阅读说明：本技术 预防病毒性传染病的活疫苗 (Live vaccine for preventing viral infectious diseases ) 是由 陈继明 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域。它公布了一类用于预防病毒性传染病的活疫苗。这类活疫苗特征在于：所述的活疫苗含有活病毒,所述的疫苗中的活病毒,与所述疫苗所防控的病毒比较,既可以是相同的而具有相同的致病能力,也可以高度相似但有所不同而具有较弱的致病能力；所述疫苗与能够抑制疫苗中活病毒增殖的药物联合使用,使疫苗中的活病毒进入人或动物体内后,无法有效增殖,从而使所述疫苗不导致疾病。此类疫苗具有疫苗种毒制备容易、疫苗生产成本低、疫苗安全性好、疫苗免疫效果好等优点。这类疫苗能够用于多种病毒性传染病的预防。(The invention belongs to the technical field of biological medicines. It discloses a kind of live vaccine for preventing viral infectious diseases. Such live vaccines are characterized by: the live vaccine contains live virus, and the live virus in the vaccine can be the same and have the same pathogenic capability or can be highly similar and different and have weaker pathogenic capability compared with the virus controlled by the vaccine; the vaccine is used in combination with a medicament capable of inhibiting the proliferation of live viruses in the vaccine, so that the live viruses in the vaccine cannot be effectively proliferated after entering a human or animal body, and the vaccine does not cause diseases. The vaccine has the advantages of easy preparation of vaccine seed virus, low vaccine production cost, good vaccine safety, good vaccine immunization effect and the like. Such vaccines can be used for the prevention of a variety of viral infectious diseases.)

预防病毒性传染病的活疫苗

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及预防病毒性传染病的活疫苗研制、生产和应用，能够用于流感等多种病毒性传染病的预防。

背景技术

病毒性传染病严重危害人和多种动物的健康与生命安全。疫苗是预防病毒性传染病重要物质。现今已经批准使用或正在研究的病毒性传染病疫苗有多种类别，包括全病毒灭活疫苗、全病毒活疫苗、基因工程制备的病毒蛋白质疫苗、工业合成的病毒蛋白质多肽疫苗、编码病毒蛋白质的DNA疫苗、编码病毒蛋白质的RNA疫苗等。其中，全病毒活疫苗用于预防人的脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、黄热病、日本脑炎、狂犬病、水痘、轮状病毒引起的腹泻、腺病毒引起的呼吸系统疾病，也用于预防猪瘟、鸡新城疫等动物病毒性传染病。

全病毒活疫苗存在安全风险。为了控制这种风险，通常采取以下三种策略之一。

第一，用致病能力下降的病毒(通常称之为“弱毒”)来制备全病毒活疫苗，这类疫苗称为“弱毒活疫苗”。绝大多数全病毒活疫苗都是用弱毒活疫苗。例如，通过在兔体内反复传代，使猪瘟病毒致病能力下降，然后再用这个致病能力下降的猪瘟病毒制作全病毒活疫苗，用该疫苗接种猪后，猪既不发病，又能产生较强的免疫力。弱毒活疫苗具有疫苗种毒制备困难、疫苗中的活病毒存在致病能力返强的风险、不适合于接种免疫缺陷的人等缺点。

第二，用致病能力较强的活病毒制备全病毒活疫苗，在制备过程中，将这些活病毒与同源的特异性抗体结合成免疫复合物。这类活疫苗称为“免疫复合物活疫苗”。举例说明“同源的”的含义：如果此疫苗给人使用，则人的抗体是同源的，而马的抗体是异源的。因为疫苗中的活病毒被特异性抗体中和了，从而使这些活病毒不再具有致病能力，因而用这种活疫苗接种人或动物，人或动物不发病，因而这类疫苗是安全的。这种全病毒能产生较强的免疫力，其部分原因是因为活病毒与同源的抗体结合后，抗体的Fc端暴露出来，能够与一些免疫细胞的Fc受体结合，引发这些免疫细胞产生一系列的免疫反应，从而产生免疫保护力。免疫复合物活疫苗在鸡传染性法氏囊病防控上，有持续多年的商业应用。它还曾经在1930年代用于美洲和英国的黄热病的预防，但总体上这类疫苗应用较少，其原因是需要制备大量的难以制备的同源的特异性抗体。

