阅读说明：本技术 一种原花色素多聚体的制备方法及原花色素多聚体 (Preparation method of proanthocyanidin polymer and proanthocyanidin polymer ) 是由 杨海花 姜坤 叶焕峰 武永杰 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种原花色素多聚体的制备方法,所述方法包括准备原料,所述原料为杨梅叶或葡萄籽；对原料进行预处理得到原料粉；将原料粉与丙酮水溶液混合得到混合溶液,然后向混合溶液中加入抗坏血酸,避光间歇震荡提取得到混合料液；对得到的混合料液进行抽滤得到滤液,将滤液与三氯甲烷混合收集上层液体；在收集到的上层液体中加入氯化钠,离心收集粗沉淀；对粗沉淀进行水洗,后经过冷冻干燥得到原花色素多聚体。本发明制备工艺简单,工艺条件温和,多聚体得率高且聚合度较高,制备得到的原花色素多聚体可用于原花色素结构及生物活性分析和应用,也可用于制备原花色素低聚体或金属螯合剂等。(The invention discloses a preparation method of proanthocyanidin polymer, which comprises the steps of preparing raw materials, wherein the raw materials are waxberry leaves or grape seeds; pretreating the raw materials to obtain raw material powder; mixing the raw material powder with an acetone aqueous solution to obtain a mixed solution, adding ascorbic acid into the mixed solution, and carrying out intermittent shaking extraction in a dark place to obtain a mixed material liquid; carrying out suction filtration on the obtained mixed feed liquid to obtain filtrate, mixing the filtrate with trichloromethane, and collecting upper-layer liquid; adding sodium chloride into the collected upper layer liquid, and centrifuging to collect a coarse precipitate; and washing the crude precipitate with water, and freeze-drying to obtain the proanthocyanidin polymer. The preparation method has the advantages of simple preparation process, mild process conditions, high polymer yield and higher polymerization degree, and the prepared proanthocyanidin polymer can be used for analyzing and applying the structure and the biological activity of proanthocyanidin and can also be used for preparing proanthocyanidin oligomer or metal chelating agent and the like.)

一种原花色素多聚体的制备方法及原花色素多聚体

技术领域

本发明属于天然产物制备技术领域，涉及食品植物化学组分，具体涉及一种原花色素多聚体的制备方法及原花色素多聚体。

背景技术

原花色素是除木质素以外，植物界多酚物质最丰富的表现形式，也是人类膳食中的最丰富充足的类黄酮物质，其在植物中大量存在，主要存在于植物表皮、果皮、种子等处。

杨梅果实和葡萄都具有极高的附加价值，其在中国的经济栽培已有多年历史且产业化已经相对成熟。然而，相比于杨梅果实和葡萄果肉，杨梅叶与葡萄籽的利用度极低，经研究发现杨梅叶原花色素含量非常高，其结构主要为原飞燕草素，葡萄籽也含有大量的原花色素，主要为聚合度不同的原花青素。原花色素多聚体一般是指聚合度≥5的原花色素，即结构中含有5个及5个以上的黄烷-3-醇单体，聚合度在2-4的即为低聚体。现在有关原花色素的研究大多还是以低聚体为研究对象，虽然多聚体在植物中的含量可观，但是仍未得到足够的关注和深入的研究，主要是因为原花色素多聚体的分子量太大，不能通过上皮细胞，从而不能为机体直接吸收利用发挥活性作用，再者多聚体结构极其复杂，分析难度大。

目前常见的原花色素制备方法主要有溶剂浸提法、微波辅助提取法以及超临界流体提取法等。溶剂浸提法的提取效率低且费时；微波辅助提取法处理能力有限，不适合大规模提取，同时长时间的提取可能会对原花色素结构造成一定的破坏。超临界CO₂萃取法操作复杂，成本高昂，同时还需要加入夹带剂一起使用。最重要的是这些制备方法主要是用于提取制备原花色素低聚体而非多聚体。相对原花色素低聚体而言，植物中存在着更大量的多聚体，为了使多聚体得到深入研究和开发利用，发明一种原花色素多聚体得率高的简便提取制备方法非常必要。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的是提供一种原花色素多聚体的制备方法及原花色素多聚体，以解决现有方法中存在的缺少原花色素多聚体制备方法的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：

