阅读说明：本技术 抗药性免疫细胞及其使用方法 (Drug resistant immune cells and methods of use thereof ) 是由 M·J·奥斯本 K·L·西朋 B·R·布拉泽 于 2019-05-16 设计创作，主要内容包括：本公开提供了具有类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性的修饰的细胞,包括多潜能干细胞,造血前体细胞和造血细胞(例如,修饰的Treg)。本公开提供了用于生成类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性修饰的细胞,包括多潜能干细胞,造血前体细胞和造血细胞。还提供了治疗的组合物和方法。(The present disclosure provides modified cells, including pluripotent stem cells, hematopoietic precursor cells, and hematopoietic cells (e.g., modified tregs), having steroid-and/or calcineurin inhibitor resistance. The present disclosure provides cells, including pluripotent stem cells, hematopoietic precursor cells, and hematopoietic cells, for generating steroid and/or calcineurin inhibitor resistance modifications. Compositions and methods of treatment are also provided.)

具体实施方式

本发明提供了具有类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性的修饰型造血细胞或其前体细胞(例如，修饰型Treg)的组合物和方法。在一些实施方式中，修饰的细胞经基因编辑以破坏一种或多种内源性基因，所述内源性基因负责类固醇介导的细胞持久性和存活降低。在一些实施方式中，修饰的细胞经基因编辑以引入钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因。在某些实施方式中，本公开的修饰的细胞包含NR3C1基因座中的一个或多个插入缺失。在某些实施方式中，本公开的修饰的细胞包含NR3C1基因座中的一个或多个插入缺失，并且进一步包含在插入NR3C1基因座中一个或多个插入缺失中的钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因。

在一些实施方式中，提供的细胞、组合物和方法提供了持久性和/或存活增加。例如，本发明的Treg显示出持久性和/或存活增加。在临床环境中，类固醇和钙依赖磷酸酶抑制剂的给药表示对已进行例如同种异体细胞移植的个体的预防性治疗护理标准。调节T细胞的过继转移是减少同种异体细胞移植后负面影响的一种方法。本文发现类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂对Treg的持久性和存活产生负面影响。因此，在预防性治疗护理标准存在的情况下，本公开的修饰的细胞更持久且寿命更长。

应当理解的是，本公开中所述的方法不限于本文公开的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。也应该理解的是，本文使用的术语只是为描述具体实施方式，而不是起限制作用。

此外，除非另有说明，否则本文所述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。这类技术为本领域技术人员所熟知，并且在文献中有充分解释。参见例如，Ausubel，等编著，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，约翰威利父子出版公司(John Wiley＆Sons，Inc.)，纽约州纽约市(1987-2008)，包括其所有增补；MR Green和J.Sambrook的《分子克隆实验手册》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)(第4版本)；和Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，第14章，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory)，冷泉港(2013，第2版)。

A.定义

除非另有定义，本文所用的科技术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。存在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优先于任何词典或外部定义。除非另作说明，单数术语应包括复数含意，复数术语应包括单数含意。除非另有说明，使用“或”表示“和/或”。使用术语“包括”以及其它形式，如“包含”和“含有”不是限制性的。

通常，本文中细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学及杂交中使用的命名是本领域公知且常用的。除非另有说明，本文所提供的方法和技术总体上遵循如本领域熟知并如各种通识或专题参考文献中所述的常规方法进行，本说明书全文多处引用并论及此类参考文献。酶促反应和纯化技术按照生产商的说明书、按照本领域常规操作或按照本文所述来进行。本文所述分析化学、合成有机化学以及医学和药学化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且常用的。化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者采用标准技术。

为了更容易地理解本公开，下文定义了选择的术语。

本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。举例而言，“一种元件”表示一个元件或者一个以上的元件。

当述及可测量值如量、时间持续时间等时，本文所用“约”意在包括与特定值±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、并且更加优选±0.1％的变化，因为这样的变化进行所公开的方法是适宜的。

如本文所用，“减缓”疾病意指降低疾病的一种或多种症状的严重性。

如本文所用，术语“自体同源”旨在表示源自与其随后将被重新引入的个体的相同的个体的任何物质。

“疾病(disease)”是动物的健康状态，其中动物不能维持稳态，并且如果疾病没有得到改善，那么动物的健康继续恶化。相反，动物的“紊乱(disorder)”是这样一种健康状态，其中该动物能够维持稳态，但是该动物的健康状况不如不存在该紊乱时好。如果不进行治疗，紊乱不一定会导致动物健康状况进一步下降。

