阅读说明：本技术 Crispr-cas9修饰的cd34+人血色素干细胞和祖细胞及其用途 (CRISPR-CAS9 modified CD34+ human pigment stem cells and progenitor cells and application thereof ) 是由 E.莫拉瓦 T.查克拉博蒂 A.S.伦德伯格 T.霍 L.桑德勒 B.尤斯塔斯 J.罗瑟 于 2018-12-05 设计创作，主要内容包括：在一些实施方案中,本文提供使用自体CRISPR-Cas9修饰的CD34+人造血干细胞和祖细胞治疗患有β-地中海贫血的受试者和患有严重镰状细胞病的受试者的方法和组合物。(In some embodiments, provided herein are methods and compositions for treating subjects with β -thalassemia and subjects with severe sickle cell disease using autologous CRISPR-Cas9 modified CD34+ human hematopoietic stem and progenitor cells.)

CRISPR-CAS9修饰的CD34+人血色素干细胞和祖细胞及其用途

相关申请

本申请要求2017年12月5日提交的美国临时申请序列号62/594,689、2018年4月27日提交的美国临时申请序列号62/664,023、2018年5月15日提交的美国临时申请序列号62/671,770、2018年9月21日提交的美国临时申请序列号62/734,431和2018年9月21日提交的美国临时申请序列号62/734,543在35 U.S.C.§119(e)下的权益，其各自的内容以引用的方式整体并入本文中。

背景技术

血红蛋白(Hb)是由四种珠蛋白肽形成的四聚体，每种珠蛋白肽与含有铁原子的血红素基团紧密结合。在妊娠期间，血红蛋白的主要形式是胎儿血红蛋白(HbF)，其由两条α-珠蛋白链和两条γ-珠蛋白链组成。在出生前不久，存在从HbF到成人血红蛋白的转换，成人血红蛋白含有两个α-球蛋白多肽链和两个β-球蛋白多肽链。从HbF到成人血红蛋白的转换是由位于染色体11上的β-珠蛋白基因簇内的从γ-珠蛋白到β-珠蛋白的转录转换介导的。

血红蛋白病是由影响血红蛋白分子的产生或功能的遗传缺陷引起的病症。血红蛋白病中最常见的两种是β-地中海贫血和镰状细胞病(SCD)。

β-地中海贫血是世界范围内最常见的常染色体隐性疾病之一，在地中海(5-15％)、中东和西亚(2-5％)、东南亚(高达10％)和南亚(高达18％)人群中具有高患病率(Colah，R.等，2010.Expert Rev Hematol 3，103-117)。由于群体迁移，在北欧、北美和南美、加勒比海和澳大利亚也发现了β-地中海贫血。目前，估计全世界β-地中海贫血主要患者群体有200,000名，他们已登记并接受治疗(Galanello，R.，Origa，R.，2010.Orphanet JRare Dis 5，11.)。

β-地中海贫血是由导致成人血红蛋白(HbA)产生减少或缺乏的一系列突变引起的。在发育的不同阶段产生不同形式的Hb。胎儿血红蛋白(HbF)是出生前并延续到新生儿期的主要Hb。HbF是含有2个γ-珠蛋白链和2个α-珠蛋白链的四聚体珠蛋白(a2γ2)。新生儿期后，Hb的主要形式是HbA，即由2个β-珠蛋白链和2个α-珠蛋白链组成的异四聚体(α2β2)。HbA通常占成人血液中总Hb的＞95％。

输血依赖性β-地中海贫血(TDT)的治疗特别包括每3-6周进行的终身输血。输血疗法的目的是保持Hb水平≥9g/dL，以便改善严重贫血的症状和生理后遗症，并维持正常生长和发育。尽管慢性输血方案在预防疾病的标志性症状和身体表现方面是有效的，但它们引入了大的铁超载，其可以因铁相关的心脏和肝毒性而导致死亡。为了防止这种情况，用通常在早期起始的铁螯合方案来控制铁超载。对螯合方案的依从性差仍然是一项关键挑战。尽管目前的疗法有所改进，但生活质量差且到30岁的总存活率仅为55％。

SCD是影响数百万人的最常见的单基因病症之一。据估计美国有超过100,000人受到影响，并且欧洲有约42,000人受到影响。SCD的最严重且最流行的形式，称为镰状细胞性贫血，是一种由于纯合突变引起的常染色体隐性疾病，在所述纯合突变中缬氨酸置换β-球蛋白中6位处的谷氨酸，导致脱氧血红蛋白聚合和红细胞(RBC)镰状化。

SCD是一种慢性疾病，其特征在于复发性急性VOC，导致急性疼痛、慢性溶血、贫血、进行性组织损伤和器官功能障碍。所述疾病影响多个器官，引起急性和慢性并发症，诸如急性胸部综合征、中风、***异常***、脾隔离症、骨坏死、肾衰竭、肺动脉高压、肝病、骨损伤、生长受限、对感染的易感性增加、疲劳和进行性认知衰退。

在美国或欧洲出生的患有SCD的儿童中约90％将存活至成年期，但是与平均死亡年龄为约四十至五十岁的普通人群相比，他们的寿命缩短了二十至三十年。

发明内容

在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗血红蛋白病，诸如β-地中海贫血或镰状细胞病的方法和组合物。使用基因编辑技术以将遗传变化准确且高效地引入BCL11A基因的非编码红细胞谱系特异性增强子中，从而特异性下调红细胞前体中的BCL11A而不影响其他造血谱系。不受理论束缚，认为这种非编码变化将再激活γ-珠蛋白基因转录，并升高红细胞(RBC)中的胎儿血红蛋白(HbF)蛋白，从而改善疾病严重程度。

因此，在一些方面，本公开提供了包含CD34+人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)的组合物，所述CD34+ hHSPC在人B-细彪淋巴瘤11A(BCL11A)基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DNA酶I超敏位点(DHS)内具有遗传修饰。在一些实施方案中，所述组合物还包含无血清冷冻保存培养基、5％二甲亚砜(DMSO)、右旋糖酐-40或两种或更多种前述试剂的任何组合。

在一些实施方案中，所述遗传修饰是或包含(至少一个)***、缺失、突变或其组合。在一些实施方案中，所述遗传修饰包含由CRISPR-Cas9介导的修饰导致的***和缺失(即，***缺失(indel))。

在一些实施方案中，遗传修饰通过向CD34+ hHSPC递送Cas9内切核酸酶(例如，化脓性链球菌的内切核酸酶)(或编码Cas9核酸酶的核酸)和导向RNA(gRNA，诸如sgRNA)(或编码gRNA的核酸)而产生，所述导向RNA靶向人BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DHS。在一些实施方案中，所述gRNA包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：1的修饰形式)。在一些实施方案中，所述gRNA在其5’端和3’端中的每一个处或其附近包含三个2’-O-甲基-硫代磷酸酯残基。在一些实施方案中，所述内切核酸酶包含N-末端SV40核定位信号(NLS)和/或C-末端SV40核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，Cas9和gRNA作为核糖核蛋白复合物递送，任选地其中所述gRNA与所述内切核酸酶的重量比为1∶1。

在一些实施方案中，遗传修饰的hHSPC或hHSPC群体表现出与未修饰的CD34+hHSPC相比γ/(γ+α)-珠蛋白mRNA比增加0.1至0.5，和/或其中修饰的CD34+ hHSPC表现出与未修饰的CD34+ hHSPC相比γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比增加0.2至0.6。在一些实施方案中，遗传修饰的hHSPC或hHSPC群体表现出15％至50％的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的HbF平均百分比。在一些实施方案中，遗传修饰的hHSPC或hHSPC群体表现出70％至90％的平均等位基因编辑频率。

在一些实施方案中，在向受试者施用修饰的CD34+ hHSPC之后，至少75％的修饰的CD34+ hHSPC群体维持多谱系潜能至少十六周。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC群体表现出至少40％或至少80％的中靶***缺失率。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC群体表现出小于5％或小于1％的脱靶***缺失率。

在其他方面，本公开提供了包括向患有血红蛋白病的受试者(例如，人受试者)施用(例如，通过注射/静脉内输注)一定剂量的CD34+ hHSPC的方法，所述CD34+ hHSPC在人BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DHS内包含遗传修饰，其中所述hHSPC以有效量施用以相对于基线减少施用到所述受试者的输血次数(例如，减少50％、60％、70％、80％、90％和/或2倍、3倍、4倍、5倍或更多)和/或将所述受试者中的胎儿血红蛋白(HbF)水平增加到至少20％。在一些实施方案中，所述方法是治疗受试者的血红蛋白病如β-地中海贫血或镰状细胞病的方法。在一些实施方案中，所述方法是增加受试者中HbF的方法。

在一些实施方案中，所述受试者是18岁或更大。在一些实施方案中，所述受试者是18至35岁。在一些实施方案中，所述受试者大于35岁。在其他实施方案中，所述受试者不到18岁。在一些实施方案中，所述受试者是11岁或更大。在一些实施方案中，所述受试者是11至35岁。在一些实施方案中，所述受试者是2岁或更大。在一些实施方案中，所述受试者是2至35岁。

在一些实施方案中，所述方法包括(a)动员患有血红蛋白病的受试者中的干细胞；(b)从所述受试者收集CD34+ hHSPC；(c)产生修饰的CD34+ hHSPC，其包含在人BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DHS内的遗传修饰；和(d)向所述受试者施用有效剂量的步骤(c)的修饰的CD34+ hHSPC量，以相对于基线减少施用到所述受试者的输血次数(例如，减少50％、60％、70％、80％、90％和/或2倍、3倍、4倍、5倍或更多)和/或将所述受试者中的胎儿血红蛋白(HbF)水平增加到至少20％。在一些实施方案中，所述方法是治疗血红蛋白病如β-地中海贫血或镰状细胞病的方法。在一些实施方案中，所述方法是增加受试者中HbF的方法。在一些实施方案中，步骤(a)包括向所述受试者施用CXCR4趋化因子受体的抑制剂，任选地其中所述CXCR4趋化因子受体的抑制剂为普乐沙福(Plerixafor)。在一些实施方案中，步骤(a)还包括向所述受试者施用粒细胞集落刺激因子(GCSF)。

在一些实施方案中，方法包括任选地在动员所述受试者中的干细胞(步骤(a))之前和/或在从所述受试者收集CD34+ hHSPC(步骤(b))之后向所述受试者施用红细胞。

在一些实施方案中，例如在步骤(b)中从所述受试者收集至少15×10⁶个CD34+hHSPC/kg。

在一些实施方案中，方法包括任选地在产生修饰的CD34+ hHSPC(步骤(c))之后和在向所述受试者施用一定剂量的所述修饰的CD34+ hHSPC(步骤(d))之前，向所述受试者施用白消安。在一些实施方案中，白消安以4mg/kg至5mg/kg剂量静脉内施用四天，或以0.5mg/kg至1mg/kg剂量每六小时静脉内施用四天。在一些实施方案中，基于药代动力学水平调整白消安的剂量以实现4500μM/min至5500μM/min、优选5000μM/min的曲线下面积(AUC)。

在一些实施方案中，步骤(c)的修饰是***缺失，所述***缺失任选地通过向CD34+ hHSPC递送Cas9内切核酸酶(例如，化脓性链球菌Cas9内切核酸酶)和靶向人BCL11A基因的+58DHS的导向RNA(例如，包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的gRNA)来产生。

在一些实施方案中，中性粒细胞植入在受试者中在施用修饰的CD34+ hHSPC(步骤(d))后35-45天如42天内发生。

在一些实施方案中，患有血红蛋白病的受试者是患有β-地中海贫血的受试者。在其他实施方案中，患有血红蛋白病的受试者是患有镰状细胞病的受试者。

在一些实施方案中，相对于施用修饰的CD34+ hHSPC之前的2年时间，在施用修饰的CD34+ hHSPC的2年时间内或在施用修饰的CD34+ hHSPC之后的2年时间内，受试者需要更少(例如，少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％)的输血。

在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC之后三个月开始，受试者实现输血减少或不需要输血达施用修饰的CD34+ hHSPC后至少三个月、至少六个月或至少十二个月。

在一些实施方案中，如通过磁共振成像(MRI)或通过血清铁蛋白水平随时间的变化所评估，受试者表现出铁超载参数相对于基线的降低(例如，降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在一些实施方案中，铁超载参数的降低包括肝脏铁浓度(LIC)和/或心脏铁含量(CIC)的降低(例如，降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

在一些实施方案中，相对于施用修饰的CD34+ hHSPC之前的2至5年的时间，在施用修饰的CD34+ hHSPC的2至5年的时间内(例如，在2、3、4或5年内)，或在施用修饰的CD34+hHSPC之后的2至5年的时间内，受试者不再需要铁螯合疗法。

在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC之时或之后的任何时间开始，受试者表现出至少20％的HbF水平至少三个月、至少六个月。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC之后三个月或六个月开始，受试者表现出至少20％的HbF水平至少三个月、至少六个月。在一些实施方案中，受试者在没有用第二药物如羟基脲(HU)治疗的情况下表现出至少20％的HbF水平。

在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC之后六个月开始，受试者表现出严重血管闭塞危象(VOC)的年率自基线的相对变化，例如降低。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC之后六个月开始，受试者表现出VOC不存在至少12个月或至少24个月。

在一些实施方案中，例如在施用修饰的CD34+ hHSPC之后，使用选自以下的下列测定中的至少一种，受试者经历患者报告结果(PRO)随时间的变化：疼痛量表(11分数字评定量表[NRS])、EuroQol生活质量量表(EQ 5D 5L)、癌症疗法-骨髓移植的功能评估(FACT-BMT)、患者报告结果测量信息系统(PROMIS)-疲劳、PROMIS-认知功能和成人镰状细胞生活质量测量系统(ASCQ-Me)。

在一些实施方案中，受试者表现出如通过下列四种溶血标志物的主要组分分析所测量的溶血指数随时间的变化：网织红细胞计数、血清天冬氨酸转氨酶浓度、乳酸脱氢酶[LDH]和总胆红素。在一些实施方案中，受试者表现出三尖瓣返流射流速度(TRV)随时间的变化。

在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用红细胞，其中所述红细胞在施用修饰的CD34+ hHSPC的步骤之前施用。在一些实施方案中，受试者在施用修饰的CD34+ hHSPC的步骤之前已经接受了红细胞(RBC)输血。所述受试者具有小于总Hb的30％的血红蛋白S(HbS)水平和/或11g/dL或更小的总Hb浓度。

在一些实施方案中，受试者在一段时间内表现出表达胎儿血红蛋白(F细胞)的循环红细胞的比例增加，任选地至少增加10％。在一些实施方案中，受试者在一段时间内表现出炎症和内皮激活标志物的变化、外周血白细胞中存在的具有遗传修饰的等位基因的比例的变化和/或骨髓细胞中存在的具有遗传修饰的等位基因的比例的变化，任选地其中所述一段时间是施用修饰的CD34+ hHSPC后至少三个月或至少六个月。

在一些实施方案中，施用到受试者的修饰的CD34+ hHSPC是表现出相对于未修饰的CD34+ hHSPC而言γ/(γ+α)-珠蛋白mRNA比增加0.1至0.5的修饰的CD34+ hHSPC，和/或其中修饰的CD34+ hHSPC表现出相对于未修饰的CD34+ hHSPC而言γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比增加0.2至0.6。在一些实施方案中，施用到受试者的修饰的CD34+ hHSPC是以下修饰的CD34+ hHSPC，其表现出15％至50％的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的HbF平均百分比，表现出等于或高于0.4的(γ+β)/α-珠蛋白mRNA的比率，和/或表现出70％至90％的平均等位基因编辑频率。在一些实施方案中，施用到受试者的至少50％的修饰的CD34+ hHSPC在施用到受试者之后维持多谱系潜能至少十六周。在一些实施方案中，施用到受试者的修饰的CD34+hHSPC是表现出至少40％或至少80％的中靶***缺失率的修饰的CD34+ hHSPC。

在一些实施方案中，受试者没有表现出由施用修饰的CD34+ hHSPC导致的赘生性和/或骨髓增生性病变。

在一些实施方案中，剂量包含至少2×10⁶或至少3×10⁶个修饰的CD34+ hHSPC/kg。

在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用普乐沙福，其中红细胞在施用修饰的CD34+ hHSPC的步骤之前施用。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用粒细胞集落刺激因子。

本发明的一个或多个实施方案的细节在以下说明中给出。从下列附图和几个实施方案的详细描述以及所附权利要求书中，将显而易见本发明的其他特征或优点。

附图说明

图1是显示编辑的细胞维持植入和分化的能力的一系列图。

图2是显示基因编辑β-地中海贫血患者样品之后珠蛋白mRNA比的图。

图3是显示用根据基因型分离的数据基因编辑β-地中海贫血患者样品之后珠蛋白mRNA比的图。

图4是显示在编辑SCD患者样品之后HbF蛋白增加的一系列图。

具体实施方式

目前，输血依赖性β-地中海贫血(TDT)的唯一治愈性治疗选择是同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)。存在与allo-HSCT相关的重大风险，诸如严重感染、移植物衰竭和移植物抗宿主病(GvHD)，其中的一些可能是致命的。因此，很少进行移植，并且主要为具有可用的人白细胞抗原(HLA)匹配的同胞供体的受试者提供，这些受试者年轻(＜16岁)，并且没有显著的铁超载。由于需要HLA匹配的同胞供体，因此allo-HSCT仅可用于＜25％的符合条件的患者，其余患者需要终生输血和螯合。由于植入失败和GvHD的高风险，使用替代供体来源如非血缘脐带血和单倍体同一性供体的移植仍然是实验性的。缺乏合适的供体、与移植相关的重大风险以及移植后需要免疫抑制疗法来预防GvHD指明对TDT受试者的转化潜力的新疗法的未得到满足的医疗需求。

已批准的预防镰状细胞病(SCD)并发症的疗法包括美国和欧洲的羟基脲(HU)和美国的L-谷氨酰胺口服粉剂。这些疗法减少SCD的并发症；然而，患者仍然会具有突破性血管闭塞危象(VOC)。此外，HU并非在所有患者中都有效，不能被良好耐受，并且具有致癌和致畸风险。同种异体造血干细胞移植(HSCT)是唯一已知的SCD治愈方法，但HSCT仅可用于约20％的具有匹配供体的患者，并且移植物抗宿主病(GvHD)是已知的风险。因此，对于SCD和其他血红蛋白病的治疗也存在显著的未得到满足的医学需求。

用本文提供的方法和组合物进行的基因编辑诱导自体CD34⁺hHSPC中DNA序列的变化，使得在患者中红细胞分化后，γ-球蛋白的表达增加，导致成人红细胞中HbF表达水平增加。HbF的增加改善了β-地中海贫血和SCD的临床表现。

本公开的CRISPR-Cas9编辑治疗方法是通过编辑BCL11A基因中的非编码区恢复HbF产生。BCL11A是γ-珠蛋白基因表达的转录沉默子，因此是HbF的负调节剂。

血红蛋白病

β地中海贫血

本公开的方面提供了用于治疗(例如，改善症状和/或临床表现)贝塔地中海贫血(β地中海贫血)的方法。β地中海贫血是一种降低血红蛋白产生的血液病症。血红蛋白是红细胞中的含铁蛋白质，其将氧携带至全身的细胞。β-珠蛋白的缺乏导致功能性血红蛋白的量减少。

在患有β地中海贫血的受试者中，低水平的血红蛋白导致身体的许多部分缺氧。在血红蛋白不足的情况下，红细胞不能正常发育，导致成熟红细胞缺乏。低数量的成熟红细胞导致贫血，其可以引起皮肤苍白、虚弱、疲劳和更严重的并发症。患有β地中海贫血的人发生异常血凝块的风险增加。

β地中海贫血根据症状的严重程度分为两类：重型地中海贫血(也称为库利氏贫血(Cooley’s anemia))和中间型地中海贫血。在这两种类型中，重型地中海贫血更严重。

重型地中海贫血的征兆和症状在生命的前两年内出现。儿童发展为威胁生命的贫血。他们无法增重并以预期的速率生长(不能茁壮成长)，并且可能发展为皮肤泛黄和黄疸(whites of the eyes/jaundice)。患病个体可能具有增大的脾脏、肝脏和心脏，并且他们的骨骼可能畸形。一些患有重型地中海贫血的青少年经历***延迟。许多患有重型地中海贫血的人具有严重的症状，以致于他们需要频繁输血以补充他们的红细胞供应。随着时间的推移，来自慢性输血的含铁血红蛋白的流入会导致铁在体内积聚，从而导致肝脏、心脏和激素问题。

中间型地中海贫血比重型地中海贫血温和。中间型地中海贫血的征兆和症状在儿童早期或生命后期出现。患病个体具有轻度至中度贫血，并且还可能具有生长缓慢和骨异常。

血红蛋白基因中的突变引起β地中海贫血。血红蛋白基因中的一些突变阻止任何β-珠蛋白的产生。β-珠蛋白缺乏被称为β-零(β0)地中海贫血。其他血红蛋白基因突变允许产生一些β-球蛋白，但量减少。β-珠蛋白的量减少被称为β+(β+)地中海贫血。由不完全(β+)或缺乏(β0)β-珠蛋白表达的程度所引起的HbA产生受损的程度决定β-地中海贫血的严重程度。β-珠蛋白产生的减少导致成红细胞中过量的、未复合的α-珠蛋白的积累。这种α-珠蛋白/β-珠蛋白失衡的临床结果是：

1)溶血，导致缺乏将氧有效地转运到整个身体的足够红细胞和Hb；

2)细胞膜的氧化损伤，从而导致红细胞前体的细胞凋亡，因此导致无效的红细胞生成；以及

3)无效红细胞生成，其导致诸如脾大、骨髓扩张、伴随的骨畸形和铁超载的发病。

然而，B0或B+地中海贫血不一定预测疾病严重程度；具有两种类型的人都被诊断为患有重型地中海贫血和中间型地中海贫血。

具有HPFH表型的患者在其一生中具有总Hb的10％至30％的持续HbF水平，通常具有HbF的pan-细胞分布。许多具有HPFH的人也带有β-地中海贫血或镰状细胞病的遗传缺陷。这些共同遗传HPFH和β珠蛋白突变两者的患者没有其潜在的β-地中海贫血或镰状细胞病的临床症状，或者患有该疾病的轻度形式。

增加的HbF水平是患有非输血依赖性地中海贫血(NTDT)的患者中β地中海贫血的一种改善和保护因子，可以测量所述患者中的HbF水平(Musallam，K.M.等人，2012.Blood119，364-367)。

增加的γ-珠蛋白产生减轻了由过量的未配对α-珠蛋白和作为β-地中海贫血标志的α/β-蛋白失衡导致的病理。结果，由于含较高HbF水平的红细胞的存活改进而存在该疾病中见到的无效红细胞生成改进，溶血降低以及总血红蛋白水平增加。似乎不存在与β地中海贫血患者发病率较低相关的最小HbF阈值，因为任何量的HbF对患有中间型β-地中海贫血的非输血依赖性患者似乎都是有益的(Musallam，K.M.等人，2013.Blood 121，2199-2212)。由于HbF水平增加引起的无效红细胞生成减少也可能对铁超载和终末器官损伤具有积极作用(Tanno，T.和Miller，J.L.，2010.Adv Hematol 358283)。

输血依赖性β-地中海贫血(TDT)的治疗特别包括每3-6周进行的终身输血。输血疗法的目的是保持Hb水平≥9g/dL，以便改善严重贫血的症状和生理后遗症，并维持正常生长和发育。尽管慢性输血方案在预防疾病的标志性症状和身体表现方面是有效的，但它们引入了大的铁超载，其可以因铁相关的心脏和肝毒性而导致死亡。为了防止这种情况，用通常在早期起始的铁螯合方案来控制铁超载。对螯合方案的依从性差仍然是一项关键挑战。尽管目前的疗法有所改进，但生活质量差且到30岁的总存活率仅为55％。

镰状细胞病

本公开的方面提供了用于治疗(例如，改善症状和/或临床表现)镰状细胞病(SCD)的方法。镰状细胞病是影响血红蛋白的一组病症，血红蛋白是红细胞中将氧递送至全身细胞的分子。患有这种病症的受试者具有称为血红蛋白S的非典型血红蛋白分子，其可以使红细胞变形为镰刀形或新月形。

SCD的征兆和症状通常开始于儿童早期。这种病症的特征性特点包括低数量的红细胞(贫血)、反复感染和疼痛的周期性发作。症状的严重程度因人而异。一些受试者具有轻微的症状，而另一些由于更严重的并发症而经常住院。

SCD是一种慢性疾病，其特征在于复发性急性VOC，导致急性疼痛、慢性溶血、贫血、进行性组织损伤和器官功能障碍。所述疾病影响多个器官，引起急性和慢性并发症，诸如急性胸部综合征、中风、***异常***、脾隔离症、骨坏死、肾衰竭、肺动脉高压、肝病、骨损伤、生长受限、对感染的易感性增加、疲劳和进行性认知衰退。

在美国或欧洲出生的患有SCD的儿童中约90％将存活至成年期，但是与平均死亡年龄为约四十至五十岁的普通人群相比，他们的寿命缩短了二十至三十年。

SCD的征兆和症状是由红细胞镰状化引起的。当红细胞镰状化时，它们过早地分解，这可以导致贫血。贫血可以引起儿童气短、疲劳和生长发育延迟。红细胞的快速分解也可能引起眼睛和皮肤泛黄，这是黄疸的征兆。当僵硬且不灵活的镰状红细胞卡在小血管中时，会发生疼痛发作。这些发作使组织和器官失去富氧血液，并且可以导致器官损伤，尤其是在肺、肾、脾和脑中的损伤。SCD的特别严重的并发症是供给肺的血管中的高血压(肺动脉高压)。肺动脉高血压发生在约三分之一的患有SCD的成年人中，并且可以导致心力衰竭。

血红蛋白基因中的突变引起SCD。血红蛋白由四个蛋白质亚基组成，通常，两个亚基称为α-珠蛋白，并且两个亚基称为β-珠蛋白。血红蛋白基因提供了制备β-珠蛋白的说明。β-珠蛋白是血红蛋白的组分(亚基)。血红蛋白由四个蛋白质亚基组成，通常是两个β-珠蛋白亚基和两个称为α-珠蛋白的另一种蛋白质的亚基。各种型式的β-珠蛋白由血红蛋白基因中的不同突变产生。一种特定的血红蛋白基因突变产生异常型式的β-球蛋白，称为血红蛋白S(HbS)。血红蛋白基因中的其他突变产生额外的异常型式的β-珠蛋白，诸如血红蛋白C(HbC)和血红蛋白E(HbE)。

胎儿血红蛋白

本公开的一些方面提供升高受试者中的胎儿血红蛋白水平的方法，所述受试者例如是患有β-地中海贫血、镰状细胞病或其他血红蛋白病的受试者。红细胞主要用于将气体转运到细胞中和从细胞中转运出来。这由血红蛋白的结构组分促进，所述结构组分具有与气体结合的能力。取决于发育的阶段，在人体中合成三种类型的血红蛋白。在出生前产生胚胎血红蛋白，在胎儿期间产生胎儿血红蛋白(HbF)，并且在出生后产生成人血红蛋白。胎儿血红蛋白(HbF，α₂γ₂)是人类胎儿中的主要氧转运蛋白，并且包括阿尔法(α)亚基和伽马(γ)亚基。HbF表达在出生后约6个月停止。成人血红蛋白(HbA，α₂β₂)是在出生约34个月后的人中的主要氧转运蛋白且包括阿尔法(α)亚基和贝塔(β)亚基。34周后，发育转换导致γ-珠蛋白基因的转录减少和β-珠蛋白基因的转录增加。β链在第6位的谷氨酸被缬氨酸置换引起镰状细胞病。这种变化，称为血红蛋白S(HbS)，是一种异常血红蛋白。在暴露于低氧浓度时，HbS沉淀为伸长的晶体，表现为镰刀形，而不是双凹圆盘。镰状细胞病的特征在于血管中的闭塞事件，导致疼痛、器官衰竭和偶尔的死亡。由于许多形式的血红蛋白病是由于未能产生足够量的正常β-珠蛋白或完全未能产生正常的β-珠蛋白，因此增加的γ-珠蛋白(HbF)的表达将改善β-珠蛋白疾病严重程度。

BCL11A红细胞谱系特异性增强子

在一些实施方案中，本公开的细胞(例如，CD34+ hHSPC)在人B-细彪淋巴瘤11A(BCL11A)基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DNA酶I超敏位点(DHS)内包含遗传修饰。BCL11A是γ珠蛋白基因表达的转录沉默子，因此是HbF的负调节剂(参见Menzel S等人，Nature Genetics.2007；39(10)：1197-9；Lettre G等人，PNAS.2008；105(33)：11869-74；以及Uda M等人，PNAS.2008；105(5)：1620-5，其各自通过引用整体并入本文)。BCLl1A位于染色体2上，并且范围为60,451，167至60,553,567个碱基对(bp)(GRCh38)。所述基因编码锌指转录因子，其阻遏胎儿血红蛋白(HbF)并在出生后约6周开始下调HbF表达。BCL11A基因含有四个外显子，跨越102.4kb的基因组DNA，并在内含子2中包括转录因子GATA-1的结合结构域。GATA-1结合增强BCL11A表达，其继而阻遏HbF表达。内含子2含有多个DNA酶I超敏位点(DHS)，包括基于距转录起始位点以千碱基计的距离而称为+55、+58和+62的位点。在所述区域内的天然存在的SNP与BCL11A表达降低和胎儿Hb水平增加相关。这些SNP围绕三个DNA超敏位点+55DHS、+58DHS和+62DHS组织。在这三个区域中，+58DHS区域似乎是与胎儿Hb水平增加相关的关键区域，并且还具有GATA1转录控制区域。