第三，用致病能力较强的活病毒制备全病毒活疫苗，这类疫苗中的活病毒进入宿主体内的途径或部位，与自然感染时病毒进入宿主体内的途径或部位是不一样的，从而避免自然感染而导致的疾病。这类活疫苗称为“异位接种的活疫苗”。例如，腺病毒引起呼吸系统疾病，是因为自然感染的腺病毒是从呼吸道进入人体的，经过呼吸道感染后，宿主免疫系统与腺病毒在娇嫩而免疫力弱的肺部发生斗争，导致肺炎(人与动物因为肺炎而容易发生呼吸困难，甚至死亡)；把活的腺病毒装入肠溶胶囊，让接种者口服这种肠溶胶囊，则活的腺病毒将在接种者肠道内释放，并感染免疫力强大的肠道组织，避开了娇嫩的肺，从而使接种者不发生肺炎等严重病变，又能产生良好的免疫力。这种活的腺病毒异位接种的活疫苗在美国新兵群体中使用了数十年，显示出很强的安全性和很高的免疫保护作用。这类疫苗是否适合于预防其他病毒性传染病，还不清楚。

发明内容

本发明公布一类用于预防病毒性传染病的活疫苗，所述的活疫苗能够克服上述三类活疫苗的缺点，具有疫苗种毒制备快速、不担心疫苗病毒致病能力返强、不需要制备大量的同源的特异性抗体、适合于多种传染病等优点。到目前为止，用这个新的安全策略制备全病毒活疫苗，未见报道。

本发明公布一类用于预防病毒性传染病的活疫苗，所述的活疫苗含有活病毒，所述的活疫苗中的活病毒，与所述的活疫苗所防控的病毒比较，既可以是相同的而具有相同的致病能力，也可以是高度相似但有所改变而具有较弱的致病能力，并且所述的活疫苗与能够抑制疫苗中活病毒增殖的药物联合使用，联合使用所述药物的方法为人或动物在接种所述的活疫苗之前或之后24小时内，通过口服、注射等途径，使能够抑制疫苗中活病毒增殖的药物进入人或动物的体内，并且所述药物不包括抗体。

进一步的，所述的活疫苗中所含的病毒为冠状病毒，并且与疫苗联合使用的某种能够抑制冠状病毒在人或动物体内增殖的药物包括磷酸氯喹、瑞德西韦。

进一步的，所述的活疫苗所含的病毒为流感病毒，并且与疫苗联合使用的某种能够抑制流感病毒在人或动物体内增殖的药物包括奥司他韦、扎拉米韦、帕拉米韦、金刚烷胺。

进一步的，所述的活疫苗所含的病毒为副黏病毒，并且与疫苗联合使用的某种能够抑制副黏病毒在人或动物体内增殖的药物包括一种代号为RK-33的核苷酸类似化合物RK-33，其英文名为diimidazo[4,5-d:4′,5′-f]-[1,3]diazepine。

进一步的，所述的活疫苗是通过肌肉内注射接种、皮内注射接种、皮下注射接种或静脉注射接种的疫苗，并且是预防冠状病毒、流感病毒、副黏病毒、腺病毒等病毒引起的以呼吸系统症状为主的传染病的疫苗。

针对不同的病毒性传染病，本发明所述的活疫苗的制备方法有所不同，但都包括以下步骤。第一，选择合适的病毒，作为疫苗种子病毒。第二，利用疫苗种子病毒，在细胞、鸡胚或动物体内，增殖病毒，分装成疫苗祖代种子病毒；再取出一支疫苗祖代种子病毒，在细胞、鸡胚或动物体内，进行增殖，分装成疫苗父代种子病毒。第三，利用疫苗父代种子病毒，进行活疫苗的生产和分装；第一批疫苗父代种子病毒用完后，再取出一支疫苗祖代种子病毒，在细胞、鸡胚或动物体内，进行增殖，分装成疫苗父代种子病毒。第四，购置或生产抗病毒药物，进行纯化、检定、分装，作为与疫苗联合使用的抗病毒药物。第五，将分装的活疫苗和分装的抗病毒药物，组合包装成本发明所述的活疫苗，随机抽取部分样品，验证其活病毒含量、安全性、有效性。上述步骤中，抗病毒药物可以与增殖的病毒进行混合，也可以不混合。在抗病毒药物与活病毒进行混合的情况下，抗病毒药物可以先与增殖的病毒进行混合，然后再进行纯化，也可以先纯化病毒，然后再与增殖的病毒进行混合。

