一种covid-19重组蛋白疫苗组合物及应用
阅读说明：本技术 一种covid-19重组蛋白疫苗组合物及应用 (COVID-19 recombinant protein vaccine composition and application ) 是由 高强 王治伟 郑泽宇 范鑫 张玮 戈小琴 李雅静 吕哲 于 2020-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种COVID-19重组蛋白疫苗组合物,其包含新型CpG寡聚脱氧核苷酸作为佐剂。本发明使用的新型CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂与COVID-19重组蛋白疫苗按配方组合后,可产生强烈的免疫效果,可以很大程度的延长COVID-19重组蛋白疫苗在体内的滞留时间,降低各种水解酶对其的水解作用；所述重组蛋白疫苗组合物的制备方法简单,质量易于控制,易于规模化生产；且安全性好,毒副作用低,特别适合在各类人群、包括中老年等免疫功能低下的人群中用于新型冠状病毒COVID-19的预防和治疗。(The invention discloses a COVID-19 recombinant protein vaccine composition which contains novel CpG oligodeoxynucleotide as an adjuvant. After the novel CpG oligodeoxynucleotide adjuvant used by the invention is combined with the COVID-19 recombinant protein vaccine according to a formula, a strong immune effect can be generated, the retention time of the COVID-19 recombinant protein vaccine in vivo can be prolonged to a great extent, and the hydrolysis effect of various hydrolytic enzymes on the vaccine can be reduced; the preparation method of the recombinant protein vaccine composition is simple, the quality is easy to control, and the large-scale production is easy to realize; and the composition has good safety and low toxic and side effects, and is particularly suitable for preventing and treating the novel coronavirus COVID-19 in various crowds, including middle-aged and old people with low immune function.)
技术领域
本发明涉及流行病预防及疫苗生产领域，具体涉及一种COVID-19重组蛋白疫苗组合物及其应用。
背景技术
冠状病毒COVID-19是一种新型冠状病毒，属于冠状病毒β家族，可经呼吸道飞沫传播、接触和粪-口传播等途径传播，在人群中极易感染。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。截至2020年4月16日，全球累计确诊超过200万例，累计死亡超过13万例，亟需开发新冠病毒疫苗阻断病毒传播，保护全球人民健康。
目前应用于人体的预防病毒感染的疫苗主要包括采用病毒经减毒后制备的减毒活疫苗，如水痘减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗等；以及灭活全病毒颗粒疫苗，如肠道病毒EV71型灭活疫苗、甲型肝炎疫苗等。然而，减毒疫苗要费很长时间使病毒繁殖许多代，然后逐渐减除病毒的大部分活性，难以满足急性传染病的预防需要。灭活疫苗则在免疫病理方面存在许多难以解决的问题，例如有些灭活病毒进入人体会在病毒入侵时加重病情。
重组蛋白疫苗是将病毒的目的抗原基因构建在表达载体上，再转化到细菌、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中，在一定的诱导条件下，表达出大量的抗原蛋白，通过纯化后制备的疫苗。重组蛋白疫苗能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并且可以快速制备。
在疫苗研制过程中，为了制备安全有效的疫苗，必须考虑佐剂的使用。佐剂与疫苗成份的配伍，使二者形成稳定、安全、具有免疫原性的疫苗复合物。因此，对疫苗使用的佐剂进行研究一直是疫苗研究过程中的重要环节。佐剂作为非特异性免疫增强剂对疫苗接种后诱导有效的免疫应答，发挥着至关重要的作用。
传统铝盐佐剂，包括氢氧化铝和磷酸铝和其组合物的应用最为广泛。尽管上述佐剂被广泛批准应用于疫苗制备中，但在实际应用中，单独使用低剂量的铝盐佐剂对疫苗的免疫增强作用有限，而提高剂量的铝盐佐剂在使用时常出现注射部位肿胀、出现肉芽肿、发烧、疼痛、发生过敏等副反应。因此，研制更为广谱、安全、高效，同时便于生产和使用的理想疫苗佐剂迫在眉睫。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种COVID-19重组蛋白疫苗组合物及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种COVID-19重组蛋白疫苗组合物，其包含CpG寡聚脱氧核苷酸作为佐剂。
CpG是指由胞嘧啶(cytosine,C)与鸟嘌呤(guanine，G)经磷酸二酯键(phosphodiesterbonds，p)相连组成的二核苷酸，CpG二核苷酸及其5'端和3'端的各两个碱基构成CpG基序(CpG motifs)。该特定的寡聚脱氧核苷酸作为COVID-19重组疫苗组合物的佐剂，能起到增强免疫效果，延长免疫时间，减少抗原用量的目的。
优选地，所述重组蛋白疫苗包含(1)COVID-19的S蛋白的受体结合结构域和(2)IgG的Fc片段。