在一些实施方案中，本公开的基因编辑策略，例如CRISPR-Cas9基因编辑策略(例如，通过下文讨论的NHEJ修复过程)在染色体2上的非编码BCL11A红细胞谱系特异性增强子内产生***缺失，因此下调红细胞前体中的BCL11A，而在其他造血谱系中没有预期的效果。因此，在一些实施方案中，人BCL11A基因的+58DHS内的遗传修饰包含至少一个(一个或多个)***缺失。不受理论束缚，认为这种非编码变化将再激活γ-珠蛋白基因转录，并且升高RBC中的HbF蛋白。

还可以通过***野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA来调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列。例如，用于通过同源定向修复(HDR)调节或灭活的供体含有具有小或大的侧接同源臂以允许退火的BCL11A基因的修饰的转录控制序列。HDR基本上是一种无错误的机制，其在DSB修复期间使用供应的同源DNA序列作为模板。同源定向修复(HDR)的速率是转录控制序列和切割位点之间的距离的函数，因此选择重叠或附近的靶位点是重要的。模板可以包括由同源区域侧接的其他序列，或者可以含有与基因组序列不同的序列，从而允许序列编辑。

除了通过NHEJ或HDR缺失、调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列之外，还可以有一系列的其他选择。如果存在小或大的缺失，则可以敲入含有BCL11A基因的修饰的转录控制序列的cDNA。可以将全长cDNA敲入任何“安全港”-即不是BCL11A基因本身的非有害***点-有或没有合适的调控序列。如果所述构建体在BCL11A调控元件附近被敲入，它将具有与正常基因相似的生理控制。两个或更多个(例如，一对)核酸酶可以用于缺失转录控制序列区域，尽管通常必须提供供体以调节或灭活所述功能。在这种情况下，将供应两个gRNA和一个供体序列。

本文提供了使用基因组工程工具以通过以下方式产生对基因组的永久性改变的细胞离体和体内方法：1)通过由于NHEJ途径产生的缺失调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列；2)通过HDR调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列；3)通过缺失转录控制序列的至少一部分和/或将野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA敲入基因座或安全港基因座来调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列。此类方法使用内切核酸酶，诸如CRISPR相关(Cas9、Cpf1等)核酸酶，以永久地缺失、***或编辑在BCL11A基因或编码BCL11A基因的调控元件的其他DNA序列的基因组基因座内或其附近的转录控制序列。以这种方式，本公开中阐述的实施例可以用单次处理或有限次数的处理来帮助缺失、调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列(而不是在患者的一生中递送潜在的疗法)。

基因组编辑

基因组编辑通常是指优选以精确或预定的方式修饰基因组的核苷酸序列的过程。本文所述的基因组编辑方法的实施例包括使用定点核酸酶以在基因组中的精确靶位置切割脱氧核糖核酸(DNA)，从而在基因组内的特定位置产生单链或双链DNA断裂的方法。此类断裂可以并且通常通过天然的内源性细胞过程如同源定向修复(HDR)和NHEJ修复，如最近在Cox等人，Nature Medicine 21(2)，121-31(2015)中综述。这两个主要的DNA修复过程由替代途径家族组成。NHEJ直接连接由双链断裂产生的DNA端，有时会丢失或添加核苷酸序列，这可能破坏或增强基因表达。HDR利用同源序列或供体序列作为模板，用于在断裂点***限定的DNA序列。同源序列可以在内源基因组如姐妹染色单体中。或者，供体可以是外源核酸，诸如质粒、单链低聚核苷酸、双链低聚核苷酸、双链体低聚核苷酸或病毒，其具有与核酸酶裂解基因座高度同源的区域，但是还可以含有额外的序列或序列改变，包括可以并入裂解的靶基因座的缺失。第三种修复机制可以是微同源介导的末端连接(MMEJ)，也称为“替代NHEJ”，其中遗传结果与NHEJ相似之处在于在裂解位点处可以出现小的缺失和***。MMEJ可以利用侧接DNA断裂位点的几个碱基对的同源序列来驱动更有利的DNA端连接修复结果，并且最近的报道进一步阐明了该过程的分子机制；参见，例如Cho和Greenberg，Nature518，174-76(2015)；Kent等人，Nature Structural and Molecular Biology，Adv.在线doi：10.1038/nsmb.2961(2015)；Mateos-Gomez等人，Nature 518，254-57(2015)；Ceccaldi等人，Nature 528，258-62(2015)。在一些情况下，可以基于DNA断裂位点的潜在微生物学分析来预测可能的修复结果。

这些基因组编辑机制中的每一种都可以用于产生所需的基因组改变。基因组编辑过程中的一个步骤可以是在如预期突变位点附近的靶基因座中产生一处或两处DNA断裂，后者为双链断裂，或两处单链断裂。这可以通过使用如本文所述并说明的定点多肽来实现。

定点多肽如DNA内切核酸酶可以在核酸如基因组DNA中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源DNA修复途径(例如，同源依赖性修复或非同源末端连接或替代非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源介导的末端连接)。NHEJ可以修复裂解的靶核酸而无需同源模板。这有时可以在裂解位点处在靶核酸中产生小的缺失或***(***缺失)，并且可以导致基因表达的破坏或改变。当可得到同源修复模板或供体时，可以发生HDR。同源供体模板可以包含可以与侧接靶核酸裂解位点的序列同源的序列。细胞可以使用姐妹染色单体作为修复模板。然而，出于基因组编辑的目的，修复模板可以作为外源核酸如质粒、双链体低聚核苷酸、单链低聚核苷酸、双链低聚核苷酸或病毒核酸供应。在使用外源供体模板的情况下，可以在同源性的侧接区域之间引入额外的核酸序列(诸如转基因)或修饰(诸如单个或多个碱基改变或缺失)，从而额外的或改变的核酸序列也变得并入靶基因座中。MMEJ可以产生与NHEJ相似的遗传结果，在裂解位点处可以出现小的缺失和***。MMEJ可以利用位于侧接裂解位点的几个碱基对的同源序列来驱动有利的末端连接DNA修复结果。在一些情况下，可以基于核酸酶靶区域中的潜在微生物学分析来预测可能的修复结果。

因此，在一些情况下，可以使用同源重组以将外源多核苷酸序列***靶核酸裂解位点中。外源多核苷酸序列在本文中称为供体多核苷酸(或供体或供体序列或多核苷酸供体模板)。可以将供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的一部分***靶核酸裂解位点中。供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即不天然存在于靶核酸裂解位点的序列。

由NHEJ和/或HDR引起的靶DNA修饰可以导致例如突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因置换、基因标记、转基因***、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。缺失基因组DNA并将非天然核酸整合到基因组DNA中的过程是基因组编辑的实例。

CRISPR内切核酸酶系统

可以在许多原核生物(例如，细菌和古细菌)的基因组中发现CRISPR(集簇的定期间隔区短回文重复序列)基因组基因座。在原核生物中，CRISPR基因座编码作为一种免疫系统起作用以帮助保护原核生物免受外来入侵者如病毒和噬菌体的攻击的产物。CRISPR基因座功能有三个阶段：将新序列整合到CRISPR基因座中、CRISPR RNA(crRNA)的表达和外来入侵者核酸的沉默。已经识别出五种类型的CRISPR系统(例如，I型、II型、III型、U型和V型)。

CRISPR基因座包括许多称为“重复序列”的短重复序列。当表达时，重复序列可以形成二级结构(例如，发夹)和/或包含非结构化的单链序列。重复序列通常以集簇的形式出现，并且经常在物种之间发散。重复序列规律地间隔着独特的间插序列，称为“间隔区”，产生重复序列-间隔区-重复序列基因座构造。间隔区与已知的外来入侵者序列相同或具有高度同源性。间隔区-重复单元编码crisprRNA(crRNA)，其被加工成间隔区-重复序列单元的成熟形式。crRNA包含参与靶向靶核酸的“种子”或间隔区序列(在原核生物中以天然存在的形式，间隔区序列靶向外来入侵核酸)。间隔区序列位于crRNA的5’端或3’端。

CRISPR基因座还包含编码CRISPR相关(Cas)基因的多核苷酸序列。Cas基因编码参与原核生物中crRNA功能的生物发生和干扰阶段的内切核酸酶。一些Cas基因包含同源的二级和/或三级结构。

II型CRISPR系统

II型CRISPR系统中的crRNA生物发生本质上需要反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA可以通过内源性RNaseIII修饰，然后与pre-crRNA阵列中的crRNA重复序列杂交。可以募集内源性RNaseIII以裂解pre-crRNA。可以对裂解的crRNA进行外切核糖核酸酶修剪以产生成熟的crRNA形式(例如，5’修剪)。tracrRNA可以保持与crRNA杂交，并且tracrRNA和crRNA与定点多肽(例如，Cas9)缔合。crRNA-tracrRNA-Cas9复合物的crRNA可以将复合物导向至crRNA可以与之杂交的靶核酸。crRNA与靶核酸的杂交可以激活Cas9以进行靶向核酸裂解。II型CRISPR系统中的靶核酸被称为前间隔区序列相邻基序(PAM)。本质上，PAM对于促进定点多肽(例如，Cas9)与靶核酸的结合是必需的。II型系统(也称为Nmeni或CASS4)被进一步细分为II-A型(CASS4)和II-B型(CASS4a)。Jinek等人，Science，337(6096)：816-821(2012)表明CRISPR/Cas9系统可用于RNA可编程基因组编辑，并且国际专利申请公告号WO2013/176772提供用于位点特异性基因编辑的CRISPR/Cas内切核酸酶系统的许多实例和应用。

Cas基因/多肽和前间隔区序列相邻基序

示例性CRISPR/Cas多肽包括Fonfara等人，Nucleic Acids Research，42：2577-2590(2014)的图1中的Cas9多肽。自从Cas基因被发现以来，CRISPR/Cas基因命名系统已经经历了广泛的改写。上文Fonfara的图5提供了来自不同物种的Cas9多肽的PAM序列。

定点多肽

定点多肽是用于基因组编辑以裂解DNA的核酸酶。定点核酸酶或多肽可以作为一种或多种多肽或者编码多肽的一种或多种mRNA施用到细胞或患者。

在CRISPR/Cas系统的背景下，定点多肽可以与导向RNA结合，这又指定多肽所定向的靶DNA中的位点。在本文公开的CRISPR/Cas系统中，定点多肽可以是内切核酸酶，诸如DNA内切核酸酶。

定点多肽可以包含多个核酸裂解(即，核酸酶)结构域。两个或更多个核酸裂解结构域可以通过接头连接在一起。例如，接头可以包含柔性接头。接头的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40个或更多个氨基酸。

天然存在的野生型Cas9酶包含两个核酸酶结构域：HNH核酸酶结构域和RuvC结构域。本文中，“Cas9”是指天然存在的Cas9和重组的Cas9两者。本文考虑的Cas9酶可以包含HNH或HNH样核酸酶结构域和/或RuvC或RuvC样核酸酶结构域。

HNH或HNH样结构域包含McrA样折叠。HNH或HNH样结构域包含两条反向平行的β-链和α-螺旋。HNH或HNH样结构域包含金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。HNH或HNH样结构域可以裂解靶核酸的一条链(例如，crRNA靶向链的互补链)。

RuvC或RuvC样结构域包含RNaseH或RnaseH样折叠。RuvC/RnaseH结构域参与多样化的基于核酸的功能，包括作用于RNA和DNA两者上的功能。RnaseH结构域包含被多个α-螺旋包围的5个β-链。RuvC/RnaseH或RuvC/RnaseH样结构域包含金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。RuvC/RnaseH或RuvC/RnaseH样结构域可以裂解靶核酸的一条链(例如，双链靶DNA的非互补链)。

定点多肽可以在核酸如基因组DNA中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源DNA修复途径(例如，同源依赖性修复(HDR)或NHEJ或替代非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源介导的末端连接(MMEJ))。NHEJ可以修复裂解的靶核酸而无需同源模板。这有时可以在裂解位点处在靶核酸中产生小的缺失或***(***缺失)，并且可以导致基因表达的破坏或改变。当可得到同源修复模板或供体时，可以发生HDR。同源供体模板可以包含与侧接靶核酸裂解位点的序列同源的序列。细胞可以使用姐妹染色单体作为修复模板。然而，出于基因组编辑的目的，修复模板可以作为外源核酸如质粒、双链体低聚核苷酸、单链低聚核苷酸或病毒核酸供应。在使用外源供体模板的情况下，可以在同源性的侧接区域之间引入额外的核酸序列(诸如转基因)或修饰(诸如单个或多个碱基改变或缺失)，从而额外的或改变的核酸序列也变得并入靶基因座中。MMEJ可以产生与NHEJ相似的遗传结果，在裂解位点处可以出现小的缺失和***。MMEJ可以利用位于侧接裂解位点的几个碱基对的同源序列来驱动有利的末端连接DNA修复结果。在一些情况下，可以基于核酸酶靶区域中的潜在微生物学分析来预测可能的修复结果。

因此，在一些情况下，可以使用同源重组以将外源多核苷酸序列***靶核酸裂解位点中。外源多核苷酸序列在本文中称为供体多核苷酸(或供体或供体序列)。可以将供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的一部分***靶核酸裂解位点中。供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即不天然存在于靶核酸裂解位点的序列。

由NHEJ和/或HDR引起的靶DNA修饰可以导致例如突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因置换、基因标记、转基因***、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。缺失基因组DNA并将非天然核酸整合到基因组DNA中的过程是基因组编辑的实例。

定点多肽可以包含与野生型示例性定点多肽[例如，来自化脓性链球菌的Cas9，US2014/0068797序列编号8或Sapranauskas等人，Nucleic Acids Res，39(21)：9275-9282(2011)]和各种其他定点多肽具有至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。相对于10个连续的氨基酸而言，定点多肽可以包含与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。相对于10个连续的氨基酸而言，定点多肽可以包含与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至多：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。相对于定点多肽的NHN核酸酶结构域中的10个连续的氨基酸而言，定点多肽可以包含与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至少：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。相对于定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续的氨基酸而言，定点多肽可以包含与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至多：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。相对于定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个连续的氨基酸而言，定点多肽可以包含与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至少：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。相对于定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个连续的氨基酸而言，定点多肽可以包含与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至多：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。

定点多肽可以包含修饰形式的野生型示例性定点多肽。修饰形式的野生型示例性定点多肽可以包含降低定点多肽的核酸裂解活性的突变。修饰形式的野生型示例性定点多肽可以具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的野生型示例性定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)的核酸裂解活性。修饰形式的定点多肽可以不具有明显的核酸裂解活性。当定点多肽是不具有明显核酸裂解活性的修饰形式时，其在本文中称为“无酶解活性的”。

修饰形式的定点多肽可以包含突变，使得其可以在靶核酸上诱导单链断裂(SSB)(例如，通过仅切割双链靶核酸的一个糖-磷酸酯主链)。突变可以在野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)的多个核酸裂解结构域中的一个或多个中产生小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的核酸裂解活性。突变可以导致多个核酸裂解结构域中的一个或多个保留裂解靶核酸的互补链的能力，但降低其裂解靶核酸的非互补链的能力。突变可以导致多个核酸裂解结构域中的一个或多个保留裂解靶核酸的非互补链的能力，但降低其裂解靶核酸的互补链的能力。例如，使野生型示例性化脓性链球菌Cas9多肽中的残基如Asp10、His840、Asn854和Asn856突变以使多个核酸裂解结构域(例如，核酸酶结构域)中的一个或多个灭活。待突变的残基可以对应于野生型示例性化脓性链球菌Cas9多肽中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856(例如，如通过序列和/或结构对齐确定)。突变的非限制性实例包括D10A、H840A、N854A或N856A。本领域的技术人员将认识到除丙氨酸取代之外的突变可能是合适的。

D10A突变可以与H840A、N854A或N856A突变中的一个或多个组合，以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定点多肽。H840A突变可以与D10A、N854A或N856A突变中的一个或多个组合，以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定点多肽。N854A突变可以与H840A、D10A或N856A突变中的一个或多个组合，以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定点多肽。N856A突变可以与H840A、N854A或D10A突变中的一个或多个组合，以产生基本上缺乏DNA裂解活性的定点多肽。包含一个基本上无活性的核酸酶结构域的定点多肽称为“切口酶”。

RNA导向的内切核酸酶如Cas9的切口酶变体可以用于增加CRISPR介导的基因组编辑的特异性。野生型Cas9通常由单个导向RNA导向，所述单个导向RNA设计成与靶序列中的特定约20个核苷酸序列(诸如内源基因组基因座)杂交。然而，在导向RNA和靶基因座之间可以耐受几种失配，将靶位点中所需同源性的长度有效地降低至例如少至13nt的同源性，从而导致由靶基因组中的其他位置的CRISPR/Cas9复合物实现结合和双链核酸裂解(也称为脱靶裂解)的潜力升高。因为Cas9的切口酶变体各自仅切割一条链，为了产生双链断裂，一对切口酶必须紧密地且在靶核酸的相对链上结合，从而产生一对切口，这相当于双链断裂。这需要两个单独的导向RNA(每个切口酶一个)必须紧密地且在靶核酸的相对链上结合。该要求基本上使双链断裂发生所需的最小同源性长度加倍，从而降低了双链裂解事件将在基因组中的其他地方发生的可能性，其中两个导向RNA位点-如果存在的话-不太可能彼此足够接近到能够形成双链断裂。如本领域所述，切口酶也可以用于促进HDR对NHEJ。HDR可以用于通过使用有效介导所需变化的特定供体序列将选定的变化引入基因组中的靶位点。

预期的突变可以包括取代、添加和缺失或其任何组合。突变将突变的氨基酸转化为丙氨酸。所述突变将突变的氨基酸转化为另一种氨基酸(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸或精氨酸)。所述突变将突变的氨基酸转化为非天然氨基酸(例如，硒代甲硫氨酸)。所述突变将突变的氨基酸转化为氨基酸模拟物(例如，磷酸酶模拟物)。所述突变可以是保守突变。例如，所述突变将突变的氨基酸转化为类似于突变氨基酸的大小、形状、电荷、极性、构象和/或旋转异构体的氨基酸(例如，半胱氨酸/丝氨酸突变、赖氨酸/天冬酰胺突变、组氨酸/苯丙氨酸突变)。所述突变可以引起阅读框架的偏移和/或过早终止密码子的产生。突变可以引起影响一种或多种基因的表达的基因或基因座的调控区域改变。

定点多肽(例如，变体，突变的、无酶解活性的和/或条件无酶解活性的定点多肽)可以靶向核酸。定点多肽(例如，变体，突变的、无酶解活性的和/或条件无酶解活性的内切核酸酶)可以靶向DNA。定点多肽(例如，变体，突变的、无酶解活性的和/或条件无酶解活性的内切核酸酶)可以靶向RNA。

定点多肽可以包含一个或多个非天然序列(例如，定点多肽是融合蛋白)。

定点多肽可以包含如下氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9、核酸结合结构域和两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)的至少15％氨基酸同一性。

定点多肽可以包含如下氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9和两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)的至少15％氨基酸同一性。

定点多肽可以包含如下氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9和两个核酸裂解结构域的至少15％氨基酸同一性，其中核酸裂解结构域中的一个或两个包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9的核酸酶结构域的至少50％氨基酸同一性。

定点多肽可以包含如下氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9、两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)和非天然序列(例如，核定位信号)或将定点多肽连接到非天然序列的接头的至少15％氨基酸同一性。

定点多肽可以包含如下氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9、两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)的至少15％氨基酸同一性，其中所述定点多肽在核酸裂解结构域中的一个或两个中包含突变，所述突变使核酸酶结构域的裂解活性降低至少50％。

定点多肽可以包含如下氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9和两个核酸裂解结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)的至少15％氨基酸同一性，其中核酸酶结构域中的一个包含天冬氨酸10的突变，和/或其中核酸酶结构域中的一个可以包含组氨酸840的突变，并且其中所述突变使一个或多个核酸酶结构域的裂解活性降低至少50％。

这一种或多种定点多肽如DNA内切核酸酶可以包含两个切口酶，这些切口酶一起在基因组中的特定基因座处实现一个双链断裂，或者四个切口酶，这些切口酶一起在基因组中的特定基因座处实现或引起两个双链断裂。或者，一种定点多肽如DNA内切核酸酶可以在基因组中的特定基因座处实现或引起一个双链断裂。

定点多肽可以在N-末端、C-末端或N-末端和C-末端两者侧接一个或多个核定位信号(NLS)。例如，Cas9内切核酸酶可以侧接两个NLS，一个NLS位于N-末端且第二个NLS位于C-末端。NLS可以是本领域中已知的任何NLS，诸如SV40 NLS。

基因组靶向核酸

本公开提供一种基因组靶向核酸，其可以将相关多肽(例如，定点多肽)的活性定向到靶核酸内的特定靶序列。基因组靶向核酸可以是RNA。基因组靶向RNA在本文中称为“导向RNA”或“gRNA”。导向RNA可以至少包含与关注的靶核酸序列和CRISPR重复序列杂交的间隔区序列。在II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型导向RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型导向RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在两种系统中，双链体可以结合定点多肽，使得导向RNA和定点多肽形成复合物。基因组靶向核酸可以凭借其与定点多肽的结合为所述复合物提供靶特异性。因此，基因组靶向核酸可以定向定点多肽的活性。

示例性导向RNA包括序列表的SEQ ID NO：1或2中的间隔区序列和SEQ ID NO：1或2中的sgRNA序列。如本领域的普通技术人员所理解，每个导向RNA可以设计成包括与其基因组靶序列互补的间隔区序列。例如，序列表的SEQ ID NO：1-3中的间隔区序列中的每一个可以放入单个RNA嵌合体或crRNA(以及相应的tracrRNA)中。参见Jinek等人，Science，337，816-821(2012)和Deltcheva等人，Nature，471，602-607(2011)。

基因组靶向核酸可以是双分子导向RNA。基因组靶向核酸可以是单分子导向RNA。

双分子导向RNA可以包含RNA的两条链。第一链在5’至3’方向上包含任选的间隔区延伸序列、间隔区序列和最小的CRISPR重复序列。第二链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。

II型系统中的单分子导向RNA(sgRNA)可以在5’至3’方向上包含任选的间隔区延伸序列、间隔区序列、最小CRISPR重复序列、单分子导向接头、最小tracrRNA序列、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸可以包含为导向RNA贡献额外功能性(例如，稳定性)的元件。单分子导向接头可以连接最小的CRISPR重复序列和最小的tracrRNA序列以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸可以包含一个或多个发夹。

V型系统中的单分子导向RNA(sgRNA)可以在5’至3’方向上包含最小的CRISPR重复序列和间隔区序列。

sgRNA可以在sgRNA序列的5’端包含20个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5’端包含少于20个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5’端包含超过20个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以在sgRNA序列的5’端包含具有17-30个核苷酸的可变长度间隔区序列。

sgRNA可以在sgRNA序列的3’端不包含尿嘧啶。sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含一个或多个尿嘧啶。例如，sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含1个尿嘧啶(U)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含2个尿嘧啶(UU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含3个尿嘧啶(UUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含4个尿嘧啶(UUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含5个尿嘧啶(UUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含6个尿嘧啶(UUUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含7个尿嘧啶(UUUUUUU)。sgRNA可以在sgRNA序列的3’端包含8个尿嘧啶(UUUUUUUU)。

sgRNA可以是未修饰的或修饰的。例如，修饰的sgRNA可以包含一个或多个2’-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸。

举例说明，CRISPR/Cas系统中使用的导向RNA或其他较小的RNA可以通过化学方法容易地合成，如下文所示和本领域中所述。虽然化学合成工序在不断扩展，但是通过诸如高效液相色谱(HPLC，其避免使用诸如PAGE的凝胶)的工序来纯化此类RNA往往变得更具挑战性，因为多核苷酸长度显著增加超过一百个左右的核苷酸。一种用于产生更长的RNA的方法是产生两个或更多个连接在一起的分子。长得多的RNA，诸如编码Cas9内切核酸酶的RNA，更容易酶产生。可以在化学合成和/或酶产生RNA期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如，增强稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度和/或增强其他属性的修饰，如本领域中所述。

间隔区延伸序列

在基因组靶向核酸的一些实施例中，间隔区延伸序列可以修饰活性，提供稳定性和/或提供修饰基因组靶向核酸的位置。间隔区延伸序列可以修饰中靶或脱靶活性或特异性。在一些实施例中，可以提供间隔区延伸序列。间隔区延伸序列的长度可以为多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个或更多个核苷酸。间隔区延伸序列的长度可以为少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000个或更多个核苷酸。间隔区延伸序列的长度可以少于10个核苷酸。间隔区延伸序列的长度可以在10-30个核苷酸之间。间隔区延伸序列的长度可以在30-70个核苷酸之间。

间隔区延伸序列可以包含另一部分(例如，稳定性控制序列、内切核酸酶结合序列、核酶)。所述部分可以降低或增加核酸靶向核酸的稳定性。所述部分可以是转录终止子区段(即，转录终止序列)。所述部分可以在真核细胞中起作用。所述部分可以在原核细胞中起作用。所述部分可以在真核细胞和原核细胞中都起作用。合适部分的非限制性实例包括：5’帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽(m7G))、核糖开关序列(例如，以允许蛋白质和蛋白质复合物的调控稳定性和/或调控可及性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、将RNA靶向亚细胞位置的序列(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)、提供追踪的修饰或序列(例如，直接缀合到荧光分子、缀合到促进荧光检测的部分、允许荧光检测的序列等)和/或提供蛋白质的结合位点的修饰或序列(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活因子、转录控制、DNA甲基转移酶、DNA去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)。

间隔区序列

间隔区序列与关注的靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的间隔区可以通过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。间隔区的核苷酸序列可以根据关注的靶核酸的序列而变化。

在本文的CRISPR/Cas系统中，间隔区序列可以设计成与位于所述系统中使用的Cas9酶的PAM的5’的靶核酸杂交。间隔区可以与靶序列完全匹配或者可以具有失配。每种Cas9酶具有在靶DNA中识别的特定PAM序列。例如，化脓性链球菌在靶核酸中识别包含序列5’-NRG-3’的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸，并且N紧邻由间隔区序列靶向的靶核酸序列的3’。

靶核酸序列可以包含20个核苷酸。靶核酸可以包含少于20个核苷酸。靶核酸可以包含多于20个核苷酸。靶核酸可以包含至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸可以包含至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸序列可以包含紧邻PAM的第一个核苷酸的5’的20个碱基。例如，在包含5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3’(SEQ ID NO：3)的序列中，靶核酸可以包含对应于N的序列，其中N是任何核苷酸，且带下划线的NRG序列是化脓性链球菌PAM。

与靶核酸杂交的间隔区序列可以具有至少约6个核苷酸(nt)的长度。间隔区序列可以是至少约6nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt、约6nt至约80nt、约6nt至约50nt、约6nt至约45nt、约6nt至约40nt、约6nt至约35nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约19nt、约10nt至约50nt、约10nt至约45nt、约10nt至约40nt、约10nt至约35nt、约10nt至约30nt、约10nt至约25nt、约10nt至约20nt、约10nt至约19nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt、或约20nt至约60nt。在一些实施例中，间隔区序列可以包含20个核苷酸。在一些实施例中，间隔区可以包含19个核苷酸。

在一些实施例中，间隔区序列与靶核酸之间的互补百分比为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实施例中，间隔区序列与靶核酸之间的互补百分比为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％或100％。在一些实施例中，相对于靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的5’-大多数核苷酸而言，间隔区序列与靶核酸之间的互补百分比是100％。相对于约20个连续核苷酸而言，间隔区序列和靶核酸之间的互补百分比可以是至少60％。间隔区序列和靶核酸的长度可以相差1至6个核苷酸，这可以被认为是一个或多个凸出(bulge)。

可以使用计算机程序设计或选择间隔区序列。所述计算机程序可以使用变量，诸如预测的熔融温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、％GC，基因组发生的频率(例如，相同或相似但由于失配、***或缺失而在一个或多个点处变化的序列)、甲基化状态、SNP的存在等。

最小CRISPR重复序列

最小CRISPR重复序列可以是与参考CRISPR重复序列(例如，来自化脓性链球菌的crRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％序列同一性的序列。

最小CRISPR重复序列可以包含可以与细胞中的最小tracrRNA序列杂交的核苷酸。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列可以形成双链体，即碱基配对的双链结构。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列可以一起结合到定点多肽。最小CRISPR重复序列的至少一部分可以与最小tracrRNA序列杂交。最小CRISPR重复序列的至少一部分可以包含与最小tracrRNA序列的至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％互补性。最小CRISPR重复序列的至少一部分可以包含与最小tracrRNA序列的至多约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％互补性。

最小CRISPR重复序列的长度可以为约7个核苷酸至约100个核苷酸。例如，最小CRISPR重复序列的长度为约7个核苷酸(nt)至约50nt、约7nt至约40nt、约7nt至约30nt、约7nt至约25nt、约7nt至约20nt、约7nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt、约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt、或约15nt至约25nt。在一些实施例中，最小CRISPR重复序列的长度可以是大约9个核苷酸。最小CRISPR重复序列的长度可以是大约12个核苷酸。

相对于一段至少6、7或8个连续核苷酸而言，最小CRISPR重复序列可以与参考最小CRISPR重复序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型crRNA)至少约60％相同。例如，相对于一段至少6、7或8个连续核苷酸而言，最小CRISPR重复序列可以与参考最小CRISPR重复序列至少约65％相同，至少约70％相同，至少约75％相同，至少约80％相同，至少约85％相同，至少约90％相同，至少约95％相同，至少约98％相同，至少约99％相同或100％相同。

最小tracrRNA序列

最小tracrRNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如，来自化脓性链球菌的tracrRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％序列同一性的序列。

最小tracrRNA序列可以包含与细胞中的最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列形成双链体，即碱基配对的双链结构。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列可以一起结合到定点多肽。最小tracrRNA序列的至少一部分可以与最小CRISPR重复序列杂交。最小tracrRNA序列可以与最小CRISPR重复序列的至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％互补。

