一种特异性结合rankl靶向治疗药物的抗体及其应用
阅读说明：本技术 一种特异性结合rankl靶向治疗药物的抗体及其应用 (Antibody specifically binding RANKL targeted therapeutic drug and application thereof ) 是由 林长征 叶才果 何婉玲 谭淑洁 黄玉芳 王笑非 于 2020-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种特异性结合RANKL靶向治疗药物的抗体,所述抗体由2条相同的重链和2条相同的轻链组成,其中所述重链的可变区具有三个抗原决定簇区域,所述重链的可变区的抗原决定簇区域的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；所述轻链的可变区具有三个抗原决定簇区域,所述轻链的可变区的抗原决定簇区域的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列。本发明的抗体能够与地舒单抗特异性结合,并且各抗体之间不存在竞争关系,从而有效、准确地检测血清中地舒单抗的浓度。(The invention provides an antibody specifically binding to a RANKL targeted therapeutic drug, which consists of 2 identical heavy chains and 2 identical light chains, wherein the variable region of the heavy chain is provided with three epitope regions, and the amino acid sequence of the epitope region of the variable region of the heavy chain is selected from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO.7-SEQ ID NO. 15; the variable region of the light chain has three antigenic determinant regions, and the amino acid sequence of the antigenic determinant regions of the variable region of the light chain is selected from the amino acid sequences shown as SEQ ID NO.16-SEQ ID NO. 24. The antibody of the invention can be specifically combined with the disitumumab, and no competition relationship exists among the antibodies, so that the concentration of the disitumumab in serum can be effectively and accurately detected.)
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种特异性结合RANKL靶向治疗药物(如地舒单抗和/或其类似物)的抗体、抗体组合及其应用。
背景技术
地舒单抗(Denosumab)是美国安进公司生产的用于抗骨质疏松和抗骨癌转移的单克隆抗体，该抗体可以特异性结合核因子-κB受体活化因子配体(Receptor activator ofnuclear factor kappa-B ligand，RANKL)，从而阻断RANKL与其膜受体RANK的结合，阻断RANKL-RANK在破骨细胞中的信号转导活化信号。
双抗体夹心法是指将一对已知抗原的非竞争性抗体依次与抗原结合，该抗原可以是蛋白、多肽或抗体，使得形成“抗体-待检测抗原-抗体”的“夹心”状态。当加入酶偶联的底物后，发生显示反应/信号变化，通过读取吸光值/信号变化来反应被检测的蛋白的浓度，所以被称为双抗体夹心法。双抗体夹心法如果用ELISA方法进行，则称为ELISA双抗体夹心法。在临床检验中，双抗体夹心法通常用于检验各种蛋白质、抗体等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。这种双位点夹心法具有很高的特异性和敏感性，通常可以达到ng级水平；而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
发明内容
本发明的目的在于针对以上要解决的技术问题，提供一种能够与RANKL靶向治疗药物特异性结合、从而有效并准确检测血清中RANKL靶向治疗药物浓度的抗体。
为实现上述目的，本发明提供了一种特异性结合RANKL靶向治疗药物的抗体，所述抗体由2条相同的重链和2条相同的轻链组成，其中所述重链的可变区具有三个抗原决定簇区域，所述重链的可变区的抗原决定簇区域的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.15所示的氨基酸序列；所述轻链的可变区具有三个抗原决定簇区域，所述轻链的可变区的抗原决定簇区域的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列。
优选地，所述RANKL靶向治疗药物包括但不限于地舒单抗。
所述抗体优选是通过小鼠免疫方法得到的鼠源单克隆抗体。
优选地，所述重链的可变区的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述轻链的可变区的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
作为一种优选的实施方案，所述重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