如本文所用，术语“下调”指减少或消除一种或多种基因的基因表达。

“有效量”或“治疗有效量”在本文可互换使用，并且指将有效实现特定生物学结果或提供治疗或预防益处的本文所述的化合物、制剂、物质或组合物的量。这类结果可以包括但不限于，相较于在不存在本发明的组合物中检测到的免疫反应，给予哺乳动物时引起可检测水平的免疫抑制或耐受性的量。可以通过多种本领域公认的方法容易地评估免疫应答。本领域技术人员将理解的是，本文给予的组合物的量是变化的，并且可以基于许多因素来容易地确定，诸如治疗的疾病或状况，治疗的哺乳动物的年龄和健康状况和身体状况，疾病的严重程度，给予的特定化合物等。

“编码”指多核苷酸中特定核苷酸序列(如基因、cDNA或mRNA)在作为合成生物过程中具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的其他多聚物和大分子的模板的固有特性以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，那么该基因编码蛋白质。编码链和非编码链可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物，所述编码链是与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列，而所述非编码链用作基因或cDNA转录的模板。

如本文所用，“内源性”指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。

如本文所用，术语“外源性”指由生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何物质。

本文所用术语“扩增”指数目增加，如细胞(例如，Treg)数目增加。在一个实施方式中，离体扩增的细胞的数量相对于培养物中原本存在的数量增加。在另一实施方式中，离体扩增的细胞的数量相对于培养物中其他细胞类型的数量增加。本文所用术语“离体”指已经从活生物体(例如，人)中移出并在该生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。

本文所用术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和纳入重组多核苷酸的病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用，术语“经遗传工程改造(的)”和“经遗传修饰(的)”可互换使用，并指经修饰而包含人工创制或修饰过的(例如，使用重组或基因编辑DNA技术)非天然产生的核酸分子或衍生自这类分子(例如，转录、翻译等)的非天然产生的核酸分子。包含外源、重组、合成和/或其他方式修饰的多核苷酸的细胞被认为是遗传修饰的细胞，因此相对于任何天然存在的对应物而言是非天然存在的。某些情形中，遗传修饰的细胞含有一种或多种重组核酸。另一些情形中，遗传修饰的细胞含有一种或多种合成的或经遗传工程化的核酸(例如，相对于其天然对应细胞含有至少一处人工插入、缺失、倒置或取代的核酸)。

本文所用“相同性”指两个多聚分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，如两个多肽分子之间的亚基序列相同性。当两个氨基酸序列在相同的位置具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子各自的位置上都被精氨酸占据，那么它们在该位置上是相同的。两个氨基酸序列在比对中的相同位置上具有相同残基的相同性或程度通常用百分比表示。两个氨基酸序列之间的相同性是匹配或相同位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个氨基酸的聚合物中的五个位置)相同，那么这两个序列为50％相同；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或相同，那么这两个氨基酸序列是90％相同。

本文所用术语“免疫应答/反应”定义为对抗原的细胞应答，其在淋巴细胞将抗原性分子鉴定为外来物并诱导抗体形成和/或激活淋巴细胞以去除抗原时发生。

术语“免疫抑制”或“免疫抑制性”在本文中用于指减少总体免疫应答/反应。

“插入/缺失”(通常缩写为“插入缺失(indel)”)是一种遗传多态性，其中基因组中存在(插入)或不存在(缺失)特定的核苷酸序列。

“分离(的)”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是由其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。

本文所用术语“敲减”指减少一种或多种基因的基因表达。

本文所用术语“敲除”指消除一种或多种基因的基因表达。

本文所用术语“慢病毒”指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体中最高效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的示例。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的方法。

本文所用术语“修饰(的)”指本发明的分子或细胞的状态或结构改变。可以多种方式修饰分子，包括化学、结构和功能上地修饰。可以通过引入核酸来修饰细胞。在某些实施方式中，经修饰的细胞可以是“(经)遗传修饰的”或“(经)基因编辑的”，其中所述细胞中的一个或多个核酸被改变。

如本文所用，述及术语“调节”意指相较于不存在治疗或化合物的对象中的反应水平和/或相较于其他相同但未经治疗的对象中的反应水平，介导对象中可检测的反应水平增加或降低。该术语包括干扰和/或影响天然信号或反应，从而介导对象(优选人)中有益的治疗反应。

在本发明的上下文中，对于常见的核酸碱基使用下述缩写。“A”指腺苷、“C”指胞苷、“G”指鸟苷、“T”指胸苷、“U”指尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此之间为简并形式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还包括内含子，从而使编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可以包含一个或多个内含子。

“肠胃外”给予免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。

本文所用术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有这样的常识，即核酸是多核苷酸，可以将其水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于，通过本领域可用的任何方法获得的所有核酸序列，包括但不限于，重组方法，即使用常规克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，以及通过合成方法。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语指两条短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物，也指长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，包括很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，同二聚体，异二聚体，多肽的变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所用，“多能性”指细胞分化形成身体(body)或胞体(soma)的所有谱系(即，胚体(embryo proper))的能力，包括所有三胚层(外胚层、内胚层和中胚层)细胞。

