一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗及其制备方法 (Perch rhabdovirus subunit vaccine and preparation method thereof ) 是由 王高学 朱斌 凌飞 郭孜饶 焦铁军 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明选取MSRV糖蛋白的部分蛋白片段G2,通过原核重组表达获得G2蛋白,并对G2蛋白进行甘露糖化修饰,制备得到了鲈鱼弹状病毒纳米载靶向性疫苗,研究表明,该亚单位疫苗免疫鲈鱼21天后攻毒MSRV FJ985毒株,鲈鱼免疫保护率为94%-96%,该疫苗安全、有效,免疫鲈鱼后可产生较好的保护作用,并能使鲈鱼有效抵御MSRV强毒的攻击。(The invention selects a partial protein fragment G2 of MSRV glycoprotein, obtains G2 protein through prokaryotic recombinant expression, and carries out mannosylation modification on G2 protein to prepare the weever rhabdovirus nano-carrier targeting vaccine, and researches show that the subunit vaccine attacks the MSRV FJ985 strain 21 days after the weever is immunized, the weever immune protection rate is 94-96 percent, the vaccine is safe and effective, can generate better protection effect after the weever is immunized, and can enable the weever to effectively resist the attack of MSRV virulent virus.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗。
背景技术
大口黑鲈（Micropterus salmoides）俗称加州鲈，隶属鲈形目太阳鱼科黑鲈属，广东佛山于1983年引进大口黑鲈，并于1985年人工繁殖成功，鱼种被广泛养殖，均取得较好的经济效益，深受广大养殖者和消费者喜爱。但是，鲈鱼易患多种疾病，如烂鳃病、溃疡病、诺卡氏菌病、车轮虫病等。其中，由鲈鱼弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus， MSRV）引起的鲈鱼弹状病毒病危害最为严重。其流行地域广，发病时间长，发病死亡率可达85%以上，给鲈鱼养殖带来了巨大经济损失。
鲈鱼弹状病毒病在我国主养殖区域内（江苏、江西、湖南、湖北、浙江和广东等）均有报道。该病从每年4月开始，持续至11月，主要流行季节为每年4～5月。当水体温度达到25～28℃、溶氧和透明度降低、水质恶化时，鲈鱼鱼种最易感染和爆发鲈鱼弹状病毒病，进而造成鲈鱼大批死亡。病鱼主要症状是烂身、烂鳍、停止摄食，濒死鱼在水面漫游，严重者体色发黑。解剖病鱼可见肝脏严重肿大、充血；脾脏肿大、充血；肾脏肿大等。
MSRV为单链RNA病毒，病毒粒子大小为（100～430）nm×（45～100）nm，形态似棒状或子弹状。MSRV基因组主要编码5个结构蛋白，分别为核蛋白（nucleoprotein N），磷蛋白（phosphoprotein P）、基质（mitrix M）蛋白、糖蛋白（glycoprotein G）以及RNA聚合酶（RNApolymerise L）。G蛋白即糖蛋白，主要负责与宿主细胞受体的结合，是病毒的主要抗原蛋白，G蛋白在病毒表面形成三聚体状的囊膜粒子，与细胞上的受体结合，介导病毒的内吞作用。G蛋白作为病毒最主要的抗原，诱导机体产生中和抗体并刺激细胞免疫，决定了病毒的血清学特征。
目前针对MSRV所引起的相关疾病仍旧缺乏有效的治疗方式。有研究表明，中草药作为预防和治疗鲈鱼弹状病毒病的药物，具有毒副作用小、资源丰富和兼有药性等优点，在鱼病防治过程中，能起到一定的预防与治疗效果。疫苗作为预防病毒感染最有效的方式在MSRV的预防上也有一定的报道。Chen等（The antiviral defense mechanisms in mandarin fish induced by DNA vaccination against a rhabdovirus,Veterinary Microbiology,157 (2012) 264–275）通过构建抗弹状病毒的糖蛋白G质粒，注射鱼体后发现，该糖蛋白质粒可以触发I型IFN抗病毒免疫应答，显著减少病毒感染后肌肉组织受损程度，并且能够抑制病毒复制，所以对MSRV的G蛋白的研究显得尤为重要；Sun-jian LYU等（Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2019 20(9):728-739）构建MSRV病毒糖蛋白（G蛋白）的杆状病毒表达系统，并利用杆状病毒表达系统获得了高丰度的病毒糖蛋白,可结合家蚕可用于后续口服疫苗的研发，但并未进行疫苗的开发和免疫效果验证；Zi-RaoGuo等（Fish and Shellfish Immunology 99 (2020) 548-554）报道了一种由MSRV糖蛋白(G)复合而成的浸渍型单壁碳纳米管负载亚单位疫苗，并评估了其对大口黑鲈的保护作用，其采用原核表达的G蛋白全序列与单壁碳纳米管组合制备得到单壁碳纳米管-糖蛋白，结果表明单壁碳纳米管-糖蛋白（SWCNTs-G）是一种很有前途的浸入式亚单位疫苗候选者，可以对抗 MSRV 引起的死亡，在 SWCNTs 的帮助下，SWCNTs-G 组（40 mg/L）的免疫保护率达到70.1%，相比单纯采用G蛋白提高了30.6%。张晨（西北农林科技大学）和赵昭（西北农林科技大学）分别在本人的指导下，通过对甘露糖以及单壁碳纳米管进行结构修饰，再通过化学连接技术，构建了靶向性碳纳米管载疫苗系统（SWCNTs-MG），分别用于防治鲤春病毒血症和鳜传染性脾肾坏死病毒病，均取得了较好的防治效果。