作为一种优选的实施方案，所述重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为一种优选的实施方案，所述重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其含有所述抗体中的一种或多种。优选地，该试剂盒还包括洗涤液、显色液、RANKL靶向治疗药物标准品和终止液。
另一方面，本发明还提供了一种特异性结合RANKL靶向治疗药物的抗体组合，其包括第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体是所述抗体，并且第一抗体的重链和轻链的可变区的氨基酸序列不同于第二抗体的重链和轻链的可变区的氨基酸序列。
优选地，第一抗体由2条相同的重链和2条相同的轻链组成，第一抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，第一抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；第二抗体由2条相同的重链和2条相同的轻链组成，第二抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，第二抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。或者，优选地，第一抗体由2条相同的重链和2条相同的轻链组成，第一抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，第一抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；第二抗体由2条相同的重链和2条相同的轻链组成，第二抗体的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，第二抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其含有所述的抗体组合。优选第一抗体作为检测抗体，第二抗体作为包被抗体。
本发明还提供了编码所述抗体的核苷酸序列。
本发明还提供了包含所述核苷酸序列的载体。
本发明还提供了包含所述载体、用于表达所述抗体的宿主细胞。
另一方面，本发明还提供了所述抗体或抗体组合在制备用于特异性结合RANKL靶向治疗药物的分子诊断或治疗试剂中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种利用双抗体夹心法检测RANKL靶向治疗药物的方法，特别是检测血清中的RANKL靶向治疗药物的浓度的方法，其采用所述的抗体作为包被抗体和检测抗体。
优选地，根据所述方法，所述包被抗体是无标记抗体，且包被于固相载体。
优选地，根据所述方法，所述检测抗体被生物素标记。
优选地，根据所述方法，检测浓度的灵敏度为50ng/ml，检测上限为1280ng/ml。
本发明提供了能够与RANKL靶向治疗药物(例如地舒单抗)特异性结合的抗体，并用该抗体组合得到非竞争性的抗抗体，以构建双抗夹心法检测血清中RANKL靶向治疗药物的浓度，抗体之间不存在竞争活性。本发明在检测血清中RANKL靶向治疗药物的浓度时，采用2个抗体配对的方式，一个抗体成为捕获抗体(包被抗体)，另一个则被成为检测抗体，检测浓度的灵敏度达到50ng/ml或更低，检测上限为1280ng/ml或更高，这表明，本发明的抗体及抗体组合能够有效、准确地检测出血清中RANKL靶向治疗药物的浓度。
附图说明
图1是4D11与地舒单抗的结合曲线，示出了两者的结合力EC50常数。
图2是12A6与地舒单抗的结合曲线，示出了两者的结合力EC50常数。
图3是14A10与地舒单抗的结合曲线，示出了两者的结合力EC50常数。
图4是12A10包被板的标准曲线。
图5是4D11包被板的标准曲线。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。值得注意的是，出于简要清楚的目的，以下实施例中对一些常规的技术操作步骤、试剂、仪器并未进行细致的描述，但应理解，如未特别说明，这些常规技术操作步骤、试剂、仪器对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
本发明所述的“RANKL靶向治疗药物”是指以对RANKL具有靶向阻断作用的药物，包括但不限于单克隆抗体、含有单克隆抗体作为活性成分的药物制剂、融合蛋白、反义核苷酸、激酶抑制剂、化合物、中药提取物、中药复方提取物、或其组合。更优选地，所述RANKL靶向治疗药物包括但不限于地舒单抗。以下实施例以地舒单抗(Denosumab)为例进行说明，靶向结合地舒单抗的抗体可称为“抗地舒单抗”。
抗地舒单抗(靶向结合地舒单抗的抗体)的制备方法
将地舒单抗与弗氏完全佐剂(Freund's Adjuvant Complete，CFA)以1：1的体积比混合以制备免疫原，并按单克隆抗体制备方法对Balb/c小鼠进行第一次皮下注射免疫，按50μL每个注射点，300μL/鼠。14天后，将地舒单抗与不完全佐剂(Freund's AdjuvantInComplete，IFA)按1:1体积比混合以制备免疫原，并对Balb/c小鼠进行第二次皮下注射免疫，按50μL每个注射点，300μL/鼠。14天后，将地舒单抗与不完全佐剂IFA混合以制备免疫原，并对Balb/c小鼠进行第三次皮下注射免疫，按50μL每个注射点，300μL/鼠。共进行3次皮下免疫后，检测小鼠尾血滴度。
使用地舒单抗包被酶标板(1μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％(w/v)milk-PBS在室温封闭1h。然后使用PBS溶液洗板1次后，加入1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1243000的梯度稀释的小鼠尾血，室温反应1h。然后使用PBS溶液洗板3次，拍干后，加入1:2000(体积比)稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠Fc二抗，室温反应1h。PBS溶液洗板5次后，拍干，加入TMB(四甲基联苯胺)底物，避光、室温条件下反应20min；然后加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD450值。对小鼠尾血滴度均超过1:50000的小鼠进行脾细胞和SP2/0细胞融合以得到杂交瘤抗体。
