阅读说明：本技术 一种申嗪霉素发酵工艺 (Shenqinmycin fermentation process ) 是由 张进武 郝祥蕊 冯镇泰 张红艳 龚新进 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及微生物发酵领域,特别是涉及一种申嗪霉素发酵工艺,所述发酵工艺包括：向M18菌体发酵体系中补加碳源和/或氮源。所述碳源选自糖类、油脂、有机酸、有机酸酯或小分子醇。所述氮源选自无机氮源或有机氮源。所述无机氮源选自铵盐,所述铵盐优选为硫酸铵或硝酸铵,所述有机氮源选自复合氨基酸粉或酰胺。本发明的申嗪霉素发酵工艺维持菌体的连续生长和产物形成的需要,延缓菌体的衰老,将申嗪霉素大罐发酵周期延长至65小时左右；延长发酵产物PCA的合成与分泌周期,在延长期发酵产物PCA的含量仍继续大幅增长,最高含量可达9.7g/L以上；大大提高了发酵产量,降低了生产成本。(The invention relates to the field of microbial fermentation, in particular to a shenqinmycin fermentation process, which comprises the following steps: and (3) supplementing a carbon source and/or a nitrogen source into the M18 thallus fermentation system. The carbon source is selected from saccharides, grease, organic acid ester or small molecular alcohol. The nitrogen source is selected from inorganic nitrogen sources or organic nitrogen sources. The inorganic nitrogen source is selected from ammonium salt, the ammonium salt is preferably ammonium sulfate or ammonium nitrate, and the organic nitrogen source is selected from compound amino acid powder or amide. The fermentation process of the shenqinmycin maintains the continuous growth of thalli and the requirement of product formation, delays the aging of the thalli, and prolongs the fermentation period of the shenqinmycin in a large tank to about 65 hours; the synthesis and secretion period of the fermentation product PCA is prolonged, the content of the fermentation product PCA is still increased greatly in the prolonged period, and the highest content can reach more than 9.7 g/L; greatly improves the fermentation yield and reduces the production cost.)

一种申嗪霉素发酵工艺

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及一种申嗪霉素发酵工艺。

背景技术

申嗪霉素是一种吩嗪类农用广谱杀菌剂，化学名称为吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，简称PCA)，是利用促生拮抗菌M18于发酵罐中深层培养再经提取纯化而得。该菌类属荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.0462，在中国专利CN00119857.2中，发明人许煜泉、冯镇泰描述了生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法，该专利被参考并结合于本文中。

目前利用M18菌工业化生产PCA的整个发酵过程中，发酵前25小时左右为菌体生长繁殖阶段，大约75％的营养成分C(还原糖)、N(氨基氮)被消耗，随后进入产物PCA的生物合成阶段，发酵约40小时之后，营养成分C基本消耗完毕，菌体生长受到影响，开始衰老自溶，释放出胞内氨基氮和产物分解酶导致产物PCA的含量开始下降，发酵结束，发酵液中产物PCA含量为4.5g/L左右。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种申嗪霉素发酵工艺，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种申嗪霉素发酵工艺，所述发酵工艺包括：向M18菌体发酵体系中补加碳源和/或氮源。