目前针对MSRV所引起的相关疾病仍旧缺乏有效的治疗方式，疫苗作为预防病毒感染最有效的方式在MSRV的预防上也有一定的报道，然而，目前仍没有MSRV亚单位疫苗面市。因此，尽快研发出安全高效的针对MSRV的亚单位疫苗，才能解决鲈鱼养殖业与市场的困局，促进水产养殖业的健康发展。目前渔用疫苗在大规模产业化应用方面仍然存在一些理论和技术瓶颈，特别是在免疫途径和免疫效果方面。其中，注射免疫保护效果最好，但由于操作技术和生产成本等原因使其难以满足大规模产业化要求；浸泡和口服免疫虽然操作技术简单、生产成本低，但同时也存在体表皮肤和肠道屏障限制作用、酶解失活、免疫保护率低等一系列难以克服的技术问题。因此，如何通过进一步提高疫苗的免疫效果，是如今亟待解决的问题。
发明内容
为解决鲈鱼养殖业与市场的困局，促进水产养殖业的健康发展，本发明旨在提供一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗及其制备方法，通过反复设计和试验，选用MSRV G蛋白的部分片段为抗原，并结合碳纳米管组合制备得到碳纳米管-甘露糖化的糖蛋白亚单位疫苗，其对于鲈鱼的攻毒保护率大大提高。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：
一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗由G2蛋白和氧化单壁碳纳米管制备而成，所述G2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：2，在制备过程中，对所述G2蛋白进行甘露糖化修饰。
优选的，所述甘露糖化修饰采用如下方法：取1-（4-异氰酸酯苯酚）-α-D-甘露吡喃糖用PBS溶解至1mg/ml得到功能化甘露糖溶液，取G2蛋白溶液用PBS稀释至目的蛋白为360μg/ml，随后以功能化甘露糖溶液∶G2蛋白溶液=1∶30（V/V）的比例混合，室温80r/min搅拌24小时，所得产物经透析、冻干即可获得甘露糖糖基化G2蛋白粗产物，粗产物经凝胶过滤纯化后备用。
优选的，所述亚单位疫苗采用如下方法制备得到，包括如下步骤：
步骤一，重组蛋白的制备和纯化；
步骤二，碳纳米管递送系统制备：将G2蛋白进行甘露糖化修饰后与氧化单壁碳纳米管混合反应，离心后取沉淀溶解，重新溶解沉淀制备得到蛋白悬液，加入甲醛灭活；
步骤三，乳化：将蛋白混悬液和丙三醇按比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成疫苗；
步骤四，分装：定量分装，轧盖，贴标。
优选的，所述疫苗中目的蛋白浓度为5mg/ml。
优选的，所述步骤二中碳纳米管递送系统制备采用如下步骤：
（1）将功能化甘露糖用PBS溶解至1mg/ml，取G2蛋白溶液用PBS稀释至目的蛋白为360μg/ml，随后以功能化甘露糖溶液∶G2蛋白溶液=1∶30（V/V）的比例混合，室温80r/min搅拌24小时，所得产物经透析、冻干即可获得甘露糖糖基化G2蛋白粗产物，粗产物经凝胶过滤纯化后备用；
（2）采用缩合酰化法，在800mL 2-（N-吗非啉）乙磺酸缓冲液（0.1M，pH=5.6）中加入6g功能化碳纳米管，用玻璃棒将混合液搅拌均匀，同时对混合液进行超声处理20min；
（3）分别称取18g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和24g N-羰基琥珀酸亚胺，加入分散均匀的碳纳米管混合液中，加的时候要用玻璃棒对其进行搅拌，使其充分混合，同时进行超声处理2h，超声的时候，每超声0.5h，暂停10min，及时更换超声清洗器中的水，避免水发热过严重；
（4）在上述分散后的溶液以12000g离心30min，弃上清。用pH=7.4的PBS溶液对沉淀进行洗涤，洗涤3次后，将沉淀溶解于2000mL，pH=7.4的PBS溶液中；
（5）称取5g甘露糖糖基化G2蛋白，加入上一步的溶液中，边加入边搅拌，搅拌的时候应避免产生气泡，搅拌幅度不宜过大，接着进行1.5h超声分散；
（6）超声后，加入转子，在避光环境下，将混合液在旋转搅拌器中搅拌48h；
（7）反应产物转入透析袋（10万）中透析2d。透析后，将产物以12000g离心30min，弃上清。得到的固体沉淀进行冷冻干燥，即得靶向性碳纳米管载疫苗系统（SWCNTs-MG），于-20℃冰箱保存；
（8）按50mg固体沉淀加入1ml PBS的比例混合，制成蛋白混悬液置于-15℃以下保存；
（9）蛋白灭活：向蛋白混悬液中加入甲醛至终浓度0.07%，2～8℃灭活72小时。
优选的，所述乳化为：按蛋白混悬液∶丙三醇=2∶3（V/V）的比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成目的蛋白浓度5mg/ml的疫苗。
本发明还请求保护制备所述鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，重组蛋白的制备和纯化；
步骤二，碳纳米管递送系统制备：将G2蛋白进行甘露糖化修饰后与氧化单壁碳纳米管混合反应，离心后取沉淀溶解，重新溶解沉淀制备得到蛋白悬液，加入甲醛灭活；
步骤三，乳化：将蛋白混悬液和丙三醇按比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成疫苗；
步骤四，分装：定量分装，轧盖，贴标。
优选的，所述步骤一为：扩增得到G2目的基因，构建表达G蛋白的重组大肠埃希氏菌 E. coli BL21/pET32a-G2；将重组大肠埃希氏菌 E. coli BL21/pET32a-G2发酵、表达和纯化制备得到G2蛋白。
优选的，所述乳化为：按蛋白混悬液∶丙三醇=2∶3（V/V）的比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成目的蛋白浓度5mg/ml的疫苗。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
第一，本发明在大量分析和试验的基础上，筛选得到糖蛋白中具有良好免疫原料的G2蛋白片段，该片段相对于G蛋白整体以及其他片段具有更好的免疫原性和免疫保护性能，基于G2蛋白制备得到的亚单位疫苗免疫鲈鱼21天后攻毒MSRV FJ985毒株，鲈鱼免疫保护率为94%，高于现有报道的保护率。
第二，在构建的碳纳米管载疫苗系统的基础上，结合甘露糖受体的特性，本发明构建了靶向性碳纳米管载疫苗系统，该系统可通过浸泡免疫实现大规模、简单快速的苗种靶向免疫的目标，大大提高浸泡免疫的效果，实现以鲈鱼弹状病毒纳米载靶向性疫苗为代表的商业渔用疫苗的产业化，也将为其它水产动物纳米载靶向基因工程疫苗研究、应用奠定理论基础，提供新的研究思路，对渔业可持续发展和水产品食品安全生产具有重要意义。