最小tracrRNA序列的长度可以为约7个核苷酸至约100个核苷酸。例如，最小tracrRNA序列的长度可以是约7个核苷酸(nt)至约50nt、约7nt至约40nt、约7nt至约30nt、约7nt至约25nt、约7nt至约20nt、约7nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt、约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt、或约15nt至约25nt。最小tracrRNA序列的长度可以是大约9个核苷酸。最小tracrRNA序列可以是大约12个核苷酸。最小的tracrRNA可以由Jinek等人，同上所述的tracrRNA nt 23-48组成。

相对于一段至少6、7或8个连续核苷酸而言，最小tracrRNA序列可以与参考最小tracrRNA(例如，来自化脓性链球菌的野生型tracrRNA)至少约60％相同。例如，相对于一段至少6、7或8个连续核苷酸而言，最小tracrRNA序列可以与参考最小tracrRNA序列至少约65％相同，约70％相同，约75％相同，约80％相同，约85％相同，约90％相同，约95％相同，约98％相同，约99％相同或100％相同。

最小CRISPR RNA和最小tracrRNA之间的双链体可以包含双螺旋。最小CRISPR RNA和最小tracrRNA之间的双链体可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。最小CRISPR RNA和最小tracrRNA之间的双链体可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。

所述双链体可以包含失配(即，双链体的两条链不是100％互补的)。双链体可以包含至少约1、2、3、4或5处或失配。双链体可以包含至多约1、2、3、4或5处或失配。双链体可以包含不超过2处失配。

凸出

在一些情况下，在最小CRISPR RNA和最小tracrRNA之间的双链体中可能存在“凸出”。凸出是双链体内核苷酸的未配对区域。凸出可以有助于双链体与定点多肽的结合。凸出可以在双链体的一侧包含未配对的5’-XXXY-3’，其中X是任何嘌呤，且Y包含可以与相对链上的核苷酸形成摆动对的核苷酸；和在双链体的另一侧上的未配对的核苷酸区域。在双链体的两侧上的未配对核苷酸的数量可以不同。

在一个实施例中，凸出可以包含在凸出的最小CRISPR重复序列链上的未配对嘌呤(例如，腺嘌呤)。在一些实施例中，凸出可以包含凸出的最小tracrRNA序列链的未配对的5’-AAGY-3’，其中Y包含可以与最小CRISPR重复序列链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。

在双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸出可以包含至少1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。在双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸出可以包含至多1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。在双链体的最小CRISPR重复序列侧上的凸出可以包含1个未配对的核苷酸。

在双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸出可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。在双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸出可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。在双链体的第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸出可以包含4个未配对的核苷酸。

凸出可以包含至少一个摆动配对。在一些实施例中，凸出可以包含至多一个摆动配对。凸出可以包含至少一个嘌呤核苷酸。凸出可以包含至少3个嘌呤核苷酸。凸出序列可以包含至少5个嘌呤核苷酸。凸出序列可以包含至少一个鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，凸出序列可以包含至少一个腺嘌呤核苷酸。

发夹

在各种实施例中，一个或多个发夹可以位于3’tracrRNA序列中最小tracrRNA的3’。

所述发夹可以从最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列双链体中的最后配对核苷酸起始至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸3’。所述发夹可以从最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列双链体中的最后配对核苷酸起始至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸3’。

所述发夹可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个连续核苷酸。所述发夹可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或更多个连续核苷酸。

所述发夹可以包含CC二核苷酸(即，两个连续的胞嘧啶核苷酸)。

所述发夹可以包含双链体核苷酸(例如，发夹中的核苷酸，一起杂交)。例如，发夹可以包含CC二核苷酸，其与3’tracrRNA序列的发夹双链体中的GG二核苷酸杂交。

发夹中的一个或多个可以与定点多肽的导向RNA相互作用区域相互作用。

在一些实施例中，存在两个或更多个发夹，并且在其他实施例中，存在三个或更多个发夹。

3’tracrRNA序列

3’tracrRNA序列可以包含与参考tracrRNA序列(例如，来自化脓性链球菌的tracrRNA序列)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％序列同一性的序列。

3’tracrRNA序列的长度可以为约6个核苷酸至约100个核苷酸。例如，3’tracrRNA序列的长度可以为约6个核苷酸(nt)至约50nt、约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt、约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt、或约15nt至约25nt。3’tracrRNA序列的长度可以为大约14个核苷酸。

相对于一段至少6、7或8个连续核苷酸而言，3’tracrRNA序列可以与参考3’tracrRNA(例如，来自化脓性链球菌的野生型3’tracrRNA序列)至少约60％相同。例如，相对于一段至少6、7或8个连续核苷酸而言，3’tracrRNA序列可以与参考3’tracrRNA序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型3’tracrRNA序列)至少约60％相同，约65％相同，约70％相同，约75％相同，约80％相同，约85％相同，约90％相同，约95％相同，约98％相同，约99％相同或100％相同。

3’tracrRNA序列可以包含多于一个双链体区域(例如，发夹、杂交区域)。3’tracrRNA序列可以包含两个双链体区域。

3’tracrRNA序列可以包含茎环结构。3’tracrRNA中的茎环结构可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。3’tracrRNA中的茎环结构可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。茎环结构可以包含功能部分。例如，茎环结构可以包含适体、核酶、蛋白质相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子或外显子。茎环结构可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。茎环结构可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。

3’tracrRNA序列中的发夹可以包含P结构域。在一些实施例中，P结构域可以包含在发夹中的双链区域。

tracrRNA延伸序列

无论tracrRNA是在单分子导向还是双分子导向的背景下，都可以提供tracrRNA延伸序列。tracrRNA延伸序列的长度可以为约1个核苷酸至约400个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380或400个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为约20至约5000个或更多个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为超过1000个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400个或更多个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以少于1000个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以少于10个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为10-30个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为30-70个核苷酸。

tracrRNA延伸序列可以包含功能部分(例如，稳定性控制序列、核酶、内切核酸酶结合序列)。所述功能部分可以包含转录终止子区段(即，转录终止序列)。功能部分的总长度可以为约10个核苷酸(nt)至约100nt、约10nt至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、或约90nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt、或约15nt至约25nt。所述功能部分可以在真核细胞中起作用。所述功能部分可以在原核细胞中起作用。所述功能部分可以在真核细胞和原核细胞中都起作用。

合适tracrRNA延伸功能部分的非限制性实例包括：3’聚腺苷酸化尾、核糖开关序列(例如，以允许蛋白质和蛋白质复合物实现调控稳定性和/或调控可及性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、将RNA靶向亚细胞位置的序列(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)、提供追踪的修饰或序列(例如，直接缀合到荧光分子、缀合到促进荧光检测的部分、允许荧光检测的序列等)和/或提供蛋白质的结合位点的修饰或序列(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活因子、转录控制、DNA甲基转移酶、DNA去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)。tracrRNA延伸序列可以包含引物结合位点或分子指数(例如，条形码序列)。tracrRNA延伸序列可以包含一个或多个亲和标签。

单分子导向接头序列

单分子导向核酸的接头序列的长度可以为约3个核苷酸至约100个核苷酸。在Jinek等人，同上中，例如，使用简单的4核苷酸“四环”(-GAAA-)，Science，337(6096)：816-821(2012)。说明性接头的长度为约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3nt至约80nt、约3nt至约70nt、约3nt至约60nt、约3nt至约50nt、约3nt至约40nt、约3nt至约30nt、约3nt至约20nt、约3nt至约10nt。例如，接头的长度可以为约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、或约90nt至约100nt。单分子导向核酸的接头可以是4至40个核苷酸。所述接头可以是至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。所述接头可以是至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。

接头可以包含多种序列中的任一种，但是在一些实施例中，接头将不包含具有与导向RNA的其他部分的广泛同源区域的序列，这可能引起可能干扰导向的其他功能区域的分子内结合。在Jinek等人，同上中，使用简单的4核苷酸序列-GAAA-，Science，337(6096)：816-821(2012)，但同样可以使用包括更长序列的许多其他序列。

接头序列可以包含功能部分。例如，接头序列可以包含一个或多个特征，这些特征包括适体、核酶、蛋白质相互作用发夹、蛋白结合位点、CRISPR阵列、内含子或外显子。接头序列可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。在一些实施例中，接头序列可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。

本公开的离体方法的步骤可以包括使用基因组工程编辑患者特异性iPSC细胞。或者，本公开的离体方法的步骤可以包括编辑间充质干细胞或造血祖细胞。同样地，本公开的体内方法的步骤可以包括使用基因组工程编辑患有血红蛋白病的患者中的细胞。相似地，本公开的细胞方法中的步骤可以包括通过基因组工程在人细胞中的BCL11A基因或编码BCL11A基因的调控元件的其他DNA序列内或其附近编辑。

患有血红蛋白病的不同患者通常将需要不同的缺失、调节或灭活策略。任何CRISPR内切核酸酶可以用于本公开的方法中，每种CRISPR内切核酸酶具有其自身的相关PAM，其可以是或可以不是疾病特异性的。

例如，BCL11A基因的转录控制序列可以通过由NHEJ途径产生的缺失来调节或灭活。NHEJ可以用于直接地或通过靶向几个位置的一个gRNA或几个gRNA裂解来改变剪接供体或受***点来缺失BCL11A基因的转录控制序列的区段。

还可以通过***野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA来调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列。例如，用于通过HDR调节或激活的供体含有具有小或大的侧接同源臂以允许退火的BCL11A基因的修饰的转录控制序列。HDR基本上是一种无错误的机制，其在DSB修复期间使用供应的同源DNA序列作为模板。同源定向修复(HDR)的速率是转录控制序列和切割位点之间的距离的函数，因此选择重叠或最靠近靶位点是重要的。模板可以包括由同源区域侧接的其他序列，或者可以含有与基因组序列不同的序列，从而允许序列编辑。

除了通过NHEJ或HDR调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列之外，还可以有一系列的其他选择。如果存在小或大的缺失，则可以敲入含有修饰的转录控制序列的cDNA。可以将全长cDNA敲入任何“安全港”中，但必须使用供应的或其他启动子。如果将所述构建体敲入恰当位置，它将具有与正常基因相似的生理控制。可以使用成对的核酸酶以缺失基因区域，尽管通常将必须提供供体以调节或灭活所述功能。在这种情况下，将供应两个gRNA和一个供体序列。

一些基因组工程策略涉及通过缺失BCL11A基因的转录控制序列的至少一部分和/或通过也称为同源重组(HR)的同源定向修复(HDR)将野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA敲入相应基因的基因座或安全港基因座来调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列。所述策略可以调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列并逆转、治疗和/或减轻患病状态。用于调节/灭活转录控制序列的供体核苷酸通常很小(＜300bp)。这是有利的，因为HDR效率可以与供体分子的大小成反比。此外，预期供体模板可以适合尺寸受限的腺相关病毒(AAV)分子，其已被证明是供体模板递送的有效手段。

同源定向修复是修复双链断裂(DSB)的细胞机制。最常见的形式是同源重组。HDR还有额外的途径，包括单链退火和替代HDR。基因组工程工具允许研究人员操纵细胞同源重组途径，以产生对基因组的位点特异性修饰。已经发现细胞可以使用反式提供的合成供体分子修复双链断裂。因此，通过在特异性突变附近引入双链断裂并提供合适的供体，可以在基因组中进行靶向改变。特异性裂解使HDR的速率比接受单独的同源供体的10⁶个细胞中的1个的速率高1,000倍以上。在特定核苷酸处同源定向修复(HDR)的速率是距切割位点的距离的函数，因此选择重叠或最靠近靶位点是重要的。基因编辑提供优于基因添加的优势，因为原位校正使得基因组的其余部分不受干扰。

由HDR进行编辑的供应供体显著不同，但可以包含具有小或大侧接同源臂以允许退火至基因组DNA的预期序列。侧接引入的遗传改变的同源区域可以是30bp或更小，或者与可以含有启动子、cDNA等的多千碱基盒一样大。已经使用了单链低聚核苷酸供体和双链低聚核苷酸供体两者。这些低聚核苷酸的大小范围为小于100nt至超过数kb，但也可以产生和使用更长的ssDNA。可以使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和小环。一般而言，已经发现AAV载体可以是递送供体模板的非常有效的手段，尽管单个供体的包装限度＜5kb。供体的活性转录使HDR增加三倍，表明包含启动子可以增加转化。相反，供体的CpG甲基化降低了基因表达和HDR。

除了野生型内切核酸酶如Cas9之外，还存在切口酶变体，其使得一个或另一个核酸酶结构域灭活，导致仅切割一条DNA链。HDR可以自单个Cas切口酶或使用侧接靶区域的成对切口酶定向。供体可以是单链的，带切口的或dsDNA。

供体DNA可以与核酸酶一起供应或者通过各种不同的方法，例如通过转染、纳米粒子、微注射或病毒转导独立地供应。已经提出了一系列系链选项，以增加供体对HDR的可用性。实例包括将供体附着到核酸酶，附着到附近结合的DNA结合蛋白，或附着到参与DNA端结合或修复的蛋白质。

修复途径的选择可以由许多培养条件如影响细胞周期的那些来导向，或通过靶向DNA修复和相关蛋白来导向。例如，为了增加HDR，可以抑制关键的NHEJ分子，诸如KU70、KU80或DNA连接酶IV。

在不存在供体的情况下，来自DNA断裂的末端或来自不同断裂的末端可以使用几种非同源修复途径连接，其中DNA端在连接处在有很少或没有碱基配对的情况下连接。除了规范的NHEJ外，还有相似的修复机制，诸如alt-NHEJ。如果存在两处断裂，则可以缺失或反转间插区段。NHEJ修复途径可以导致接合点处的***、缺失或突变。

在核酸酶裂解后，使用NHEJ以将15-kb诱导型基因表达盒***人细胞系中的确定的基因座中。Maresca，M.，Lin，V.G.，Guo，N.和Yang，Y.，Genome Res 23，539-546(2013)。

除了通过NHEJ或HDR进行基因组编辑之外，还进行了使用NHEJ途径和HR两者的位点特异性基因***。组合方法可以适用于某些设置，可能包括内含子/外显子边界。NHEJ可以证明对在内含子中的连接有效，而无错误的HDR可能更适合于编码区域。

作为另一种选择，可以将野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA敲入相应基因的基因座或敲入安全港位点，诸如AAVS1。在一些实施例中，所述方法可以提供一个gRNA或一对gRNA，其可以用于促进并入来自多核苷酸供体模板的新序列以敲入一部分或整体的野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA。

这些方法可以提供通过切割基因两次进行缺失的gRNA对，一个gRNA在一个或多个突变的5’端切割，且另一个gRNA在一个或多个突变的3’端切割，这促进来自多核苷酸供体模板的新基因***以置换BCL11A基因的转录控制序列。切割可以通过一对DNA内切核酸酶完成，每个内切核酸酶在基因组中产生DSB，或者切割可以通过多个切口酶完成，这些切口酶在基因组中一起产生DSB。

或者，这些方法可以提供一个gRNA以在BCL11A基因的转录控制序列周围进行一次双链切割，其促进***来自多核苷酸供体模板的新序列以用野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA置换BCL11A基因的转录控制序列。双链切割可以由单个DNA内切核酸酶或多个切口酶进行，这些切口酶在基因组中一起产生DSB。

BCL11A基因或编码BCL11A基因的调控元件的其他DNA序列内或其附近的说明性修饰包括在上文提到的BCL11A基因的转录控制序列内或其附近(邻近)，诸如在转录控制序列的上游或下游在小于3kb、小于2kb、小于1kb、小于0.5kb的区域内的置换。

此类变体可以包括在5’和/或3’方向上比所讨论的特定置换大的置换或者在任一方向上更小的置换。因此，关于特定置换的“近”或“邻近”，意图是与所需置换边界(在本文中也称为端点)相关的SSB或DSB基因座可以在距所提到的参考基因座小于约3kb的区域内。SSB或DSB基因座可以更接近并且在2kb内，在1kb内，在0.5kb内或在0.1kb内。在小置换的情况下，所需端点可以位于或“邻近”参考基因座，意图是该端点可以在距参考基因座的100bp内，在50bp内，在25bp内或小于约10bp至5bp内。

只要转录控制活性被调节或灭活，可以预期包含更大或更小置换的实例提供相同的益处。因此，预期本文描述并说明的置换的许多变型可以有效改善血红蛋白病。

另一种基因组工程策略涉及外显子或内含子缺失。特定外显子或内含子的靶向缺失可以是用单一治疗性混合物治疗大患者亚组的有吸引力的策略。缺失可以是单外显子或内含子缺失或多外显子或内含子缺失。虽然多外显子缺失可以到达更多的患者，但是对于更大的缺失，缺失效率随着大小的增加而大大降低。因此，缺失的大小范围可以是40至10,000个碱基对(bp)。例如，缺失的大小范围可以是40-100；100-300；300-500；500-1,000；1,000-2,000；2,000-3,000；3,000-5,000；或5,000-10,000个碱基对。如果内含子含有调控元件，诸如转录控制元件(例如，转录因子结合位点)，则可能需要缺失内含子。

为了确保在缺失后正确加工pre-mRNA，可以缺失周围的剪接信号。剪接供体和受体通常在相邻内含子的100个碱基对内。因此，在一些实施例中，方法可以提供相对于每个关注的外显子/内含子接合切割大约+/-100-3100bp的所有gRNA。

对于任何基因组编辑策略，可以通过测序或PCR分析来确认基因编辑。

靶序列选择

相对于特定参考基因座的5’边界和/或3’边界的位置的偏移可以用于促进或增强基因编辑的特定应用，其部分地取决于选择用于编辑的内切核酸酶系统，如本文中进一步描述和说明的。

在这种靶序列选择的第一非限制性实施例中，许多内切核酸酶系统具有可以导向用于裂解的潜在靶位点的初始选择的规则或标准，例如在CRISPR II型或V型内切核酸酶的情况下在与DNA裂解位点相邻的特定位置中需要PAM序列基序。

在靶序列选择或优化的另一个非限制性实施例中，靶序列和基因编辑内切核酸酶的特定组合的脱靶活性的频率(即，在除所选靶序列以外的位点处发生的DSB的频率)可以相对于中靶活性的频率评估。在一些情况下，已经在所需基因座上正确编辑的细胞相对于其他细胞可以具有选择优势。选择优势的说明性但非限制性的实例包括获得诸如增强的复制速率、持久性、对某些情况的抗性、引入患者后体内增强的成功植入率或持久性等属性以及与维持或增加此类细胞的数量或活力相关的其他属性。在其他情况下，可以通过用于识别、分类或以其他方式选择已经正确编辑的细胞的一种或多种筛选方法来积极地选择已在所需基因座处正确编辑的细胞。选择优势和定向选择方法都可以利用与校正相关的表型。在一些情况下，可以编辑细胞两次或更多次以产生第二修饰，其产生用于选择或纯化预期细胞群体的新表型。可以通过添加用于可选择或可筛选标志物的第二gRNA来产生这种第二修饰。在一些情况下，可以使用含有cDNA以及可选择的标志物的DNA片段在所需基因座上正确编辑细胞。

无论任何选择优势是否适用或在特定情况下是否应用任何定向选择，还可以通过考虑脱靶频率来导向靶序列选择，以便增强应用的有效性和/或降低在除所需靶标之外的位点处不期望改变的可能性。如本文和本领域中进一步描述和说明的，脱靶活性的发生可以受许多因素影响，这些因素包括中靶位点和各种脱靶位点之间的相似性和不相似性以及所用的特定内切核酸酶。生物信息学工具可以用于帮助预测脱靶活性，并且此类工具通常也可以用于识别脱靶活性的最可能位点，然后可以在实验设置下评价以评价脱靶活性与中靶活性的相对频率，从而允许选择具有较高相对中靶活性的序列。本文提供了此类技术的说明性实施例，并且其他技术在本领域中是已知的。

靶序列选择的另一方面涉及同源重组事件。共有同源区域的序列可以作为导致间插序列缺失的同源重组事件的焦点。此类重组事件在染色体和其他DNA序列的正常复制过程期间发生，并且在合成DNA序列的其他时间，诸如在修复双链断裂(DSB)的情况下发生，这在正常细胞复制周期期间定期地发生，但也可以通过各种事件(诸如UV光和DNA断裂的其他诱导物)的出现或某些试剂(诸如各种化学诱导剂)的存在来增强。许多这样的诱导剂引起DSB在基因组中不加选择地发生，并且DSB可以在正常细胞中定期地诱导和修复。在修复期间，可以完全保真地重新产生原始序列，然而，在一些情况下，在DSB位点引入小***或缺失(称为“***缺失”)。

DSB还可以在特定位置特异性地诱导，如本文所述的内切核酸酶系统的情况，其可以用于在选定的染色***置引起定向或优先的基因修饰事件。在许多情况下可以利用同源序列在DNA修复(以及复制)的背景下进行重组的趋势，并且这是基因编辑系统如CRISPR的一种应用的基础，其中使用同源定向修复以将通过使用“供体”多核苷酸提供的关注的序列***所需染色***置。

也可以使用特定序列之间的同源区域形成所需缺失，这些同源区域可以是可以包含少至10个碱基对或更少的“微同源”的小区域。例如，可以在与附近序列表现出微同源性的位点处引入单处DSB。在这种DSB的正常修复过程期间，高频率发生的结果是作为由DSB和伴随的细胞修复过程促进的重组的结果的间插序列的缺失。

然而，在某些情况下，在同源区域内选择靶序列也可以产生大得多的缺失，包括基因融合(当缺失在编码区中时)，其可能需要或可能不需要给出特定情况。

本文提供的实施例进一步说明用于产生设计用于诱导导致转录控制蛋白活性的调节或灭活的置换的DSB的各种靶区域的选择，以及在设计用以相对于中靶事件而言使脱靶事件减至最少的此类区域内特异性靶序列的选择。

核酸修饰

在一些情况下，引入细胞中的多核苷酸可以包含一种或多种修饰，这些修饰可以单独或组合使用例如以增强活性、稳定性或特异性，改变递送，减少宿主细胞中的先天免疫应答，或用于其他增强，如本文进一步描述和本领域已知的。

在某些实施例中，修饰的多核苷酸可以用于CRISPR/Cas9系统，在这种情况下，导向RNA(单分子导向或双分子导向)和/或编码引入细胞中的Cas内切核酸酶的DNA或RNA可以被修饰，如下面所述和说明的。此类修饰的多核苷酸可以用于CRISPR/Cas9系统中以编辑任何一个或多个基因组基因座。

出于此类用途的非限制性说明目的使用CRISPR/Cas9系统，可以使用导向RNA的修饰来增强包含可以是单分子导向或双分子导向的导向RNA和Cas内切核酸酶的CRISPR/Cas9基因组编辑复合物的形成或稳定性。导向RNA的修饰也可以或替代地用于增强在具有在基因组中的靶序列的基因组编辑复合物之间的相互作用的起始、稳定性或动力学，其可以用于例如增强中靶活性。导向RNA的修饰也可以或替代地用于增强特异性，例如与在其他(脱靶)位点处的效应相比较，增强在中靶位点处的基因组编辑的相对速率。

修饰也可以或替代地用于例如通过增加导向RNA对细胞中存在的核糖核酸酶(RNase)引起的降解的抗性增加导向RNA的稳定性，从而使其在细胞中的半衰期增加。增强导向RNA半衰期的修饰可以在其中Cas内切核酸酶被引入细胞中以通过需要翻译以产生内切核酸酶的RNA编辑的方面特别有用，因为增加在与RNA编码内切核酸酶的同时引入的导向RNA的半衰期可以用以增加导向RNA和编码的Cas内切核酸酶在细胞中共存在的时间。

修饰也可以或替代地用于降低引入细胞的RNA引发先天免疫应答的可能性或程度。在包括小干扰RNA(siRNA)的RNA干扰(RNAi)的背景下已经充分表征的此类应答，如下文和本领域中所述，往往与RNA的半衰期降低和/或与免疫应答相关的细胞因子或其他因子的诱导相关联。

还可以对引入细胞中的编码内切核酸酶的RNA进行一种或多种类型的修饰，包括但不限于增强RNA的稳定性(诸如通过由细胞中存在的RNase增加其降解)的修饰、增强所得产物(即，内切核酸酶)的翻译的修饰和/或降低引入细胞的RNA引发先天免疫应答的可能性或程度的修饰。

同样可以使用诸如前述和其他的修改的组合。在CRISPR/Cas9的情况下，例如，可以对导向RNA进行一种或多种类型的修饰(包括上面示例的那些)，和/或可以对编码Cas内切核酸酶的RNA进行一种或多种类型的修饰(包括上面示例的那些)。

举例说明，CRISPR/Cas9系统中使用的导向RNA或其他较小的RNA可以通过化学方法容易地合成，使得能够容易地并入许多修饰，如下文所示并在本领域中所述。虽然化学合成工序在不断扩展，但是通过诸如高效液相色谱(HPLC，其避免使用诸如PAGE的凝胶)的工序来纯化此类RNA往往变得更具挑战性，因为多核苷酸长度显著增加超过一百个左右的核苷酸。可以用于产生更长的化学修饰的RNA的一种方法是产生两个或更多个接合在一起的分子。长得多的RNA，诸如编码Cas9内切核酸酶的RNA，更容易酶产生。虽然可用于酶产生的RNA的修饰类型较少，但仍有修饰可以用于例如增强稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度和/或增强其他属性，如下文和本领域中进一步描述的；并且正在定期地开发新的修饰类型。

作为各种类型的修饰的说明，特别是那些经常与较小化学合成的RNA一起使用的修饰，修饰可以包含在糖的2’位修饰的一个或多个核苷酸，在一些方面，2’-O-烷基、2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟-修饰的核苷酸。在一些实施例中，RNA修饰可以在RNA的3’端的嘧啶、无碱基残基或反向碱基的核糖上包含2’-氟、2’-氨基或2’O-甲基修饰。此类修饰可以常规地并入低聚核苷酸中，并且已经显示这些低聚核苷酸具有比针对给定靶的2’-脱氧低聚核苷酸高的Tm(即，更高的靶结合亲和力)。

已经显示许多核苷酸和核苷修饰使得并入了它们的低聚核苷酸比天然低聚核苷酸对核酸酶消化更具抗性；这些修饰的低聚核苷酸比未修饰的低聚核苷酸完整地存活更长的时间。修饰的低聚核苷酸的具体实例包括包含修饰的主链的那些，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。一些低聚核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的低聚核苷酸和具有杂原子主链，特别是CH2-NH-O-CH2、CH，～N(CH3)～O～CH2(称为亚甲基(甲基亚胺基)或MMI主链)、CH2--O--N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主链的低聚核苷酸，其中天然磷酸二酯主链表示为O-P--O-CH)；酰胺主链[参见De Mesmaeker等人，Ace.Chem.Res.，28：366-374(1995)]；吗啉代主链结构(参见Summerton和Weller，美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)主链(其中低聚核苷酸的磷酸二酯主链被聚酰胺主链置换，核苷酸直接或间接结合到聚酰胺主链的氮杂氮原子上，参见Nielsen等人，Science 1991，254，1497)。含磷键包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包含3’亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯的甲基和其他烷基膦酸酯、次膦酸酯、包含3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯、这些的2’-5’连接的类似物以及具有相反极性的那些，其中相邻的核苷酸单元对将3’-5’连接至5’-3’或将2’-5’连接至5’-2’；参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。

基于吗啉代的低聚化合物描述于Braasch和David Corey，Biochemistry，41(14)：4503-4510(2002)；Genesis，第30卷，第3期，(2001)；Heasman，Dev.Biol.，243：209-214(2002)；Nasevicius等人，Nat.Genet.，26：216-220(2000)；Lacerra等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，97：9591-9596(2000)；和美国专利号5,034,506，1991年7月23日颁发。

环己烯基核酸低聚核苷酸模拟物描述在Wang等人，J.Am.Chem.Soc.，122：8595-8602(2000)中。

其中不包括磷原子的修饰的低聚核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷酸间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间键形成的主链。这些包括具有吗啉代键的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和其他具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他主链；参见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。

还可以包括一个或多个取代的糖部分，例如，在2’位的下列之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n为1至约10；C1至C10低碳烷基、烷氧基烷氧基，取代的低碳烷基、烷芳基或芳烷基；氯；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解基团；报导体基团；嵌入剂；用于改进低聚核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改进低聚核苷酸和具有相似性质的其他取代基的药效学性质的基团。在一些方面，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-0-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基))(Martin等人，HeIv.Chim.Acta，1995，78，486)。其他修饰包括2’-甲氧基(2’-0-CH3)、2’-丙氧基(2’-OCH2CH2CH3)和2’-氟代(2’-F)。也可以在低聚核苷酸上的其他位置，特别是在3’末端核苷酸上的糖的3’位和5’末端核苷酸的5’位上进行相似的修饰。低聚核苷酸也可以具有糖模拟物，诸如环丁基代替戊呋喃糖基基团。

在一些实施例中，核苷酸单元的糖和核苷酸间键(即主链)都可以用新的基团置换。可以维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的低聚化合物，即已显示具有优异杂交性质的低聚核苷酸模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，低聚核苷酸的糖主链可以用含酰胺的主链如氨基乙基甘氨酸主链置换。核碱基可以保留并直接或间接键合到主链的酰胺部分的氮杂氮原子上。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等人，Science，254：1497-1500(1991)中见到。

导向RNA还可以另外或替代地包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括仅在天然核酸中偶尔或短暂发现的核碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2’脱氧胞嘧啶，并且在本领域中通常被称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC；以及合成的核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。Kornberg，A.，DNA Replication，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第75至77页(1980)；Gebeyehu等人，Nucl.Acids Res.15：4513(1997)。还可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。已经显示5-Me-C取代使核酸双链体稳定性增加0.6℃至1.2℃。(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276至278页)和碱基取代的方面。