优选的，所述M18发酵体系选自以下方式获得：

1)将M18菌体种子菌液接种至发酵摇瓶中获得；

2)将M18菌体种子菌液接入种子罐中培养，待菌体浓度OD600达2.0以上时移种至大罐中发酵获得。

优选的，所述碳源选自糖类、油脂、有机酸或有机酸酯。

优选的，糖类选自单糖或多糖，所述单糖优选为葡萄糖，所述多糖优选为蔗糖。

优选的，所述氮源选自无机氮源或有机氮源。

优选的，所述无机氮源选自铵盐，所述铵盐优选为硫酸铵或硝酸铵，所述有机氮源选自复合氨基酸粉或酰胺。

优选的，补加的碳源或氮源为各自的水溶液。

优选的，当发酵体系内还原糖的含量或氨基氮的含量为起始质量浓度的70％～75％时，补加入碳源或氮源。

优选的，以发酵容器的培养基装量体积为基数计量，补加的碳源总量为0.2％～1.0％，和/或，补加的氮源总量为0.2％～0.8％。

优选的，补加碳源/或氮源的方式选自分次补加或持续补加。

如上所述，本发明的申嗪霉素发酵工艺，具有以下有益效果：

1)维持菌体的连续生长和产物形成的需要，延缓菌体的衰老，将申嗪霉素大罐发酵周期延长至65小时左右；

2)延长发酵产物PCA的合成与分泌周期，在延长期发酵产物PCA的含量仍继续大幅增长，最高含量可达9.7g/L以上；

3)大大提高了发酵产量，降低了生产成本。

附图说明

图1显示为发酵罐培养时同时分次补加碳源和氮源试验中还原糖(C)、氨基氮(N)的含量变化曲线图。

图2显示为发酵罐培养时同时分次补加碳源和氮源试验中PCA含量变化曲线图。

图3显示为发酵罐培养同时连续补加碳源和氮源试验中还原糖(C)、氨基氮(N)的含量变化曲线图。

图4显示为发酵罐培养同时连续补加碳源和氮源试验中PCA含量变化曲线图。

具体实施方式

本发明提供一种申嗪霉素发酵工艺，所述发酵工艺包括以下步骤：向M18菌体发酵体系中补加碳源和/或氮源。

所述发酵工艺还包括以下条件中的一个或几个：

1)所述M18发酵体系中使用的培养基为含葡萄糖和蛋白胨培养基；

2)培养温度为26～30℃；

3)转速为80～200转/分。

所述M18发酵体系选自以下任意方式获得：

1)将M18菌体种子菌液接种至发酵摇瓶中获得；

2)将M18菌体种子菌液接入种子罐中培养，待菌体浓度OD600达2.0以上时移种至大罐发酵获得。

所述种子菌液的获得方法为：从M18菌种斜面上挑起少许菌苔，转接至茄子瓶斜面上，28～30℃培养24小时，用灭菌蒸馏水将茄子瓶斜面上长好的菌苔洗至灭菌三角瓶中，即成种子菌液。

M18菌种斜面和茄子瓶斜面的培养基组分均为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L，骨蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，琼脂18g/L。将上述组分用纯水配制，pH7.0～7.2，115℃下灭菌20min，搁置冷却成斜面即可。

具体的，方式1)中摇瓶培养基组成为：甘油5g/L，葡萄糖20g/L，骨蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁1g/L。将上述组分用纯水配制，pH7.0～7.2，115℃下灭菌20min。

具体的，方式1)中发酵摇瓶的培养条件为：摇床温度28～30℃，转速200转/分。

具体的，方式2)中种子罐培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L，骨蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，余量为水，pH7.0～7.2，115℃下灭菌20min。

具体的，方式2)中种子罐的培养温度为28～30℃。

所述种子罐的罐压0.02～0.03MPa。

所述种子罐的空气流量为1:0.1～1:1.5(种子罐体积与每分钟空气体积之比)。

所述种子罐的搅拌转速100～150转/分。

一般的，培养22～24小时后取样显微镜检，菌体生长旺盛，无杂菌污染，菌体浓度OD600可达2.0以上。

具体的，方式2)中移种至大罐发酵时，接种量为大罐培养基装量体积的1％～2％。

具体的，大罐培养基的组成为：甘油5g/L，葡萄糖20g/L，骨蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁1g/L，余量为水，pH 6.5～7.5，115℃下灭菌20min。

具体的，大罐的培养温度为28～30℃。

大罐的罐压为0.01～0.03MPa。

大罐的空气流量为1:0.1～1:1.5(大罐体积与每分钟空气体积之比)。

大罐的搅拌转速80～120转/分。

所述M18属荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，与中国专利CN00119857.2中的M18相同，该菌已在申请专利CN00119857.2时保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0462。

所述碳源为含有碳元素且能被微生物生长繁殖所利用的一类营养物质，所述碳源包括糖类、油脂、有机酸或有机酸酯。其中，糖类包括单糖和多糖，单糖可以为葡萄糖，多糖可以为蔗糖；有机酸酯为有机酸与醇反应生成的酯。

所述氮源为用于合成菌体细胞氨基酸、蛋白质、核酸和含氮代谢物等物质的材料。具体的，所述氮源包括无机氮源和有机氮源。所述无机氮源包括铵盐，所述铵盐可以为硫酸铵、硝酸铵，所述有机氮源可以为复合氨基酸粉、酰胺。

所述碳源和氮源的溶剂为水，灭菌后使用。

当发酵体系内还原糖的含量或氨基氮含量为起始质量浓度的70％～75％时，开始补加入碳源或氮源。所述还原糖的含量利用菲林试剂法测定，所述氨基氮含量利用甲醛滴定法测定。

大罐发酵培养时，每2小时取样检测还原糖、氨基氮和产物申嗪霉素(PCA)的含量。一般的，转入大罐中发酵25小时左右，还原糖、氨基氮即消耗了起始质量浓度的70％～75％，即可补加碳源或氮源。