本发明在大量分析和试验的基础上，选取MSRV糖蛋白的部分蛋白片段G2，通过原核重组表达获得G2蛋白，并采用甘露糖修饰，制备得到了鲈鱼弹状病毒纳米载靶向性疫苗，研究表明，该疫苗安全、有效，免疫鲈鱼后可产生较好的保护作用，并能使鲈鱼有效抵御MSRV强毒的攻击。
附图说明
图1为PCR扩增CO细胞培养物电泳图。图1中M表示DNA Marker 2000；图1中1表示CO细胞培养物；图1中2表示MSRV阳性质粒样品；图1中3表示阴性对照。
图2为重组质粒pET32a-G2鉴定结果图。图2中a为G2基因PCR扩增产物：M表示DL2000 DNA Marker，1表示G2基因，2表示阴性对照。图2中b为重组表达质粒双酶切分析：M表示DL5000 DNA Marker；1表示pET32a-G2重组质粒；2表示pET32a-G2重组质粒双酶切。
图3为重组蛋白G2的SDS-PAGE检测图。图3中M表示蛋白Marker；图3中1表示未诱导的包含pET32a-G2质粒的E. coli BL21菌体蛋白；图3中2表示IPTG诱导的包含pET32a-G2质粒的E. coli BL21上清中的菌体蛋白；图3中3表示IPTG诱导的包含pET32a-G2质粒的E. coli BL21沉淀中的菌体蛋白。
图4为重组蛋白G2的Western blot检测图。图4中M表示Marker；图4中1表示阴性对照；图4中2表示纯化G2蛋白。
图5为不同蛋白片段免疫后的抗体水平检测结果图。
图6为肝脏和脾脏切片图。图6中A表示正常肝脏；图6中B表示病变肝脏；图6中C表示正常脾脏；图6中D表示病变脾脏。
图7为不同蛋白片段亚单位疫苗的攻毒后存活率（保护率）。
具体实施方式
实施例1：重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2株的构建和鉴定
G2目的基因扩增
参照病毒RNA提取试剂盒说明书，以CO细胞培养的MSRV FJ985株病毒液（MSRVFJ985毒株由西北农林科技大学提供，具体见Fei Yang等，Evaluation on the antiviral activity of ribavirin against Micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV) in vitro and in vivo，Aquaculture，Volume 543，网络公开时间：2021年5月27日）为材料，提取MSRV病毒RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，微量核酸分析仪测定样品RNA浓度和质量。并用反转录试剂盒将提取的RNA样品反转为cDNA。用MSRV-G-F/R和VP7-F/R引物对扩增G2基因，其中MSRV-G-F：5’- GAACTGTGGATGGAATAACG-3’（SEQ ID No：6）；MSRV-G-R：5’-GTCTGACGGCGTACCCAA-3’（SEQ ID No：7）。
取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V电压30分钟。电泳产物切胶、回收、经凝胶回收试剂盒纯化DNA产物，纯化产物与pMD19-T载体连接，将重组产物命名为pMD19T-G2。将转化子转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态中，经蓝白斑筛选获取阳性菌株，并提取质粒进行PCR扩增检测及测序鉴定。G2蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。PCR扩增CO细胞培养物电泳图结果如图1所示。
表达G蛋白的重组大肠埃希氏菌（E. coli BL21/pET32a-G2）的构建
原核表达载体pET32a-G2的构建：将重组pMD19T-G2质粒进行双酶切，并克隆至pET-32a表达载体上相应的酶切位点之间，获得重组质粒pET32a-G2。
重组质粒pET32a-G2的转化与筛选：分别将重组质粒pET32a-G2转化至E. coliBL21（DE3）中，涂布含有氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。然后挑取单菌落进行针对G2的菌落PCR检测鉴定。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪下观察扩增产物目的条带大小，如图2中a所示，与预期的G2 414bp相符的菌落为重组菌E. coli BL21/ pET32a-G2。
重组质粒pET32a-G2的鉴定：将菌落PCR阳性的菌落接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、以180r/min培养12～16小时，按Omega质粒提取试剂盒操作说明进行质粒的提取，测定质粒的浓度后，取8μl质粒溶液、1μL 10×酶切Buffer和各0.5μl限制性内切酶，混匀，37℃酶切5分钟。将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2中b所示。
重组菌E. coli BL21/pET32a-G2的诱导表达
将生产用菌种用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基平皿，37℃静置培养12～16小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时作为一级种子；将一级种子以1%（V/V）接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时作为二级种子。将二级种子按1%（V/V）接种至改良LB培养基，同时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/ml。37℃通气发酵培养5～7小时，溶氧30%～40%，至菌液的OD600值为1.1～1.3时，加入IPTG至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导培养6小时，停止发酵。
菌液处理与超声破碎