一种原花色素多聚体的制备方法，包括以下步骤：

S1，准备原料，所述原料为杨梅叶或葡萄籽；

S2，对原料进行预处理得到原料粉；

S3，将原料粉与丙酮水溶液混合得到混合溶液，然后向混合溶液中加入抗坏血酸，避光间歇震荡提取得到混合料液；

S4，对得到的混合料液进行抽滤得到滤液，将滤液与三氯甲烷混合收集上层液体；

S5，在收集到的上层液体中加入氯化钠，离心收集粗沉淀；

S6，对粗沉淀进行水洗，后经过冷冻干燥得到原花色素多聚体。

具体的，所述原料为杨梅叶时，杨梅叶粉与丙酮水溶液的重量体积比为：1:40～45(g/mL)。

具体的，所述原料为葡萄籽时，葡萄籽粉与丙酮水溶液的重量体积比为：1:10～20(g/mL)。

具体的，步骤S2中所述的预处理包括将原料在25～40℃下烘干8～14h，然后研磨粉碎过40～80目筛。

具体的，步骤S3中所述的丙酮水溶液的浓度为50～80％(v/v)。

具体的，步骤S3中所述的抗坏血酸的浓度为0.1％～1％(w/v)。

具体的，步骤S4中所述的滤液与三氯甲烷的体积比为1:1～2。

本发明还公开了上述制备方法制得的杨梅叶原花色素多聚体，所述杨梅叶原花色素多聚体的平均聚合度为24～31。

本发明还公开了上述制备方法制得的葡萄籽原花色素多聚体，所述葡萄籽原花色素多聚体的平均聚合度为6.2～7.3。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

与传统的制备方法相比，本发明可用于制备不同品种植物的原花色素多聚体，制备工艺简单，工艺条件温和，多聚体得率高，所得多聚体聚合度较高，可批量生产。

附图说明

图1为实施例1制备得到的杨梅叶原花色素多聚体酸降解物HPLC图；其中，EGCG-ph为表棓儿茶素棓酸酯间苯三酚的加成产物。

图2为实施例2制备得到的葡萄籽原花色素多聚体酸降解物HPLC图；其中，C-ph，EC-ph，CG-ph分别是儿茶素间苯三酚加成物、表儿茶素间苯三酚加成物、儿茶素棓酸酯间苯三酚加成物。

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

如无特殊说明，下述实施例中所使用的材料、试剂等均为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

步骤S1，准备杨梅叶(荸荠种)原料；

步骤S2，将杨梅叶置于25～40℃的烘箱内烘干12h，取出后用粉碎机打碎至过60～80目筛，然后将杨梅叶粉末在-20℃冰箱中冷冻保存。

步骤S3，称取10g杨梅叶粉加入装有400mL 70％丙酮水溶液的棕色丝口瓶中得到混合溶液，向得到的混合溶液中加入0.4g抗坏血酸以防止提取过程中发生氧化，将所得料液摇匀并封口，于室温下避光间歇震荡棕色丝口瓶以提取原花色素多聚体，震荡提取时间为12h。

步骤S4，对得到的混合料液进行抽滤得到滤液，将滤液与400mL的分析纯三氯甲烷1:1等体积萃取，摇匀静置分层后，放出下方有机相，收集上层液体。

步骤5，在收集到的上层液体中加入过量氯化钠，不停搅拌直至溶液中出现片状漂浮物，棕色丝口瓶的瓶壁上析出原花色素多聚体粗沉淀。加入过量氯化钠的目的是为了使原花色素多聚体在水中的溶解度降低而析出。

步骤6，将得到的原花色素多聚体粗沉淀加入0℃的水中进行冷水水洗除盐，经除盐后得到沉淀物在15～40℃的水中溶解，对得到的液体进行低温冷冻干燥处理，得原花色素多聚体。在本实施例中，作为优选方案，进行冷水水洗除盐的冷水的温度为0℃。

称量发现，最终得到杨梅叶原花色素多聚体为0.596g，得率为5.96％。

对提取得到的原花色素多聚体采用间苯三酚-硫酸法进行酸降解：称取5mg通过本发明方法制备得到的多聚原花色素，将其溶解在1mL新制备的含有0.2moL/L的HCL、50g/L的间苯三酚和10g/L的抗坏血酸的甲醇溶液中。混匀后置于60℃恒温水浴锅中反应1小时，然后加入等体积的200mM乙酸钠水溶液终止反应。

