融合板上的克隆号对相应的ELISA检测板进行信息标注；
b)取两管1ml的同阶段杂交瘤细胞培养基,其中一管加入1.00ul的FB作为阳性对照样品，另一管培养基为阴性对照样品；
c)按照50ul/well的标准取融合板杂交瘤上清液到相应的ELISA微孔板中，并在预留孔中分别加入50ul的阴性和阳性对照样品；
d)将上述ELISA检测板放入37℃恒温箱孵育1小时后，用洗板机进行清洗。
5)洗板
a)检查洗板机状况，确保仪器能正常运行且没有任何堵塞，若PBST洗液不够，则同步骤2中配置；
b)调出洗板机的相应清洗程序，以300ul/well的1X PBST将包被过的ELISA板清洗三遍；
c)全部清洗完成后再次检查仪器状况，确认没有堵塞后启动相应维护程序。
6)加二抗
a)取步骤3“封闭”步骤中的配置好的稀释缓冲液100ml,加入20ul的Anti-MouseIgG(Fc specific)-HRP(1:5000)；按照每孔50ul的标准，将上述二抗溶液加入到清洗过的ELISA检测板中；
b)转至37℃恒温箱里孵育0.5小时后，用洗板机进行清洗。
7)洗板
a)检查洗板机状况，确保仪器能正常运行且没有任何堵塞，若PBST洗液不够，则同步骤2“洗板”步骤中的配置；
b)调出洗板机的相应清洗程序，以300ul/well的1X PBST将包被过的ELISA板清洗三遍；
c)全部清洗完成后再次检查仪器状况，确认没有堵塞后启动相应维护程序。
8)显色
a)将清洗完毕的ELISA板按照包被样品的不同区分开，并依据克隆号的大小进行排序；
b)拿干净的容器，按照1:1的比例配置TMB显色液，A液和B液各取90ml混合摇匀；
c)按照每孔100ul的体积，将配置好的TMB显色液加入到ELISA检测板中，显色15分钟。
9)终止
a)在指定试剂瓶中加入880ml的ddH2O，再取80ml的盐酸(AR.36-38％)，提前在通风橱内稀释得到1N的盐酸溶液以备用，后续需要时同理配置(原浓度为12N)；
b)按照每孔50ul的体积，将1N的HCl加入到ELISA检测板中，终止显色反应。
10)读板
a)提前在酶标仪软件上键入ELISA板对应的板号或克隆号等信息，读板时顺序放板并仔细核对；
b)显色反应终止后，立即使用酶标仪在450nm波长下进行读板分析，导出需要的数据结果，并保存或上传到指定位置存档。
5、融合细胞的FACS筛选
1)收取细胞
a)取100ul细胞培养液，用于细胞计数；
b)取每次实验所需细胞量的细胞培养液，用离心机1000rpm离心5min，弃掉上清液；
c)用等比例FACS buffer(1XPBS+2％FBS)重悬细胞(活细胞浓度为1.02E6个/ml)，准备铺板。
2)铺板
a)根据样品数量排布，在对应孔里分别加入100ul步骤1)中的细胞悬液(最后每孔活细胞数为1.02E5个；
b)室温下封闭20-30min后,300g、4℃离心5分钟，弃掉上清液。
3)加一抗
a)按照100ul/well的标准取杂交瘤上清液或对照样品到相应的微孔板中，重悬细胞
b)将上述检测板放入4℃冰箱孵育1小时后，用FACS buffer清洗两遍。
4)洗板
a)加入200ul/well的FACS buffer重悬细胞，用离心机300g,4℃离心5min，弃掉上清液；
b)重复上述清洗步骤。
5)加二抗
a)取FACS buffer 3ml,加入3ul的Anti-Mouse IgG(Fc specific)-Alexa488(1:1000)；
b)按照每孔100ul的标准，将上述二抗溶液加入到清洗过的检测板中；
c)转至4℃冰箱避光孵育1小时后，用FACS buffer清洗两遍。
6)洗板
a)加入200ul/well的FACS buffer，用离心机300g,4℃离心5min，弃掉上清液；
b)重复上述清洗步骤。
7)上机
a)用100ul的1XPBS重悬步骤6中的细胞，避光准备上机分析。
四、特异性抗体的生产纯化和标记
1、抗体生产和纯化
配制抗体生产所需培养液2.5％SFM(含有2.5％的ultra low IgG FBS，1×Pen-Strep solution的SFM培养液，显微镜下观察需要抗体生产的细胞，长至≥70％以上且细胞状态良好，收集细胞并用Countstar IC1000型细胞计数仪进行计数。用配制好的SFM培养基将细胞浓度调至1～5×105个/ml,转移至Roller Bottle。将转好细胞的Roller Bottle送到滚瓶培养箱中37℃培养10-15天，每天观察细胞生长状况，待培养液变橙黄且透明，取出待纯化。
2、细胞上清通过Protein A柱子进行抗体纯化
3、抗体生物素标记
将Biotin-NHS溶解在无水DMF中制成10毫克/毫升DMF溶液备用。取出待标记抗体，分别放入两支15毫升离心管中，使用UV-Nanodrop的IgG工作模式测得抗体浓度，分别加入biotin-NHS(浓度10毫克/毫升)至抗体中，放入25摄氏度水浴中反应30分钟后，加入1M氯化铵水溶液终止反应。将偶联完生物素的抗体放入透析袋中，4摄氏度1×PBS缓冲液中透析过夜。第一次透析4小时后更换一次透析液。6.实验第三天上午，将生物素化抗体样品取出透析袋后放入两支干净的15毫升离心管中，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品浓度，以及ELISA方法验证Biotin标记结果。
本发明的单克隆抗体也可以使用本领域公知的其他方法进行标记。
五、单克隆抗体特性检测
1、单克隆抗体亚类的鉴定