发酵产物经管式离心机12000r/min室温离心，收集菌体，用PBS（0.015mol/l，pH7.2）洗涤2次，将收集的菌体按湿菌和PBS溶液（0.015mol/l，pH7.2）质体比1∶9的比例进行重悬，2～8℃高压均质机破碎细菌，细菌连续通过均质机两次以后，将破碎的菌液涂片，使用0.1%结晶紫溶液染色0.5分钟，显微镜下取3～5个视野进行观察，破碎完全时视野内全为细胞碎片而看不到完整的菌体，破碎菌液至细菌的破碎率不再发生变化为止。管式离心机12000r/min室温离心，收集蛋白沉淀。
蛋白的纯化
按每克蛋白沉淀用10ml溶解液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8 M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）的比例进行溶解，室温下200r/min振荡溶解2小时后，4℃10000r/min离心30分钟，收集上清。用平衡缓冲液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8 M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）充分平衡金属（镍Ni2＋）螯合亲和层析柱后，按2倍柱体积上样，再用平衡缓冲液平衡，然后用洗脱缓冲液（0.5mol/L咪唑，0.5 mmol/L氯化钠，8 M尿素，20 mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）洗脱，收集蛋白。将纯化好的200ml蛋白置于SnakeSkin™透析袋（10K MWCO），直接完全浸入到10L的复性液中（150 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、1%吐温-20、10mM β-环糊精、1ML-半胱氨酸，3 mM还原型和1 mM氧化型谷胱甘肽，pH7.9）中，4℃透析12 h，期间，每6h换液一次，透析结束后，收集透析后的蛋白液4℃保存备用。
内毒素去除
向透析后的蛋白液中，加入Triton X-114至终浓度1.5%，4℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，高速离心机17000r/min，离心去除沉淀，收集上清液。上清液按上述方法重复处理三次。
重组蛋白的检测
SDS-PAGE：向破菌后上清及重悬沉淀后溶液加入等体积的2×凝胶上样缓冲液，另取不经超声波破碎，直接加入等体积的2×凝胶上样缓冲液。煮沸10分钟，SDS-PAGE电泳检测，分离胶的丙烯酰胺浓度为15%。考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至条带清晰为止。同时设立不加IPTG诱导的E. coli BL21/pET32a-G2培养物作为对照。结果如图3所示。
鉴定：先将重组蛋白作SDS-PAGE电泳，方法同上。电泳结束后，取一片胶片置于转膜仪上，200mA条件下转膜1小时。将载有蛋白的PVDF膜置于塑料洗盒中，加入25ml的5%脱脂乳在室温下封闭2小时，倒掉脱脂乳，用TBST洗3次后，加入30ml一抗鼠源组氨酸单克隆抗体（抗体稀释液稀释，比例1∶1000），室温缓慢振荡反应2小时，倒掉一抗，用TBST洗5次后，加入30ml辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（抗体稀释液稀释，比例1∶2000稀释），室温缓慢振荡反应2小时，倒掉二抗，用TBST洗5次后，将膜放入平皿中，置于暗室。先加入1ml去离子水，再加入DAB显色液(A液和B液各1滴)，用移液器反复冲洗膜表面1分钟，至显色完全后，用去离子水冲洗、晾干、成像，显色后在约30KDa有特异性条带，表明样品中存在表达正确的G2蛋白。结果如图4所示。
实施例2：重组蛋白的免疫效力评价
在研发过程中，设计了不同的片段，采用实施例1的方法分别制得了不同的糖蛋白片段以及完整的糖蛋白，糖蛋白片段G1（氨基酸序列为SEQ ID No：3）、糖蛋白片段G3（氨基酸序列为SEQ ID No：4）蛋白和完整糖蛋白G（氨基酸序列为SEQ ID No：5），分别验证了以上蛋白片段的免疫效力。具体采用如下免疫效力评价试验：取健康鲈鱼300尾，随机分为6组，包括对照组（PBS）、G1蛋白组（40 mg/L），G2蛋白组（40 mg/L）、G3蛋白组（40 mg/L）、G蛋白组（40 mg/L）、G蛋白组（80 mg/L），所有鲈鱼均通过浴液接种相应的疫苗，浸泡6小时。随后，接种疫苗的鲈鱼被转移到不同的水箱中，并每天进行监测。在每一组中，每周一次选择三条鱼进行取样测试和制备血浆，持续到第四周，使用前血浆储存在−20°C，以含3%脱脂牛奶的PBS稀释的血清作为一级抗体，37℃孵育约1.5小时。然后，以纯化的G蛋白（含his-tag）作为抗原，随后，用1:1500稀释的抗His标记抗体和山羊-小鼠IgG抗体，以TMB为比色底物，测定OD450，分析血清中的平均抗体水平。具体结果如图5所示。基于图5的结果可知，糖蛋白及其片段均在免疫后第21天达到最高的抗体水平，其中本发明所选取的G2片段重组蛋白相对于G1蛋白片段、G3蛋白片段和完整的G蛋白具有更好的免疫原性，因而，本发明的G2重组蛋白是相对最优的亚单位疫苗的抗原蛋白。
实施例3：疫苗制造用中间品的制备
生产种子菌液制备
将重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2株基础菌种用生理盐水稀释后，用接种环挑取少量的菌液，接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时，收获菌液，置-20℃以下保存。
半成品的制备
一级种子的制备：将生产用菌种用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基平皿，37℃静置培养12～16小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时。
二级种子的制备：将一级种子以1%（V/V）接种于LB液体培养基中，置于37℃、以180r/min培养12～16小时。
发酵、表达：将二级种子按1%（V/V）接种至改良LB培养基，同时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/ml。37℃通气发酵培养5～7小时，溶氧30%～40%，至菌液的OD600值为1.1～1.3时，加入IPTG至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导培养6小时，停止发酵。
