特殊医学用途婴儿乳蛋白部分水解配方食品
阅读说明：本技术 特殊医学用途婴儿乳蛋白部分水解配方食品 (Infant milk protein partial hydrolysis formula food for special medical use ) 是由 徐庆利 刘宝华 杜玲玲 于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本申请提供了一种特殊医学用途婴儿乳蛋白部分水解配方食品,其包括由碱性蛋白酶或胰蛋白酶水解乳清蛋白制备的水解乳清蛋白。本申请的配方食品在适度水解保持良好风味的同时有效降低的其β-乳球蛋白致敏性。(The present application provides a partially hydrolysed infant milk protein formula for particular medical use comprising hydrolysed whey protein prepared by hydrolysing whey protein with an alkaline protease or trypsin. The formula food of the application can effectively reduce the beta-lactoglobulin sensitization of the formula food while maintaining good flavor through moderate hydrolysis.)
技术领域
本申请属于食品，特别是婴幼儿配方食品领域，具体地，本申请提供了一种特殊医学用途婴儿乳蛋白部分水解配方食品，其包括由碱性蛋白酶或胰蛋白酶水解乳清蛋白制备的水解乳清蛋白。
背景技术
牛乳是婴幼儿替代母乳的主要食物蛋白来源，但其也是最常见的食物过敏原之一(学前儿童的牛乳过敏率可达10％左右，到成人阶段仍有3％左右)，制备防止过敏的牛乳制品或代用配方食品，对于牛乳过敏人群，特别是婴幼儿牛乳过敏人员的健康非常有意义。β-乳球蛋白占乳清蛋白总量50％左右，是乳清蛋白的主要功能活性成分。对牛乳过敏人群中80％以上属于对β-乳球蛋白过敏，消除β-乳球蛋白或其过敏原表位可以有效减少牛乳过敏发生的概率。
目前消除β-乳球蛋白或其过敏原表位的方法主要包括热加工、高压处理、发酵、辐射处理、酶解处理等。由于热加工、高压处理、发酵、辐射处理在实际效果和安全性上都存在难以克服的问题，酶解处理依然是生产低致敏乳制品/代用配方食品的主流方法。
一方面，由于β-乳球蛋白具有紧密的空间折叠结构，导致β-乳球蛋白具有耐蛋白酶水解的特性；另一方面，提高水解程度(如深度水解奶粉/乳清蛋白或酪蛋白)虽然可以降低致敏性，但也一般伴随着成本的提高和风味的下降；因此控制水解过程/程度是制备低致敏乳制品/代用配方食品中的关键步骤，研究在更低水解程度(意味着更好的口感和更低的成本)下进一步降低致敏性的水解方式很有必要。
发明内容
申请人对水解所用酶种类、酶解条件以及酶解中所加入的助剂进行了研究，发现以碱性蛋白酶加入适量焦磷酸钠酶解乳清蛋白可以实现在适当的水解度和风味下有效降低致敏性，实现了风味与低致敏性的良好平衡，为配方食品或奶粉提供了良好的原材料。
一种特殊医学用途婴儿乳蛋白部分水解配方食品，其特征在于，其包括水解乳清蛋白；所述水解乳清蛋白由碱性蛋白酶或复合风味蛋白酶水解乳清蛋白制备。
进一步地，所述配方食品中成分为：植物脂肪粉C 69.9％、植物脂肪粉E 24％、低聚果糖2％、胆碱1.1％、氯化钾0.7％、磷酸氢钙0.5％、矿物质0.5％、肌醇0.3％、磷酸三钙0.3％、维生素0.3％、氯化钠0.2％、碳酸钙0.1％、左旋肉碱0.05％、核苷酸0.05％；
其中植物脂肪粉C为：乳糖45％、水解乳清蛋白26％、复合植物油26.6％、磷酸氢钙1.4％、单，双甘油脂肪酸酯0.7％、L-抗坏血酸钠0.2％、抗坏血酸棕榈酸酯0.033％、磷脂0.033％、混合生育酚浓缩物0.034％；
植物脂肪粉E为：固体淀粉糖26.8％、无水奶油25％、水解乳清蛋白23％、麦芽糊精19.2％、复合植物油5％、单，双甘油脂肪酸酯0.71％、L-抗坏血酸钠0.21％、抗坏血酸棕榈酸酯0.03％、磷脂0.03％、混合生育酚浓缩物0.02％；