修饰的核碱基可以包括其他合成和天然核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假-尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

另外，核碱基可以包括美国专利号3,687,808中公开的那些；’The ConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering’，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编，John Wiley&Sons，1990中公开的那些；Englisch等人，Angewandle Chemie，International Edition’，1991，30，第613页公开的那些；以及Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications’，第289至302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.ea.，CRC Press，1993公开的那些。这些核碱基中的某些特别适用于增加本发明的低聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6℃至1.2℃(Sanghvi，Y.S.、Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，’AntisenseResearch and Applications’，CRC Press，Boca Raton，1993，第276至278页)并且是碱基取代的方面，甚至更特别地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。修饰的核碱基描述于美国专利号3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653；6,005,096；和美国专利申请公告号2003/0158403中。

因此，术语“修饰的”是指并入导向RNA、内切核酸酶或BCL11A的转录控制序列或导向RNA和内切核酸酶两者的非天然糖、磷酸酯或碱基。给定低聚核苷酸中的所有位置不必均匀地修饰，并且实际上可以将多于一种前述修饰并入单个低聚核苷酸中，或甚至并入低聚核苷酸内的单个核苷酸中。

编码内切核酸酶的导向RNA和/或mRNA(或DNA)可以与一个或多个增强低聚核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物化学连接。此类部分包括但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分[Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6553-6556(1989)]；胆酸[Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，4：1053-1060(1994)]；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇[Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：306-309(1992)和Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，3：2765-2770(1993)]；硫代胆固醇[Oberhauser等人，Nucl.AcidsRes.，20：533-538(1992)]；脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基[Kabanov等人，FEBSLett.，259：327-330(1990)和Svinarchuk等人，Biochimie，75：49-54(1993)]；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯[Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，36：3651-3654(1995)和Shea等人，Nucl.AcidsRes.，18：3777-3783(1990)]；聚胺或聚乙二醇链[Mancharan等人，Nucleosides&Nucleotides，14：969-973(1995)]；金刚烷基乙酸[Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，36：3651-3654(1995)]；棕榈酰基部分[(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1264：229-237(1995)]；或十八烷基胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部分[Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，277：923-937(1996)]。还参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。

糖和其他部分可以用于将包含核苷酸如阳离子多核糖体和脂质体的蛋白和复合物靶向特定位点。例如，肝细胞定向转移可以通过脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导；参见例如Hu等人，Protein Pept Lett.21(10)：1025-30(2014)。本领域已知并定期开发的其他系统可以用于将这种情况下使用的生物分子和/或其复合物靶向关注的特定靶细胞。

这些靶向部分或缀合物可以包含与官能团共价键合的缀合基团，诸如伯或仲羟基基团。本发明的缀合基团包括嵌入剂、报导体分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学性质的基团和增强低聚物的药代动力学性质的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本公开的背景下，增强药效动力学性质的基团包括改进摄取、增强抗降解性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本公开的背景下，增强药代动力学性质的基团包括改进本发明的化合物的摄取、分布、代谢或***的基团。代表性缀合基团公开在1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196和美国专利号6,287,860中。缀合部分包括但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分；胆酸；硫醚，例如己基-5-三苯甲基硫醇；硫代胆固醇；脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯；多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸，棕榈基部分或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。参见，例如，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541，313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；和5,688,941。

较不易于化学合成并且通常通过酶合成产生的较长多核苷酸也可以通过各种手段进行修饰。此类修饰可以包括例如引入某些核苷酸类似物、在分子的5’端或3’端并入特定序列或其他部分以及其他修饰。举例来说，编码Cas9的mRNA的长度为大约4kb，并且可以通过体外转录合成。对mRNA的修饰可以应用于例如增加其翻译或稳定性(诸如通过增加其对细胞降解的抗性)或降低RNA在引入外源RNA，特别是诸如编码Cas9的RNA的较长RNA后引发在细胞中常观察到的先天免疫应答的趋势。

在本领域中已经描述了许多这样的修饰，诸如polyA尾、5’帽类似物(例如，反逆向帽类似物(ARCA)或m7G(5’)ppp(5’)G(mCAP))、修饰的5’或3’非翻译区域(UTR)、使用修饰的碱基(诸如假-UTP、2-硫代-UTP、5-甲基胞嘧啶-5’-三磷酸酯(5-甲基-CTP)或N6-甲基-ATP)或用磷酸酶处理以除去5’末端磷酸酯。这些和其他修饰是本领域已知的，并且定期开发了RNA的新修饰。

存在许多修饰的RNA的商业供应商，包括例如TriLink Biotech、AxoLabs、Bio-Synthesis Inc.、Dharmacon等。如TriLink所述，例如，5-甲基-CTP可以用于赋予所需特征，诸如增加的核酸酶稳定性、增加的翻译或减少的先天免疫受体与体外转录的RNA的相互作用。也已经显示5-甲基胞嘧啶-5’-三磷酸酯(5-甲基-CTP)、N6-甲基-ATP以及假-UTP和2-硫代-UTP可以降低培养物中和体内的先天免疫刺激，同时增强翻译，如下文提到的Kormann等人和Warren等人的出版物所说明。

已经显示，体内递送的化学修饰的mRNA可以用于实现改进的治疗效果；参见，例如，Kormann等人，Nature Biotechnology 29，154-157(2011)。此类修饰可以用于例如增加RNA分子的稳定性和/或降低其免疫原性。使用化学修饰如假-U、N6-甲基-A、2-硫代-U和5-甲基-C，发现用2-硫代-U和5-甲基-C取代仅四分之一的尿苷和胞苷残基分别引起小鼠中mRNA的toll样受体(TLR)介导的识别的显著降低。通过减少先天免疫系统的激活，这些修饰可以用于有效地增加体内mRNA的稳定性和寿命；参见，例如，Kormann等人，同上。

还已经显示，重复施用并入设计成绕过先天抗病毒应答的修饰的合成信使RNA可以将分化的人细胞重编程为多能性。参见，例如，Warren等人，Cell Stem Cell，7(5)：618-30(2010)。充当初级重编程蛋白的此类修饰的mRNA可以是重编程多种人细胞类型的高效手段。此类细胞被称为诱导的多能干细胞(iPSC)，并且发现并入5-甲基-CTP、假-UTP和反逆向帽类似物(ARCA)的酶合成的RNA可以用于有效地逃避细胞的抗病毒应答；参见，例如，Warren等人，同上。

本领域中描述的多核苷酸的其他修饰包括，例如，使用polyA尾、添加5’帽类似物(诸如，m7G(5’)PPP(5’)G(mCAP))、修饰5’或3’非翻译区域(UTR)或用磷酸酶处理以除去5’末端磷酸酯-并且正在定期开发新的方法。

已经结合包括小干扰RNA(siRNA)的RNA干扰(RNAi)的修饰开发了适用于产生用于本文的修饰的RNA的许多组合物和技术。siRNA在体内存在特定的挑战，因为它们通过mRNA干扰对基因沉默的影响通常是短暂的，这可能需要重复施用。此外，siRNA是双链RNA(dsRNA)，并且哺乳动物细胞具有发展以检测和中和dsRNA的免疫应答，dsRNA通常是病毒感染的副产物。因此，存在哺乳动物酶，诸如PKR(dsRNA反应激酶)和潜在的视黄酸诱导基因I(RIG-I)，其可以介导细胞对dsRNA的应答，以及Toll样受体(诸如TLR3、TLR7和TLR8)，其可以响应此类分子触发细胞因子的诱导；参见，例如以下评论：Angart等人，Pharmaceuticals(Basel)6(4)：440-468(2013)；Kanasty等人，Molecular Therapy 20(3)：513-524(2012)；Bumett等人，Biotechnol J.6(9)：1130-46(2011)；Judge和MacLachlan，Hum Gene Ther 19(2)：111-24(2008)；以及其中引用的参考文献。

已经开发并应用了多种修饰以增强RNA稳定性、降低先天免疫应答和/或实现可以结合将多核苷酸引入人细胞中使用的其他益处；参见，例如以下评论：Whitehead KA等人，Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering，2：77-96(2011)；Gaglione和Messere，Mini Rev Med Chem，10(7)：578-95(2010)；Chernolovskaya等人，Curr OpinMol Ther.，12(2)：158-67(2010)；Deleavey等人，Curr Protoc Nucleic Acid ChemChapter 16：Unit 16.3(2009)；Behlke，Oligonucleotides 18(4)：305-19(2008)；Fucini等人，Nucleic Acid Ther 22(3)：205-210(2012)；Bremsen等人，Front Genet 3：154(2012)。

如上所述，存在许多修饰RNA的商业供应商，其中许多已经专门设计用于改进siRNA有效性的修饰。基于文献中报道的各种发现提供了多种方法。例如，Dharmacon指出用硫(硫代磷酸酯，PS)置换非桥接氧已被广泛用于改进siRNA的核酸酶抗性，如Kole，NatureReviews Drug Discovery 11：125-140(2012)报道。据报道，核糖的2’-位置的修饰改进了核苷酸间磷酸键的核酸酶抗性，同时增加了双链体稳定性(Tm)，也已经显示其提供免于免疫激活的保护。中等PS主链修饰与小的耐受良好的2’-取代(2’-O-甲基、2’-氟、2’-羟基)的组合已经与用于体内应用的高度稳定的siRNA相关联，如Soutschek等人，Nature 432：173-178(2004)所报道；和已经报道2’-O-甲基修饰有效改进稳定性，如Volkov，Oligonucleotides 19：191-202(2009)报道。关于降低先天免疫应答的诱导，已经报道用2’-O-甲基、2’-氟、2’-羟基修饰特定序列降低TLR7/TLR8相互作用，同时通常保持沉默活性；参见，例如，Judge等人，Mol.Ther.13：494-505(2006)；和Cekaite等人，J.Mol.Biol.365：90-108(2007)。额外的修饰，诸如2-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷也已经显示出最小化由TLR3、TLR7和TLR8介导的免疫效应；参见，例如，Kariko，K.等人，Immunity 23：165-175(2005)。

如本领域所知，并且可商购获得，许多缀合物可以应用于用于本文的多核苷酸如RNA，其可以增强它们的细胞递送和/或摄取，包括例如胆固醇、生育酚和叶酸、脂质、肽、聚合物、接头和适体；参见，例如，Winkler，Ther.Deliv.4：791-809(2013)的评论及其中引用的参考文献。

密码子优化

编码定点多肽的多核苷酸可以根据本领域的标准方法进行密码子优化，以在含有关注的靶DNA的细胞中表达。例如，如果预期的靶核酸在人细胞中，则预期编码Cas9的人密码子优化的多核苷酸用于产生Cas9多肽。

基因组靶向核酸和定点多肽的复合物

基因组靶向核酸与定点多肽(例如，核酸导向的核酸酶，诸如Cas9)相互作用，从而形成复合物。基因组靶向核酸将定点多肽导向至靶核酸。

RNP

定点多肽和基因组靶向核酸可以各自单独地施用到细胞或患者。另一方面，定点多肽可以与一种或多种基因组靶向核酸(导向RNA、sgRNA或crRNA以及tracrRNA)预复合。然后可以将预复合的材料施用到细胞或患者。此类预复合材料被称为核糖核蛋白粒子(RNP)。RNP中的定点多肽可以是例如Cas9内切核酸酶。定点多肽可以在N-末端、C-末端或N-末端和C-末端两者侧接一个或多个核定位信号(NLS)。例如，Cas9内切核酸酶可以侧接两个NLS，一个NLS位于N-末端且第二个NLS位于C-末端。NLS可以是本领域中已知的任何NLS，诸如SV40NLS。RNP中基因组靶向核酸与定点多肽的重量比可以是1∶1。例如，RNP中sgRNA与Cas9内切核酸酶的重量比可以是1∶1。例如，sgRNA可以包含SEQ ID NO：1或2的核酸序列，Cas9内切核酸酶可以是包含N-末端SV40 NLS和C-末端SV40 NLS的化脓性链球菌Cas9，并且sgRNA与Cas9内切核酸酶的重量比可以是1∶1。

核酸编码系统组分

本公开提供一种核酸，其包含编码本公开的基因组靶向核酸的核苷酸序列；本公开的定点多肽；和/或实施本公开方法的方面所必需的任何核酸或蛋白质分子。

编码本公开的基因组靶向核酸、本公开的定点多肽和/或实施本公开方法的方面所必需的任何核酸或蛋白质分子的核酸可以包含载体(例如，重组表达载体)。

术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其可以接合额外的核酸区段。另一类型的载体是病毒载体，其中可以将额外的核酸区段接合到病毒基因组。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。

在一些实施例中，载体能够定向它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”，或更简单地称为“表达载体”，其起相同的功能。

术语“可操作地连接”是指关注的核苷酸序列以允许表达核苷酸序列的方式与一个或多个调控序列连接。术语“调控序列”旨在包括例如启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调控序列在本领域中是公知的，并且描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中定向核苷酸序列的组成型表达的调控序列，以及仅在某些宿主细胞中定向核苷酸序列的表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员应理解，表达载体的设计可以取决于诸如靶细胞的选择、所需表达水平等因素。

预期的表达载体包括但不限于基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒的病毒载体；和源自逆转录病毒如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体；以及其他重组载体。预期用于真核靶细胞的其他载体包括但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。预期用于真核靶细胞的额外载体包括但不限于载体pCTx-1、pCTx-2和pCTx-3。可以使用其他载体，只要它们与宿主细胞相容即可。

在一些实施例中，载体可以包含一种或多种转录和/或翻译控制元件。取决于所用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。载体可以是自灭活载体，其使病毒序列或CRISPR机制的组分或其他元件灭活。

合适的真核启动子(即，在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自以下的启动子：早期巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)、人延伸因子-1启动子(EF1)、包含与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体、鼠干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)和小鼠金属硫蛋白-I。

为了表达小RNA，包括与Cas内切核酸酶结合使用的导向RNA，包括例如U6和H1的各种启动子如RNA聚合酶III启动子可能是有利的。用于增强此类启动子的使用的描述和参数是本领域已知的，并且定期描述额外的信息和方法；参见，例如，Ma，H.等人，MolecularTherapy-Nucleic Acids 3，e161(2014)doi：10.1038/mtna.2014.12。

表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包含用于扩增表达的适当序列。表达载体还可以包括编码与定点多肽融合的非天然标签(例如，组氨酸标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生融合蛋白。

启动子可以是诱导型启动子(例如，热激启动子、四环素调控的启动子、类固醇调控的启动子、金属调控的启动子、***受体调控的启动子等)。启动子可以是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在一些情况下，启动子可以是空间限制的和/或时间限制的启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。

编码本公开的基因组靶向核酸和/或定点多肽的核酸可以包装到递送载体的表面中或所述表面上以递送至细胞。预期的递送载体包括但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米粒子、聚乙二醇粒子、水凝胶和胶束。如本领域所述，可以使用多种靶向部分以增强此类载体与所需细胞类型或位置的优先相互作用。

通过病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、定向微注射、纳米粒子介导的核酸递送等可以将本公开的复合物、多肽和核酸引入细胞中。

导向RNA和/或内切核酸酶多核苷酸的递送

导向RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或内切核酸酶多核苷酸(RNA或DNA)可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送载体如电穿孔、机械力、细胞变形(SQZ Biotech)和细胞穿透肽递送。或者，内切核酸酶多肽可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送载体如电穿孔或脂质纳米粒子递送。在进一步的替代方面，DNA内切核酸酶可以作为一种或多种多肽单独地或与一种或多种导向RNA，或一种或多种crRNA以及tracrRNA预复合来递送。

电穿孔是一种递送技术，其中将电场施加到一个或多个细胞以增加细胞膜的渗透性，这允许诸如药物、核酸(基因组靶向核酸)、蛋白质(定点多肽)或RNP的物质引入细胞中。通常，电穿孔通过在电穿孔比色皿中在1至2毫米的悬浮细胞的距离上经过数千伏特来工作(1.0-1.5kV，250-750V/cm)。

使用CRISPR-Cas9的基因编辑

在一些实施方案中，可以使用CRISPR-Cas9进行基因编辑，以在CD34⁺人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)和诱导的多能干细胞(iPSC)中的染色体2上的非编码BCL11A红细胞谱系特异性增强子内以高特异性和频率产生遗传修饰，这将产生与胎儿血红蛋白(HPFH)相关变体的天然存在的遗传持续性相似的表型。这些遗传修饰增加了HbF的产生，这又改善了β-珠蛋白疾病的严重程度。

CRISPR-Cas9系统是原核生物中天然存在的防御机制，其已被重新用作用于基因编辑的RNA导向的DNA靶向平台。其依赖于DNA核酸酶Cas9，以及两种非编码RNA-crisprRNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)-以靶向DNA的裂解。

crRNA通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对驱动CRISPR-Cas9复合物的序列识别和特异性，所述沃森-克里克碱基配对通常与靶DNA中的20个核苷酸(nt)序列配对。改变crRNA中5’20nt的序列允许CRISPR-Cas9复合物靶向特定基因座。如果靶序列后面是被称为原型间隔区序列邻近基序(PAM)的特定短DNA基序(具有序列NGG)，则CRISPR-Cas9复合物仅结合含有与单导向RNA(sgRNA)的前20nt匹配的序列的DNA序列。

TracrRNA与crRNA的3’端杂交以形成RNA双链体结构，其被Cas9内切核酸酶结合以形成催化活性CRISPR-Cas9复合物，其然后可以裂解靶DNA。

一旦CRISPR-Cas9复合物在靶位点结合DNA，则Cas9酶内的两个独立核酸酶结构域各自裂解PAM位点上游三个碱基的DNA链之一，留下双链断裂(DSB)，其中DNA的两条链终止于碱基对(平端)。

对于用于药品生产的分子试剂，两个RNA分子(crRNA和tracrRNA)通过接头环(例如，如各自通过引用整体并入本文的WO2017/182881或WO2017/191503中所示的四核苷酸接头环)连接以形成嵌合单导向RNA(sgRNA)。sgRNA(例如，包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或由其组成的sgRNA)靶向关键的红细胞谱系特异性转录因子结合位点(GATA1)。转录因子结合位点位于BCL11A基因的第二内含子中的红细胞谱系特异性增强子内。CRISPR-Cas9(sgRNA/Cas9)复合物一起原位形成核糖核蛋白复合物(RNP)。

在CRISPR-Cas9复合物与DNA在特定靶位点结合并且形成位点特异性DSB之后，下一个关键步骤是修复DSB。细胞使用两种主要的DNA修复途径来修复DSB：非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。

NHEJ是一种强有力的修复机制，其在包括非***细胞的大多数细胞类型中表现出高度活性。NHEJ易错，并且通常可以导致在DSB位点处一百至数百个核苷酸之间的去除或添加，尽管这样的修饰通常小于20nt。所产生的***和缺失(***缺失)可以破坏基因的编码区或非编码区。或者，HDR使用内源或外源提供的一长段同源供体DNA，以高保真度修复DSB。HDR仅在***细胞中有活性，并且在大多数细胞类型中以相对低的频率发生。在本公开的许多实施方案中，NHEJ被用作修复操作。

在一些实施方案中，用于产生药品的细胞的sgRNA包含下列序列或由下列序列组成：CUAACAGUUGCUUUUAUCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，sgRNA是修饰过的。例如，sgRNA可以在5’端/或3’端包含2’-O-甲基-硫代磷酸酯残基。在一些实施方案中，sgRNA在5’端包含三个2’-O-甲基-硫代磷酸酯残基且在3’端包含2’-O-甲基-硫代磷酸酯残基，如下：c*u*a*ACAGUUGCUUUUAUCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCu*u*u*U(SEQ ID NO：2)，其中“*”指示2’-O-甲基-硫代磷酸酯残基。

在一些实施方案中，Cas9(CRISPR相关蛋白9)内切核酸酶来自化脓性链球菌，但可以使用其他Cas9同源物。应当理解，可以使用野生型Cas9，或者可以使用修饰型式的Cas9(例如，进化型式的Cas9)(例如，Cas9直向同源物或变体)，如本文所提供。在一些实施方案中，Cas9可以用另一种RNA导向的内切核酸酶如Cpf1(II类CRISPR/Cas系统的Cpf1)或任何已知的靶特异性内切核酸酶取代。

导向RNA制剂

本公开的导向RNA可以与药学上可接受的赋形剂如载剂、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等一起配制，这取决于特定的施用模式和剂型。可以配制导向RNA组合物以实现生理学上相容的pH，并且取决于制剂和施用途径，pH范围为pH约3至pH约11，pH约3至pH约7。在一些情况下，可以将pH调整至pH约5.0至pH约8的范围。在一些情况下，组合物可以包含治疗有效量的至少一种如本文所述的化合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，组合物可以包含本文所述化合物的组合，或者可以包含可用于治疗或预防细菌生长的第二活性成分(例如而不限于抗细菌或抗微生物剂)，或者可以包括本公开的试剂的组合。

合适的赋形剂包括例如载剂分子，其包括大的缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒粒子。其他示例性赋形剂可以包括抗氧化剂(例如而不限于抗坏血酸)、螯合剂(例如而不限于EDTA)、碳水化合物(例如而不限于糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如而不限于油、水、盐水、甘油和乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通过测序检测中靶突变和脱靶突变

为了测序中靶位点和推定脱靶位点，可以识别适当的扩增引物，并且可以使用用QuickExtract DNA提取溶液(Epicentre)在转染后三天从处理的细胞收获的基因组DNA用这些引物建立反应。扩增引物含有侧接衔接子的基因特异性部分。正向引物的5’端包含修饰的正向(读序1)引物结合位点。反向引物的5’端含有相反取向的组合修饰的反向(读序2)和条形码引物结合位点。单个PCR反应可以通过在琼脂糖凝胶上分离验证，然后纯化并重新扩增。第二轮正向引物含有Illumina P5序列，接着是一定比例的修饰的正向(读序1)引物结合位点。第二轮反向引物含有Illumina P7序列(在5’端)，然后是6-碱基条形码和组合的修饰的反向(读序2)和条形码引物结合位点。第二轮扩增还可以在琼脂糖凝胶上检查，然后纯化，并使用NanoDrop分光光度计定量。可以将扩增产物汇集以匹配浓度，然后提交至Emory Integrated Genomic核心，用于在Illumina Miseq机上进行文库预备和测序。

测序读数可以通过条形码分类，然后将其与由生物信息学对于每种产物供应的参考序列比对。可以使用先前描述的软件在推定的切割位点的区域中检测比对的测序读数中的***和缺失率；参见，例如Lin等人，Nucleic Acids Res.，42：7473-7485(2014)。然后可以将在该窗口中检测到的***和缺失水平与从模拟转染细胞中分离的基因组DNA中相同位置中观察到的水平进行比较，以最小化测序假象的影响。

突变检测分析

可以使用由NHEJ对双链断裂的不完全修复产生的突变率来测量Cas9和导向RNA组合的中靶和脱靶裂解活性。

按照制造商的说明，可以使用AccuPrime Taq DNA聚合酶高保真(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)对于在含有1μl细胞裂解物和1μl的每种10μM扩增引物的50μl反应物中的40个周期(94℃，30秒；52-60℃，30秒；68℃，60秒)扩增中靶基因座。按照制造商的方案执行T7EI突变检测测定[Reyon等人，Nat.Biotechnol.，30：460-465(2012)]，其中消化物在2％琼脂糖凝胶上分离，并使用ImageJ定量[Guschin等人，Methods Mol.Biol.，649：247-256(2010)]。这些测定可以确定批量细胞群体中***/缺失(“***缺失”)的百分比。

人细胞

为了减轻血红蛋白病，如本文所述并说明的，用于基因编辑的主要靶标是人细胞。例如，在离体方法中，人细胞可以是体细胞，其在使用所述技术修饰后可以产生祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)。例如，在体内方法中，人细胞可以是骨髓细胞、造血祖细胞或CD34+细胞。

通过在源自需要的患者并因此已经与需要的患者完全匹配的自体同源细胞中执行基因编辑，可以产生可以安全地重新引入患者并且有效地产生可以有效地改善与患者疾病相关的一种或多种临床状况的细胞群体的细胞。

祖细胞(本文中也称为干细胞)能够增殖并产生更多的祖细胞，这些祖细胞又能够产生大量的母细胞，这些母细胞又可以产生分化的或可分化的子细胞。可以诱导子细胞自身以增殖并产生后代，后代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留一种或多种具有亲本发育潜力的细胞。因此，术语“干细胞”是指在特定情况下具有分化成更特异化或分化的表型的能力或潜力并且在某些情况下保持增殖而不明显分化的能力的细胞。在一个方面，术语祖细胞或干细胞是指广义母细胞，其后代(子代)通常在不同的方向上通过分化，例如通过获取完全个性化而特异化，如在胚胎细胞和组织的进行性多样化中发生的。细胞分化是通常通过许多细胞***发生的复杂过程。分化细胞可以源自多能细胞，其本身源自多能细胞等等。尽管这些多能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但是各自可以产生的细胞类型的范围可以显著变化。一些分化细胞也具有产生更大发育潜力的细胞的能力。这种能力可以是天然的，或者可以在用各种因子处理后人工诱导。在许多生物学事例中，干细胞也可以是“多能的”，因为它们可以产生多于一种不同细胞类型的子代，但这不是“干细胞特性”所必需的。

自我更新可以是干细胞的另一重要方面。理论上，自我更新可以通过两种主要机制中的任一种发生。干细胞可以不对称***，其中一个子细胞保持干细胞状态，而另一子细胞表达一些不同的其他特异性的功能和表型。或者，群体中的一些干细胞可以对称地***成两个干细胞，从而维持群体中的一些干细胞作为整体，而群体中的其他细胞仅产生分化的子代。通常，“祖细胞”具有更原始(即，与完全分化的细胞相比，处于沿着发育途径或进展的较早阶段)的细胞表型。通常，祖细胞也具有显著或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多种不同的分化细胞类型或单一分化细胞类型，这取决于发育途径和细胞发育和分化的环境。

在细胞个体发育的背景下，形容词“分化的”或“正分化的”是相对术语。“分化的细胞”是比正比较的细胞在发育途径中进一步发展的细胞。因此，干细胞可以分化成谱系限制性前体细胞(诸如，造血祖细胞)，其又可以在该途径中进一步分化成其他类型的前体细胞(诸如，造血前体)，然后成为末期分化的细胞，诸如红细胞，其在某种组织类型中起特征性作用，并且可以保持或不保持进一步增殖的能力。

术语“造血祖细胞”是指干细胞谱系中产生所有血细胞类型的细胞，包括红细胞(红细胞(erythrocyte)或红细胞(red blood cell，RBC))、骨髓细胞(单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞/血小板和树突细胞)和淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)。

“红细胞谱系细胞”指示接触的细胞是经历红细胞生成的细胞，因此在最终分化时它形成红细胞(erythrocyte)或红细胞(red blood cell)。这些细胞来源于骨髓造血祖细胞。在暴露于特定生长因子和造血微环境的其他组分时，造血祖细胞可以通过一系列中间分化细胞类型(红细胞谱系的所有中间体)成熟为RBC。因此，“红细胞谱系”的细胞包括造血祖细胞、红血胚细胞、嗜碱性正成红细胞、有核红血球、晚幼红细胞、网织红细胞和红细胞。

造血祖细胞可以表达造血祖细胞特征性的至少一种下列细胞表面标志物：CD34+、CD59+、Thyl/CD90+、CD381o/-和C-kit/CDl 17+。在本文提供的一些实施例中，造血祖细胞可以是CD34+。

造血祖细胞可以是在患者用一种或多种因子如粒细胞集落刺激因子(任选地，与Plerixaflor组合)治疗后从患者体内获得的外周血干细胞。CD34+细胞可以使用细胞选择系统(Miltenyi Biotec)富集。在基因组编辑之前，CD34+细胞可以在具有细胞因子(例如，SCF、rhTPO、rhFLT3)的无血清培养基(例如，CellGrow SCGM培养基、CellGenix)中刺激。预期添加SR1和dmPGE2和/或其他因子以改进长期植入。

红细胞谱系的造血祖细胞可以具有红细胞谱系特征性的细胞表面标志物：诸如CD71和Terl 19。

造血干细胞(HSC)可以是基因疗法的重要靶标，因为它们提供校正细胞的延长来源。HSC产生血细胞的髓样谱系和淋巴谱系两种。成熟的血细胞具有有限的寿命，并且必须在整个生命中不断地更换。血细胞通过多能HSC群体的增殖和分化不断地产生，所述多能HSC群体可以通过自我更新补充。骨髓(BM)是人造血的主要位点并且是造血干细胞和祖细胞(HSPC)的良好来源。在外周血(PB)中可以发现少量的HSPC。在一些适应症或治疗中，它们的数量增加。HSC的子代阶段性成熟，产生多能和谱系定型的祖细胞，包括产生表达BCL11A的细胞的淋巴祖细胞。B细胞和T细胞祖细胞是需要BCL11A活性的两个细胞群体，因此它们可以在重新排列之前的阶段进行编辑，尽管校正祖细胞具有继续成为校正细胞来源的优势。经处理的细胞如CD34+细胞将返回患者体内。植入水平可能是重要的，因为在体内CD34+输注后基因编辑细胞的细胞多谱系植入的能力也是如此。

诱导的多能干细胞

本文所述的基因工程化人细胞可以是诱导的多能干细胞(iPSC)。使用iPSC的一个优势是细胞可以源自与祖细胞一起施用的相同受试者。也就是说，体细胞可以从受试者体内获得，重编程为诱导的多能干细胞，然后再分化成祖细胞以施用到受试者(例如，自体同源细胞)。因为祖细胞基本上来源于自体同源来源，所以与使用来自另一受试者或另一组受试者的细胞相比，可以降低植入排斥或变应性应答的风险。此外，iPSC的使用否定了对从胚胎来源获得的细胞的需要。因此，在一个方面，在所公开的方法中使用的干细胞不是胚胎干细胞。