细菌破碎：发酵产物经管式离心机12000r/min室温离心，收集菌体，用PBS（0.015mol/L，pH 7.2）洗涤2次，将收集的菌体按湿菌和PBS溶液（0.015mol/L，pH 7.2）质体比1∶9的比例进行重悬，2～8℃高压均质机破碎细菌，细菌连续通过均质机两次以后，将破碎的菌液涂片，使用0.1%结晶紫溶液染色0.5分钟，显微镜下取3～5个视野进行观察，破碎完全时视野内全为细胞碎片而看不到完整的菌体，破碎菌液至细菌的破碎率不再发生变化为止。管式离心机12000r/min室温离心，收集蛋白沉淀。
蛋白的纯化：按每克蛋白沉淀用10ml溶解液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8 M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）的比例进行溶解，室温下200r/min振荡溶解2小时后，4℃10000r/min离心30分钟，收集上清。用平衡缓冲液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8 M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）充分平衡金属（镍Ni2＋）螯合亲和层析柱后，按2倍柱体积上样，再用平衡缓冲液平衡，然后用洗脱缓冲液（0.5mol/L咪唑，0.5 mmol/L氯化钠，8 M尿素，20 mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）洗脱，收集蛋白。将纯化好的200ml蛋白置于SnakeSkin™透析袋（10K MWCO），直接完全浸入到10L的复性液中（150 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、1%吐温-20、10mM β-环糊精、1ML-半胱氨酸，3 mM还原型和1 mM氧化型谷胱甘肽，pH7.9）中，4℃透析12 h，期间，每6h换液一次，透析结束后，收集透析后的蛋白液4℃保存备用。
内毒素去除：向透析后的蛋白液中，加入Triton X-114至终浓度1.5%，4℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，高速离心机17000r/min，离心去除沉淀，收集上清液。上清液按上述方法重复处理三次。
中间品检验
蛋白浓度及纯度测定：取去除内毒素后的蛋白，用密度分析法测定目的蛋白浓度及纯度。每毫升蛋白浓度应≥600μg，蛋白纯度应≥60%。
鉴定：取去除内毒素后的蛋白，进行Western-blot检测。应可见30KDa左右的目的条带。
内毒素检测：按现行《中国兽药典》一部附录进行检验，每毫升中间品内毒素含量应≤5000 EU。
实施例4：靶向性碳纳米管载疫苗系统的合成
参照张晨（张晨. 靶向性碳纳米管载疫苗系统防治鲤春病毒血症研究[D].西北农林科技大学,2019.）的方法对甘露糖进行化学修饰（附录1）、对单壁碳纳米管结构进行修饰（正文第11页，2.2.3单壁碳纳米管结构修饰）和制备靶向性碳纳米管载疫苗系统。
功能化甘露糖化学修饰：
（1）向1000mL圆底烧瓶中加入乙酸酐240mL，吡啶200mL，冰盐浴冷却至-10℃，搅拌下缓慢加入D-甘露糖25g，搅拌5h，白色粉末逐渐消失，得无色澄清溶液。溶液摇匀后缓慢倒入含碎冰的4L水中，搅拌至无固体析出，减压抽滤，所得白色固体用水洗后干燥，得白色粉末（五氧乙酰-β-D甘露吡喃糖）；
（2）于500mL三颈瓶中加入对硝基苯酚10g，五氧乙酰-D-吡喃甘露糖10g，50mL甲苯溶液，在氮气保护下缓慢滴加三氟化硼乙醚溶液10mL，常温搅拌反应2h。反应完后用饱和碳酸钠溶液萃取反应液，无水Na2SO4干燥有机相甲苯过夜，抽滤、旋蒸除去甲苯得到黄色液体。柱层析纯化条件为己烷：乙酸乙酯=3：2，再用热乙醇重结晶得到对硝基苯酚-四氧乙酰-吡喃甘露糖。
（3）将5.4g对硝基苯酚-四氧乙酰-D-吡喃甘露糖加入到60mL无水甲醇中，搅拌成混悬液后加入30mM的甲醇钠，室温搅拌5h，旋蒸除去部分甲醇后置于-20℃过夜，析出大量晶体过滤得白色粉末，即对硝基苯酚-D-吡喃甘露糖。
（4）向含有50mL甲醇的250mL圆底烧瓶中加入0.8g对硝基苯酚-D-吡喃甘露糖，搅拌15min后加入100mg钯碳，通入H2室温搅拌6h，过滤，减压浓缩至白色晶体析出等反应。固体上硅胶柱分离纯化，获得对氨基苯酚-α-D-甘露吡喃糖。
（5）向100mL圆底烧瓶中加入30mL无水乙醇与水的混合物（9：1）和1mM（271mg）的对氨基苯酚-D-吡喃甘露糖，冰浴条件下缓慢滴加CSCl2 0.4mL，敞口通N2搅拌反应3h，冰浴条件下用0.1M NaOH调节溶液pH为6.0，减压蒸除溶液得黄色固体，上柱分离纯化（氯仿：甲醇=5：1），减压蒸除溶剂得棕黄色油状液体即为所需产物1-（4-异氰酸酯苯酚）-α-D-甘露吡喃糖。
单壁碳纳米管结构修饰
单壁碳纳米管的功能化修饰采用的是混酸处理法：
（1）将所需的烧杯、玻璃棒、量筒清洗干净，放入 55℃烘箱中烘干。
（2）在通风橱中，量取相应体积的浓硫酸和浓硝酸，体积比为 3：1，将商品化单壁碳纳米管加入混酸中，一边加入一边搅拌，搅拌时，玻璃棒不能碰到烧杯底部和侧壁，再加入转子，在磁力搅拌器中搅拌 48 h。
（3）将上一步反应后的溶液，用纯水进行稀释后，进行超声处理，至溶液成中性为止，用 0.22 的滤膜进行抽滤，最后用无水乙醇对抽滤后的沉淀进行洗涤。
（4）将洗涤后的氧化单壁碳纳米管沉淀放置烘箱中烘干水分后，在研钵中研磨成粉末状，过 300 目的筛子，即得氧化单壁碳纳米管（o-SWCNTs），之后分装密封备用。
碳纳米管递送系统制备
（1）将上步制得的功能化甘露糖用PBS溶解至1mg/ml，取G2蛋白溶液用PBS稀释至目的蛋白为360μg/ml，随后以功能化甘露糖溶液∶G2蛋白溶液=1∶30（V/V）的比例混合，室温80r/min搅拌24小时，所得产物经透析、冻干即可获得甘露糖糖基化G2蛋白粗产物，粗产物经凝胶过滤纯化用于后续反应。
（2）采用缩合酰化法，在800mL 2-（N-吗非啉）乙磺酸缓冲液（0.1M，pH=5.6）中加入6g功能化碳纳米管，用玻璃棒将混合液搅拌均匀，同时对混合液进行超声处理20min。
（3）分别称取18g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和24g N-羰基琥珀酸亚胺，加入分散均匀的碳纳米管混合液中，加的时候要用玻璃棒对其进行搅拌，使其充分混合，同时进行超声处理2h，超声的时候，每超声0.5h，暂停10min，及时更换超声清洗器中的水，避免水发热过严重。