按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的ELISA法。在已包被抗原的酶标板内分别加入细胞培养上清50μL/孔，37℃1h，PBST洗涤3次，每次5min分别加入1：1000稀释的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM亚类抗体50μL/孔，37℃0.5h，每株单克隆抗体加每种亚类两孔，PBST洗涤3次每次5min；加入1：5000稀释的兔抗羊酶标二抗50μL/孔，37℃15min，PBST洗涤3次；加显色液邻苯二胺(OPD)溶液50μL/孔，37℃避光显色10～15min，2MH2SO4 50μL/孔终止反应，以肉眼观察颜色明显高于其他孔者所加亚类抗体为单克隆抗体亚类。
经鉴定，结果表明，单克隆抗体(记为3984-mab001-H)的轻链可变区互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
RASQDISNYLN
单克隆抗体的轻链可变区互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
YTSRLRS
单克隆抗体的轻链可变区互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
QQGDTLPYT
单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGADYSLTISNLEQEDIATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLEIN
单克隆抗体的重链可变区互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
GYSFTDY
单克隆抗体的重链可变区互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
DPYNGG
单克隆抗体的重链可变区互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
TYDNYEFAY
单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSFTDYTMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPYNGGTNYSQRFKGKATLTVDKSSSTAFMHLNSLPSEDSAVYYCANTYDNYEFAYWGQGTLVTVSA
实施例2抗体的制备
根据SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8，合成编码单克隆抗体3984-mab001-H轻链和重链的核苷酸序列。将单克隆抗体3984-mab001-H的重链cDNA和轻链cDNA使用链接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)连接后，克隆到pCMV载体中，获得单克隆抗体3984-mab001-H的重组表达质粒。
将重组质粒转染HEK293F细胞。将HEK293F细胞培养上清液收集，经亲和纯化后进行检测。得到所述单克隆抗体3984-mab001-H。
实施例3.CAR-T细胞的检测试剂盒的组装
CAR-T细胞的检测试剂盒组装步骤如下：
(1)生物素标记的单克隆抗体(记为Bio-3984-mab001-H)的制备：
将实施例2得到的单克隆抗体3984-mab001-H采用标准生物素标记法进行标记，获得生物素标记单克隆抗体Bio-3984-mab001-H。溶解2～10mg单克隆抗体Bio-3984-mab001-H蛋白于1mL的磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；平衡生物素至室温，加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100μL超纯水中，加入一定浓度的生物素；室温30分钟，或冰上放置2小时；用30mL PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5mL或1mL于单独的管中，以280nm的吸收值测定单克隆抗体蛋白含量。
(2)试剂盒组装
将微孔滤膜板(例如96孔滤膜板)、生物素标记的单克隆抗体Bio-3984-mab001-H等组份按每个试剂盒数量装载瓶数放入试剂盒塑料支架，包装组装成试剂盒，将说明书放入试剂盒，贴好外标签和侧标签。
进一步的，试剂盒中依据需要组装入稀释液、洗涤液(20×)、封闭液、阴性对照(例如完全1640培养基)和阳性对照(FMC63 scfv重组蛋白或IgG)中的一种或多种。
试剂盒中，微孔滤膜板、生物素标记的单克隆抗体Bio-3984-mab001-H也可采用包被生物素标记单克隆抗体Bio-3984-mab001-H的微孔滤膜板替代。
包被生物素标记单克隆抗体Bio-3984-mab001-H的微孔滤膜板的制备方法：
①无菌打开96孔滤膜板，20μL/孔，35％乙醇，预湿PVDF膜，1min后用PBS清洗3次，250μL/孔，1min/次。
②96孔滤膜板中加入5μg/mL的生物素标记的单克隆抗体Bio-3984-mab001-H，100μL/孔，4℃过夜包被；
③弃包被液，使用含有灭菌PBS洗板3次，1min/次；
④加入含10％胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；
⑤弃封闭液，使用PBS洗板1次，37℃干燥2h，加干燥剂将96孔滤膜板一起放于密封袋中，抽真空密封，置4℃保存。
表1本发明所涉及试剂盒的组份
实施例3本发明单克隆抗体在检测anti-CD19 CAR表达的效果
1、实验材料：
1)对照组：商业化产品，购买于ACROBiosystems公司，型号为CD19-H8259对照组产品初始实验方式：复苏CAR-T细胞，加入100μl Biotinylated Human CD19,Fc Tag(5μg/ml)，室温孵育20分钟后，加入5μl PE anti-Biotin，室温避光孵育20分钟后，洗涤1次，流式细胞仪检测(CytoFlex)。