尽管在生理环境下分化通常是不可逆的，但最近已开发了几种方法来将体细胞重编程为iPSC。示例性方法是本领域技术人员已知的并且在下文中简要描述。

术语“重编程”是指改变或逆转分化细胞(例如，体细胞)的分化状态的过程。换句话说，重编程是指将细胞向后分化分成更未分化或更原始类型的细胞的过程。应该注意的是，将许多原代细胞置于培养物中可以导致一些完全分化的特征的丧失。因此，简单地培养术语分化细胞中包括的这些细胞不会使这些细胞成为非分化细胞(例如，未分化细胞)或多能细胞。分化细胞向多能性的转变需要超出导致培养物中分化特性的部分丧失的刺激的重编程刺激。与原代细胞亲本相比，重编程细胞还具有延长传代能力而不丧失生长潜力的特征，所述原代细胞亲本通常仅具有在培养物中有限数量的***的能力。

在重编程之前，待重编程的细胞可以是部分分化的或终末分化的。重编程可以涵盖分化细胞(例如，体细胞)的分化状态完全逆转至多能状态(pluripotent state)或多能状态(multipotent state)。重编程可以涵盖分化细胞(例如，体细胞)的分化状态完全或部分逆转至未分化细胞(例如，胚胎样细胞)。重编程可以导致细胞表达特定基因，其表达进一步有助于重编程。在本文所述的某些实施例中，分化细胞(例如，体细胞)的重编程可以使分化细胞呈现未分化状态(例如，是未分化的细胞)。所得细胞称为“重编程细胞”或“诱导多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”。

重编程可以涉及在细胞分化期间发生的至少一些可遗传的核酸修饰模式(例如，甲基化)、染色质浓缩、表观遗传变化、基因组印记等的改变，例如逆转。重编程不同于简单地维持已经是多能的细胞的现有未分化状态或维持已经是多能细胞(例如，造血干细胞)的细胞的现有的不完全分化状态。重编程也不同于促进已经是多能(pluripotent)或多能(multipotent)的细胞的自我更新或增殖，尽管在一些实施例中，本文所述的组合物和方法也可以用于此类目的。

本领域已知许多方法可以用于由体细胞产生多能干细胞。将体细胞重编程为多能表型的任何此类方法都适用于本文所述的方法。

已经描述了使用确定的转录因子组合产生多能细胞的重编程方法。通过定向转导Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，可以将小鼠体细胞转化为具有扩展的发育潜力的ES细胞样细胞；参见，例如，Takahashi和Yamanaka，Cell 126(4)：663-76(2006)。iPSC类似于ES细胞，因为它们恢复了多能性相关的转录环路和大部分的表观遗传景观。此外，小鼠iPSC满足多能性的所有标准测定：特别地，体外分化成三个胚层的细胞类型、畸胎瘤形成、对嵌合体的贡献、种系传递[参见，例如Maherali和Hochedlinger，Cell Stem Cell.3(6)：595-605(2008)]，和四倍体互补。

人iPSC可以使用相似的转导方法获得，并且已经确立转录因子trio、OCT4、SOX2和NANOG作为控制多能性的转录因子的核心组；参见，例如，Budniatzky和Gepstein，StemCells Transl Med.3(4)：448-57(2014)；Barrett等人，Stem Cells Trans Med 3：1-6sctm.2014-0121(2014)；Focosi等人，Blood Cancer Journal 4：e211(2014)；和其中引用的参考文献。iPSC的产生历史上可以使用病毒载体通过将编码干细胞相关基因的核酸序列引入成人体细胞中来实现。

iPSC可以自终末分化的体细胞以及成人干细胞或体干细胞产生或衍生。也就是说，非多能祖细胞可以通过重编程呈现多能(pluripotent)或多能(multipotent)。在这种情况下，可能没有必要包括重编程终末分化细胞所需的尽可能多的重编程因子。另外，重编程可以通过非病毒引入重编程因子诱导，例如通过引入蛋白质本身，或通过引入编码重编程因子的核酸，或通过引入在翻译产生重编程因子的信使RNA诱导(参见例如，Warren等人，Cell Stem Cell，7(5)：618-30(2010)。重编程可以通过引入编码干细胞相关基因的核酸的组合来实现，所述组合包括例如Oct-4(也称为Oct-3/4或Pouf51)、Soxl、Sox2、Sox3、Sox15、Sox 18、NANOG、Klfl、Klf2、Klf4、Klf5、NR5A2、c-Myc、1-Myc、n-Myc、Rem2、Tert和LIN28。使用本文所述的方法和组合物的重编程可以进一步包括将Oct-3/4、Sox家族的成员、Klf家族的成员和Myc家族的成员中的一种或多种引入体细胞中。本文所述的方法和组合物可以进一步包括引入Oct-4、Sox2、Nanog、c-MYC和Klf4中的每一种的一种或多种用于重编程。如上所述，用于重编程的确切方法对于本文所述的方法和组合物未必是关键的。然而，在从重编程细胞分化的细胞用于例如人类疗法的情况下，在一个方面，重编程不受改变基因组的方法影响。因此，在此类实施例中，可以例如在不使用病毒或质粒载体的情况下实现重编程。

通过添加各种试剂如小分子可以增强源自起始细胞群体的重编程的效率(即，重编程细胞的数量)，如Shi等人，Cell-Stem Cell 2：525-528(2008)；Huangfu等人，NatureBiotechnology 26(7)：795-797(2008)；和Marson等人，Cell-Stem Cell 3：132-135(2008)所示。因此，增强诱导的多能干细胞产生的效率或速率的试剂或试剂组合可以用于产生患者特异性或疾病特异性iPSC。增强重编程效率的试剂的一些非限制性实例包括可溶性Wnt、Wnt条件培养基、BIX-01294(G9a组蛋白甲基转移酶)、PD0325901(MEK抑制剂)、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5’-氮杂胞苷、***、辛二酰苯胺、异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)等。

重编程增强剂的其他非限制性实例包括：辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如，MK0683、伏立诺他(vorinostat))和其他异羟肟酸)、BML-210、Depudecin((例如，(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1，3-二氧代-1H，3H)-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸盐(例如，苯基丁酸钠)和丙戊酸((VP A)及其他短链脂肪酸)、Scriptaid、苏拉明钠、曲古菌素A(TSA)、APHA化合物8、Apicidin、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸酯(Pivanex，AN-9)、Trapoxin B、衣原体、缩酚酸肽(也称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如，CI-994(例如，N-乙酰基地那林))和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双羟肟酸)、JNJl6241199、Tubacin、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-Cl-UCHA(例如，6-(3-氯代苯基脲基)己酸异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9，10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP 50。其他重编程增强剂包括例如HDAC的显性阴性形式(例如，无催化活性的形式)、HDAC的siRNA抑制剂和特异性结合HDAC的抗体。此类抑制剂可从(例如BIOMOLInternational、Fukasawa、Merck Biosciences、Novartis、Gloucester Pharmaceuticals、Titan Pharmaceuticals、MethylGene和Sigma Aldrich购得。

为了证实用于本文所述方法的多能干细胞的诱导，可以测试分离的克隆的干细胞标志物的表达。在源自体细胞的细胞中的这种表达将细胞识别为诱导的多能干细胞。干细胞标志物可以选自包括SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Daxl、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和Natl的非限制性组。在一种情况下，例如，表达Oct4或Nanog的细胞被识别为多能细胞。检测此类标志物表达的方法可以包括例如RT-PCR和检测编码多肽的存在的免疫学方法，诸如西方印迹或流式细胞术分析。检测不仅可以涉及RT-PCR，还可以包括蛋白质标志物的检测。细胞内标志物可以通过RT-PCR或蛋白质检测方法如免疫细胞化学来最好地识别，而细胞表面标志物可以例如通过免疫细胞化学容易地识别。

分离细胞的多能干细胞特性可以通过评价iPSC分化成三个胚层中每一个的细胞的能力的测试来确认。作为一个实例，裸鼠中的畸胎瘤形成可以用于评价分离的克隆的多能特性。可以将细胞引入裸鼠中，并且可以对由细胞带来的肿瘤执行组织学和/或免疫组织化学。例如，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤的生长进一步表明细胞是多能干细胞。

产生患者特异性iPSC

在一个实施方案中，本公开的离体方法的一个步骤可以涉及产生患者特异性iPS细胞、患者特异性iPS细胞或患者特异性iPS细胞系。如Takahashi和Yamanaka 2006；Takahashi，Tanabe等人，2007所述，本领域有许多已确立的用于产生患者特异性iPS细胞。例如，产生步骤可以包括：a)从患者体内分离体细胞，诸如皮肤细胞或成纤维细胞；和b)将一组多能性相关基因引入体细胞中，以诱导细胞成为多能干细胞。所述组的多能性相关基因可以是选自由OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG和cMYC组成的组的基因中的一种或多种。

对患者的骨髓执行活检或抽吸

在一些实施方案中，活检物或抽吸物是取自身体的组织或液体的样品。有许多种不同的活检物或抽吸物。几乎所有的这些都涉及使用锋利的工具以取出少量组织。如果活检将在皮肤或其他敏感区域上进行，则可以先应用***。可以根据本领域的任何已知方法执行活检或抽吸。例如，在骨髓抽吸物中，使用大针进入骨盆骨以收集骨髓。

分离间充质干细胞

可以根据本领域已知的任何方法，诸如从患者的骨髓或外周血中分离间充质干细胞。例如，骨髓抽吸物可以用肝素收集到注射器中。细胞可以在Percoll^TM密度梯度上洗涤和离心。可以使用Percoll^TM分离细胞，诸如血细胞、肝细胞、***、巨噬细胞、肥大细胞和胸腺细胞。可以在含有10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良的伊格尔培养基(DMEM)(低葡萄糖)中培养细胞(Pittinger MF、Mackay AM、Beck SC等人，Science 1999；284：143-147)。

从患者体内分离造血祖细胞

可以通过本领域已知的任何方法从患者体内分离造血祖细胞。CD34+细胞可以例如使用细胞选择系统(Miltenyi Biotec)富集。在基因组编辑之前，可以例如在无血清的培养基(例如，CellGrow SCGM培养基，CellGenix)中用细胞因子(例如，SCF、rhTPO、rhFLT3)弱刺激CD34+细胞。

人造血干细胞和祖细胞

在一些实施方案中，本公开的遗传修饰的细胞是人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)。所述干细胞谱系产生所有血细胞类型，包括红细胞(红细胞(erythrocyte)或红细胞(redblood cell，RBC))、骨髓细胞(单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞/血小板和树突细胞)和淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)。血细胞通过非常小的多能造血干细胞(HSC)群体的增殖和分化产生，所述HSC也具有通过自我更新补充自身的能力。在分化期间，HSC的子代经过各种中间成熟阶段，在达到成熟之前产生多潜能和谱系定向祖细胞。骨髓(BM)是人类造血的主要部位，并且在正常条件下，在外周血(PB)中仅能发现少量的造血干细胞和祖细胞(HSPC)。用细胞因子(特别是粒细胞集落刺激因子；G-CSF)、用于癌症治疗的一些骨髓抑制药物和破坏造血基质细胞与BM基质细胞之间的相互作用的化合物治疗可以迅速地将大量干细胞和祖细胞动员到循环中。在本公开的一些实施方案中，G-CSF用于受试者中以改进干细胞动员，而在其他实施方案中，使用普乐沙福

在一些实施方案中，普乐沙福与G-CSF组合使用。下文更详细地讨论普乐沙福。

人HSPC的最著名的标志物是细胞表面糖蛋白CD34。CD34常规用于识别和分离hHSPC以临床用于骨髓移植。因此，本文中，将药品的hHSPC称为修饰的CD34+ hHSPC。

遗传修饰的细胞

术语“遗传修饰的细胞”是指包含通过基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas9系统)引入的至少一种遗传修饰的细胞。在本文的一些离体实施例中，遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)。在本文的一些体内实施例中，遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的造血祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)。本文预期包含外源基因组靶向核酸和/或编码基因组靶向核酸的外源核酸的遗传修饰的细胞。

术语“对照物处理的群体”描述已经用相同培养基、病毒诱导、核酸序列、温度、汇合度、烧瓶大小、pH等处理的细胞群体，除了添加基因组编辑组分之外。可以使用本领域已知的任何方法来测量BCL11A基因的转录控制序列或蛋白质表达或活性的调节或灭活，例如BCL11A基因蛋白的转录控制序列的蛋白质印迹分析或BCL11A基因mRNA的转录控制序列的定量。

术语“分离的细胞”是指从最初发现它的生物体中除去的细胞，或这种细胞的后代。任选地，细胞可以在体外培养，例如在限定条件下或在其他细胞存在下培养。任选地，可以将细胞随后引入第二生物体中或重新引入从中分离出细胞(或其后代细胞)的生物体中。

关于分离的细胞群体的术语“分离的群体”是指已经从混合或异质细胞群体中除去和分离的细胞群体。在一些情况下，与分离或富集细胞的异质群体相比，分离的群体可以是基本上纯的细胞群体。在一些情况下，与包含人祖细胞和得到人祖细胞的细胞的异质细胞群体相比，分离的群体可以是人祖细胞的分离群体，例如，基本上纯的人祖细胞群体。

关于特定的细胞群体，术语“明显增强”是指其中特定类型细胞的发生率相对于预先存在或参考水平增加至少2-倍、至少3-倍、至少4-倍、至少5-倍、至少6-倍、至少7-倍、至少8-倍、至少9倍、至少10-倍、至少20-倍、至少50-倍、至少100-倍、至少400-倍、至少1000-倍、至少5000-倍、至少20000-倍、至少100000-倍或更多倍的细胞群体，这取决于例如用于改善血红蛋白病的此类细胞的所需水平。

关于特定细胞群体的术语“明显富集”是指相对于构成总细胞群体的细胞而言至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或更多的细胞群体。

关于特定细胞群体的术语“基本上纯的”是指相对于构成总细胞群体的细胞而言至少约75％、至少约85％、至少约90％或至少约95％纯的细胞群体。也就是说，关于祖细胞群体的术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指含有少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或小于1％的细胞不是由本文的术语定义的祖细胞的细胞群体。

将基因组编辑的iPSC分化成造血祖细胞

在一些实施方案中，本公开的离体方法的另一步骤可以包括将基因组编辑的iPSC分化成造血祖细胞。分化步骤可以根据本领域已知的任何方法执行。

将基因组编辑的间充质干细胞分化成造血祖细胞

在一些实施方案中，本公开的离体方法的另一步骤可以包括将基因组编辑的间充质干细胞分化成造血祖细胞。分化步骤可以根据本领域已知的任何方法执行。

药品

本公开的药品是细胞产品，其包含通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑修饰的自体CD34⁺ hHSPC。CRISPR-Cas9基因编辑的靶标是位于染色体2上的外显子2和3之间的内含子2上的BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子区域。编辑是用高度特异性的导向RNA，例如包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或由其组成的gRNA产生，所述高度特异性的导向RNA靶向BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子区域(识别为DNA酶I超敏位点+58，DHS+58)的关键转录因子结合位点(GATA1)(参见，例如，WO2017/182881，通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，gRNA-内切核酸酶RNP如gRNA-Cas9RNP使用本领域已知的病毒或非病毒递送机制如电穿孔递送或引入本公开的细胞如CD34⁺ hHSPC中。在递送到细胞中之后，RNP以序列依赖性方式将DSB引入DNA中。通过NHEJ修复DSB导致DNA***缺失，旨在破坏GATA1结合，从而降低BCL11A转录，伴随着增加γ-球蛋白和HbF水平。由于gRNA-Cas9 RNP精确地靶向BCL11A基因的非编码红细胞谱系特异性增强子区域而不是BCL11A编码序列本身，不受理论限制，预期调节BCL11A基因和蛋白质在仅红细胞谱系细胞中的表达水平，且不影响非红细胞造血细胞系。

在一些实施方案中，药品在无血清(没有血清或基本无血清)的冷冻保存培养基如含有5％DMSO和右旋糖酐40的CS5培养基中配制。可以使用其他冷冻保存培养基和/或赋形剂。

在一些实施方案中，本公开的修饰的CD34+ hHSPC相对于未修饰的CD34+ hHSPC表现出γ/(γ+α)-珠蛋白mRNA比增加0.30±0.20。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC相对于未修饰的CD34+ hHSPC可以表现出γ/(γ+α)-珠蛋白mRNA比增加0.1至0.6。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC相对于未修饰的CD34+ hHSPC可以表现出γ/(γ+α)-珠蛋白mRNA比增加0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55或0.6。

在一些实施方案中，本公开的修饰的CD34+ hHSPC相对于未修饰的CD34+ hHSPC表现出γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比增加0.41±0.15。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC相对于未修饰的CD34+ hHSPC可以表现出γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比增加0.2至0.6。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC相对于未修饰的CD34+ hHSPC可以表现出γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比增加0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55或0.6。

在一些实施方案中，本公开的修饰的CD34+ hHSPC表现出(γ+β)/α-珠蛋白mRNA的比率等于或高于0.4(例如，等于或高于0.4、等于或高于0.42、等于或高于0.44、等于或高于0.46、等于或高于0.48、或等于或高于0.5，诸如高于0.4、高于0.42、高于0.44、高于0.46、高于0.48或高于0.5)。

在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出32％±9％的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的HbF平均百分比。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出29％±11％的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的HbF平均百分比。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的HbF平均百分比。

在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出30％至99％的平均等位基因编辑频率。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出70％至99％的平均等位基因编辑频率。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出70％至90％的平均等位基因编辑频率。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出80％±4％的平均等位基因编辑频率。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的平均等位基因编辑频率。

在一些实施方案中，在向受试者施用修饰的CD34+ hHSPC之后，至少50％的修饰的CD34+ hHSPC维持多谱系潜能至少十六周。在一些实施方案中，在向受试者施用修饰的CD34+ hHSPC之后，至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％或至少95％的修饰的CD34+ hHSPC维持多谱系潜能至少十六(例如16、17、18、19、20)周。

在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出至少80％的中靶***缺失率。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的中靶***缺失率。

在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出小于5％或小于1％的脱靶***缺失率。在一些实施方案中，修饰的CD34+ hHSPC表现出小于0.9％、小于0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的脱靶***缺失率。

治疗方法

在本公开的一些方面，本文提供用于治疗患有血红蛋白病的患者的方法。这种方法的一个方面是使用iPSC的离体细胞基疗法。例如，可以产生患者特异性诱导的多能干细胞(iPSC)。然后，可以使用本文所述的材料和方法编辑这些iPS细胞的染色体DNA。接着，基因组编辑的iPSC可以分化成造血祖细胞。最后，可以将造血祖细胞植入患者体内。

这种方法的又一个方面是使用间充质干细胞的离体细胞基疗法。例如，可以从患者体内分离间充质干细胞，其可以从患者的骨髓或外周血中分离。接着，可以使用本文所述的材料和方法编辑这些间充质干细胞的染色体DNA。接着，基因组编辑的间充质干细胞可以分化成造血祖细胞。最后，可以将这些造血祖细胞植入患者体内。

这种方法的另一个方面是使用造血祖细胞的离体细胞基疗法。例如，造血祖细胞可以从患者体内分离。接着，可以使用本文所述的材料和方法编辑这些细胞的染色体DNA。最后，可以将基因组编辑的造血祖细胞植入患者体内。

离体细胞治疗方法的一个优点是能够在施用前对治疗剂进行全面分析。核酸酶基治疗剂可以具有一定程度的脱靶效应。离体执行基因校正允许人们在植入前表征校正的细胞群体。本公开包括对校正的细胞的部分或整个基因组进行测序以确保脱靶效应(如果有的话)可以在与患者的最小风险相关的基因组位置中。另外，可以在植入前分离特定细胞群体，包括克隆群体。

离体细胞疗法的另一个优点涉及与其他原代细胞来源相比在iPSC中的遗传校正。iPSC是多产的，使得其容易获得细胞基疗法所需要的大量细胞。另外，iPSC是执行克隆分离的理想细胞类型。这允许筛选正确的基因组校正，而不会有降低活力的风险。相比之下，其他原代细胞仅存活几代并且难以克隆扩增。因此，用于治疗血红蛋白病的iPSC的操作可以更容易，并且可以缩短进行期望的遗传校正所需的时间量。

对于离体疗法，移植需要清除骨髓壁龛或供体HSC以进行植入。目前的方法依赖于放射和/或化学疗法。由于这些限制，已经并且正在开发更安全的调理方案，诸如通过针对造血细胞表面标志物如CD117、c-kit等的抗体或抗体毒素缀合物免疫耗竭骨髓细胞。HSC移植的成功取决于对骨髓的高效归巢、后续植入和骨髓再增殖。基因编辑的细胞的植入水平很重要，细胞多谱系植入的能力也很重要。

造血干细胞(HSC)是离体基因疗法的重要靶标，因为它们提供校正细胞的延长来源。经处理的CD34+细胞将返回患者体内。

方法还可以包括基于体内的疗法。使用本文所述的材料和方法编辑患者体内细胞的染色体DNA。这些细胞可以是骨髓细胞、造血祖细胞或CD34+细胞。

尽管血细胞提供离体治疗和疗法的有吸引力的靶标，但增加的递送功效可以允许定向体内递送至造血干细胞(HSC)和/或其他B和T细胞祖细胞，诸如CD34+细胞。理想地，靶向和编辑将涉及相关的细胞。通过使用仅在某些细胞和或发育阶段中有活性的启动子，也可以防止其他细胞中的裂解。额外的启动子是可诱导的，因此如果核酸酶作为质粒递送，则可以暂时地得到控制。还可以使用增加的处理或结构域来调整递送的RNA和蛋白质保留在细胞中的时间量以改变半衰期。体内治疗将消除许多治疗步骤，但较低的递送速率可能需要较高的编辑速率。体内治疗可以消除离体治疗与植入的问题和损失。

体内基因疗法的优点可以是治疗性产生和施用的容易性。相同的治疗方法和疗法将有可能用于治疗一个以上的患者，例如共有相同或相似基因型或等位基因的许多患者。相反，离体细胞疗法通常需要使用患者自身的细胞，将其分离、操作并返回到同一患者。

本文还提供一种通过基因组编辑来编辑细胞中的BCL11A基因的细胞方法。例如，可以从患者或动物体内分离细胞。然后，可以使用本文所述的材料和方法编辑细胞的染色体DNA。

在一些实施方案中，无论细胞或离体或体内方法，本文提供的方法都可以涉及下列中的一种或组合：1)通过由于NHEJ途径产生的缺失调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列；2)通过HDR调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列；或3)通过缺失转录控制序列的至少一部分和/或将野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA敲入基因座或在基因组的异源位置(诸如安全港口位点，诸如AAVS1)来调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列。HDR和敲入策略都可以在同源性定向修复(HDR)中利用供体DNA模板。任一策略中的HDR可以通过使用一种或多种内切核酸酶在基因组中的特定位点处产生一处或多处单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)来实现。

例如，NHEJ策略可以涉及通过在BCL11A基因或编码BCL11A基因的调控元件的其他DNA序列内或其附近用一种或多种CRISPR内切核酸酶和gRNA(例如，crRNA+tracrRNA，或sgRNA)诱导一处单链断裂或双链断裂，或者在BCL11A基因或编码BCL11A基因的调控元件的其他DNA序列内或其附近用两种或更多种CRISPR内切核酸酶和两种或更多种sgRNA诱导两处或更多处单链断裂或双链断裂来缺失BCL11A基因的转录控制序列的至少一部分。所述方法可能需要开发和优化sgRNA用于BCL11A基因的转录控制序列。

例如，HDR策略可以涉及通过在外源引入以定向对同源定向修复的细胞DSB应答的供体DNA模板(供体DNA模板可以是短的单链寡核苷酸、短的双链寡核苷酸、长的单链或双链DNA分子)的存在下在BCL11A基因或编码BCL11A基因的调控元件的其他DNA序列内或其附近用一种或多种CRISPR内切核酸酶和gRNA(例如，crRNA+tracrRNA，或sgRNA)诱导一处单链断裂或双链断裂，或者在BCL11A基因或编码BCL11A基因的调控元件的其他DNA序列内或其附近用一种或多种CRISPR内切核酸酶和两种或更多种gRNA诱导两处或更多处单链断裂或双链断裂来调节或灭活BCL11A基因的转录控制序列。所述方法可能需要开发和优化包含野生型BCL11A基因的gRNA和供体DNA分子，所述野生型BCL11A基因包含修饰的转录控制序列。

例如，敲入策略涉及使用在BCL11A基因的转录控制序列上游或在其中或在安全的港口位点(诸如AAVS1)中靶向的gRNA(例如，crRNA+tracrRNA，或sgRNA)或一对gRNA将野生型BCL11A基因或包含修饰的转录控制序列的cDNA敲入BCL11A基因的基因座中。供体DNA可以是单链或双链DNA，并且包含野生型BCL11A基因，所述野生型BCL11A基因包含修饰的转录控制序列。上述策略(缺失/调节/灭活和敲入)的优点是相似的，原则上包括短期有益的临床和实验室效应和长期有益的临床和实验室效应两者。

除了上面列出的编辑选项之外，Cas9或相似蛋白质可以用于将效应子结构域靶向可以识别用于编辑的相同靶位点，或者在效应子结构域范围内的额外靶位点。可以使用一系列的染色质修饰酶、甲基化酶或去甲基酶来改变靶基因的表达。这些类型的表观遗传调控具有一些优点，特别是因为它们在可能的脱靶效应方面受到限制。

转录和翻译的调控涉及与细胞蛋白质或核苷酸相互作用的许多不同类别的位点。通常，转录因子或其他蛋白质的DNA结合位点可以被靶向用于突变或缺失以研究所述位点的作用，尽管它们也可以被靶向以改变基因表达。可以通过非同源末端连接NHEJ或通过同源定向修复(HDR)进行定向基因组编辑来添加位点。增加使用基因组测序、RNA表达和转录因子结合的全基因组研究增加了我们识别这些位点如何导致发育或时间基因调控的能力。这些控制系统可以是定向的，或者可以涉及广泛的合作调控，这可能需要整合来自多种增强子的活性。转录因子通常结合6-12bp长的简并DNA序列。单个位点提供的低特异性水平提示复杂的相互作用和规则涉及结合和功能结果。具有较少简并性的结合位点可以提供更简单的调控方式。可以设计人工转录因子以指定在基因组中具有较少相似序列并且具有较低的脱靶裂解潜力的较长序列。可以突变、缺失或甚至产生任何这些类型的结合位点以使基因调控或表达能够发生改变(Canver，M.C.等人，Nature(2015))。GATA转录因子是以其结合GATA DNA结合序列的能力为特征的转录因子家族。GATA结合序列位于BCL11A基因的+58DNA超敏位点(DHS)内。具有这些特征的另一类基因调控区域是微RNA(miRNA)结合位点。miRNA是非编码RNA，其在转录后基因调控中起关键作用。miRNA可以调控30％的所有哺乳动物蛋白编码基因的表达。发现通过双链RNA(RNAi)进行的特定且有效的基因沉默以及额外的小的非编码RNA(Canver，M.C.等人，Nature(2015))。对基因沉默重要的最大类别的非编码RNA是miRNA。在哺乳动物中，miRNA首先被转录为长RNA转录物，其可以是单独的转录单元、蛋白质内含子的一部分或其他转录物。长转录物被称为初级miRNA(pri-miRNA)，其包括不完全碱基配对的发夹结构。这些pri-miRNA可以被Microprocessor裂解成一个或多个较短的前体miRNA(pre-miRNA)，所述Microprocessor是细胞核中的蛋白质复合物，其涉及Drosha。

Pre-miRNA是长度约70个核苷酸的短茎环，其中2-核苷酸3’-悬伸部输出到成熟的19-25个核苷酸的miRNA：miRNA*双链体中。具有较低碱基配对稳定性的miRNA链(导向链)可以加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)上。乘客导向链(标有*)可以起作用，但通常会被降解。成熟的miRNA将RISC系链到主要在3’非翻译区域(UTR)内发现的靶mRNA中的部分互补序列基序，并且诱导转录后基因沉默(Bartel，D.P.Cell 136，215-233(2009)；Saj，A.和Lai，E.C.Curr Opin Genet Dev 21，504-510(2011))。miRNA在发育、分化、细胞周期和生长控制中以及在哺乳动物和其他多细胞生物中的几乎所有的生物途径中都可以是重要的。miRNA也可以涉及在细胞周期控制、细胞凋亡和干细胞分化、造血、缺氧、肌肉发育、神经发生、胰岛素分泌、胆固醇代谢、衰老、病毒复制和免疫应答中。

单miRNA可以靶向数百种不同的mRNA转录物，而单个转录物可以被许多不同的miRNA靶向。在最新发布的miRBase(v.21)中已经注释了超过28645种微RNA。一些miRNA可以由多个基因座编码，其中的一些基因座可以由串联共转录的簇表达。这些特征允许复杂的调控网络具有多种途径和反馈控制。miRNA可以是这些反馈和调控回路的组成部分，并且可以通过将蛋白质产量保持在限度内来帮助调控基因表达(Herranz，H.和Cohen，S.M.GenesDev 24，1339-1344(2010)；Posadas，D.M.和Carthew，R.W.Curr Opin Genet Dev 27，1-6(2014))。

miRNA在与异常miRNA表达相关的大量人类疾病中也很重要。所述关联强调了miRNA调控途径的重要性。最近的miRNA缺失研究已经将miRNA与免疫应答的调控相连(Stern-Ginossar，N.等人，Science 317，376-381(2007))。miRNA也与癌症强烈相连，并且可以在不同类型的癌症中发挥作用。已经发现miRNA在许多肿瘤中被下调。miRNA在诸如细胞周期控制和DNA损伤应答的关键癌症相关途径的调控中是重要的，因此可以用于诊断并且可以在临床上靶向。微RNA可以微妙地调控血管生成的平衡，使得耗尽所有微RNA的实验抑制肿瘤血管生成(Chen，S.等人，Genes Dev 28，1054-1067(2014))。