以初始培养基体积为基数计量，补加的碳源总质量分数为0.2％～1.0％，例如可以为0.6％，单位为kg/L或g/mL，补加的碳源总质量为用水溶解之前的粉末质量。

以初始培养基体积为基数计量，补加的氮源总量为0.2％～0.8％，如可以为0.5％，单位为kg/L或g/mL，补加的氮源总质量为用水溶解之前的粉末质量。

补加的碳源或氮源可以分次补加，例如分为两次补加，每次补加总量的一半；或分三次补加，每次补加总量的1/3。补加的碳源或氮源还可以连续补加(或称为持续补加)，控制补加物料的流速，在发酵结束前一定时间内补加完毕即可。当补加碳源和氮源时，可以将氮源和碳源混合后加入，也可以分别加入。

分次或连续补加0.6％的碳源和0.5％的氮源后，发酵65h时PCA的产量达9.7g/L以上。

所述PCA的产量通过HPLC测得，检测方法如下：

取发酵菌液200μl于10ml的容量瓶中，加适量乙腈稀释，在超声波浴槽中震荡15min，恢复至室温后定容，摇匀。取1ml样品至刻度离心管中，15000转/min条件下离心10min，取10μl上清液进样检测，检测条件为波长248nm，保留时间约14.5min；流动相为乙腈:水:冰醋酸＝40:60:0.2，流速1.0ml/min，C18反向柱。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤，除非另有说明；而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1摇瓶发酵补料试验

1、种子菌液制备

用接种针从M18菌种斜面上挑起少许菌苔，转接至已制备好的茄子瓶斜面上，28～30℃培养24小时，用适量的灭菌蒸馏水将茄子瓶斜面上长好的菌苔洗至灭菌三角瓶中，即成种子菌液。M18菌种斜面和茄子瓶斜面的培养基配制方法均为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L，骨蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，琼脂18g/L，纯水配制，pH7.0～7.2，115℃下灭菌20min，搁置冷却成斜面。

2、摇瓶发酵补加碳源试验：

将所述种子菌液按体积比2％的接种比例接至发酵摇瓶中，摇瓶培养基组成：甘油5g/L，葡萄糖20g/L，骨蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁1g/L，纯水配制，pH7.0～7.2，115℃下灭菌20min；控制摇床温度28～30℃，转速200转/分。根据M18菌种在发酵过程中的碳源代谢特征设定在发酵中后期(25小时和45小时)分别补加葡萄糖、蔗糖和糊精3组试验，补加量均以摇瓶培养基装量体积为基准(g/ml)，每组试验均设计补加碳源0.15％、0.3％、0.45％三个水平；发酵25小时后每隔5小时取样一次，检测产物PCA的含量，发酵65小时放瓶，结果如表1。

表1补加碳源后不同时间PCA的含量

表1数据显示，二次补加0.3％的葡萄糖发酵试验中产物PCA的含量最高，发酵65小时放瓶，产物PCA含量为8.12g/L，比同期对照增长101％。

3、摇瓶发酵补加氮源试验：

将所述种子菌液按体积比2％的接种比例接至发酵摇瓶中，摇瓶培养基组成：甘油5g/L，葡萄糖20g/L，骨蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁1g/L，纯水配制，pH7.0～7.2，115℃下灭菌20min；控制摇床温度28～30℃，转速200转/分。根据M18菌种发酵过程中的氮源代谢特征设定在发酵中后期(25小时和45小时)分别补加复合氨基酸粉、硫酸铵和尿素3组试验，补加量均以摇瓶培养基装量体积为基准(g/ml)，每组试验设计补加氮源0.15％、0.25％、0.35％三个水平，发酵25小时后每隔5小时取样一次，检测产物PCA的含量，发酵65小时放瓶，结果如表2。

表2补加氮源后不同时间PCA的含量

表2数据显示，二次补加0.25％的复合氨基酸粉发酵试验中产物PCA的含量最高，发酵65小时放瓶，产物PCA含量为6.72g/L，比同期对照增长64.3％。

4、摇瓶发酵同时分次补加碳源和氮源试验：

将所述种子菌液按体积比2％的接种比例接至发酵摇瓶中，摇瓶培养基组成：甘油5g/L，葡萄糖20g/L，骨蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁1g/L，纯水配制，pH7.0～7.2，115℃下灭菌20min；控制摇床温度28～30℃，转速200转/分。根据2和3的试验结果设定在发酵中后期(25小时和45小时)同时补加0.3％葡萄糖和0.25％复合氨基酸粉，发酵25小时后每隔5小时取样一次，检测产物PCA的含量，发酵65小时放瓶，结果如表3。