优选地，所述重组蛋白疫苗包含S蛋白的ACE2受体结合结构域和/或表面抗原决定簇；所述S蛋白为SARS的S蛋白或COVID-19的S蛋白。
优选的，所述重组蛋白疫苗包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的一个或多个氨基酸序列，或与其同一性为90％以上的氨基酸序列。
上述氨基酸序列参见本发明的序列表，具体如下表1所示。
表1：氨基酸序列
作为本发明的优选实施方案，所述重组蛋白疫苗中抗原有效成分的含量为1～80μg/剂；优选地，所述重组蛋白疫苗中抗原有效成分的含量为2.5μg/剂、10μg/剂、40μg/剂或80μg/剂。
作为本发明的优选实施方案，所述重组蛋白疫苗中CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂的含量为0.25～5mg/剂；优选地，所述重组蛋白疫苗中CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂的含量为0.25mg/剂、1mg/剂、2mg/剂或5mg/剂。
本发明对新型CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂与COVID-19重组疫苗的结合配比方案进行了研究，确定了最高效的配比方案。使用该方案的COVID-19重组疫苗可产生强烈的免疫应答效益。
作为本发明的优选实施方案，所述重组蛋白疫苗组合物为液体疫苗，优选为肌肉内液体注射剂、鼻腔内液体喷剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。
在实际应用时，可以根据转染效率、局部免疫监视等临床需要进行调整和选择，如选择单一的剂型进行注射免疫，或者选择多种混合剂型进行注射免疫。
本发明的第二个目的是提供所述COVID-19重组蛋白疫苗组合物在制备用于预防和/或治疗COVID-19感染引起的疾病的药物中的应用，优选地，所述疾病为肺炎及综合征、严重急性呼吸道感染、肠道疾病、心脏衰竭、肾衰竭或严重急性呼吸道综合征。
本发明的第三个目的是提供CpG寡聚脱氧核苷酸作为COVID-19重组蛋白疫苗的免疫增强剂或免疫佐剂的应用，或在提高COVID-19重组蛋白疫苗的抗原或疫苗的免疫原性中的应用。
作为本发明的优选实施方案，所述CpG寡聚脱氧核苷酸的所有核苷酸均为硫代修饰，且所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有至少2个CpG单元，其链长至少为20bp；优选地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸序列为：
5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:7)；或
5’-TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC-3’(SEQ ID NO:8)；或
5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO:9)。
本发明提供的重组蛋白疫苗能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。且本发明提供的重组蛋白疫苗可以快速制备，适用于新型冠状病毒COVID-19的疫情的控制。
本发明的重组蛋白疫苗组合物的制备方法简单，质量易于控制，易于规模化生产。可用于有效预防和治疗新型冠状病毒COVID-19感染引起的肺炎及综合征，甚至是严重呼吸道感染。为在我国乃至全世界范围内的疾病的防控提供了技术保障。
附图说明
图1为不同CpG佐剂的COVID-19重组疫苗免疫BALB/c小鼠的血清IgG效价示意图；左侧的柱形表示7天的效价，右侧的柱形表示14天的效价。
图2为血清中特异性表达S蛋白细胞因子的结果示意图。
具体实施方式
以下各实施例中CpG寡聚脱氧核苷酸采用SEQ ID NO:7的核苷酸序列：
SEQ ID NO:7
5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’。
以下各实施例中重组蛋白疫苗的抗原具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列：
SEQ ID NO:6
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAASVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。
具体为：将CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂加入经0.22μm滤膜过滤的疫苗原液，使佐剂浓度为0.5mg/剂，疫苗抗原含量5μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200401。
实施例2
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为0.5mg/剂，疫苗抗原含量10μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200402。
实施例3
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为0.5mg/剂，疫苗抗原含量20μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200403。
实施例4
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为0.5mg/剂，疫苗抗原含量40μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200404。
实施例5
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为3mg/剂，疫苗抗原含量5μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200405。
实施例6
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为3mg/剂，疫苗抗原含量10μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200406。