（4）在上述分散后的溶液以12000g离心30min，弃上清。用pH=7.4的PBS溶液对沉淀进行洗涤，洗涤3次后，将沉淀溶解于2000mL，pH=7.4的PBS溶液中。
（5）称取5g甘露糖糖基化G2蛋白，加入上一步的溶液中，边加入边搅拌，搅拌的时候应避免产生气泡，搅拌幅度不宜过大，接着进行1.5h超声分散。
（6）超声后，加入转子，在避光环境下，将混合液在旋转搅拌器中搅拌48h。
（7）反应产物转入透析袋（10万）中透析2d。透析后，将产物以12000g离心30min，弃上清。得到的固体沉淀进行冷冻干燥，即得靶向性碳纳米管载疫苗系统（SWCNTs-MG），于-20℃冰箱保存。
半成品的配制：
按50mg干燥的固体沉淀加入1ml PBS的比例混合，制成蛋白混悬液置于-15℃以下保存。
蛋白灭活：向蛋白混悬液中加入甲醛至终浓度0.07%，2～8℃灭活72小时。
半成品检验
无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
内毒素检测按现行《中国兽药典》一部附录进行检验，每毫升半成品内毒素含量应≤5000EU。
疫苗制备
乳化：按蛋白混悬液∶丙三醇=2∶3（V/V）的比例配制混合液，100r/min搅拌30分钟，即可制成目的蛋白浓度5mg/ml的疫苗。
分装：定量分装，轧盖，贴标。
实施例5成品检验
性状：黑色混悬液。久置后底部有少量沉淀，振荡后呈均匀混悬液。
装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
内毒素检测：按现行《中国兽药典》一部附录进行检验，每毫升疫苗内毒素含量应≤5000EU。
安全检验：取0.5～1g（60日龄以上）健康鲈鱼150尾，分为免疫组1、免疫组2和对照组，每组50尾。免疫组免疫剂量为2ml/L，分别采用20180121和20180125批次疫苗进行免疫，对照组用生理盐水代替疫苗，浸泡免疫6小时后转入正常养殖水体，连续观察14日，试验鲈鱼应全部健活。若出现非特异性死亡，免疫组死亡数应不超过5尾，且与对照组死亡数之和应不超过10尾。结果如表1所示。
表1 两批次疫苗接种试验鲈鱼临床观察结果
批号
摄食
游动
精神状态
临床反应
各部位观察
20180121
50/50正常
50/50正常
50/50正常
50/50无不良反应
50/50无异常反应
20180125
50/50正常
50/50正常
50/50正常
50/50无不良反应
50/50无异常反应
对照组
49/50正常
49/50正常
49/50正常
49/50无不良反应
49/50无异常反应
甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
实施例6：疫苗免疫效力评价
效力检验-免疫攻毒保护：取0.5～1g（60日龄以上）健康鲈鱼100尾，分为2组（50尾/组），其中1组为免疫组，1组为对照组。试验组免疫剂量均为1ml/L（重组蛋白含量5mg/L），对照组用生理盐水代替疫苗，浸泡免疫6小时后转入正常养殖水体，连续观察21天后分别以鲈鱼弹状病毒FJ985株进行腹腔注射攻毒，15μl（病毒含量为100TCID50/ml）/尾。攻毒后连续观察14日，定时检查、记录发病情况；死亡鲈鱼随时剖检，至观察期结束，剖杀所有鲈鱼，观察各脏器病变情况。
攻毒后观察攻毒后连续观察14天，每天定时检查、记录发病死亡情况，结果表明，蛋白浸泡免疫鲈鱼21天后攻毒MSRVFJ985毒株，鲈鱼免疫保护率为94%，观察记录见表2。
表2免疫攻毒MSRVFJ985毒株保护结果
剖检死亡鱼随时剖杀并进行标记，观察期结束后，剖杀所有试验鱼，观察各脏器病变情况。结果表明，免疫组发病鲈鱼脏器可见病变情况，对照组试验鲈鱼脏器出现明显病变情况。切片图可见正常肝脏排列紧密，结构完整，病变肝脏胞质溶解，细胞间隙增大，排列紊乱且有出血现象；正常脾脏可见清晰被膜和脾索，病变脾脏被膜不完整且出现空泡化现象。详见表3和图6。
表3免疫攻毒保护试验剖检观察记录表
由此可知制备的鲈鱼弹状病毒基因工程亚单位灭活疫苗（E.coli-G2株）能保护鲈鱼抵抗强毒MSRV株的攻击。
不同蛋白片段所制备疫苗的免疫效力评价
在疫苗开发过程中，设计了不同的片段，分别制得了不同的糖蛋白片段以及完整的糖蛋白，分别为G1（氨基酸序列为SEQIDNo：3）、G2（氨基酸序列为SEQIDNo：2）、G3（氨基酸序列为SEQIDNo：4）蛋白和糖蛋白（SEQIDNo：5），并分别按照以上方法制备得到基于所述糖蛋白片段的碳纳米管疫苗，其中G2的蛋白对应以上实施例2的疫苗，G1、G3和G蛋白制得的疫苗分别命名为G1疫苗、G3疫苗和G疫苗，分别进行免疫效力评价。
取0.5～1g（60日龄以上）健康鲈鱼300尾，分为5组（50尾/组），其中第1组~第5组为免疫组，第6组为对照组。试验组免疫剂量均为1ml/L（重组蛋白含量5mg/L），对照组用生理盐水代替疫苗，浸泡免疫6小时后转入正常养殖水体，连续观察21天后分别以鲈鱼弹状病毒FJ985株进行腹腔注射攻毒，15μl（病毒含量为100TCID50/ml）/尾。攻毒后连续观察15日，定时检查、记录攻毒后第3、6、9、12、15天死亡率。具体结果如下图7所示。
基于以上试验可知，从截断的G蛋白片段和完整G蛋白所制备的疫苗的免疫效力评价来看，其中G2蛋白组的攻毒后的保护率最高，其攻毒后存活率高达96%，而G1和G3段白片段以及完整G蛋白所制备得到的疫苗的保护效力相对较低，完整G蛋白和G3片段的保护率高于80%，而G1片段的第12天和第15天的保护率不足70%，由此可见，本发明所制备得到的基于G2蛋白片段的疫苗具有最高的攻毒保护率，其对鱼苗的保护率高达96%。
以上记载的仅为本发明的优选实施例，不能以此来限定本发明之权利范围，因此，依据本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 深圳万可森生物科技有限公司
<120> 一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗及其制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 420
<212> DNA/RNA
<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgaactgtg gatggaataa cgtgttgact gagtcccaag aattcaccac tttgacttca 60