本发明所述的活疫苗所联合使用的抗病毒药物包括一些化合物，如抗流感病毒的奥司他韦，但不能是具有抗病毒作用的同源的抗体或康复者血浆或血清，否则就等同于前面所述的已经面世的免疫复合物活疫苗。需要说明的是，针对不同的病毒性传染病，本发明所述的活疫苗所用的抗病毒药物是不同的。例如，预防流感的本发明所述的活疫苗可以使用奥司他韦作为联合使用的抗病毒药物(因为奥司他韦能够抑制流感病毒的增殖)，但是预防新型冠状病毒病的本发明所述的活疫苗就不能使用奥司他韦作为联合使用的抗病毒药物(因为奥司他韦不能抑制新型冠状病毒的增殖)，但是可以用瑞德西韦作为联合使用的抗病毒药物(因为瑞德西韦能够抑制新型冠状病毒的增殖)。

本发明在新颖性、创造性和实用性方面，说明如下。本发明所述的活疫苗采取了一种新的安全策略，即通过抗病毒药物来抑制活病毒在体内的增殖，从而避免活病毒在体内增殖导致的一系列病理变化。这一策略在既往的文献中未见报道。本发明所述的活疫苗依据这一新策略，可以直接用宿主体内分离到的有致病作用的病毒，制备活疫苗，从而避免了弱毒活疫苗具有疫苗种毒制备困难的缺点，也避免疫苗中的活病毒存在致病能力返强的风险(因为本发明所述的活疫苗可以用的致病能力强的病毒作为疫苗种毒)，也避免了既往活疫苗不适合于接种免疫缺陷的人的缺点(因为在抗病毒药物作用下，用致病能力强的病毒接种免疫缺陷的人，这些病毒在这些人的体内也难以增殖，因而也不致病)。另外，与免疫复合物活疫苗相比，本发明所述的活疫苗无需制备大量的难以制备的同源的特异性抗体；与异位接种的活疫苗相比，本发明所述的活疫苗具有一定的普适性，只要人们研究出高效抑制某种病毒在宿主体内复制的药物，那么就大概率上能够用本发明所述的活疫苗预防这种病毒引起的传染病。过去，抗病毒药物比较少，因而研制本发明所述的活疫苗比较困难；现在和将来，高效抗病毒药物越来越多，研制和生产本发明所述的活疫苗的难度将显著下降。本发明所述的活疫苗包括既往活疫苗制备步骤，又新增了配置抗病毒药物和联合使用抗病毒药物的步骤；所述的活疫苗所包括的既往活疫苗制备步骤和各个细节，都可以与既往活疫苗制备保持一致。

本发明所述的活疫苗不排斥同时采用既往活疫苗的安全机制，即：本发明所述的活疫苗所用的活病毒也可以是致病能力下降的活病毒，也可以采用异位接种方法，增加本发明所述的活疫苗的安全性。本发明所述的活疫苗如果采取既往活疫苗的安全机制，也必须同时采用抗病毒药物抑制病毒增殖这个安全机制。

在有效性方面，本发明所述的活疫苗含有完好的病毒颗粒，含有相应的致病病毒所有的或者绝大多数的T细胞表位和B细胞表位，它所含有的活病毒有时还能在接种者体内少量增殖，因而能够刺激机体产生较强甚至很强的免疫保护反应。

具体实施方式

实施例1

实施例1阐述了预防流感病毒的一种活疫苗的制备方法与使用方法。实施例1是说明本发明的具体应用方式。该实施例不是用于限定本发明的应用范围和本发明专利的保护范围。

实施例1所述的活疫苗的制备包括以下五个步骤。第一，按照传统的流感病毒灭活疫苗制备方法，选择疫苗种毒，简言之：采集一批新近感染的流感患者的咽喉拭子，从中分离流感病毒，分离的病毒用鸡胚(9至10日龄，下同)传代，选择鸡胚传代时病毒浓度较高、并且基因组序列与主要流行毒株的基因组序列高度相似的分离株，在MDCK细胞上进行噬斑克隆纯化，作为疫苗种子病毒；第二，用疫苗种子病毒接种大量的鸡胚，制备祖代种子病毒，分装成十万支，每支含有的活病毒数量至少为1千万个半数鸡胚感染剂量，置于负80摄氏度下保存；取出一支保存的疫苗祖代种子病毒，接种大量的鸡胚，制备疫苗父代种子病毒，分装成十万支，每支含有的活病毒数量至少为1千万个半数鸡胚感染剂量；第三，取出一支疫苗父代种子病毒，接种大量的鸡胚，增殖病毒，收获含有大量病毒的鸡胚尿囊液，进行混合，测定混合的尿囊液中病毒含量(用血凝试验进行检测)，然后与传统流感病毒灭活疫苗制备过程不同，不对病毒进行灭活，直接对病毒进行纯化、浓缩、冻干、定量、分装入瓶，每瓶疫苗含有活病毒的数量为1千万个半数鸡胚感染量；第四，购置抗流感病毒药物奥司他韦原料药，对其进行纯化、检定、定量，再制备成片剂，每片含有200毫克奥司他韦；第五，将分装入瓶的疫苗病毒与分装成片剂的奥司他韦，组合包装成疫苗，每份疫苗含有1瓶活病毒和1片奥司他韦。本发明所述的活疫苗是在医生监督和操作下使用的，包括三个步骤：第一步，由被接种者或其法律监护人签署知情同意书，签署后的知情同意书由医生收回保存；第二步，在医生现场监督下，被接种者每人口服疫苗包装中配置的1片奥司他韦；第三步，由医生给被接种者的肌肉内注射用1毫升纯水溶解的疫苗包装中配置的一瓶活病毒。