进一步地，所述水解乳清蛋白制备方法包括以7％的酶/底物质量比的碱性蛋白酶酶解乳清蛋白
进一步地，酶解乳清蛋白过程中加入0.1％乳清蛋白质量的焦磷酸钠。
进一步地，酶解条件为：pH 8.5、温度50摄氏度、时间4小时：
另一方面，本申请提供了一种水解乳清蛋白的制备方法，其特征在于，以7％的酶/底物质量比的碱性蛋白酶酶解乳清蛋白。
进一步地，酶解乳清蛋白过程中加入0.1％乳清蛋白质量的焦磷酸钠。
进一步地，酶解条件为：pH 8.5、温度50摄氏度、时间4小时；
另一方面，本申请提供了上述水解乳清蛋白在制备低致敏性食品中的应用。
进一步地，所述食品为婴幼儿奶粉或配方食品。
具体实施方式
主要试剂、仪器和方法
乳清蛋白为申请人使用自有奶源自制，实验过程中使用相同批次的产品；
碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶：诺维信；
木瓜蛋白酶：东恒华道；
焦磷酸钠：济南允诚生物科技有限公司；
KU812(人外周血嗜碱性白血病细胞)：购自EK-bioscience；
β-HEX ELISA检测试剂盒：睿信生物；
液质联仪器：岛津LCMS-2020；
其他试剂和配料均为符合相关规定的常规国产或进口种类。
酶解方法：
以5mM的所需PBS配制10g/L的乳清蛋白溶液，加入所需酶和焦磷酸钠后在恒温水浴锅中酶解预定时间(期间低速搅拌)，100摄氏度10分钟灭酶后进行测定或置于冰箱冷冻室中保存待用。
水解度测定：
OPA(邻苯二甲醛)法，取400微升样品或丝氨酸对照液(0.1g/L)加入3mLOPA试剂中，反应2分钟后，测定340nm吸光度后计算(详细试剂和步骤参考CHURCH F C等.，SpectrophotometricAssay Using o-Phthaldialdehyde for Determination ofProteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins，Journal of Dairy Science，1983年，第66卷，第6期)；
此外，以SDS-PAGE电泳测定水解后乳清蛋白片段的分子量分布情况。
致敏性细胞水平测定：
通过合作医疗机构获取对牛乳β-乳球蛋白确诊过敏的患者(特异性IgE>0.8KUA/L)血清，测试所用血清池由25位患者的血清混合而成。
将购买的冻存KU812细胞复苏、传代；向培养基中加入2％牛乳β-乳球蛋白确诊过敏患者血清池血清(空白组为无菌缓冲液)后孵育12小时，使细胞处于致敏状态；加入培养基体积1％的蛋白浓度为10mg/mL的样品(阴性对照组为无菌缓冲液)，孵育6小时；TritonX-100裂解后，使用上述试剂盒检测β-HEX，并计算β-HEX释放率：β-HEX释放率(100％)＝(样品组OD值-阴性组OD值)/(阳性组OD值-阴性组OD值)×100％。
HPLC-MS检测
取水解乳清蛋白，适当稀释后进样；流动相1：0.1％甲酸水溶液、流动相2：0.1％甲酸乙腈溶液，0-60分钟内流动相2从0％-100％；电喷雾正离子模式，碰撞电压28ev；PEAKS软件对Swiss-Prot数据库进行分析。
实施例1水解乳清蛋白的制备
根据前期研究经验和实际水解实验(出于篇幅原因未在此展示)中的水解度、时间、苦味值、风味评价等数据，我们从多种可用蛋白酶及其组合中选择了碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶和木瓜蛋白酶三种单酶酶解方法，并进一步确定了其适合的酶解条件：
碱性蛋白酶：7％酶/底物质量比、pH 8.5、温度50摄氏度、时间4小时；
复合风味蛋白酶：9％酶/底物质量比、pH 7、温度50摄氏度、时间4小时；
木瓜蛋白酶：6％酶/底物质量比、pH 7、温度55摄氏度、时间4小时。
使用上面的记载的方法制备如下样品：
未水解乳清蛋白：不进行任何水解、热处理、压力处理、辐照处理的乳清蛋白样品样品；
水解乳清蛋白1：以上述条件碱性蛋白酶酶解；
水解乳清蛋白2：以上述条件复合风味蛋白酶酶解；
水解乳清蛋白3：以上述条件木瓜蛋白酶酶解；
水解乳清蛋白4：以上述条件加0.1％乳清蛋白质量的焦磷酸钠碱性蛋白酶酶解；
水解乳清蛋白5：以上述条件加0.1％乳清蛋白质量的焦磷酸钠复合风味蛋白酶酶解；
水解乳清蛋白6：以上述条件加0.1％乳清蛋白质量的焦磷酸钠木瓜蛋白酶酶解；