实施例7
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为3mg/剂，疫苗抗原含量20μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200407。
实施例8
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为3mg/剂，疫苗抗原含量40μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200408。
实施例9
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为1mg/剂，疫苗抗原含量5μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200409。
实施例10
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为1mg/剂，疫苗抗原含量10μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200410。
实施例11
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为1mg/剂，疫苗抗原含量20μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200411。
实施例12
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为1mg/剂，疫苗抗原含量40μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200412。
实施例13
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为5mg/剂，疫苗抗原含量5μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200413。
实施例14
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为5mg/剂，疫苗抗原含量10μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200414。
实施例15
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为5mg/剂，疫苗抗原含量20μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200415。
实施例16
本实施例提供了一种使用CpG寡聚脱氧核苷酸佐剂和新型冠状病毒COVID-19重组疫苗的组合方式。该疫苗为液体疫苗，其中佐剂浓度为5mg/剂，疫苗抗原含量40μg/剂。将本实施例所得疫苗编号记为20200416。
实验例1：佐剂效果在小鼠模型上的免疫学评价
(1)中和抗体效价测定
按照表2所示，将实施例中提供的8组疫苗分别用生理盐水做1:4、1:16、1:64稀释，使用1mL注射器，接种BALB/c小鼠，每组10只，按照0，7天免疫，每只腹腔注射一个剂量，第1次免疫后4周采血，检测中和抗体。中和抗体效价GMT大于8的视为阳性，视为有保护效果。结果如表3所示。
表2：佐剂效果在小鼠模型上的免疫学评价实验设计
实施例
疫苗编号
抗原含量(μg/剂)
CpG佐剂含量(mg/剂)
1
20200401
5
0.5
2
20200402
10
0.5
3
20200403
20
0.5
4
20200404
40
0.5
5
20200405
5
3
6
20200406
10
3
7
20200407
20
3
8
20200408
40
3
表3：不同CpG佐剂的COVID-19重组疫苗免疫BALB/c小鼠的中和效价
结果显示，上述不同有效成分和佐剂含量的COVID-19疫苗免疫BALB/c小鼠，均能产生足够高的中和抗体效价。佐剂含量高的疫苗免疫原性相对高于含量低的同样有效成份的疫苗。本发明提供疫苗均能诱导BALB/c小鼠产生有保护能力的中和抗体。
(2)IgG抗体效价测定
按照表2所示，将实施例中提供的8组疫苗进行IgG抗体效价测定。IgG抗体效价检测方法如下：
将新冠病毒按蛋白浓度1μg/ml 100μl/孔，包被于酶标板，2-8℃包被过夜或37℃包被2小时以上，洗板拍干，采用含1％BSA或10％小牛血清的0.01M PBS进行封闭，200μl/孔封闭，37℃封闭1-2小时，甩去其中液体，排干待用。将待检样品及阴性血清对照采用上述封闭液系列稀释，100μl每孔加入封闭后的酶标板，37℃孵育60-70分钟，洗板拍干；加入对应抗种属的HRP酶标抗体，37℃孵育45-60分钟，洗板拍干；加入显色A/B液各50μl，37℃显色10-15分钟后，加入2M H2SO4终止。结果分析：样品OD值≥阴性血清相同稀释倍数下OD值的2.1倍时的最高稀释倍数即为样品的IgG抗体效价。若阴性对照OD值小于0.05，则按0.05计算。
结果如图1所示。
实验例2：细胞因子检测
将表2中的疫苗按照0、7天免疫，28天采血的程序分别免疫BALB/c小鼠，采集细胞上清进行细胞免疫检测。采用细胞内细胞因子染色法和流式细胞法检测血清中特异性表达S蛋白细胞因子的CD4+T细胞。
(1)脾淋巴细胞的分离
颈椎脱臼处死小鼠，于70％酒精浸泡约3min。将小鼠于生物安全柜内无菌取出脾脏，放到置于无菌平皿中的200目细胞筛上。加入10mL RPMI1640完全培养基，用注射器活塞将脾轻柔地研磨成单个细胞，再用10mL RPMI1640完全培养基冲洗细胞筛，以获得更多的脾细胞。将脾细胞悬液转移至50mL离心管中，500g水平离心5min。弃上清，细胞用3m|1×红细胞裂解液重悬，室温裂解5min，加入27mL RPMI1640完全培养基，500g水平离心5min。弃上清，细胞再用20mL RPMI1640完全培养基清洗一次，用适量培养基重悬，经200目细胞筛过滤至10mL试管中，取50μL稀释20倍后进行计数，待用。
(2)小鼠脾细胞的体外刺激