优化对照组产品后的实验方式：复苏CAR-T细胞，加入100μl Biotinylated HumanCD19,Fc Tag(10μg/ml)，4℃孵育1个小时后，加入5μl PE anti-Biotin，室温避光孵育20分钟后，洗涤3次，流式细胞仪检测(CytoFlex和Attune)。
2)实验组：本发明anti-CD19 scFv抗体组：复苏CAR-T细胞，加入本发明实施例3中得到的试剂盒中的生物素标记的单克隆抗体Bio-3984-mab001-H，染色20分钟，加入5μlPEanti-Biotin，室温避光孵育20分钟后，洗涤1次，流式细胞仪检测(CytoFlex和Attune)。所述各组均设置三组平行实验。
2、实验结果：
如图1中右图所示，汇总结果如表2所示，CD19抗原蛋白无法稳定检测到CD19 CAR-T细胞表面的anti-CD19 CAR表达(14.24±5.15％，RSD＝36.20％)，但是用本发明anti-CD19scFv抗体可以稳定的检测到anti-CD19 CAR表达(47.88±0.65％，RSD＝1.35％)，两者P＝0.004。
表2
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 华道（上海）生物医药有限公司
<120> CAR-T细胞的检测用单克隆抗体、试剂盒及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser
1 5
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Pro Tyr Asn Gly Gly
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Thr Tyr Asp Asn Tyr Glu Phe Ala Tyr
1 5
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Pro Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Thr Tyr Asp Asn Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 9
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Pro Thr Pro Leu Val His Pro His Leu Pro Ile Ser Ser Pro Arg
1 5 10 15
Val Ser Pro Phe Pro Pro Pro Ala Phe Gln Lys Ala Ser Ser Ile Val
20 25 30
Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe
35 40 45
Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln Ala Glu
50 55 60
Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys
65 70 75 80
Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly
85 90 95
Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro Gln Tyr
100 105 110
Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln
130 135 140
Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys Leu Met
145 150 155 160
Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser Lys Arg Glu
165 170 175
Lys Ala Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu
180 185 190
Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu
195 200 205
Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile Val Leu Gly
210 215 220
Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys
225 230 235 240
Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser Gln Ile
245 250 255
Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His Arg Phe
260 265 270
Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile
275
<210> 10
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
165 170 175
Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln
210 215 220
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Thr