试验上，按照实施例1方法，用H5N6亚型高致病性禽流感病毒一个从野鸟中分离的禽流感病毒A/wild bird/China/JMYY/2019(H5N6)作为疫苗毒株，制备成活疫苗，用该疫苗在5组6周龄SPF级别BALB/c雄性小鼠上进行试验。这5组编号分别为A组、B组、C组、D组、E组，每组10只小鼠。A组鼻腔内滴液接种疫苗中的活病毒(每只接种1千万个半数鸡胚感染量的病毒)，同时口腔内灌注生理盐水(每只0.1毫升)；B组鼻腔内滴液接种疫苗中的活病毒(每只接种1千万个半数鸡胚感染量的病毒)，同时口腔内灌注奥司他韦(每只0.1毫升含1毫克奥司他韦)；C组肌肉内注射接种疫苗中的活病毒(每只接种1千万个半数鸡胚感染量的病毒)，同时口腔内灌注生理盐水(每只0.1毫升)；D组肌肉内注射接种疫苗中的活病毒(每只接种1千万个半数鸡胚感染量的病毒)，同时口腔内灌注奥司他韦(每只0.1毫升含1毫克奥司他韦)；E组为空白对照，鼻腔内或肌肉内不接种病毒，口腔内不灌注奥司他韦。各组小鼠接种后饲养30日，观察这个期间小鼠的死亡率；在首次接种病毒后的第31天，对B组至E组小鼠每只存活的小鼠，再用疫苗中的活病毒进行鼻腔内滴液接种，每只接种十亿个半数鸡胚感染量的病毒，进行攻毒保护试验。各组小鼠攻毒后饲养30日，观察这个期间小鼠的死亡率。整个试验的结果如表1所示。

表1.5组小鼠接种活病毒和攻毒之后的死亡率

组	接种与给药	接种后死亡率	存活小鼠攻毒后死亡率
				A	鼻腔内接种，没给药	70％(＝7/10)	存活的小鼠已处死剖检
B	鼻腔内接种，给药	30％(＝3/10)	0％(＝0/3)
				C	肌肉内接种，没给药	10％(＝1/10)	0％(＝9/9)
D	肌肉内接种，给药	0％(＝0/10)	0％(＝10/10)
				E	没接种病毒，没给药	0％(＝0/10)	100％(＝10/10)

表1显示A组的小鼠，没灌注奥司他韦，鼻腔内接种所述活病毒之后，死亡率高达70％。肉眼观察这组小鼠存在体重下降、体毛变乱、不爱运动，部分小鼠弓背、打喷嚏、呼吸有啰音，剖检发现死亡小鼠和存活的3只小鼠，发现它们全部患有严重的肺炎(肺部体积增大5倍以上，肺颜色变为红色、酱红色或灰黑色，有出血斑点或斑块、坏死斑点或斑块)，未见其他脏器发生明显病变，用流感病毒荧光定量RT-PCR方法，从死亡小鼠的肺部检出流感病毒。这些数据说明这组小鼠发生了流感病毒引起的病毒性肺炎，与相关文献报道是一致的。B组小鼠也是鼻腔内接种所述活病毒，但是灌注了奥司他韦，结果死亡率与A组比较，显著减少，从70％减少到30％，提示灌注了抑制流感病毒在体内复制增殖的奥司他韦，部分抑制了接种的流感病毒的致病作用。C组没灌注奥司他韦，肌肉内接种所述活病毒之后，死亡率为10％，显著低于A组。推测这是因为肌肉内接种活病毒，避开了娇嫩的肺部，并且让活病毒都在较短时间内与小鼠全身的免疫力量(而不是呼吸道局部的免疫力量)进行斗争，从而有利于小鼠的免疫力量战胜接种的活病毒。D组灌注奥司他韦，肌肉内接种所述活病毒之后，死亡率为0％。这推测是因为灌注的抑制流感病毒在体内复制增殖的奥司他韦能够帮助小鼠免疫系统战胜接种的流感病毒，从而使D组小鼠的死亡率比C组更低，并且为零，支持本发明所述的活疫苗具有很高的安全性。这些小鼠首次接种后的第31天，再用大剂量的同一病毒通过鼻腔滴液接种，攻击上述各组存活的小鼠(A)，结果在攻毒后30天内，空白对照E组的小鼠全部死亡，而其他组存活的小鼠(包括D组)全部存活。这说明攻毒之前E组存活的小鼠对于所述病毒，没有特异性免疫保护力，而其他组存活的小鼠(包括D组)全部产生了免疫保护作用，这支持本发明申请书所述的活疫苗具有很高的有效性。总之，所述小鼠动物实验支持本发明所述的活疫苗具有很高的安全性和很高的有效性。