表3同时分次补加碳源和氮源后不同时间PCA的含量

表3数据显示，在摇瓶发酵中后期同时分二次补加0.3％葡萄糖和0.25％复合氨基酸粉，可以大幅提高产物PCA的含量，发酵65小时放瓶，产物PCA含量为9.76g/L，比同期对照增长139.8％。

实施例2发酵罐培养同时分次补加碳源和氮源试验

用接种针从M18菌种斜面上挑起少许菌苔，转接至已制备好的茄子瓶斜面上，28℃培养24小时，用120ml灭菌蒸馏水将茄子瓶斜面上的菌苔洗至灭菌三角瓶中，做成种子菌液；将此种子菌液在火焰保护下接入1000L的种子罐中进行培养；种子罐培养基组成：葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L，骨蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，余量为自来水，pH7.1，装量为500L，115℃下灭菌20min。种子罐培养条件：温度28℃，罐压0.03MPa，空气流量1：1(v/v)，搅拌转速120转/分；培养24小时后取样显微镜检，菌体生长旺盛，无杂菌污染，菌体浓度OD600为2.25；

将此种子罐中培养良好的种子菌液通过灭菌管道转入50000L的大罐发酵培养，大罐培养基组成：甘油5g/L，葡萄糖20g/L，骨蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁1g/L，自来水配制，pH 7.1，装量35000L，115℃下灭菌20min。大罐培养条件：温度28℃，罐压0.02MPa，空气流量1：1(v/v)，搅拌转速90转/分。

大罐接种1小时后，开始取样检测发酵参数，每隔2小时取样一次；种后1小时测得C含量1.93g/100ml、N含量76.52mg/100ml、PCA含量为0；发酵25小时测得C含量0.45g/100ml、N含量19.03mg/100ml、PCA含量1.168g/L；此时补加灭菌营养物料(葡萄糖105KG和复合氨基酸粉87.5KG，自来水配制，115℃下灭菌20min，控制营养物料的灭菌体积为500L左右)，继续发酵至发酵45小时，测得C含量0.28g/100ml、N含量15.66mg/100ml、PCA含量6.348g/L，此时按上述计量再补料一次，维持发酵条件，继续发酵至65小时，测得C含量0.07g/100ml、N含量25.16mg/100ml、产物PCA的含量为9.745g/L，此时，发酵液氨基氮已明显回升，产物PCA含量开始下降，结束发酵。本实施例的全过程检测数据见表4，生长代谢曲线图见图1～2。

表4发酵罐中同时分次补加碳源和氮源的检测数据

实施例3发酵罐培养同时连续补加碳源和氮源试验

用接种针从M18菌种斜面上挑起少许菌苔，转接至已制备好的茄子瓶斜面上，28℃培养24小时，用120ml灭菌蒸馏水将茄子瓶斜面上的菌苔洗至灭菌三角瓶中，做成种子菌液；将此种子菌液在火焰保护下接入1000L的种子罐中进行培养，种子罐培养基组成：葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L，骨蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，余量为自来水，pH7.0，装量为500L，115℃下灭菌20min；种子罐培养条件：温度28℃，罐压0.03MPa，空气流量1：1(v/v)，搅拌转速120转/分，培养24小时后取样显微镜检，菌体生长旺盛，无杂菌污染，菌体浓度OD600为2.32；

将此种子罐中培养良好的种子菌液通过灭菌管道转入50000L的大罐发酵培养，大罐培养基组成：甘油5g/L，葡萄糖20g/L，骨蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁1g/L，自来水配制，pH 6.9，装量35000L，115℃下灭菌20min；大罐培养条件：温度28℃，罐压0.02MPa，空气流量1：1(v/v)，搅拌转速90转/分。

大罐接种1小时后，开始取样检测发酵参数，每隔2小时取样一次；种后1小时测得C含量1.91g/100ml、N含量75.72mg/100ml、PCA含量0；发酵25小时测得C含量0.41g/100ml、N含量18.52mg/ml、PCA含量1.153g/L；此时通过灭菌计量管道流加灭菌营养物料(葡萄糖210KG和复合氨基酸粉175KG，自来水配制，115℃下灭菌20min，控制营养物料的灭菌体积为1000L左右)，控制物料流加速度0.55L/min，大约30小时补加完毕，维持发酵条件，继续取样检测，发酵至65小时左右，发酵液氨基氮明显回升，产物PCA的含量开始下降，结束发酵，此时测得C含量0.08g/100ml、N含量24.65mg/100ml、产物PCA的含量9.773g/L。本实施例的全过程检测数据见表5，生长代谢曲线图见图3～4。

表5发酵罐中同时连续补加碳源和氮源的检测数据

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具有高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。