采用RP-HPLC-DAD法检测原花色素多聚体的聚合度，检测条件包括：柱温35℃、进样量10μL、流速1mL/min、检测波长280nm、流动相为0.1％的甲酸水溶液(A)和甲醇(B)、梯度洗脱：5％B(0～10min)、5～20％B(10～20min)、20～40％B(20～30min)、40～90％B(30～37min)，检测结果如图1所示。

检测发现，杨梅叶原花色素多聚体的平均聚合度为31.6。

实施例2

将实施例1中的10g杨梅叶粉末换为20g杨梅叶粉末；将实施例1步骤3中400mL的70％丙酮改为800mL的70％丙酮；加入的抗坏血酸为0.8g(0.1％w/v)；步骤4中的滤液萃取改为与800mL的分析纯三氯甲烷1:1等体积萃取；其余步骤同实施例1。

最终得杨梅叶原花色素多聚体为1.090g，得率为5.45％。

经间苯三酚-硫酸法降解后，通过RP-HPLC-DAD进行检测，检测结果如图2所示，杨梅叶原花色素多聚体平均聚合度为29.8。

实施例3

将实施例1中的10g杨梅叶粉末换为20g杨梅叶粉末；将实施例1步骤3中400mL的70％丙酮改为800mL的70％丙酮；加入的抗坏血酸为0.8g(0.1％w/v)；步骤4中的滤液萃取改为与800mL的分析纯三氯甲烷1:1等体积萃取；在12h的震荡提取时间内提取两次；其余步骤同实施例1。

最终得杨梅叶原花色素多聚体为1.104g，得率为5.52％

经间苯三酚-硫酸法降解后，通过RP-HPLC-DAD进行检测，上述杨梅叶原花色素多聚体平均聚合度为23.8。

实施例4

将实施例1中的10g杨梅叶粉末换为20g杨梅叶粉末；将实施例1步骤3中400mL的70％丙酮改为800mL的70％丙酮；加入的抗坏血酸为0.8g(0.1％w/v)；步骤4中的滤液萃取改为与800mL的分析纯三氯甲烷1:1等体积萃取；震荡提取时间改为24h；其余步骤同实施例1。

最终得杨梅叶原花色素多聚体为1.015g，得率为5.075％。

经间苯三酚-硫酸法降解后，通过RP-HPLC-DAD进行检测，上述杨梅叶原花色素多聚体平均聚合度为24.7。

实施例5

将实施例1中的10g杨梅叶粉末换为20g杨梅叶粉末；将实施例1步骤3中400mL的70％丙酮改为900mL的70％丙酮；加入的抗坏血酸为0.9g(0.1％w/v)；步骤4中的滤液萃取改为与900mL的分析纯三氯甲烷1:1等体积萃取；其余步骤同实施例1。

最终得杨梅叶原花色素多聚体为1.050g，得率5.25％。

经间苯三酚-硫酸法降解后，通过RP-HPLC-DAD进行检测，上述杨梅叶原花色素多聚体平均聚合度为29.1。

实施例6

将实施例1中的10g杨梅叶粉末换为10g葡萄籽粉末，将实施例1步骤3中400mL的70％丙酮改为100mL的70％丙酮(料液比1:10(W/V))；加入的抗坏血酸改为0.1g(0.1％w/v)；步骤4中的滤液萃取改为将滤液与100mL的分析纯三氯甲烷1:1等体积萃取；其余步骤同实施例1。

最终得葡萄籽原花色素多聚体为1.550g，得率15.55％

经间苯三酚-硫酸法降解后，通过RP-HPLC-DAD进行检测，上述葡萄籽原花色素多聚体平均聚合度为7.26。

实施例7

将实施例1中的10g杨梅叶粉末换为5g葡萄籽粉末，将实施例1步骤3中400mL的70％丙酮改为50mL的70％丙酮(料液比1:10(W/V))；加入的抗坏血酸为0.05g(0.1％w/v)；步骤4中的滤液萃取改为将滤液与50mL的分析纯三氯甲烷1:1等体积萃取；其余步骤同实施例1。

最终得葡萄籽原花色素多聚体为0.640g，得率12.8％。

经间苯三酚-硫酸法降解后，通过RP-HPLC-DAD进行检测，上述葡萄籽原花色素多聚体平均聚合度为6.95。

表1列出了分别以杨梅叶(实施例1-5)和葡萄籽为原料提取制备原花色素多聚体的试验数据。

表1.杨梅叶及葡萄籽原花色素多聚体得率及平均聚合度

以上列举的仅是本发明的若干具体实施例。本发明不限于以上实施例和材料，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。