实施例2

实施例2阐述了鸽新城疫活疫苗的制备方法与使用方法。实施例2是说明本发明的具体应用方式。该实施例不是用于限定本发明的应用范围和本发明专利的保护范围。

实施例2所述的活疫苗的制备包括以下五个步骤。第一，购置抗副黏病毒药物RK-33(其英文名为diimidazo[4,5-d:4′,5′-f]-[1,3]diazepine)，用二甲亚砜溶解RK-33至55mM后，置于负20摄氏度备用；第二，采集一批新近感染新城疫病毒的鸽子的咽拭子，从中分离新城疫病毒，分离的病毒用鸡胚(9至10日龄，下同)传代，选择鸡胚传代时病毒浓度较高、并且基因组序列与主要流行毒株的基因组序列高度相似的、并且没有混合其他已知的鸽子病毒的分离毒株Pigeon/sd007/2019，作为疫苗种子病毒；第三，用疫苗种子病毒接种鸡胚，制备祖代种子病毒，分装成100支，每支含有的活病毒数量至少为1百万个半数鸡胚感染剂量，置于负80摄氏度下保存；取出一支保存的疫苗祖代种子病毒，接种鸡胚，制备疫苗父代种子病毒，分装成100支，每支含有的活病毒数量至少为1百万个半数鸡胚感染剂量；第四，取出一支疫苗父代种子病毒，接种鸡胚来增殖病毒，收获鸡胚尿囊液，进行混合，测定混合的尿囊液中病毒含量为每毫升含有120万个半数鸡胚感染量；第五，用pH值为7.2的PBS和保存的RK-33溶液，稀释混合的尿囊液，稀释到每毫升含有1000个半数鸡胚感染量和5微摩尔RK-33，再分装成本实施例的活疫苗，每瓶疫苗100毫升，用于鸽子的肌肉内注射接种，每只鸽子注射0.2毫升。

如表2所示，用30只来源相同的、外观健康的、没有接种过新城疫疫苗的3周龄鸽子，测试本实施例的活疫苗的安全性和有效性。这30只鸽子随机分成3组，每组10只。第0天，A组鸽子肌肉内注射0.2毫升本实施例的活疫苗(每毫升含有1000个半数鸡胚感染量的病毒)，B组鸽子肌肉内注射0.2毫升与本实施例的活疫苗制备方法和疫苗病毒都一致的、但是不含RK-33的活疫苗(每毫升含有1000个半数鸡胚感染量的病毒)，C鸽子肌肉内注射0.2毫升生理盐水(没有病毒)。接种后观察30日，期间A组和C组所有鸽子都外观正常，B组10只鸽子在接种后15日内全部死亡。第31天，对A组和C组所有鸽子，每只都鼻腔接种1万个半数鸡胚感染量的同一病毒，再观察30日，A组所有鸽子都外观正常，而C组10只鸽子在接种后15日内全部死亡。这些数据说明含有RK-33药物的实施例2活疫苗肌肉内接种鸽子是安全的，没有导致临床症状和死亡，又能使鸽子产生很强特异性免疫保护作用，能够抵抗具有致病作用的病毒的攻击。

表2.3组鸽子接种活疫苗和攻毒之后的死亡率

组	接种与给药	接种后死亡率	存活小鼠攻毒后死亡率
				A	肌肉内接种有RK-33的活疫苗	0％(＝0/10)	0％(＝0/10)
B	肌肉内接种无RK-33的活疫苗	100％(＝10/10)
				C	没接种活疫苗	0％(＝0/10)	100％(＝10/10)