对符合条件的小鼠颈椎脱臼法处死后，取脾细胞与SP2/0细胞融合并种植于15个96孔板中，在选择培养基中培养为单克隆细胞株后挑克隆，对挑取的克隆进行结合活性检测。使用地舒单抗包被酶标板(10μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应。使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1h；然后使用PBS溶液洗板1次。单克隆细胞上清与含10μg/ml人IgG的5％milk-PBS以1:1体积比混合，室温反应1h后加入孔中，室温反应1h。然后使用PBS溶液洗板3次，拍干后，加入1:2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠Fc二抗，室温反应1h。PBS溶液洗板5次后，拍干，加入TMB反应底物，避光，室温条件下反应20min；然后加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD450值。从15个96孔板共1410个克隆中初筛共保留48个OD≥2.0的阳性克隆。阳性克隆检测结果见表1。
表1：初筛阳性克隆检测结果
Clone#
14G6
1E10
13F2
15A3
13F8
6G3
14E8
14A9
15A10
15A2
14A4
13E4
OD(450nm)
2.937
2.935
2.868
2.866
2.837
2.831
2.828
2.804
2.804
2.758
2.758
2.751
Clone#
15E1
12A5
12A6
13F7
7B2
7E2
4C2
4D11
6H9
7B1
14A5
14A10
OD(450nm)
2.742
2.732
2.732
2.688
2.687
2.673
2.667
2.642
2.638
2.622
2.618
2.618
Clone#
15E3
3G6
12A9
12D5
12A8
4C3
7B10
15B5
4B7
4C1
7B4
4C4
OD(450nm)
2.590
2.557
2.554
2.547
2.538
2.537
2.519
2.501
2.499
2.482
2.478
2.477
Clone#
15D8
7B11
15C6
7B3
1D5
15C12
1D8
12F2
15F12
12D6
13F6
4F10
OD(450nm)
2.462
2.441
2.425
2.402
2.288
2.227
2.224
2.218
2.140
2.133
2.026
2.000
Clone#
NC
PC
OD(450nm)
0.053
2.536
注：NC为阴性对照，PC为阳性对照4#小鼠心脏血。
经检测，这些抗体都是IgG类抗体。
本发明的抗地舒单抗为鼠源完整抗体(IgG)，均包括两条相同重链和两条相同轻链。其中，重链的可变区和轻链的可变区均由3个抗原互补决定簇区域(CDR)和4个框架区(Framwork)构成。重链的可变区和轻链的可变区的抗原互补决定簇区域决定了抗体对抗原的结合特异性。重链的恒定区和轻链的恒定区的氨基酸序列通常不影响抗体对抗原的结合特异性。优选地，重链的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，轻链的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
本发明的抗地舒单抗的重链可变区的氨基酸序列可以是如SEQ ID NO.1所示，其中重链可变区的3个抗原互补决定簇区域的氨基酸序列如H_CDR1(SEQ ID NO.7)、H_CDR2(SEQ ID NO.8)、H_CDR2(SEQ ID NO.9)所示(也可以有多种不同的前后排列顺序)。或者，重链可变区的氨基酸序列可以是如SEQ ID NO.2所示，其中重链可变区的3个抗原互补决定簇区域的氨基酸序列如H_CDR4(SEQ ID NO.10)、H_CDR5(SEQ ID NO.11)、H_CDR6(SEQ IDNO.12)所示(也可以有多种不同的前后排列顺序)；或者，重链可变区的氨基酸序列可以是如SEQ ID NO.3所示，其中重链可变区的3个抗原互补决定簇区域的氨基酸序列如H_CDR7(SEQ ID NO.13)、H_CDR8(SEQ ID NO.14)、H_CDR9(SEQ ID NO.15)所示(也可以有多种不同的前后排列顺序)。
本发明的抗地舒单抗的轻链可变区的氨基酸序列可以是如SEQ ID NO.4所示，其中轻链可变区的3个抗原互补决定簇区域的氨基酸序列如L_CDR1(SEQ ID NO.16)、L_CDR2(SEQ ID NO.17)、L_CDR3(SEQ ID NO.18)所示(也可以有多种不同的前后排列顺序)；或者，轻链可变区的氨基酸序列可以是如SEQ ID NO.5所示，其中轻链可变区的3个抗原互补决定簇区域的氨基酸序列如L_CDR4(SEQ ID NO.19)、L_CDR5(SEQ ID NO.20)、L_CDR6(SEQ IDNO.21)所示(也可以有多种不同的前后排列顺序)；或者，轻链可变区的氨基酸序列可以是如SEQ ID NO.6所示，其中轻链可变区的3个抗原互补决定簇区域的氨基酸序列如L_CDR7(SEQ ID NO.22)、L_CDR8(SEQ ID NO.23)、L_CDR9(SEQ ID NO.24)所示(也可以有多种不同的前后排列顺序)。