caccctgtta aattggatgc ctactctttc atattaattg acagcatgtt tgagggagga 120
cggtgtcaat caaaagagtg tcctgtggtg ttccatcaag ggatgtggat tgctgatcaa 180
gaagctttcg gattttgcaa agacttggac aaacacaggg gactactttt caaaactgga 240
ttgaggaatt cactgggaga aattgtcaga caagagtgga atctgaattc ggtattccag 300
ccagagatag gaagggaaaa acatttcaag ggtgcctgta aaatgtcgta ctgcgggaat 360
tcaggggtta gattttctga tagagagtgg tttcaattgg gtacgccgtc agacaattga 420
<210> 2
<211> 139
<212> PRT
<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Asn Cys Gly Trp Asn Asn Val Leu Thr Glu Ser Gln Glu Phe Thr
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ser His Pro Val Lys Leu Asp Ala Tyr Ser Phe Ile Leu
20 25 30
Ile Asp Ser Met Phe Glu Gly Gly Arg Cys Gln Ser Lys Glu Cys Pro
35 40 45
Val Val Phe His Gln Gly Met Trp Ile Ala Asp Gln Glu Ala Phe Gly
50 55 60
Phe Cys Lys Asp Leu Asp Lys His Arg Gly Leu Leu Phe Lys Thr Gly
65 70 75 80
Leu Arg Asn Ser Leu Gly Glu Ile Val Arg Gln Glu Trp Asn Leu Asn
85 90 95
Ser Val Phe Gln Pro Glu Ile Gly Arg Glu Lys His Phe Lys Gly Ala
100 105 110
Cys Lys Met Ser Tyr Cys Gly Asn Ser Gly Val Arg Phe Ser Asp Arg
115 120 125
Glu Trp Phe Gln Leu Gly Thr Pro Ser Asp Asn
130 135
<210> 3
<211> 141
<212> PRT
<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Met Gln Glu Val Arg Arg Ala Arg Glu Thr Lys Ala Val Ser Asp Trp
1 5 10 15
Leu Leu Ser Met Met Ser Pro Phe Ser Glu Gly Ile Gly Lys Val Tyr
20 25 30
Arg Ile His Arg Gly Met Leu Glu Ser Thr Val Gly Phe Tyr Arg Lys
35 40 45
Val Val Leu Glu Gly Asp Gly Thr Pro Glu Arg Leu Gly Val Gly Leu
50 55 60
Asp Lys Lys Pro Val Ser Trp Asp Gln Phe Val Val Lys Thr Asn Asp
65 70 75 80
Thr Arg Ile Gln Ser Met Phe Asn Gly Asn Thr Val Val Asn Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Trp Val Lys Asn Val Leu Gly Ala His Ile Leu Asp Glu Ile
100 105 110
Ser Ala Leu Glu Phe Asp Val Pro Leu Ile Pro His Pro His Leu Asp
115 120 125
Gly Leu Lys Phe Asn Glu Ser His Thr Ile Ser Ser His
130 135 140
<210> 4
<211> 141
<212> PRT
<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
Met Arg Phe Ser Asp Arg Glu Trp Phe Gln Leu Gly Thr Pro Ser Asp
1 5 10 15
Asn Gly Ile Lys Lys Ile Ile Glu Gly Leu Pro Glu Cys Gly Glu Asp
20 25 30
Asn Leu Ile His Ser His Asp Thr Ser Asn Thr Leu Lys Glu Leu Ala
35 40 45
Glu His Val Asp Glu Ile Ala Leu Asn Ala Ile Cys Leu Gln Glu Val
50 55 60
Arg Arg Ala Arg Glu Thr Lys Ala Val Ser Asp Trp Leu Leu Ser Met
65 70 75 80
Met Ser Pro Phe Ser Glu Gly Ile Gly Lys Val Tyr Arg Ile His Arg
85 90 95
Gly Met Leu Glu Ser Thr Val Gly Phe Tyr Arg Lys Val Val Leu Glu
100 105 110
Gly Asp Gly Thr Pro Glu Arg Leu Gly Val Gly Leu Asp Lys Lys Pro
115 120 125
Val Ser Trp Asp Gln Phe Val Val Lys Thr Asn Asp Thr
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<210> 5
<211> 519
<212> PRT
<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