将以上分离的小鼠脾细胞取适量稀释至4×106cells/mL，每孔0.5mL加入到24孔板中。每只小鼠分别设置特异CTL表位刺激孔和无刺激孔。特异表位浓度为每条肽2μg/mL，无刺激加入等量的DMSO。作为阳性对照，加入PMA和ionomycin刺激孔，其中PMA浓度为100ng/mL，ionomycin浓度为1μg/mL。同时每孔加入1μL Brilliant Violet 421TM anti-mouse CD107a。细胞于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养1小时后，每孔各加入适量的GolgiStop和(或)GolgiPlug作为细胞因子分泌的阻断剂。总共培养6小时后进行相关抗原的染色，用于细胞内细胞因子的流式细胞术检测。
(3)细胞表面抗原和细胞内细胞因子染色
脾细胞经体外刺激6小时后，转移至流式管中，4℃，500g离心5分钟，弃上清。用PBS+2％FBS按说明书推荐的使用量先稀释好适量的荧光标记抗体PerCP/Cy5.5-conjugatedanti-CD3(clone 145-2c11)和FITC conjugated anti-CD8(clone 53-6.7)，每管加入50μL，轻轻混匀，4℃放置30分钟。30分钟后，每管加入3mL PBS+2％FBS，4℃，500g离心5分钟，弃上清。每管加入200μL Cytofix/CytopermTM Fixation and Permeabilizaiton Solution，于4℃放置20分钟，对细胞进行固定和穿孔。20分钟后，每管加入1mL1×Perm/WashTMBuffer，4℃，600g离心5分钟，弃上清。用1×Perm/WashTM Buffer按说明书推荐使用量先稀释好适量的PE conjugated anti-IFN-γ(clone XMG1.2)抗体，每管加50μL，轻轻混匀，于4℃放置30分钟。最后，每管分别用1mL1×Perm/WashTM Buffer和3mL的PBS各洗一次，弃上清后用200μL PBS重悬，上机检测。为了在检测时调节各染料间的荧光补偿，设置不染色管、单染PerCP/Cy5.5-conjugated anti-CD3管、单染FITC conjugated anti-CD8管和单染PEconjugated anti-IFN-γ管，其中PE conjugated anti-IFN-γ单染管使用的是阳性刺激的细胞。
(4)流式细胞术检测
使用BD FACS CantoTM进行流式细胞术检测。首先各通道调节合适的电压，使用单荧光染色样品调节各染料间的荧光补偿，然后依次上样，收集数据。
(5)细胞内细胞因子染色流式细胞术检测结果
细胞内细胞因子染色流式细胞术检测结果显示，免疫小鼠的脾细胞经表位刺激后，CD4+T细胞可大量分泌IFNγ和IL-2细胞因子，表达水平显著高于对照组。结果如图2所示。
结果显示，在本发明提供的抗原含量范围内的疫苗均能引起良好的细胞免疫。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京科兴中维生物技术有限公司
<120> 一种COVID-19重组蛋白疫苗组合物及应用
<130> RYP2010643.6
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 2
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
1 5 10 15
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
20 25 30
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
35 40 45
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
65 70 75 80
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
85 90 95
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
100 105 110
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
115 120 125
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
130 135 140
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
145 150 155 160
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
165 170 175
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
180 185 190
Cys Gly Pro Lys Lys Ser
195
<210> 3
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
1 5 10 15
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
20 25 30
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
35 40 45
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
65 70 75 80
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
85 90 95
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
100 105 110
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
115 120 125
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
130 135 140
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tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
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