以上任一重链可变区的氨基酸序列可以与任一轻链可变区的氨基酸序列进行组合，以构建成包含2个重链和2个轻链的抗体。例如，编号为4D11的抗体的每个重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1，每个轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4；编号为12A6的抗体的每个重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.2，每个轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO.5；编号为14A10的抗体的每个重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3，每个轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。下面以这三个抗体为例，说明其应用，但应理解，本发明所涉及的抗体不限于这三种具体实施例。
可通过商业机构或已知方法检测以上表1中的抗体氨基酸序列，并根据相应的氨基酸序列合成所期望得到的抗体。
实施例1：抗地舒单抗对地舒单抗的结合力检测
用ELISA的方法检测各抗地舒单抗抗体对地舒单抗的结合力。
首先将地舒单抗用pH9.0的碳酸钠缓冲液(CBS，pH9.0)稀释成5μg/ml，然后将5μg/ml地舒单抗溶液包被于酶标板，50μL/孔，并置于2-8度孵育过夜。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。每孔加入1％BSA，100μL/孔，于25℃孵育30min。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。设置BSA(牛血清白蛋白)为阴性对照，各抗地舒单抗(4D11、12A6、14A10)为待检验组并按照1000.00、333.33、111.11、37.04、12.35、4.12、1.37ng/ml浓度与酶标板包被的地舒单抗孵育，25度，1h。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。每孔加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的商品化抗鼠抗体(Jackson,#115-035-062)，100μL/孔，25度，1h。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。每孔加入50μL TMB显色液进行显色反应，孵育时间3-5min。显色达到预定终点后，加入反应终止液50μL。将96孔板用酶标仪检测450nm吸光值(OD450)。
各抗体与地舒单抗的结合曲线如图1-图3所示，分别示出了4D11、12A6、14A10与地舒单抗的结合力EC50常数。如图所示，本发明的抗地舒单抗4D11与地舒单抗的结合力EC50为6.07ng/ml，本发明的抗地舒单抗12A6与地舒单抗的结合力EC50为4.23ng/ml，本发明的抗地舒单抗14A10与地舒单抗的结合力EC50为7.87ng/ml。
实施例2：抗地舒单抗14A10和12A6检测血清中地舒单抗浓度
此实施例采用标准曲线法检测质控样品的浓度，计算标准品和质控品的标准差和回收率。
将地舒单抗按照1280、960、640、480、320、180、90和50ng/ml配制标准品，将地舒单抗按照960、720、360、200和90ng/ml配制质控品，溶剂均为10％v/v小牛血清。将上述标准品和质控品按照3复孔的设计加入到12A6抗体包被的酶标板中，于25℃孵育1h。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。然后加入生物素标记的14A10抗体，100μL/孔，于25℃孵育1h。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。然后加链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)底物，100μL/孔，于25℃孵育1h。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。每孔加入50μLTMB显色液进行显色反应，孵育时间3-5min。显色达到预定终点后，加入反应终止液50μL。将96孔板用酶标仪检测450nm吸光值(OD450)。图4示出了12A6包被板的标准曲线。
用标准品进行标准曲线的定标后，用得出的标准曲线和各参数，对各标曲品的理论值进行回算分析，回算分析结果和回收率见表2。表2中，SD指标准差，CV指变异系数(coefficient of variation)。
表2：根据拟合的标准曲线计算各标准品样品的浓度和回收率
用得出的标准曲线和各参数，对各质控品的浓度进行计算和回算分析，分析结果和回收率情况见表3。
表3：根据拟合的标准曲线计算各质控样品的浓度和回收率
实施例3：抗地舒单抗14A10和4D11检测血清中地舒单抗浓度
此实施例采用标准曲线法检测质控样品的浓度，计算标准品和质控品的标准差和回收率。
将地舒单抗按照1280、960、640、480、320、180、90和50ng/ml配制标准品，将地舒单抗按照960、720、360、200和90ng/ml配制质控样品，溶剂均为10％(v/v)小牛血清。将上述标准品和质控品按照3复孔的设计加入到4D11抗体包被的酶标板中，于25℃孵育1h。孵育完成后，用PBST(磷酸盐缓冲液(PBS)+Tween-20)洗板4次，300μL/孔。然后加入生物素标记的14A10抗体，100μL/孔，于25℃孵育1h。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。然后加SA-HRP底物，100μL/孔，于25℃孵育1h。孵育完成后，用PBST洗板4次，300μL/孔。每孔加入50μLTMB显色液进行显色反应，孵育时间3-5min。显色达到预定终点后，加入反应终止液50μL。将96孔板用酶标仪检测450nm吸光值(OD450)。图5示出了4D11包被板的标准曲线。
用标准品进行标准曲线的定标后，用得出的标准曲线和各参数，对各标曲品的理论值进行回算分析，回算分析结果和回收率见表4。
表4：根据拟合的标准曲线计算各标准品样品的浓度和回收率
用得出的标准曲线和各参数，对各质控品的浓度进行计算和回算分析，分析结果和回收率情况见表5。