Met Asn Thr Leu Ile Lys Ile Leu Leu Ile Ile Ile Ile Leu Arg Glu
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Ala Arg Ser His Ile Val Leu Val Pro Leu Asp Leu Gly Glu Trp Arg
20 25 30
Thr Thr Glu Ala Asp Gln Leu Asp Cys Pro Met His Gly Asp Leu Ser
35 40 45
Asn Gln Gly Thr Gln Ala Ile Glu Leu Glu Tyr His Thr Ala Ser Trp
50 55 60
Gly Leu Lys Asn Asn Ile Ala Gly Ser Leu Cys Val Thr Ala Lys Trp
65 70 75 80
Ser Ile Thr Cys Asp Tyr Arg Trp Tyr Gly Ser Lys Tyr Ile Ser Thr
85 90 95
Val Ile Glu Tyr Leu Pro Thr Thr Pro Glu Met Cys Lys Glu Ala Lys
100 105 110
Arg Ala Ser Asp Arg Gly Glu Ser Leu Ala Pro His Phe Pro Thr Glu
115 120 125
Asn Cys Gly Trp Asn Asn Val Leu Thr Glu Ser Gln Glu Phe Thr Thr
130 135 140
Leu Thr Ser His Pro Val Lys Leu Asp Ala Tyr Ser Phe Ile Leu Ile
145 150 155 160
Asp Ser Met Phe Glu Gly Gly Arg Cys Gln Ser Lys Glu Cys Pro Val
165 170 175
Val Phe His Gln Gly Met Trp Ile Ala Asp Gln Glu Ala Phe Gly Phe
180 185 190
Cys Lys Asp Leu Asp Lys His Arg Gly Leu Leu Phe Lys Thr Gly Leu
195 200 205
Arg Asn Ser Leu Gly Glu Ile Val Arg Gln Glu Trp Asn Leu Asn Ser
210 215 220
Val Phe Gln Pro Glu Ile Gly Arg Glu Lys His Phe Lys Gly Ala Cys
225 230 235 240
Lys Met Ser Tyr Cys Gly Asn Ser Gly Val Arg Phe Ser Asp Arg Glu
245 250 255
Trp Phe Gln Leu Gly Thr Pro Ser Asp Asn Gly Ile Lys Lys Ile Ile
260 265 270
Glu Gly Leu Pro Glu Cys Gly Glu Asp Asn Leu Ile His Ser His Asp
275 280 285
Thr Ser Asn Thr Leu Lys Glu Leu Ala Glu His Val Asp Glu Ile Ala
290 295 300
Leu Asn Ala Ile Cys Leu Gln Glu Val Arg Arg Ala Arg Glu Thr Lys
305 310 315 320
Ala Val Ser Asp Trp Leu Leu Ser Met Met Ser Pro Phe Ser Glu Gly
325 330 335
Ile Gly Lys Val Tyr Arg Ile His Arg Gly Met Leu Glu Ser Thr Val
340 345 350
Gly Phe Tyr Arg Lys Val Val Leu Glu Gly Asp Gly Thr Pro Glu Arg
355 360 365
Leu Gly Val Gly Leu Asp Lys Lys Pro Val Ser Trp Asp Gln Phe Val
370 375 380
Val Lys Thr Asn Asp Thr Arg Ile Gln Ser Met Phe Asn Gly Asn Thr
385 390 395 400
Val Val Asn Gly Lys Ile Lys Trp Val Lys Asn Val Leu Gly Ala His
405 410 415
Ile Leu Asp Glu Ile Ser Ala Leu Glu Phe Asp Val Pro Leu Ile Pro
420 425 430
His Pro His Leu Asp Gly Leu Lys Phe Asn Glu Ser His Thr Ile Ser
435 440 445
Ser His His Pro Asn Gly Lys Gly Val Asn Phe Val Glu Ser Val Thr
450 455 460
His Trp Ala Gly Gly Leu Trp Glu Ser Ile Gly Ser Ser Ala Val Ile
465 470 475 480
Ile Val Val Leu Leu Ile Cys Ala Phe Val Ala Val Lys Phe Cys Gln
485 490 495
Arg Leu Val Pro Ser Arg Arg Pro Pro Thr Arg Glu Ser Ser Glu Asn
500 505 510
Val Phe Met Leu Arg Thr Val
515
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
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<210> 7
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 鲈鱼弹状病毒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
gtctgacggc gtacccaa 18
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