如已经对于蛋白质编码基因所显示，miRNA基因也可以经历随癌症发生的表观遗传变化。许多miRNA基因座可以与CpG岛相关，增加了它们通过DNA甲基化调控的机会(Weber，B.，Stresemann，C.，Brueckner，B.和Lyko，F.Cell Cycle 6，1001-1005(2007))。大多数研究使用染色质重塑药物治疗来揭示表观遗传学上沉默的miRNA。

除了它们在RNA沉默中的作用外，miRNA还可以激活翻译(Posadas，D.M.和Carthew，R.W.Curr Opin Genet Dev 27，1-6(2014))。敲除这些位点可以导致靶向基因的表达降低，而引入这些位点可以增加表达。

通过突变种子序列(微RNA的碱基2-8)可以最有效地敲除单个miRNA，这对于结合特异性是重要的。在所述区域中进行裂解，然后通过NHEJ进行错误修复可以通过阻断与靶位点的结合来有效地废除miRNA功能。miRNA也可以通过与回文序列相邻的特殊环区域的特异性靶向来抑制。无催化活性的Cas9也可用于抑制shRNA表达(Zhao，Y.等人，Sci Rep 4，3943(2014))。除了靶向miRNA之外，还可以靶向和突变结合位点以防止被miRNA沉默。

将细胞植入患者体内

在一些实施方案中，本公开的离体方法的另一步骤可以包括将细胞植入患者体内。所述植入步骤可以使用本领域已知的任何植入方法完成。例如，遗传修饰的细胞可以直接注射到患者的血液中或以其他方式施用到患者。遗传修饰的细胞可以使用选择的标志物离体纯化。

治疗方法-自体干细胞移植

在一些实施方案中，本公开的治疗方法包括自体干细胞移植手术。术语“自体”是指用于所述工序的供体细胞来自受试者(患者)。在本文中，CD34+ hHSPC获自受试者，使用CRISPR-Cas9基因编辑进行修饰，并且施用到相同的受试者。通常，如本文提供的自体干细胞移植方法包括：施用(例如，注射)(至少一种)动员剂(例如，普乐沙福和/或G-CSF)，其导致干细胞的动员(刺激干细胞从骨髓空间移动到血流中)；使用单采从血液中收集动员的干细胞；使用CRISPR-Cas9基因编辑修饰干细胞(例如，在BCL11A基因的内含子2内进行修饰)；以及将修饰的干细胞递送至受试者。

红细胞富集

在称为动员前期的时间期间，在一些实施方案中，受试者如患有SCD的受试者可以经历红细胞(RBC)输血。例如，RBC输血可以在计划开始动员前8(±2)周开始，并且可以持续到受试者开始白消安调理。在一些实施方案中，这些RBC输血的目标是靶向血红蛋白S(HbS)水平小于总Hb的30％，同时保持总Hb浓度≤11g/dL。因此，在一些实施方案中，本公开的方法包括根据需要在干细胞动员之前或在治疗期间的任何其他时间点将红细胞施用到受试者。

干细胞动员

因为在外周血中仅发现少量的HSPC，所以可以使用各种不同的试剂来破坏造血细胞和骨髓基质细胞之间的相互作用，以迅速动员大量的干细胞和祖细胞进入循环。这些试剂的非限制性实例包括细胞因子(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF))、用于癌症治疗的一些骨髓抑制药物以及破坏造血细胞和骨髓基质细胞之间的相互作用的其他化合物。在一些实施方案中，所述试剂是普乐沙福

普乐沙福是CXCR4趋化因子受体的抑制剂，并阻断其同源配体基质细胞衍生因子-1(SDF-1α)的结合。SDF-1α和CXCR4被认为在造血干细胞(HSC)向髓室的运输和归巢中起作用。普乐沙福(用于注射)(NDC编号0024-5862-01)提供为单用途小瓶中的20mg/mL溶液。每个小瓶被填充成递送1.2mL的体积，并且含有溶解于注射用水中的24mg药物和5.9mg氯化钠，如果需要，用盐酸和氢氧化钠将pH调整至6.0-7.5。普利沙福的推荐剂量为0.24mg/kg实际体重，通过皮下(SC)注射施用。因此，在一些实施方案中，普利沙福以0.24mg/kg实际体重的剂量施用到受试者，尽管可以施用更多或更少的剂量。例如，普乐沙福可以以0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg或0.35mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，普乐沙福以0.2mg/kg、0.21mg/kg、0.22mg/kg、0.23mg/kg、0.24mg/kg、0.25mg/kg、0.26mg/kg、0.27mg/kg、0.28mg/kg、0.29mg/kg的剂量施用。

在一些实施方案中，受试者经历仅用普里沙福进行的干细胞动员，然后通过单采收集外周血单核细胞(PBMC)。例如，在第1天，受试者在计划的单采前7(±2)小时接受普乐沙福。

在一些实施方案中，在第一剂普乐沙福前施用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(例如，10微克/千克)。例如，可以在首次给药普乐沙福之前和在单采前每天施用G-CSF，持续四天。G-CSF可被称为非格司亭(filgrastim，）或来格司亭(lenograstim，

)。受试者可以连续2或3天进行单采以收集CD34+ hHSPC。在一些实施方案中，用于制造药品的靶向CD34+细胞收集量为至少15×10⁶个CD34+细胞/千克，以实现3×10⁶个CD34+细胞/千克的最小靶剂量。在一些实施方案中，在用药品未实现植入的情况下，可以收集额外的细胞(例如，额外的2×10⁶个CD34+细胞/千克)作为备用用于拯救疗法。

如果第一次动员和单采周期没有产生足够的细胞用于最低限度的药品和安全备用两者，或者如果受试者不能完成单采，可以使用额外的动员和单采周期来收集额外的细胞。额外的动员周期可以例如在前一动员周期的第一天之后至少14天，且在一些实施方案中，在前一周期结束之后不超过60天起始。

干细胞收集

一旦动员达到最佳水平，则主要通过单采收集干细胞。单采起始的确定阈值可以变化，但通常在5至20(例如5、10、15或20)个CD34+细胞/微升的范围内。尽管可用于评估动员功效，但外周血CD34+计数可以是可变的。在一些实施方案中，例如通过单采收集至少15×10⁶个CD34+ hHSPC/kg。在一些实施方案中，收集1×10⁶至1×10⁸个CD34+ hHSPC/kg。

清髓性调理

在清髓性化学疗法之后通常进行骨髓或干细胞移植以重建骨髓。

在药品制造期间和在计划开始清髓性(例如，白消安)调理之前，在一些实施方案中，受试者如患有SCD的受试者将继续接受简单或交换RBC输血，目标是维持HbS水平小于总Hb的30％，同时保持总Hb浓度≤11g/dL。如果计划开始清髓性调理是在动员完成后超过四个月，例如，可以停止RBC输血方案，并且可以对先前已经用HU治疗的那些受试者重新开始羟基脲(HU)治疗。如果中断RBC输血方案，则在一些实施方案中，受试者可以在计划开始清髓性调理之前8(±2)周开始RBC输血(简单或交换)，目标是维持HbS水平小于总Hb的30％，同时保持总Hb浓度例如≤11g/dL。在一些实施方案中，如果在计划开始清髓性调理之前7(±3)天内HbS水平大于总Hb的30％，则受试者可以接受一次交换输血，目标是确保HbS水平在开始清髓性调理之前小于30％。

在一些实施方案中，清髓性调理包括施用白消安 白消安是一种抗癌(抗赘生性或细胞毒性)化疗药物，被分类为烷化剂，通常用于自体干细胞移植前的调理方案中。在一些实施方案中，白消安的起始剂量为每天3.2mg/kg，以靶向4500μM/min至5500μM/min，例如4000μM/min的曲线下面积(AUC)。可以使用其他剂量。例如，白消安的剂量可以是2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg或4mg/kg。在一些实施方案中，白消安的剂量为2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg或3.5mg/kg。在一些实施方案中，静脉内(IV)施用白消安，例如，每天一次，连续四天。在其他实施方案中，可以每6小时(q6h)施用白消安0.8mg/kg，连续4天。可以使用其他给药方案。在一些实施方案中，基于药代动力学水平调整剂量以实现4500μM/min至5500μM/min的曲线下面积(AUC)。在一些实施方案中，基于药代动力学水平调整剂量以实现5000μM/min的AUC。

药学上可接受的载剂

本文预期的向受试者施用祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)的离体方法可以包括使用包含祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)的治疗组合物。

治疗组合物可以含有生理学上可耐受的载剂以及细胞组合物以及任选地作为活性成分溶解或分散在其中的至少一种如本文所述的额外生物活性剂。在一些情况下，除非如此需要，否则当出于治疗目的施用到哺乳动物或人患者时，治疗组合物基本上不具有免疫原性。

通常，本文所述的祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)可以作为具有药学上可接受的载剂的混悬剂施用。本领域的技术人员将认识到，用于细胞组合物中的药学上可接受的载剂将不包括缓冲剂、化合物、冷冻保存剂、防腐剂或其他试剂，其量明显干扰待递送到受试者的细胞的活力。包含细胞的制剂可以包含例如容许维持细胞膜完整性的渗透缓冲液，和任选的在施用后维持细胞活力或增强植入的营养物质。此类制剂和混悬剂是本领域技术人员已知的和/或如本文所述，使用常规实验，可以适合与祖细胞一起使用。

细胞组合物也可以乳化或作为脂质体组合物存在，条件是乳化工序不会不利地影响细胞活力。细胞和任何其他活性成分可以与药学上可接受并且与活性成分相容并且以适合用于本文所述的治疗方法的量的赋形剂混合。

包含在细胞组合物中的额外试剂可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸如盐酸或磷酸或有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

生理上可耐受的载剂是本领域公知的。示例性液体载剂是无菌水溶液，其不含除活性成分和水以外的任何物质，或含有缓冲剂，诸如生理pH值下的磷酸钠、生理盐水或两者，诸如磷酸盐缓冲的盐水。另外，水性载剂可以含有一种以上的缓冲盐，以及盐如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇和其他溶质。除了水以外并且排除水，液体组合物还可以含有液相。这些额外液相的实例是甘油、植物油如棉籽油和水-油乳液。在细胞组合物中使用的有效治疗特定病症或病况的活性化合物的量可以取决于所述病症或病况的性质，并且可以通过标准临床技术确定。

施用和功效

术语“施用”、“引入”和“移植”在通过导致引入的细胞在所需位点如受伤或修复位点至少部分定位从而产生所需效果的方法或途径将细胞，例如祖细胞如CD34+ hHSPC，置于受试者中的背景下可互换使用。细胞，例如祖细胞如CD34+ hHSPC，或其分化的后代可以通过引起递送到受试者中的所需位置的任何适当的途径施用，在所述位置处至少一部分的植入细胞或细胞组分保持活力。施用到受试者后细胞的活力时间可以短至几小时，例如二十四小时、几天、长达几年或甚至受试者的生活时间，即，长期植入。例如，在本文所述的一些方面，通过全身施用途径如腹膜内或静脉内途径施用有效量的肌原性祖细胞。

术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何受试者。在一些方面，受试者是哺乳动物。在一些方面，受试者是人。

当预防性地提供时，本文所述的祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)可以在血红蛋白病的任何症状之前，例如在发展疲劳，呼吸短促，黄疸，***后期生长缓慢，关节、骨和胸痛，脾脏和肝脏肿大之前施用到受试者。因此，预防性施用造血祖细胞群体用于预防血红蛋白病，诸如B-地中海贫血或镰状细胞病。

当治疗性地提供时，在血红蛋白病的症状或适应症发作时(或之后)，例如在疾病发作时，提供造血祖细胞。

根据本文所述的方法施用的造血祖细胞群体可以包含从一个或多个供体获得的同种异体造血祖细胞。“同种异体的”是指造血祖细胞或包含从相同物种的一个或多个不同供体获得的造血祖细胞的生物样品，其中在一个或多个基因座处的基因不相同。例如，向受试者施用的造血祖细胞群体可以来源于一个或多个不相关的供体受试者，或来源于一个或多个不相同的同胞。在一些情况下，可以使用同基因造血祖细胞群体，诸如从遗传上相同的动物或从同卵双胞胎获得的那些。造血祖细胞可以是自体同源细胞；即，造血祖细胞从受试者获得或分离并施用到同一受试者，即供体和受体是相同的。

术语“有效量”是指预防或减轻血红蛋白病的至少一种或多种征象或症状所需的祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)群体或其后代的量，并且涉及足以提供所需效果，例如治疗患有血红蛋白病的受试者的量的组合物。因此，术语“治疗有效量”是指当施用到典型受试者如具有或处于血红蛋白病的风险之中的受试者时足以促进特定效果的祖细胞(例如，CD34+hHSPC)或包含祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)的组合物的量。有效量还将包括足以预防或延迟疾病症状发展，改变疾病症状的过程(例如，但不限于减缓疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。应当理解，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的“有效量”。

为了在本文所述的各个方面中使用，有效量的祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)包含至少10²个祖细胞、至少5×10²个祖细胞、至少10³个祖细胞、至少5×10³个祖细胞、至少10⁴个祖细胞、至少5×10⁴个祖细胞、至少10⁵个祖细胞、至少2×10⁵个祖细胞、至少3×10⁵个祖细胞、至少4×10⁵个祖细胞、至少5×10⁵个祖细胞、至少6×10⁵个祖细胞、至少7×10⁵个祖细胞、至少8×10⁵个祖细胞、至少9×10⁵个祖细胞、至少1×10⁶个祖细胞、至少2×10⁶个祖细胞、至少3×10⁶个祖细胞、至少4×10⁶个祖细胞、至少5×10⁶个祖细胞、至少6×10⁶个祖细胞、至少7×10⁶个祖细胞、至少8×10⁶个祖细胞、至少9×10⁶个祖细胞或其倍数。祖细胞可以来源于一个或多个供体，或者可以从自体同源的来源获得。在本文所述的一些实施例中，祖细胞可以在施用到需要其的受试者之前在培养物中扩增。

“施用的”是指通过导致细胞组合物在所需位点处至少部分地定位的方法或途径将祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)组合物递送到受试者体内。细胞组合物可以通过任何适当的途径施用，所述途径导致受试者中的有效治疗，即施用导致递送至受试者中的所需位置，其中经一定的时间将所述组合物的至少一部分，即至少1×10⁴个细胞递送到所需位点。施用模式包括注射、输注、滴注或摄取。“注射”包括而不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下腔、脊柱内、脑内脊柱和胸骨内注射和输注。在一些实施例中，途径是静脉内。对于细胞的递送，施用可以通过注射或输注进行。

细胞可以全身施用。短语“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”和“外周地施用”是指除直接施用到靶位点、组织或器官外祖细胞(例如，CD34+ hHSPC)群体的施用，因此其代替地进入受试者的循环系统且因此经受新陈代谢和其他类似的过程。

包括用于治疗血红蛋白病的组合物的治疗的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，如果功能性BCL11A和功能性HbF的水平(仅作为一个实例)的任何一个或所有征象或症状以有益的方式改变(例如，BCL11A降低至少10％和/或HbF增加至少10％)或疾病的其他临床上接受的症状或标志物得到改进或改善，则认为治疗是“有效治疗”。功效也可以通过如通过住院或需要医学干预(例如，疾病的进展停止或至少减缓)所评估个体失败以至恶化来测量。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或本文所述的。治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)，并且包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如引起症状消退；和(3)预防或降低症状发展的可能性。

根据本公开的治疗可以通过减少功能性BCL11A的量和/或增加个体中功能性HbF的量来减轻与血红蛋白病相关的一种或多种症状。通常与血红蛋白病相关的早期征象包括例如疲劳，呼吸短促，黄疸，***后期生长缓慢，关节、骨和胸痛，脾和肝脏肿大。

如本文所用，疾病或病症的“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指完成下列中的一项或多项：(a)降低所述病症的严重程度和/或持续时间；(b)限制或预防所治疗的病症的特征性症状的发展；(c)抑制所治疗的病症的特征性症状的恶化；(d)限制或预防先前已经患有所述病症的患者中病症的复发；和(e)限制或预防先前具有所述病症的症状的患者中所述症状的复发。

如本文所用，“单位剂型”是指适合作为人受试者的单一剂量的物理离散单位，各单位含有经计算以与所需要的药物稀释剂、载剂或媒剂结合产生所需治疗效果的预定量的活性物质。本发明的新型单位剂型的规格由(a)活性物质的独特特性和有待实现的特定治疗效应和(b)混配用于治疗动物或人的这种活性物质的领域中固有的限制决定，并且直接取决于此，如本说明书所公开，这些是本发明的特征。根据本发明的合适单位剂型的实例是小瓶、片剂、胶囊、锭剂、栓剂、粉末包、糯米纸囊剂、扁囊剂、安瓿、任何前述剂型的分离的多个，以及如本文所述或本领域通常已知的其他形式。基因编辑的细胞的一个或多个此类单位剂型可以包含在本发明的制品中。

药品剂量和施用途径

用于各种适应症的自体移植通常使用至少2至2.5×10⁶个CD34⁺细胞/千克以支持植入。为了确保在SCD研究中在所有受试者中的植入，可以使用3×10⁶个修饰的CD34⁺hHSPC/kg的保守最小剂量，其比自体移植的典型最小剂量高20％至50％。不受理论的约束，骨髓细胞清除后输注更高数量的CD34⁺干细胞与更快的植入、持久性和治疗功效相关。在一些实施方案中，可以使用更低或更高的剂量。例如，可以向受试者施用2×10⁶、2.5×10⁶、3×10⁶、3.5×10⁶、4×10⁶、4.5×10⁶、5×10⁶、5.5×10⁶、6×10⁶、6.5×10⁶、7×10⁶、7.5×10⁶、8×10⁶、8.5×10⁶、9×10⁶、9.5×10⁶、1×10⁷、1.5×10⁷、2×10⁷个修饰的CD34⁺ hHSPC/kg。在一些实施方案中，可以施用3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷或1×10⁸个修饰的CD34⁺ hHSPC/kg。

在一些实施方案中，在最后的白消安剂量后，施用单剂量的药品至少48小时(例如，至少48小时、54小时、60小时、66小时或72小时)且在7天(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天)内施用。在一些实施方案中，全部剂量的药品在解冻的大约20分钟内输注。

在一些实施方案中，受试者在第1天经由通过中心静脉导管输注来接受药品。可以使用其他施用途径(例如，静脉内途径)。

在一些实施方案中，中性粒细胞(和/或血小板)植入在受试者中在施用修饰的CD34+ hHSPC后的42天内发生。植入通常是在移植期间收集的干细胞开始生长并产生新的血细胞的过程。在一些实施方案中，中性粒细胞植入定义为连续三天中的第一天，其中中性粒细胞计数(绝对中性粒细胞计数)为500个细胞/mm3(0.5×10⁹/L)或更大。在一些实施方案中，血小板植入定义为无血小板输血支持的20,000/mm3(20×10⁹/L)。在一些实施方案中，中性粒细胞(和/或血小板)植入在受试者中在施用修饰的CD34+ hHSPC后20、25、30、35或40天内发生。在一些实施方案中，中性粒细胞(和/或血小板)植入在受试者中在施用修饰的CD34+ hHSPC后40天以上发生。

在一些实施方案中，在药品输注后，患有β-地中海贫血的受试者的输血次数自基线减少。在一些实施方案中，存在输血次数相对于基线的减少。例如，在一些实施方案中，患有β-地中海贫血的受试者的输血次数相对于基线减少2倍。在一些实施方案中，患有β-地中海贫血的受试者的输血次数相对于基线减少2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。在一些实施方案中，患有β-地中海贫血的受试者的输血次数相对于基线减少2倍至5倍、3倍至5倍或4倍至5倍。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC(治疗)时、施用后至少三个月(或三个月)或施用后至少六个月(或六个月)开始，计算输血次数的减少。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC时、施用后三个月或施用后六个月开始，输血次数减少持续至少6个月(例如，至少6个月、至少12个月、至少18个月或至少24个月)。

在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC时、施用后至少3个月、施用后至少六个月或施用后至少九个月开始，实现不需要输血的患有β-地中海贫血的受试者(未接受常规疾病相关的输血的受试者)的数目自基线变化至少6个月、至少12个月、至少18个月或至少24个月。应当理解，即使在与血红蛋白病的治疗无关的某些临床环境中需要一次或多次输血，诸如与手术或过量出血有关的输血，也可以将患有β-地中海贫血的受试者视为已经实现了不需要输血。

基线值是在筛选期间和开始动员之前收集的最近的非缺失测量结果(预定的或非预定的)。

对于患有β-地中海贫血的受试者的输血事件的数量，治疗前基线被定义为入选前2年期间的输血次数。基线可以使用治疗前2年期间所有输血事件的记录来计算。可以将自基线的变化(绝对变化)计算为后基线值-基线值。可以计算自基线的相对变化，并以百分比表示为100％×(后基线值-基线值)/基线值。

在一些实施方案中，在没有用羟基脲(HU)治疗的情况下，患有SCD的受试者的HbF水平为至少20％。在一些实施方案中，在没有用HU治疗的情况下，患有SCD的受试者的HbF水平为至少30％、至少40％或至少50％。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC时开始，患有SCD的受试者的HbF水平在没有羟基脲(HU)的情况下为至少20％，持续至少三个月。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC时开始，患有SCD的受试者的HbF水平在没有HU的情况下为至少30％、至少40％或至少50％，持续至少三个月、至少四个月、至少五个月或至少六个月。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC后三个月开始，患有SCD的受试者的HbF水平在没有HU的情况下为至少20％，持续至少三个月。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC后三个月开始，患有SCD的受试者的HbF水平在没有HU的情况下为至少30％、至少40％或至少50％，持续至少三个月、至少四个月、至少五个月或至少六个月。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC后六个月开始，患有SCD的受试者的HbF水平在没有HU的情况下为至少20％，持续至少三个月。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+hHSPC后六个月开始，患有SCD的受试者的HbF水平在没有HU的情况下为至少30％、至少40％或至少50％，持续至少三个月、至少四个月、至少五个月或至少六个月。

在一些实施方案中，对于患有SCD的受试者，存在严重血管闭塞危机(VOC)的年率自基线的相对变化。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC后六个月开始，患有SCD的受试者的严重VOC的年率自基线降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。在一些实施方案中，在施用修饰的CD34+ hHSPC后六个月开始，VOC不存在至少12个月(例如，至少18个月或至少24个月)。

在一些实施方案中，对于患有SCD的受试者，在施用修饰的CD34+ hHSPC后六个月开始，存在严重VOC的住院的年持续时间自基线的变化。

基线值是在筛选期间和开始动员之前收集的最近的非缺失测量结果(预定的或非预定的)。对于严重VOC事件的数目：治疗前基线定义为入选之前2年期间的平均年化严重VOC事件。基线可以使用治疗前2年期间所有严重VOC事件的记录来计算。可以将自基线的变化(绝对变化)计算为后基线值-基线值。可以计算自基线的相对变化，并以百分比表示为100％×(后基线值-基线值)/基线值。

在一些实施方案中，使用选自以下的下列测定中的至少一种，在受试者中存在患者报告结果(PRO)随时间的变化：疼痛量表(11分数字评定量表[NRS])、EuroQol生活质量量表(EQ 5D 5L)、癌症疗法-骨髓移植的功能评估(FACT-BMT)、患者报告结果测量信息系统(PROMIS)-疲劳、PROMIS-认知功能和成人镰状细胞生活质量测量系统(ASCQ-Me)。

疼痛-量表(11分NRS)：数字评定量表是报告成人疼痛强度的1维量度。11分NRS是分段视觉模拟量表(VAS)，包括从0到10的数字，‘0’表示无疼痛，‘10’表示最糟糕的疼痛。每个应答者将选择反映他们的疼痛强度的整数。NRS的评分范围为0至10分，较高的值指示较高的疼痛级别。

EQ-5D-5L：EQ-5D-5L问卷以标准化方式评估受试者的健康状况，并且由2部分组成：EQ-5D描述系统和EQ VAS。EQ-5D-5L描述系统包括相同的5个维度；流动性、自我护理、平常活动、疼痛/不适和焦虑/抑郁。每个维度具有5个级别：没有问题、轻微问题、中度问题、严重问题和极端问题。要求应答者通过对照5个维度中的每一维度中的最适当陈述而在框中勾选(或放置十字)来指示他/她的健康状态。这种判定产生表示为所述维度选择的级别的1位数。5个维度的数字可以组合成描述受试者的健康状态的5位数字。

EQ VAS在100分VAS上记录受试者的自评健康，其中端点标记为‘你可以想象的最好健康’和‘你可以想象的最坏健康。’这个信息可以用作如由个体应答者判断的健康的定量量度。

FACT-BMT：FACT-BMT调查表是有效的自我报告调查表，其包括身体、社会、家庭、情绪和功能状况。FACT-BMT由骨髓移植的FACT-General(构成所有分量表的核心)和治疗特异性问题组成。

FACT-BMT中的每种陈述都具有范围从0到4的5分Likert型反应量表(0＝“根本没有”；1＝“一点点”；2＝“有点”；3＝“相当多”；和4＝“非常多”)。要求受试者每行圈上或标记1个数字以指示他/她对所述陈述的反应，其适用于过去的7天。然后对问卷进行评分，并且评分越高，QOL越好。所述信息可以用于提供识别受试者的需要的整体评估，这可能未被标准临床咨询揭示。

PROMIS-疲劳和PROMIS-认知功能：PROMIS项目库含有超过300项疾病相关的PRO。PROMIS-疲劳7a含有7项，并评价自我报告的症状，诸如感觉疲倦和极度衰竭，以及这些症状对日常活动和正常功能的影响。PROMIS-认知功能8a包含8项关于思考、集中等能力的项目。两种量度都具有7天回忆期(“在过去的7天中”)。每个问题具有5个级别：从不、几乎从不、有时、经常和几乎总是。PROMIS量度使用T-评分度量来评分，其中参考群体的平均值为50，并且SD为10。评分可以通过考虑评分的方向和报告的评分与参考群体(SD 10)中平均值50之间的差异来解释。

ASCQ-Me：ASCQ-Me由评估身体、精神和社会健康的量度以及关于疾病严重程度的信息组成。其包括下列域：情绪影响、疼痛影响、疼痛发作、睡眠影响、社交功能影响、僵硬影响和SCD病史清单。大多数维度具有5个级别：从不、很少、有时、经常和总是或者根本没有、一点点、有点、相当多和非常多。SCD病史检查表上的问题用是或否选项指示，并且疼痛发作频率和严重程度用事件频率指示。ASCQ-Me域使用T-评分度量来评分，其中参考群体的平均值为50，并且SD为10。评分可以通过考虑评分的方向和报告的评分与参考群体(SD 10)中平均值50之间的差异来解释。

在一些实施方案中，在受试者中存在如通过下列四种溶血标志物的主要组分分析所测量的溶血指数随时间的变化：网织红细胞计数、血清天冬氨酸转氨酶浓度、乳酸脱氢酶[LDH]和总胆红素。

肺动脉高压(PHTN)是潜在的威胁生命的并发症，通过三尖瓣返流速度(TRV)升高的超声心动图证据检测。这种病症已经在患有镰状细胞病(SCD)和其他溶血性病症的成人中描述；然而，关于儿科患者中发生这种病症的信息很少。在一些实施方案中，在受试者中存在三尖瓣返流射流速度(TRV)随时间的变化(例如，降低至少10％、至少20％或至少30％)。

在一些实施方案中，在受试者中存在表达胎儿血红蛋白的循环红细胞(F细胞)的比例随时间的增加。在一些实施方案中，在受试者中存在表达胎儿血红蛋白的循环红细胞(F细胞)的比例随时间至少10％(例如，至少20％或至少30％)的增加。

在一些实施方案中，在受试者中存在炎性标志物和内皮激活标志物随时间的变化(例如，减少)。在一些实施方案中，在受试者中存在炎性标志物和内皮激活标志物随时间至少10％、至少20％或至少30％的减少。

在一些实施方案中，在受试者中存在外周血白细胞中存在的具有遗传修饰的等位基因的比例随时间的变化(例如，增加)。在一些实施方案中，在受试者中存在外周血白细胞中存在的具有遗传修饰的等位基因的比例随时间至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％)的增加。

在一些实施方案中，在受试者中存在骨髓细胞中存在的具有遗传修饰的等位基因的比例随时间的变化(例如，增加)。在一些实施方案中，在受试者中存在外周血白细胞中存在的具有遗传修饰的等位基因的比例随时间至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％)的增加。

测量上述端点的时间可以是3个月至5年或更长。例如，“随时间”可以包括3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、42个月、48个月、54个月或60个月。

试剂盒

本公开提供用于实施本文所述方法的试剂盒。试剂盒可以包含基因组靶向核酸、编码基因组靶向核酸的多核苷酸、定点多肽、编码定点多肽的多核苷酸和/或需要实施本文所述方法的方面或其任何组合的任何核酸或蛋白质分子中的一种或多种。

试剂盒可以包含：(1)载体，其包含编码基因组靶向核酸的核苷酸序列，(2)定点多肽或包含编码定点多肽的核苷酸序列的载体，和(3)用于重构和/或稀释一种或多种载体和或多肽的试剂。

试剂盒可以包含：(1)载体，其包含(i)编码基因组靶向核酸的核苷酸序列，和(ii)编码定点多肽的核苷酸序列；和(2)用于重构和/或稀释载体的试剂。

在任何上述试剂盒中，试剂盒可以包含单分子导向基因组靶向核酸(例如，SEQ IDNO：1或2)。在任何上述试剂盒中，试剂盒可以包含双分子基因组靶向核酸。在任何上述试剂盒中，试剂盒可以包含两种或更多种双分子导向或单分子导向。试剂盒可以包含编码核酸靶向核酸的载体。