水解乳清蛋白7：以上述条件加0.05％乳清蛋白质量的焦磷酸钠碱性蛋白酶酶解；
水解乳清蛋白8：以上述条件加0.5％乳清蛋白质量的焦磷酸钠碱性蛋白酶酶解；
实施例2水解乳清蛋白的基本性质研究
水解程度的测定：
通过上述OPA法测定和SDS电泳观察，水解乳清蛋白1-8的水解情况如下表所示：
表1各种水解乳清蛋白的水解情况：
结果表明，碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶的酶解效果好于木瓜蛋白酶，水解后的片段大小距离深度水解(一般认为3kDa片段高于90％)尚有明显区别。经过评分品评，以上述水解乳清蛋白4制备的配方食品(具体配方如下实施例所述)风味口感评分上高于申请人自制的深度水解配方食品(多种蛋白酶复合酶长时间酶解)和市售某品牌深度水解奶粉(具体方案和数据由于篇幅原因未展示)，这也符合对部分水解和深度水解奶粉区别的一般认识。
实施例3致敏性测定和残留肽短分析
使用上述方法对未水解乳清蛋白、水解乳清蛋白1-8和市售某深度水解奶粉的β-HEX释放率进行检测，结果如下：
表2各种水解乳清蛋白的β-HEX释放率
样品
β-HEX释放率(％)
未水解乳清蛋白
44.51
水解乳清蛋白1
29.22
水解乳清蛋白2
28.75
水解乳清蛋白3
37.41
水解乳清蛋白4
20.34
水解乳清蛋白5
27.69
水解乳清蛋白6
36.71
水解乳清蛋白7
22.45
水解乳清蛋白8
23.96
市售某深度水解奶粉
19.85
结合实施例2的结果来看，加入适量的焦磷酸钠络合乳清蛋白中的金属成分或起乳化作用可以改变蛋白构象(推测待验证)使得某些致敏关键位置暴露进而被碱性蛋白酶水解，可能是由于暴露位置的原因，复合风味蛋白酶于焦磷酸钠的组合并不能达到与碱性蛋白酶类似的效果。水解乳清蛋白4的β-HEX释放率已经接近市售某深度水解奶粉水平(按经验配制成奶粉后，致敏性会略有2-3％的升高，但幅度不会太大)，但水解乳清蛋白4在风味和制造成本上明显优于深度水解产品。
进一步以上述HPLC-MS方法检测了水解乳清蛋白1、4中的残留肽段，在水解乳清蛋白1中发现β-乳球蛋白的1-9、34-40、42-60、73-82、93-101、87-94、140-149残留肽段，分别有对应的过敏表位；而在水解乳清蛋白4中未检测到34-40肽段(对应IgE表位21-40，Fritsche R.等，IgE-mediated rat mast cell triggering with tryptic andsynthetic peptides of bovine beta-lactoglobulin，Int Arch Allergy Immunol，2005年，第138卷，第4期)。
实施例4配方食品实际产品制备
以水解乳清蛋白4实际制备配方食品，具体配方如下：
植物脂肪粉C 69.9％、植物脂肪粉E 24％、低聚果糖2％、胆碱1.1％、氯化钾0.7％、磷酸氢钙0.5％、矿物质0.5％、肌醇0.3％、磷酸三钙0.3％、维生素0.3％、氯化钠0.2％、碳酸钙0.1％、左旋肉碱0.05％、核苷酸0.05％；
其中植物脂肪粉C为：乳糖45％、水解乳清蛋白26％、复合植物油26.6％、磷酸氢钙1.4％、单，双甘油脂肪酸酯0.7％、L-抗坏血酸钠0.2％、抗坏血酸棕榈酸酯0.033％、磷脂0.033％、混合生育酚浓缩物0.034％；
植物脂肪粉E为：固体淀粉糖26.8％、无水奶油25％、水解乳清蛋白23％、麦芽糊精19.2％、复合植物油5％、单，双甘油脂肪酸酯0.71％、L-抗坏血酸钠0.21％、抗坏血酸棕榈酸酯0.03％、磷脂0.03％、混合生育酚浓缩物0.02％
矿物质包括硫酸铜、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、碘酸钾、亚硒酸钠；
维生素包括醋酸视黄酯、胆钙化醇、dl-α-醋酸生育酚、植物甲萘醌、盐酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、氰钴胺、烟酰胺、叶酸、D-泛酸钙、L-抗坏血酸钠、D-生物素；
复合植物油包括葵花籽油、大豆油、低芥酸菜籽油、椰子油、玉米油。
经过品评和试用，该配方食品口味良好且有效避免了婴幼儿过敏情况的发生，优于现有部分水解产品。