表5：根据拟合的标准曲线计算各质控样品的浓度和回收率
由以上实验数据可见，抗地舒单抗14A10和12A6组合、14A10和4D11组合能够有效、准确地检测地舒单抗在血清中的浓度。
以上实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 佛山安普泽生物医药股份有限公司
<120> 一种特异性结合RANKL靶向治疗药物的抗体及其应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Val Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Pro Glu Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Gly Gly Tyr Asp Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Tyr Tyr Asp Ser Asp Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gln Leu Cys Arg Trp
1 5 10 15
Arg Glu Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr Leu
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Asn Pro Gly Ser Gly Val Thr
1 5
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Arg Leu Gly Gly Gly Tyr Asp Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ile Asn Pro Asn Asn Gly Tyr Thr
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Leu Tyr Tyr Asp Ser Asp Gly Glu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Tyr Ala Ser
1
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Arg Thr
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe
1 5 10
<210> 20
<211> 3
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Trp Ala Ser
1
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Leu Thr
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Tyr Thr Ser
1
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 25
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ser Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys
1 5 10 15
Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr
35 40 45
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
50 55 60
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
65 70 75 80
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser
85 90 95
Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
100 105 110
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro
130 135 140
Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu
145 150 155 160
Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn
165 170 175
Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys
195 200 205
Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu
210 215 220
Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Leu Asp
225 230 235 240
Leu Asp Asp Ile Cys Ala
245
<210> 26
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
20 25 30
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
35 40 45
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
65 70 75 80
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
85 90 95
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100
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