在任何上述试剂盒中，试剂盒还可以包含待***以实现所需遗传修饰的多核苷酸。

试剂盒的组分可以在单独的容器中，或组合在单个容器中。

任何上述试剂盒都可以还包含一种或多种额外的试剂，其中此类额外试剂选自缓冲液、用于将多肽或多核苷酸引入细胞中的缓冲液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照载体、对照RNA多核苷酸、用于由DNA体外产生多肽的试剂、用于测序的衔接子等。缓冲液可以是稳定缓冲液、重构缓冲液、稀释缓冲液等。试剂盒还可以包含一种或多种组分，其可以用于促进或增强内切核酸酶实现的DNA的中靶结合或裂解或改进靶向的特异性。

除了上述组分之外，试剂盒还可以包含使用试剂盒的组分来实施这些方法的说明书。可以将用于实践这些方法的说明书记录在合适的记录媒体上。例如，说明书可以印刷在基材如纸或塑料等上。说明书可以作为包装说明书存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组件的容器的标签中(即，与包装或子包装相关)等。说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储媒体如CD-ROM、软盘、闪存驱动器等上的电子存储数据文件存在。在一些情况下，试剂盒中不存在实际说明书，但是可以提供用于从远程源(例如，通过因特网)获得说明书的手段。这种情况的一个实例是一种包括网址的试剂盒，在所述网址中可以查看说明书和/或可以从中下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书的手段可以记录在合适的基材上。

实施例

实施例1.非临床研究

进行下列非临床功效和毒理学研究。

简言之，在研究药品(CTX001)的临床前研究中，在健康供体CD34⁺细胞的BCL11A基因红细胞增强子处进行CRISPR-Cas9基因编辑导致γ-珠蛋白mRNA(平均γ/α-珠蛋白比为0.30(标准偏差[SD]±0.20)和γ/(γ+β)-珠蛋白比为0.41(SD±0.15))和HbF(HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的平均百分比为32％(SD±9％))增加。平均等位基因编辑频率为80％(SD±4％)，并且遍及包括长期造血干细胞(LT-HSC)的CD34⁺细胞亚群是一致的。大多数编辑是双等位的。

在小鼠异种移植研究中，在移植后16周，在用药品或对照(EGFP)编辑的CD34⁺hHSPC输注的NOD SCIDγ(NSG)小鼠之间的植入嵌合性没有差异(图1)。16周后骨髓样品中存在的编辑的等位基因的平均频率为91％(SD±15％)。此外，植入的细胞能够维持其多谱系潜能(图1)。

为了进一步解决与药品相关的最相关的潜在风险，还进行了评价药品安全性的临床前研究。在药品的非临床基因毒性和毒理学评估中，使用多种已建立的方法广泛且系统地评价了中靶编辑和潜在脱靶编辑。与未编辑的健康供体细胞相比，药品在可检测水平上显示出高效率的中靶***和缺失(大约88％)且无脱靶编辑。染色体核型分析没有识别任何染色体易位或其他可检测的异常。此外，致瘤性研究在接受药品的小鼠中没有揭示任何赘生性或骨髓增生性病变。

β-地中海贫血患者样品

高频率的等位基因编辑在β-地中海贫血患者(两个β⁺/β⁺，一个β⁰/β⁰)样品中重复，并且在gRNA-RNP编辑后使得在β⁺/β⁺中γ/α-珠蛋白mRNA比为0.42和0.58且在β⁰/β⁰中γ/β-珠蛋白mRNA比为0.41，并且在gRNA-RNP-处理的情况下在β⁺/β⁺中升高的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平为73％和79％且在β⁰/β⁰中升高的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平为92％，相比之下，在未处理的对照中，在β⁺/β⁺中升高的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平为24％和50％且在β⁰/β⁰中升高的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平为68％。还测量了另外的β-地中海贫血患者(β⁺/β⁰)样品中的水平。在gRNA-RNP编辑后，γ/α-珠蛋白mRNA比为0.42，并且在gRNA-RNP编辑后，HbF/(HbF+HbA)蛋白水平为81％，相比之下，在未处理的对照中，γ/α-珠蛋白mRNA比为0.18，并且在未处理的对照中，HbF/(HbF+HbA)蛋白水平为61％。当与HPFH患者的历史实例中所见的水平相比时，用gRNA-RNP编辑所引起的γ-珠蛋白mRNA和HbF水平的增加在临床上是有意义的。

还评估gRNA-RNP编辑的β-地中海贫血患者(两个β⁺/β⁺，一个β⁰/β⁰和一个β⁺/β⁰)样品中(γ+β)/α-珠蛋白mRNA比，并与未处理的对照相比较(图2和图3)。不希望受理论的束缚，预期获得临床益处所需的阈值(γ+β)/α-珠蛋白mRNA比为大约0.4(参见，例如Giampalo等人，胎儿血红蛋白(HPFH)的异细胞遗传性持续存在(Heterocellular hereditarypersistence of fetal hemoglobin(HPFH))。与β地中海贫血相关的异常γ基因表达的分子机制以及与β-珠蛋白基因簇的连锁关系(Molecular mechanisms of abnormal gamma-gene expression in association with beta thalassemia and linkage relationshipwith the beta-globin gene cluster)。Hum Genet.1984；66(2-3)：151-156和Marinucci等人，与增加的HBF产生相关的β地中海贫血(beta Thalassemia associated withincreased HBF production)。在意大利南部人群中存在与β地中海贫血相关的胎儿血红蛋白(HPFH)决定簇的异细胞遗传性持续存在的证据(Evidence for the existence of aheterocellular hereditary persistence of fetal hemoglobin(HPFH)determinantlinked to beta thalassemia in a southern Italian population)。Hemoglobin.1981；5(1)：1-)。编辑的β-地中海贫血患者样品具有高于0.4的(γ+β)/β-珠蛋白mRNA比(图2和图3)，表明编辑的患者样品中γ-珠蛋白和β-珠蛋白mRNA水平的组合增加具有临床意义。

镰状细胞疾病患者样品

高频率的等位基因编辑在镰状细胞病患者样品中重复，并且导致平均γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比为0.53(SD±0.085，n＝9)且平均百分比HbF(HbF/(HbF+HbA))蛋白水平为40％(SD±9.2％，n＝3)(图4)。

实施例2.评价单剂量自体CRISPR-Cas9修饰的CD34+人造血干细胞和祖细胞在患有输血依赖性β-地中海贫血的受试者中的安全性和功效的研究

进行1/2期安全性和功效研究，以评价单剂量自体CRISPR-Cas9修饰的CD34+人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)(药品)在患有输血依赖性β-地中海贫血的受试者中的安全性和功效(主要目的)。评估药品输注对疾病特异性事件和临床状态的影响，并且量化基因编辑效率(次要目的)。此外，还评估了生物标志物表征药品效果和预测治疗结果的能力(探索性目的)。这种研究最初将包括至多12名参加研究的受试者，可能扩展至30名或更多名受试者。参加研究的受试者是18至35岁(包括知情同意之时)，患有记载的非β⁰/β⁰输血依赖性β-地中海贫血。这种研究可以扩展到儿科群体(例如，小于18岁)。

出于研究的目的，输血依赖性β-地中海贫血定义为：

·记载的纯合β-地中海贫血(β⁰/β⁰基因型除外)或复合杂合β-地中海贫血，包括β-地中海贫血/血红蛋白E(HbE)。

·在2年的时间内进行至少100mL/kg/年或10单位/年的浓厚RBC输血。

作为研究初始阶段的安全措施，前2名受试者将以交错方式用药品治疗，以确保在研究中治疗第二名受试者之前第一名受试者已经成功植入。直到第一受试者实现中性粒细胞植入(绝对中性粒细胞计数[ANC]≥500/μL持续连续3天)，数据监测委员会(DMC)已经审阅了可利用的植入和安全性数据，并且在向第一受试者输注药品后至少30天，第二受试者才进行骨髓清除。一旦第二受试者已经实现中性粒细胞植入并且不具有除通常与白消安调理或自体移植手术相关的不良事件以外的≥3级的AE，其余受试者就可以同时进行调理和药品输注。如果输注药品的第二受试者经历除通常与白消安调理或自体移植手术相关的不良事件以外的≥3级的AE，则在其余受试者可以进行调理和药品输注之前，将召开DMC会议并检查数据。可以同时进行进行白消安骨髓清除之前的所有步骤，诸如同意、筛选和干细胞收集，而不使受试者交错。

将研究扩展到包括总共多达30名受试者的决定将基于在至少6名受试者已经接受药品输注之后主办者与DMC和指导委员会(SC)协商的可用安全性和功效数据的评审。

对于每个受试者，研究将以4个阶段进行，其描述如下。将要求所有输注药品的受试者参加额外的长期追踪研究。

示例纳入标准

受试者必须满足所有下列纳入标准以符合入选研究的条件：

1.受试者将签署知情同意书(ICF)并记录日期。

2.受试者18至35岁，包括知情同意之日在内。

3.输血依赖性β-地中海贫血(TDT)的诊断，如下定义：

a.记载的纯合β-地中海贫血(除β⁰/β⁰基因型外)或复合杂合β-地中海贫血，包括β-地中海贫血/血红蛋白E(HbE)。受试者可以基于历史数据入选，但在白消安调理前将需要使用研究中心实验室进行基因型确认。β⁰/β⁰基因型使用HbVar数据库定义。

b.在提供研究同意之前2年内至少100mL/kg/年或10单位/年的浓厚RBC输血

4.Karnofsky体力状态≥80％。

5.按照研究者的判断，符合自体干细胞移植的条件。

6.在同意之前至少2年获得关于浓厚RBC输血的详细医疗记录，包括浓厚RBC的体积或单位和相关的输血前Hb值，以及住院患者住院治疗。

7.具有生育潜力(经产后，具有完整的子宫和至少1个卵巢，并且绝经后小于1年)的女性受试者必须同意从同意到输注药品后至少6个月使用可接受的避孕方法。

8.男性受试者必须同意从开始动员到输注药品后至少6个月使用有效的避孕

9.愿意并能够遵守预定的访问、治疗计划、实验室测试、避孕指南和其他研究工序。

10.在完成所述研究后愿意参与额外的长期随访研究。

示例排除标准

符合任何下列标准的受试者都不符合入选条件：

1.可获得的10/10人白细胞抗原(HLA)-匹配的相关供体。

2.先前的HSCT。

3.具有相关的α-地中海贫血和＞1处α链缺失的受试者。

4.具有β⁰/β⁰地中海贫血基因型或镰状细胞β地中海贫血变体的受试者

5.如研究者所确定的临床显著和活性的细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。

6.白细胞(WBC)计数＜3×10⁹/L或血小板计数＜50×10⁹/L，与按照研究者判断的超脾功能无关。

7.显著出血病症史。

8.据研究者的看法可能混淆研究结果或对受试者造成额外风险的任何疾病或任何临床病况史。这可以包括但不限于：相关药物过敏史；心血管或中枢神经系统病史；临床显著病理的历史或存在；精神病史或家族性癌症综合征史。

9.任何先前或当前的恶性肿瘤或骨髓增生性病症或显著的免疫缺陷病症。

10.晚期肝病，定义为

a.天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)＞3×正常上限(ULN)或直接胆红素值＞2×ULN，或

b.基线凝血酶原时间(PT)(国际标准化比[INR])＞1.5×ULN，或

c.肝硬化史或任何桥接纤维化证据，或肝活检物上的活动性肝炎

11.通过MRI测得的心脏T2*＜10ms或通过超声心动图测得的左心室射血分数(LVEF)＜45％。

12.基线估计的肾小球滤过率＜60mL/min/1.73m²。

13.一氧化碳肺弥散量(DLco)＜预测值的50％(对血红蛋白和/或肺泡体积校正)。

14.用基因疗法/编辑产物进行的现有治疗。

15.不耐性、禁忌症或已知对普乐沙福或白消安的敏感性。与药品的赋形剂(二甲亚砜[DMSO]，葡聚糖)的现有过敏反应。

16.人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)或人免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)(乙型肝炎核心抗体[HBcAb]或核酸测试[NAT])或丙型肝炎病毒(HCV)(NAT)的阳性血清学。如由本地测试细胞加工所需的梅毒或任何其他传染病标志物的阳性血清学。

17.参与在筛选30天或小于研究试剂的5倍半衰期(无论是否长于筛选)内用研究药物/产品进行的另一临床研究。

18.如研究者所判断受试者不能遵守方案中概述的研究工序。

19.怀孕或哺乳的女性。

所述药品包括通过静脉内(IV)输注施用的在BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子处用CRISPR-Cas9修饰的自体CD34+ hHSPC。

这是在患有输血依赖性β-地中海贫血的受试者中的单臂、开放标记、多位点、单剂量、1/2期研究。所述研究将评价单剂量自体CRISPR-Cas9修饰的hHSPC(药品)的安全性和功效，并且将包括多达12名18至35岁(包括端值)的受试者。所述研究可以扩展到包括总共30名或更多名受试者。所述研究还可以包括儿科群体。

整个过程与恶性疾病患者中自体HSCT所用的工序一致，除了下面描述的一些例外。因此，预期与本研究中的工序相关的风险不会与这些工序的标准风险显著不同。

动员后，将在用G-CSF产物(例如，非格司亭)和普乐沙福的组合的情况下通过单采收集CD34⁺干细胞。通过单采而不是骨髓收获来收集干细胞使得CD34⁺细胞的分离更容易，因为这个过程对患者的侵入性较小并且不需要全身麻醉。

将单独使用白消安进行调理。对于异基因干细胞移植，白消安通常与环磷酰胺或氟达拉滨组合，因为这种组合提供骨髓清除和免疫抑制两者。对于自体移植，如在使用所述药品的临床研究中，不需要免疫抑制来预防GvHD，并且单一试剂白消安将主要提供清髓性作用。使用白消安调理的方案已经用于β-地中海贫血的同种异体移植中，并且已经产生成功植入、较少的治疗相关的并发症和稳定的供体嵌合性。此外，其他基因疗法研究已经成功地将白消安单独用于疾病领域如SCD、β-地中海贫血和由于腺苷脱氨酶缺乏引起的严重联合免疫缺陷的调理。

由于药品的施用是自体工序，因此不需要GvHD的预防性治疗。

所述研究将以4个阶段进行：

阶段1：筛选和前动员期

在此期间，符合纳入标准的受试者具有通过冷冻保存***或***来进行生育力保存的选择。

阶段2：动员、自体CD34⁺干细胞收集、药品制造和处置

每个受试者将用G-CSF产物(例如，非格司亭)和普乐沙福的组合进行干细胞动员。通过单采收集外周血单核细胞(PBMC)。受试者将连续2或3天进行单采以收集CD34⁺ hHSPC。用于制造药品的靶向CD34⁺细胞收集量为至少15×10⁶个CD34⁺细胞/千克，以实现3×10⁶个CD34⁺细胞/千克的最小靶剂量。在用药品未实现植入的情况下，将收集额外的2×10⁶个CD34⁺细胞/千克作为备用用于拯救疗法。如果第一次动员和单采周期没有产生足够的细胞用于最低限度的药品和安全备用两者，或者如果受试者不能完成单采，则将允许多达2次的额外动员和单采周期来收集额外的细胞。额外的动员周期将在前一动员周期的第一天之后至少14天且在前一周期结束之后不超过60天起始。

阶段3：清髓性调理(阶段3A)和药品输注(第1天，阶段3B)

阶段3A-清髓性调理：

在现场接受药品并且已经确认备用细胞已经储存并且可用后，受试者将住院并且用白消安进行清髓性调理。将以3.2mg/kg/天的起始剂量(基于白消安开始前3-7天收集的体重)每日静脉内(IV)施用白消安，连续4天。每日一次给药是优选的方案；然而，可以将白消安给药方案调整至按照现场标准实践每6小时(Q6H)进行。白消安的剂量将基于第一白消安剂量的药代动力学(PK)进行调整以维持适当的骨髓清除水平。接受3.2mg/kg/天的起始剂量4天的受试者的曲线下平均目标面积(AUC)为5000μM*min(范围：4500μM*min至5500μM*min)；相当于目标累积白消安暴露量为90mg×hr/L(范围80-100mg×hr/L)。持续4天Q6H施用白消安的受试者的平均目标AUC为1125μM*min(范围：900μM*min至1350μM*min)。

阶段3B-药品输注：在白消安输注完成后最少48小时且在白消安输注完成后最多7天将进行药品的输注。

在第1天，将全部剂量(所有小瓶)的药品解冻并通过中心静脉导管施用。

阶段4：进行随访直至植入以及药品输注后长达2年

阶段4A-输注后医院内随访：在移植中心将每天追踪受试者，并根据进行造血干细胞移植(HSCT)的受试者的标准实践接受支持性护理。将监测受试者的AE和植入。按照标准实践/研究者对进行HSCT的患者的判断，将浓厚RBC和血小板输注给受试者。按照本地医院指南和/或研究者判断，受试者在中性粒细胞植入(定义为ANC≥500/μL，连续3天)和主要医学问题稳定时将从移植中心出院。

在药品输注的42天内没有实现植入的不太可能的情况下，受试者将接受备用CD34+干细胞。

阶段4B-植入后随访：在药品输注后，将追踪受试者24个月，进行身体检查、实验室和成像评估以及AE评价。根据现场管理指南和/或研究者的判断，在药品输注后大约一(1)个月，将允许受试者重新开始铁螯合。

除非医学上有指示(例如，症状性贫血或需要手术)，否则植入后，对于Hb≥9g/dL，应当避免输注浓厚RBC。推荐受试者对于Hb＜7.0g/dL将接受压缩RBC输血，而建议医学判断基于受试者的临床需要，对于7-9g/dL的Hb水平进行输血。

输注工序、剂量和施用

用于各种适应症的自体移植通常使用至少2至2.5×10⁶个CD34⁺细胞/千克以支持植入。为了确保在SCD研究中所有受试者的植入，选择3×10⁶个CD34⁺细胞/千克的保守最小剂量，其比自体移植的典型最小剂量高20％至50％。原则上，骨髓清除后输注更高数量的CD34⁺干细胞与更快的植入、耐久性和治疗功效相关。

药品将在含有5％DMSO和右旋糖酐40的CS5培养基中配制。与DMSO相关的组胺释放可以导致诸如以下的症状：副作用，包括恶心、呕吐、腹泻、面红、发烧、寒战、头痛、呼吸困难、皮疹、支气管痉挛、过敏反应、血管舒张和低血压，以及精神状态改变。考虑到这些AE的风险，在服用药品之前，将对受试者预先用抗组胺药(盐酸苯海拉明)和解热药(对乙酰氨基酚或对乙酰氨基酚)。按照机构指南和调查者判断，根据需要，这些药物可以每3-4小时重复一次。

在最后的白消安剂量后的至少48小时且7天内将给予单剂量的药品。药品小瓶应当按照本地现场SOP在预定的输注之前解冻。全部剂量的药品应该在解冻的20分钟内输注。解冻和输注细胞的详细说明在研究参考手册中。医院指南将用于维持药品从干细胞实验室到受试者的监管链。在输注之前，应当遵循关于受试者身份和产品细节的验证的本地工序，以确保产品的匹配以及完整性。

受试者将在第1天通过中心静脉导管输注来接受药品。所有含有药品的小瓶都将被输注。

所有涉及药品的工序都应该由受过训练的人员根据临床现场的SOP使用无菌技术来进行。

在最后一次白消安剂量后7天内不进行药品输注的不太可能的情况下，受试者应接受备用CD34+干细胞。

研究持续时间

阶段1的持续时间将为大约1-3个月；阶段2的持续时间将为大约2-3个月；阶段3的持续时间将为大约1个月；阶段4的持续时间将为大约2年。研究中的受试者在签署同意书后将被追踪总计大约2.5年且在药品输注后将被追踪2年。另外，将要求所有输注药品的受试者在完成或退出/中止该研究后参加长期的追踪研究或登记。

现有药物

将记录在筛选的30天内服用的所有药物。将记录从同意研究筛选之日之前的24个月关于RBC输血的回顾性信息。

静脉通路

将使用中心静脉导管来进行调理方案的施用和药品的输注。中心静脉导管也可用于单采、交换输血，以及按照研究者判断用于在药品输注之后受试者的临床护理。

输血

在开始单采工序之前和在白消安调理的计划起始之前至少一个月，应对受试者进行输血以达到Hb≥11g/dL的目标。这样做是为了抑制无效的红细胞生成并允许更成功的植入。在白消安调理和药品输注的住院治疗期间，受试者应当按照经历HSCT的受试者的标准实践用浓厚RBC和血小板输注来支持。

在药品输注后的24个月随访期间，建议受试者对于Hb≤7g/dL和需要输血的临床症状接受浓厚RBC。所有输血的原因都应记录。对于Hb≥9g/dL，应避免输血，除非认为临床上重要(例如，手术)。

所有血液制品都将按照医院指南进行过滤和照射。

铁螯合

螯合必须在开始用白消安进行清髓性调理之前至少7天中断。地拉罗司(Deferasirox)是一个例外，其应在调理前至少30天停止(由于潜在的药物间相互作用)。如果停止地拉罗司，则在白消安调理前可使用不同的螯合剂长达7天。

与地拉罗司、去铁胺或去铁酮的铁螯合应该直到CTX001输注后至少1个月才开始，以允许稳定的造血恢复并避免潜在的骨髓抑制作用。应该定期评价受试者以确定是否需要螯合。当按照机构指南选择初始剂量、逐步增加和中断规则时，应当根据输血要求和铁超载水平施用螯合剂。

中断铁螯合的潜在原因是：

·血清铁蛋白＜1000μg/L

·LIC＜7mg/g

·不需要输血且能够进行作为铁螯合的替代的放血术

对于Hb持续地≥11g/dL且输血独立的受试者，可以用放血术代替螯合。

禁用药物

G-CSF不应该在CTX001输注后施用，除非与医学监测者讨论并经其同意。这是由于假设问题：早期G-CSF施用将优先驱使编辑的重新输注的CD34+细胞分化成髓系，而不是红细胞系。避免在CTX001输注后施用G-CSF可以允许CD34+细胞在所有谱系中完全成熟。应密切监测受试者，并且如果CTX001输注后+21天未发生中性粒细胞植入，则研究者可联系医学监测者来讨论G-CSF的潜在起始。

动员

在开始动员之前，每个受试者将由有单采经验的医师检查，并被认为适于按照表1和现场标准工序进行动员和单采。不合格的实例包括血液动力学不稳定性、阳性感染性血清学或活动性感染。

动员将包括非格司亭和普乐沙福的组合。每12小时以5μg/kg/剂的剂量皮下施用非格司亭，持续5-6天。剂量将基于在动员第一天的5天内称出的体重。脾切除的受试者应每24小时接受5μg/kg的较低剂量的G-CSF，持续5-6天，以防止显著的白细胞增多。

在受试者已经接受G-CSF 4天后，将施用普乐沙福。普乐沙福将通过皮下注射施用；推荐剂量为0.24mg/kg，在计划的单采前大约5-7小时施用。剂量也将基于动员的第一天前5天内称出的重量。对于全剂量方案，参见表1。

在针对白细胞增多使用非格司亭的第一、第四和第五天测量全血计数(CBC)，并在存在显著的白细胞增多(例如，＞70×10⁹/L)的情况下将基于本地实践调整剂量。外周血中的CD34⁺细胞计数将在单采前的早晨进行。可以按照现场标准操作工序(SOP)进行额外的CD34⁺细胞计数和CBC。

表1.动员和单采时机

^a只有在第7天经历单采的受试者在第6天(或在第7天计划的单采之前7±2小时)将接受普乐沙福。

^b仅保留第三天的单采用于收集备用细胞。那天不应收集用于生产的细胞。

单采工序

将按照临床现场SOP收集PBMC长达3天。在单采的第一天和第二天收集CD34+细胞用于产品制造的最低目标是15×10⁶个CD34+细胞/千克。在单采的第三天，将不收集用于生产的细胞。这些细胞将被运送到中心制造设备用于药品制造。

在单采的第三天将收集目标为2×10⁶个CD34+细胞/千克的备用细胞。备用细胞也可以在单采的第二天收集，但仅在有足够的细胞可用于运送到制造设备之后。在未植入的情况下，收集备用细胞作为安全工序。备用细胞将被冷冻保存并储存在治疗场所。这在进行到阶段3(白消安调理)之前发生。

如果第一动员和单采周期没有产生足够的细胞用于最低限度的药品和安全备用两者，则将在2-6周后进行第二动员周期。

调理：白消安施用

一旦在现场接受药品，就应该开始白消安调理，并且已经证实地中海贫血基因分型的结果(α和HBB基因座)。白消安将以3.2mg/kg/天的起始剂量每日静脉内施用，连续4天(基于在白消安施用第一天前3-7天内收集的体重)。每日一次给药是优选的方案，但可以将白消安的给药方案调整至按照现场标准实践Q6H进行。

白消安的剂量将基于第一剂量白消安PK进行调整以维持适当的骨髓清除水平。以3.2mg/kg/天的起始剂量持续4天的受试者的平均目标AUC为5000μM*min(范围：4500μM*min至5500μM*min)；相当于90mg×hr/L的目标累积白消安暴露[范围80100mg×hr/L])。持续4天Q6H施用白消安的受试者的AUC为1125μM*min(范围：900μM*min至1350μM*min)。

测试剂量的白消安可以在开始骨髓清除之前3-7天进行，以预先确定可以进行的白消安剂量。按照研究者的判断允许进行去纤苷预防。在白消安调理期间，应当按照医院指南制定癫痫发作预防和其他支持措施。

药品输注

在最后的白消安剂量后至少48小时且7天内给予单剂量的药品。药品小瓶应当在利用本地现场SOP的预定输注之前解冻，并在解冻的20分钟内输注。

受试者将在第1天通过中心静脉导管以≥3.0×10⁶个CD34+细胞/千克的剂量输注接受该药品。所有含有药品的小瓶都将被输注。

所有涉及药品的工序都应该由受过训练的人员根据临床现场的SOP使用无菌技术来进行。

主要功效端点分析

这种药品是一种细胞产品，其被开发具体地用于增加红细胞中HbF的产生。通过测量外周血中的HbF水平，将直接评估施用药品的预期结果。

主要功效端点是“在药品输注后9至24个月时间期间，受试者实现输注减少持续至少6个月(TR6)的比例”。

次要功效端点的分析

·从药品输注后3个月开始，实现不需要输血持续至少6个月(TI6)的受试者的比例。

·从药品输注后3个月开始，实现不需要输血持续至少12个月(TR12)的受试者的比例。

·从药品输注后3个月开始，实现输注减少持续至少12个月(TI12)的受试者的比例。

·外周血白细胞中存在的具有预期遗传修饰的等位基因随时间的比例。预期的遗传修饰是修饰BCL11A的内含子2中红细胞特异性增强子的序列的***缺失

·骨髓细胞中存在的具有预期遗传修饰的等位基因随时间的比例

·胎儿血红蛋白浓度(输血前)随时间的变化

·使用EuroQol调查问卷-5维-5级严重程度(EQ-5D-5L)得到的健康相关生活质量(HRQoL)随时间自基线的变化

·使用癌症疗法的功能评估-骨髓移植问卷(FACT-BMT)的HRQoL随时间自基线的变化

·铁超载参数的变化，包括：

ο如通过T2*磁共振成像(MRI)评估的自基线的肝脏铁浓度(LIC)和心脏铁含量(CIC)

ο血清铁蛋白水平随时间自基线的变化

·接受铁螯合疗法的受试者随时间的比例

探索性端点的分析

·表达胎儿血红蛋白(F细胞)的循环红细胞的比例随时间自基线(输血前)的变化

·循环网织红细胞中α-珠蛋白和非α-珠蛋白mRNA随时间的表达

·***(EPO)浓度随时间的变化

·铁调素浓度随时间的变化

·与基线相比，骨髓分析中随时间推移的红细胞生成的评估

安全性分析

植入的受试者的比例。植入被定义为连续三天绝对中性粒细胞计数(ANC)≥500/μL。植入失败定义为任何受试者在药品输注后第+42天或如果利用备用的未修饰的CD34+细胞都没有实现中性粒细胞植入。单独地，还将分析血小板植入。

·植入的时间

·如由国家癌症研究所(NCI)关于不良事件的通用术语标准(CTCAE)v4.03所评估，从签署知情同意至第24个月访问，收集的AE的频率和严重程度。

·在药品输注后100天和1年时移植相关死亡(TRM)的发生率。TRM定义为可能与移植手术相关的死亡。

·全因死亡率

药品输注后感染预防和监视

在药品输注后，受试者可以按照HSCT的本地指南和研究者判断进行感染监视和预防(细菌、病毒、真菌)。

如果药品输注后受试者出现脓毒症或全身性菌血症，则将起始适当的培养和医疗管理。

患者报告结果

PRO评估应当作为获得知情同意后的第一次评估进行，并且在任何评估前由受试者在研究访问开始时完成。

实施例3.评价单剂量自体CRISPR-Cas9修饰的CD34+人造血干细胞和祖细胞在患有严重镰状细胞病的受试者中的安全性和功效的研究

进行1/2期安全性和功效研究，以评价单剂量自体CRISPR-Cas9修饰的CD34+人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)(药品)在患有输血严重镰状细胞病(SCD)的受试者中的安全性和功效(主要目的)。评估药品输注对疾病特异性事件和临床状态的影响，并且量化基因编辑效率(次要目的)。此外，还评估了生物标志物表征药品效果和预测治疗结果的能力(探索性目的)。这种研究最初将包括至多12名参加研究的受试者，可能扩展至45名或更多名受试者。参加研究的受试者是18至35岁(包括知情同意之时)，具有记载的βS/βS基因型，患有严重SCD。这种研究可以扩展到儿科群体(例如，小于18岁)。

严重SCD定义为如由研究者所判断在筛选前2年期间在接受适当支持性护理(例如，疼痛治疗计划，如果有指示，HU)的同时每年发生至少2次以下事件：

·需要到医疗机构就诊并施用疼痛药物(阿片样物质或静脉内[IV]非甾体抗炎药[NSAID])或RBC输血的急性疼痛事件

·急性胸部综合征，如由与肺炎样症状、疼痛或发热相关的新的肺浸润的存在所指示

·***异常***持续＞2小时

·脾隔离症

作为研究初始阶段的安全措施，前2名受试者将以交错方式用药品治疗，以确保在研究中治疗第二名受试者之前第一名受试者已经成功植入。直到第一受试者实现中性粒细胞植入(绝对中性粒细胞计数[ANC]≥500/μL持续连续3天)，数据监测委员会(DMC)已经审阅了可利用的植入和安全性数据，并且在向第一受试者输注药品后至少30天，第二受试者才进行骨髓清除。一旦第二受试者已经实现中性粒细胞植入并且不具有除通常与白消安调理或自体移植手术相关的不良事件以外的≥3级的AE，其余受试者就可以同时进行调理和药品输注。如果输注药品的第二受试者经历除通常与白消安调理或自体移植手术相关的不良事件以外的≥3级的AE，则在其余受试者可以进行调理和药品输注之前，将召开DMC会议并检查数据。可以同时进行进行白消安骨髓清除之前的所有步骤，诸如同意、筛选和干细胞收集，而不使受试者交错。

将研究扩展到包括总共多达45名受试者的决定将基于在至少6名受试者已经接受药品输注之后经主办者与DMC和指导委员会(SC)协商对可用安全性和功效数据的评审。

对于每个受试者，研究将以4个阶段进行，其描述如下。将要求所有输注药品的受试者参加额外的长期追踪研究。

示例纳入标准

受试者必须满足所有下列纳入标准以符合入选研究的条件：

11.受试者将签署知情同意书(ICF)并记录日期。

12.受试者18至35岁，包括知情同意之日在内。

13.记载的βS/βS基因型。受试者可以基于历史βS/βS基因型结果入选，但在白消安调理前需要确认基因型。

14.受试者患有严重的SCD。

15.Karnofsky体力状态≥80％。

16.按照研究者的判断，符合自体干细胞移植的条件。

17.具有生育潜力(经产后，具有完整的子宫和至少1个卵巢，并且绝经后小于1年)的女性受试者必须同意从同意到输注药品后至少6个月使用可接受的避孕方法。

18.男性受试者必须同意从开始动员到输注药品后至少6个月使用有效的避孕

19.愿意并能够遵守预定的访问、治疗计划、实验室测试、避孕指南和其他研究工序。

20.在完成所述研究后愿意参与额外的长期随访研究。

示例排除标准

符合任何下列标准的受试者都不符合入选条件：

20.可获得的10/10人白细胞抗原(HLA)-匹配的相关供体。

21.先前的HSCT。

22.如研究者所确定的临床显著和活性的细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。

23.白细胞(WBC)计数＜3×10⁹/L或血小板计数＜50×10⁹/L，与按照研究者判断的超脾功能无关。

24.据研究者的看法，植入后不能中断用常规RBC输血进行治疗。

25.受试者具有RBC抗原同种异体免疫史，并且研究者预期在研究期间其RBC单位不足。

26.在筛选前的1年内，超过10次与SCD相关的非计划住院治疗或急诊部就诊。

27.HbF水平＞15.0％，与HbF诱导治疗如HU的伴随治疗无关。

28.未治疗的莫亚哥疾病史或者在筛选时存在据研究者的看法使受试者处于出血风险之中的莫亚哥疾病。

29.显著出血病症史。

30.据研究者的看法可能混淆研究结果或对受试者造成额外风险的任何疾病或任何临床病况史。这可以包括但不限于：相关药物过敏史；心血管或中枢神经系统病史；临床显著病理的历史或存在；精神病史或家族性癌症综合征史。

31.任何先前或当前的恶性肿瘤或骨髓增生性病症或显著的免疫缺陷病症。

32.晚期肝病，定义为

a.丙氨酸转氨酶(ALT)＞3×正常上限(ULN)或直接胆红素值＞2×ULN，或

b.基线凝血酶原时间(PT)(国际标准化比[INR])＞1.5×ULN，或

c.肝硬化史或任何桥接纤维化证据，或肝活检物上的活动性肝炎

33.基线估计的肾小球滤过率＜60mL/min/1.73m²。

34.一氧化碳肺弥散量(DLco)＜预测值的50％(对血红蛋白和/或肺泡体积校正)。

35.通过超声心动图测定，左心室射血分数(LVEF)＜45％。

36.用基因疗法/编辑产物进行的现有治疗。

37.不耐性、禁忌症或已知对普乐沙福或白消安的敏感性。与药品的赋形剂(二甲亚砜[DMSO]，葡聚糖)的现有过敏反应。

38.人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)或人免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)(乙型肝炎核心抗体[HBcAb]或核酸测试[NAT])或丙型肝炎病毒(HCV)(NAT)的阳性血清学。如由本地测试细胞加工所需的梅毒或任何其他传染病标志物的阳性血清学。

39.参与在筛选30天或小于研究试剂的5倍半衰期(无论是否长于筛选)内用研究药物/产品进行的另一临床研究。

40.如研究者所判断受试者不能遵守方案中概述的研究工序。

41.怀孕或哺乳的女性。

所述药品包括通过静脉内(IV)输注施用的在BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子处用CRISPR-Cas9修饰的自体CD34+ hHSPC。

这是在患有严重SCD的受试者中的单臂、开放标记、多位点、单剂量、1/2期研究。所述研究将评价单剂量自体CRISPR-Cas9修饰的hHSPC(药品)的安全性和功效，并且将包括多达12名18至35岁(包括端值)的受试者。所述研究可以扩展到包括总共45名或更多名受试者。所述研究还可以包括儿科群体。

整个过程与恶性疾病患者中自体HSCT所用的工序一致，除了下面描述的一些例外。因此，预期与本研究中的工序相关的风险不会与这些工序的标准风险显著不同。

预防性RBC输血(简单或交换)将在通过药品输注动员前8(±2)周开始施用，以降低动员和白消安调理期间VOC的风险。这种输血指导的原理源于证明以下的证据：通过简单或交换技术将非镰状RBC输注给SCD患者可以减轻生理并发症，诸如中风³¹、外科手术后与疾病相关的并发症³²、ACS³³和VOC³⁴。用于SCD患者的干细胞移植方案通常涉及交换输血，以在动员和调理之前降低HbS到＜30％。

动员后，在单独用普乐沙福的情况下将通过单采收集CD34⁺干细胞。通过单采而不是骨髓收获来收集干细胞使得CD34⁺细胞的分离更容易，因为这个过程对患者的侵入性较小并且不需要全身麻醉。单独使用普乐沙福代替普乐沙福与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)组合(这是用于收集的标准方案)的决定来自施用G-CSF可以在患有SCD的受试者中诱导严重的VOC(这可能是致命的)的事实。健康受试者和血红蛋白病受试者的研究数据表明，单独的普乐沙福可以有效动员CD34⁺细胞。这些研究还表明，当在同种异体HSCT的情况下施用时，在健康受试者中单独使用普乐沙福收集的CD34⁺细胞成功植入。此外，一项描述在患有严重SCD的受试者中单独用普乐沙福进行干细胞动员的小型研究报道了在单次单采后收集到中值为10.4×10⁶个CD34⁺细胞/千克(5.1至20.0)。然而，尽管在前2个月施用RBC输血，7名受试者中的3名还是发生了非严重性疼痛危机。不能成功地收集目标数量的CD34⁺细胞是本研究的停止标准之一。

将单独使用白消安进行调理。对于异基因干细胞移植，白消安通常与环磷酰胺或氟达拉滨组合，因为这种组合提供骨髓清除和免疫抑制两者。对于自体移植，如在使用所述药品的临床研究中，不需要免疫抑制来预防GvHD，并且单一试剂白消安将主要提供清髓性作用。使用白消安调理的方案已经用于SCD的同种异体移植中，并且已经产生成功植入、较少的治疗相关的并发症和稳定的供体嵌合性。此外，其他基因疗法研究已经成功地将白消安单独用于疾病领域如β-地中海贫血、SCD和由于腺苷脱氨酶缺乏引起的严重联合免疫缺陷的调理。

由于药品的施用是自体工序，因此不需要GvHD的预防性治疗。

所述研究将以4个阶段进行：

阶段1：筛选和前动员期

在此期间，符合纳入标准的受试者具有通过冷冻保存***或***来进行生育力保存的选择。在确认符合条件后，受试者将在计划开始动员前8(±2)周开始RBC输血(简单或交换)，并将继续接受这些输血直至他们开始白消安调理。这些RBC输血的目标是靶向血红蛋白S(HbS)水平小于总Hb的30％，同时保持总Hb浓度≤11g/dL。在计划动员之前至少6周应停止用HU治疗。

阶段2：动员、自体CD34⁺干细胞收集、药品制造和处置

每个受试者将经历仅用普乐沙福进行的干细胞动员。通过单采收集外周血单核细胞(PBMC)。在第1天，受试者将在计划的单采前7(±2)小时接受普乐沙福。受试者将连续2或3天进行单采以收集CD34⁺ hHSPC。用于制造药品的靶向CD34⁺细胞收集量为至少15×10⁶个CD34⁺细胞/千克，以实现3×10⁶个CD34⁺细胞/千克的最小靶剂量。在用药品未实现植入的情况下，将收集额外的2×10⁶个CD34⁺细胞/千克作为备用用于拯救疗法。如果第一次动员和单采周期没有产生足够的细胞用于最低限度的药品和安全备用两者，或者如果受试者不能完成单采，则将允许多达2次的额外动员和单采周期来收集额外的细胞。额外的动员周期将在前一动员周期的第一天之后至少14天且在前一周期结束之后不超过60天起始。

阶段3：清髓性调理(阶段3A)和药品输注(第1天，阶段3B)

阶段3A-清髓性调理：在药品制造期间和在计划开始白消安调理之前，受试者将继续接受简单或交换RBC输血，目标是维持HbS水平小于总Hb的30％，同时保持总Hb浓度≤11g/dL。

如果计划的白消安调理的开始是在动员完成后＞4个月，则研究者可以停止RBC输血方案，并对先前用HU治疗的那些受试者重新开始施用HU。如果中断RBC输血方案，则受试者应在计划开始白消安调理之前8(±2)周开始RBC输血(简单或交换)，目标是维持HbS水平小于总Hb的30％，同时保持总Hb浓度≤11g/dL。如果在计划开始白消安调理之前7(±3)天内HbS水平大于总Hb的30％，则受试者将接受1次交换输血，目标是确保HbS水平在开始白消安调理之前小于30％。

在现场接受药品并且已经确认备用细胞仍然可用并且如果需要将在可接受的条件下施用之后，受试者将接受白消安。白消安的起始剂量将是3.2mg/kg，每天一次静脉内施用，连续4天。然而，按照现场标准实践，白消安可以以0.8mg/kg每6小时(Q6h)施用，连续4天。

阶段3B-药品输注：在白消安输注完成后最少48小时且在白消安输注完成后最多7天将进行药品的输注。

在第1天，将全部剂量(所有小瓶)的药品解冻并通过中心静脉导管施用。

阶段4：进行随访直至植入以及药品输注后长达2年

阶段4A-输注后医院内随访：在移植中心将每天监测受试者，并根据进行造血干细胞移植(HSCT)的受试者的标准实践接受支持性护理。

阶段4B-植入后随访：在从移植中心出院后，在药品输注后，受试者将被追踪大约2年。

阶段1的持续时间将为大约2至4个月；阶段2的持续时间将为大约2至4个月；阶段3的持续时间将为大约1个月；阶段4的持续时间将为大约2年。研究中受试者在药品输注后将被追踪总共大约2年。另外，将要求所有输注药品的受试者在完成或退出/中止后参加长期的追踪研究。

将进行以下评估：用于功效评估的HbF水平、VOC事件、RBC输血、具有预期遗传修饰的等位基因和PRO；用于安全性评估的植入、TRM、临床实验室评估、生命体征、身高、体重、ECG和体格检查(PE)；和用于探索性评估的溶血实验室评估、TRV、炎性标志物和内皮激活标志物、F细胞分布。

输注工序、剂量和施用

用于各种适应症的自体移植通常使用至少2至2.5×10⁶个CD34⁺细胞/千克以支持植入。为了确保在SCD研究中所有受试者的植入，选择3×10⁶个CD34⁺细胞/千克的保守最小剂量，其比自体移植的典型最小剂量高20％至50％。原则上，骨髓清除后输注更高数量的CD34⁺干细胞与更快的植入、耐久性和治疗功效相关。

药品将在含有5％DMSO和右旋糖酐40的CS5培养基中配制。与DMSO相关的组胺释放可以导致诸如以下的症状：副作用，包括恶心、呕吐、腹泻、面红、发烧、寒战、头痛、呼吸困难、皮疹、支气管痉挛、过敏反应、血管舒张和低血压，以及精神状态改变。考虑到这些AE的风险，在服用药品之前，将对受试者预先用抗组胺药(盐酸苯海拉明)和解热药(对乙酰氨基酚或对乙酰氨基酚)。按照机构指南和调查者判断，根据需要，这些药物可以每3-4小时重复一次。

在最后的白消安剂量后的至少48小时且7天内将给予单剂量的药品。药品小瓶应当按照本地现场SOP在预定的输注之前解冻。全部剂量的药品应该在解冻的20分钟内输注。解冻和输注细胞的详细说明在研究参考手册中。医院指南将用于维持药品从干细胞实验室到受试者的监管链。在输注之前，应当遵循关于受试者身份和产品细节的验证的本地工序，以确保产品的匹配以及完整性。

受试者将在第1天通过中心静脉导管输注来接受药品。所有含有药品的小瓶都将被输注。

所有涉及药品的工序都必须由受过训练的人员根据临床现场的SOP使用无菌技术来进行。

在最后一次白消安剂量后7天内不进行药品输注的不太可能的情况下，受试者应接受备用CD34+干细胞。

研究持续时间

研究中受试者在药品输注后将被追踪2年。认为2年的随访持续时间足以表征临床结果。因为该研究将入选在筛选前的2年期间每年具有至少2次严重VOC事件的受试者，所以2年随访将允许对VOC年发生率的降低进行有意义的评估。

另外，将要求所有输注药品的受试者在完成或退出/中止后参加长达15年的长期追踪研究。这是为了确保捕获与药品相关的任何潜在的长期AE，并评价长期治疗结果以及提供对功效的更久追踪。

现有药物

将记录在筛选的30天内服用的所有药物。

将记录从同意研究筛选之日之前的24个月关于RBC输血的回顾性信息。

静脉通路

将使用中心静脉导管进行调理方案的施用和药品的输注。中心静脉导管也可用于单采、交换输血，以及按照研究者判断用于在药品输注之后受试者的临床护理。

禁用药物

HU：在计划开始动员之前至少6周应停止用羟基脲(HU)治疗。如果研究者认为需要以及如果计划在动员完成和白消安调理开始之间＞4个月，则在动员和单采之后，受试者可以重新开始施用HU。如果重新开始施用HU，一旦白消安调理之前重新开始RBC输血，则应该停止用HU治疗。

在药品输注之后，一旦实现了植入，如果受试者经历VOC或由研究者判断为与SCD相关并担保HU的重新起始的其他并发症，则可以重新开始施用HU。如果重新开始施用HU，如果认为医学上可接受且如果HbF≥20％，则建议逐渐减少HU。

L-谷氨酰胺：在药品输注后，应该停止用L-谷氨酰胺治疗。

HbF诱导剂(除HU之外)：用任何HbF诱导治疗进行的治疗都应在药品输注后停止。

动员

将由有单采经验的护士或医生决定是否需要中心线来进行动员。将仅使用普乐沙福进行动员。不应施用G-CSF。

在计划的单采前7(±2)小时，受试者将通过皮下注射接受0.24mg/kg剂量的普乐沙福。将使用在动员第一天之前5天内称出的体重来计算推荐剂量。对于全剂量方案，参见表2。

表2.动员和单采时机

^a只有在第3天经历单采的受试者应在第3天接受普乐沙福

^b仅保留第三天的单采用于收集备用细胞。那天不应收集用于生产的细胞。

单采工序

将按照临床现场标准操作工序(SOP)收集PBMC长达连续3天。用于制造药品的靶向CD34⁺细胞收集量为至少15×10⁶个CD34⁺细胞/千克。如果可能，则可以稍后研究较低的收集目标。在用药品未实现植入的情况下，将收集额外的2×10⁶个CD34⁺细胞/千克作为备用用于拯救疗法。备用细胞的收集必须在进行到阶段3(白消安调理)之前进行。

如果第一次动员和单采周期没有产生足够的细胞用于最低限度的药品和安全备用两者，或者如果受试者由于VOC而不能完成单采，则将允许两次的额外动员和单采周期来收集额外的细胞。

额外的动员周期应在前一动员周期的第一天之后至少14天且在前一周期结束之后不超过60天起始。基于制造现场接受的CD34⁺细胞的数量和制造的药品剂量，如果需要额外的动员周期，则医疗监测器将通知临床现场。如果没有达到用于制造或备用的最小细胞剂量或者如果受试者需要额外的动员周期，则研究者应当联系医疗监测器。

与单采工序相关的任何AE都应该按照场所的标准指南进行管理。

应该在第一和第二收集日结束时运送细胞。将为备用剂量而收集的细胞冷冻保存并储存在研究现场。关于运送和接收的额外细节和说明包括在研究参考手册中。

调理：白消安施用

白消安将以3.2mg/kg/天的起始剂量每日静脉内施用，连续4天(基于在白消安施用第一天前3至7天内收集的体重)。每日一次给药是优选的方案，但可以将白消安的给药方案调整至按照现场标准实践q6h进行。测试剂量的白消安可以在开始骨髓清除之前30(±)2天进行，以预先确定白消安剂量。

白消安的剂量可以基于第一白消安剂量的PK进行调整以维持适当的骨髓清除水平。以3.2mg/kg/天的起始剂量持续4天的受试者的平均目标AUC为5000μM·min(范围：4500μM·min至5500μM·min)；相当于目标累积白消安暴露量为90mg·hr/L(范围80100mg·hr/L)。持续4天q6h施用白消安的受试者的AUC为1125μM·min(范围：900μM·min至1350μM·min)。

在白消安调理期间，应当按照医院指南制定抗癫痫预防和其他支持措施。

药品输注

药品将在输注瓶中供应。所有含有药品的小瓶都将被输注。另外的描述提供在参考手册中。

主要功效端点分析

这种药品是一种细胞产品，其被开发具体地用于增加红细胞中HbF的产生。通过测量外周血中的HbF水平，将直接评估施用药品的预期结果。

主要功效端点为“在不用HU治疗的情况下，在药品输注后6个月开始，HbF≥20％持续至少3个月”。如果在没有用HU治疗的情况下分析时，在药品输注后6个月开始，受试者的HbF水平≥20％将持续至少3个月，则认为该受试者已经达到主要功效端点。

主要基于CSSCD和MSH数据的重新分析，选择20％的HbF阈值作为主要端点。这些分析表明疼痛危机的相对风险与HbF水平之间的反向关系，其中HbF水平≥20％时，疼痛危机风险极低。特别地，回归模型基于CSSCD数据预测在20％的HbF浓度下VOC风险降低87.3％(与0％的HbF浓度相比)(95％CI：83.0％，91.5％)，并且基于MSH数据预测VOC风险降低81.5％(95％CI：70.5％，92.5％)。

2项观察研究也支持20％的阈值，这些研究分析了HbF水平与SCD有关事件之间的关系，以便找到将指导用HU进行治疗的阈值。在272名未接受HU的成人中进行的历史研究中，较高的HbF水平与较少的并发症相关，并且作者得出的结论是需要达到20％的HbF水平以提供有意义的临床益处。在对230名患有SCD并用HU治疗的儿童中进行的更近期的前瞻性研究(羟基脲的长期作用研究，HUSTLE)中，当HbF值＜20％时，儿童由于任何原因(包括血管闭塞性疼痛和急性胸部综合征)而住院的几率为两倍，并且发热几率为4倍以上。作者得出的结论是他们的数据表明优选的给药策略是靶向HbF＞20％的给药策略。

次要功效端点的分析

将计算每个受试者的严重VOC的年率自基线的相对变化，并加以概括。

·将在相应精确的95％CI下提供在药品输注后严重VOC的年率自基线降低至少50％的受试者的比例。

·将在相应精确的95％CI下提供在药品输注后严重VOC的年率自基线降低至少65％的受试者的比例。

·将在相应精确的95％CI下提供实现无VOC事件的受试者的比例。

·将概括严重VOC住院的年持续时间自基线的相对变化。

·将在精确的95％CI下提供在分析时在药品输注后3个月开始实现HbF≥20％持续至少3个月的受试者的比例。

·将在精确的95％CI下提供在分析时在药品输注时开始实现HbF≥20％持续至少3个月的受试者的比例。

·HbF和Hb浓度将被概括为随时间的连续变量。

·将概括对于SCD有关迹象输血RBC的单位数的相对变化。

·PRO的变化将被概括为随时间的连续变量。

·外周血白细胞中存在的具有预期遗传修饰的等位基因的比例将被概括为随时间的连续变量。

·骨髓细胞中存在的具有预期遗传修饰的等位基因的比例将被概括为随时间的连续变量。

探索性端点的分析

·如通过4种溶血标志物(网织红细胞计数、AST的血清浓度、LDH和总胆红素)的主要组分分析所测量的溶血指数的变化将被概括为随时间的连续变量。

·TRV的变化将被概括为随时间的连续变量。

·表达F细胞的循环红细胞的比例的变化将被概括为随时间的连续变量。

·炎性标志物的变化将被概括为随时间的连续变量。

·内皮激活标志物的变化将被概括为随时间的连续变量。

安全性分析

将根据MedDRA编码AE。

基于安全性分析组的分析将包括：

·在药品输注后的42天内具有中性粒细胞植入的受试者的比例

·中性粒细胞植入的时间

·血小板植入的时间

·自签署知情同意书至第24个月访问的AE、实验室值和生命体征。

·在药品输注后100天和1年内TRM的发病率。TRM定义为如由研究者所评估的可能与移植手术有关的死亡。

·全因死亡率

将根据下列时间段，以表格形式以严重程度和严重性概括具有AE和治疗紧急AE的受试者的数量和百分比：ICF签署至动员开始，动员至白消安调理开始，白消安调理至药品输注开始，以及药品输注至输注后24个月。

将通过卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)方法分析中性粒细胞植入的时间，中性粒细胞植入的时间定义为自植入起连续3天ANC≥500/μL的第一天。植入失败定义为药品输注后第42天或接受备用干细胞没有实现中性粒细胞植入。将概括植入失败的受试者的数量和百分比。

将通过卡普兰-梅尔方法评估血小板植入的时间，血小板植入的时间定义为在过去7天中没有输血的情况下血小板≥20,000/μL的最初连续3天。

还将对实验室异常值(正常范围外的值，并且根据不良事件的常用术语标准[CTCAE]等级)制表。

将概括在药品输注后100天和1年内TRM的受试者的数量和百分比，其中TRM定义为如由研究者所评估的至少可能与移植手术有关的死亡。将由研究者评估导致死亡的SAE与移植之间的相关性。如果SAE被评估为至少可能与移植手术有关，则该死亡将被归类为移植有关。

统计分析

所述研究最初将入选多达12名受试者以提供对药品的安全性和功效的初步评价。所述研究可以扩展到包括总共多达45名受试者。在分析时，当在药品输注后HbF≥20％持续至少3个月的真实反应率为75％时，该扩展的样本量将提供至少90％的功率以排除50％的反应率。

在扩展研究中将使用具有2个期中分析(IA)的组顺序测试法，以允许早期评价强悍的功效。

将在精确的95％CI下提供在分析时在药品输注后6个月开始实现HbF≥20％持续至少3个月的受试者的比例。

将概括关键的次要功效端点、严重VOC的年率自基线的相对变化。

连续变量将使用以下描述性概括统计来概括：受试者数(n)、平均值、SD、中值、最小值(min)和最大值(max)。

分类变量将使用计数和百分比概括。百分比将表示为小数点后1位。

估计的不确定性将通过CI评估。所有的受试者数据将呈现在受试者数据列表中；列表将展示入选群体中的所有受试者，而不管他们是否接受研究药物。纵向数据将根据数据的性质以适当的时间间隔如每月或每季度呈现。

除非另有说明，否则基线值将被定义为在筛选期间和动员开始之前收集的最近的非缺失测量结果(预定的或非预定的)。

对于严重VOC事件的数目：治疗前基线定义为入选之前2年期间平均年化严重VOC事件。基线将使用在ICF签署之前2年期间所有严重VOC事件的记录来计算。

将捕获药品输注后直至研究结束(第24个月)发生的所有严重VOC事件作为药品后严重VOC事件。所有药品输注前和药品输注后严重VOC事件都将由EAC判定，并且将仅包括与潜在SCD有关而与急性并发事件如急性出血或感染无关的严重VOC事件用于评价VOC的年率自基线的变化。

将自基线的变化(绝对变化)计算为基线后值-基线值。

将自基线的相对变化计算并以百分比表示为100％×(基线后值-基线值)/基线值。

治疗紧急(TE)期将包括从药品输注到最后一次研究访问的时间。

药品输注后感染预防和监视

在药品输注后，受试者可以按照HSCT的本地指南和研究者判断进行感染监视和预防(细菌、病毒、真菌)。

如果药品输注后受试者出现脓毒症或全身性菌血症，则将起始适当的培养和医疗管理。

患者报告结果

PRO评估应当作为获得知情同意后的第一次评估进行，并且在任何评估前由受试者在研究访问开始时完成。

关于说明性实施例的注释

尽管出于说明本发明的各个方面和/或其潜在应用的目的，本公开提供了各种具体方面的描述，但应理解，本领域的技术人员将想到变化和修改。因此，本文所述的发明应当被理解为至少与它们要求保护的一样广泛，而不是由本文提供的特定说明性方面更狭义地限定。

除非另有说明，否则本文中识别的任何专利、出版物或其他公开材料通过引用整体并入本说明书中，但仅仅在并入的材料不与现有的描述、定义、表述或本说明书明确阐述的其他公开材料发生冲突的程度上并入。因此，并且在必要的程度上，如本说明书中阐述的明确公开内容取代通过引用并入的任何冲突材料。任何材料或其一部分(据说通过引用并入本说明书中，但与现有定义、表述或本文所阐述的其他公开材料冲突)仅仅在并入的材料与现有的公开材料之间无冲突发生的程度上并入。申请人保留修改本说明书以明确地叙述通过引用并入本文的任何主题或其部分的权利。

术语“包含(comprising)”或“包含(comprise)”用于指对本发明必需的组合物、方法和其各自的组分，但是敞开式包括未指明的要素，而无论是否是必需的。

术语“基本上由......组成”是指给定方面所需的那些要素。所述术语容许存在不会实质上影响本发明的这一方面的基本和新颖或功能特征的其他要素。

术语“由......组成”是指如本文所述的组合物、方法和其各自的组分，其不包括在该方面的该描述中未列举的任何要素。

除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(种)”和“该”包括复数个(种)指示物。

本说明书中列举的任何数值范围都描述在所述范围内包含的相同数值精度(即，具有相同数量的指定数字)的所有子范围。例如，所述的“1.0至10.0”范围描述在所述最小值1.0和所述最大值10.0之间(并且包括端值)的所有子范围，例如，“2.4至7.6”，即使“2.4至7.6”的范围未在本说明书的文本中明确叙述。因此，申请人保留修改本说明书(包括权利要求书)的权利，以明确地叙述包含在本说明书中明确叙述的范围内的相同数值精度的任何子范围。所有这些范围都在本说明书中固有地描述，使得修改以明确地叙述任何这样的子范围将符合书面描述、描述的充分性和附加的物质要求，包括35U.S.C.§112(a)和第123条(2)EPC下的要求。此外，除非上下文明确指出或以其他方式要求，否则本说明书中描述的所有数值参数(诸如表达值、范围、量、百分比等的那些)可以被读作好像以词“约”为前缀，即使词“约”并没有明确地出现在一个数字之前。另外，本说明书中描述的数值参数应根据报告的有效数字的数量、数值精度且通过应用普通的舍入技术来解释。还应理解，本说明书中描述的数值参数必然具有用于确定参数的数值的基础测量技术的固有可变性特征。

还应理解的是，除非明确地相反指示，否则本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于所述方法的步骤或动作被叙述的顺序。

在权利要求书中以及上述说明书中，诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由...组成”等所有过渡性短语应该理解为是开放性的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查工序手册第2111.03节中所阐述，只有过渡短语“由......组成”和“基本上由...组成”分别是封闭式或半封闭式的过渡短语。

在数值之前的术语“约”和“基本上”是指±10％的所引用数值。

在提供值范围的情况下，本文具体考虑并描述了该范围的上端和下端之间的每个值。

序列表

<110> 沃泰克斯药物股份有限公司(Vertex Pharmaceuticals Incorporated)

<120> CRISPR-CAS9修饰的CD34+人血色素干细胞和祖细胞及其用途

<130> C1542.70041WO00

<150> US 62/594,689

<151> 2017-12-05

<150> US 62/671,770

<151> 2018-05-15

<150> US 62/734,431

<151> 2018-09-21

<150> US 62/734,543

<151> 2018-09-21

<150> US 62/664,023

<151> 2018-04-27

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 1

cuaacaguug cuuuuaucac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 2

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 修饰的sgRNA

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(3)

<223> 2'-O-甲基-硫代磷酸酯核苷酸

<220>

<221> modified_base

<222> (97)..(99)

<223> 2'-O-甲基-硫代磷酸酯核苷酸

<400> 2

cuaacaguug cuuuuaucac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> n是a、c、g或t

<400> 3

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nrg 23