如本文所用，术语“多潜能干细胞”指能够持续自我更新并且能够在适当条件下分化为所有三个胚层细胞的细胞。多潜能干细胞(PSC)的实例包括胚胎干细胞(ESC)和诱导性多潜能干细胞(iPSC)。如本文所用，“胚胎干细胞”或“ESC”指源自囊胚内部细胞团的多潜能细胞或多潜能细胞群。参见例如，Thomson等Science 282：1145-1147(1998)。这些细胞表达Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，并且在体外显示为具有高核质比和显著核仁的紧凑菌落。如本文所用，术语“iPS细胞”或“iPSC”指这样的多潜能细胞或多潜能细胞群，其可能会因分化的起源体细胞而有所不同，可能会因特定的一组效力决定因子(potency-determining factor)而有所不同，并且可能会因用于分离他们的培养条件而有所不同，但是尽管如此，他们与其各自分化的起源体细胞在遗传上基本相同，并且展示出与本文所述的高效力细胞如ESC相似的特征。参见例如，Yu等Science 318：1917-1920(2007)。IPSC与其各自分化的起源体细胞在遗传上基本相同，展示出与高效力细胞如ES细胞相似的特征，并且细胞是通过对非多潜能细胞(例如，多能细胞、寡能(oligopotent)细胞、单能细胞和终末分化细胞)如体细胞进行重编程获得。ESC和iPSC可从各种商业供应商处获得。

术语“对象”旨在包括其中可以引发免疫应答/反应的活生物体(例如，哺乳动物)。本文所用“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如，牲畜和宠物，如绵羊、牛、猪、犬、猫和鼠类哺乳动物。优选地，对象是人。

“靶位点”或“靶序列”指基因组核酸序列，其限定了在足以发生结合的条件下结合分子可以特异性结合的核酸部分。

本文所用术语“治疗”是指治疗和/或预防。治疗效果通过抑制、缓解或消除疾病状态获得。

“移植物”指待移植的生物相容性晶格(lattice)或供体组织、器官或细胞。移植物的实例可以包括但不限于，皮肤细胞或组织，骨髓和实体器官，如心脏，胰腺，肾脏，肺和肝脏。移植物还可以指待给予宿主的任何物质。例如，移植物可以指核酸或蛋白质。

本文所用术语“转染(的)”或“转化(的)”或“转导(的)”指将外源性核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染(的)”或“转化(的)”或“转导(的)”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞及其后代。

如本文所用术语“治疗”疾病指降低对象所经历的疾病或紊乱的至少一种体征或症状的频率或严重性。

“载体”是物质组合物，其包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸，与离子或两亲性化合物结合的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进转移核酸至细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体等。

范围：在本公开中，可以范围形式呈现本发明的各个方面应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各数值。例如，应当认为诸如1至6的范围的描述具有具体公开的子范围，如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的个别数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这普遍适用，与范围广度无关。

B.修饰的细胞

本发明提供了对类固醇(例如，糖皮质激素)的作用具有抗性的修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的免疫细胞，修饰的调节T细胞，衍生自修饰的多潜能干细胞的免疫细胞)。本发明提供了对钙依赖磷酸酶抑制剂(例如，CsA，FK506)的作用具有抗性的修饰的细胞(例如，免疫细胞，调节T细胞)。在某些实施方式中，本发明提供了对类固醇(例如，糖皮质激素)和钙依赖磷酸酶抑制剂(例如，CsA，FK506)的作用具有抗性的修饰的细胞(例如，免疫细胞，调节T细胞)。还提供了对其他免疫抑制剂药物(例如，mTOR抑制剂，麦考酚酸(mycophenolic acid)，甲氨蝶呤，氟达拉滨，喷司他丁，环磷酰胺等)的作用具有抗性的修饰的细胞。还提供了对类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂的作用敏感的修饰的效应T细胞(Teff)。

类固醇抗性细胞

如本文所述，当治疗患有移植物抗宿主疾病(GVHD)的对象时，类固醇(例如，糖皮质激素)代表预防性护理标准，并且可以降低效应T细胞(Teff)功能并且直接抑制Treg的持久性和功能。类固醇可能直接影响细胞的存活，例如，在类固醇地塞米松存在的情况下，Treg的存活大大降低。

本公开提供了类固醇抗性细胞(例如，基因编辑的类固醇抗性多潜能干细胞，类固醇抗性调节T细胞(Treg)，类固醇抗性造血细胞或其前体细胞)。如本文所用，“类固醇抗性”细胞指对类固醇(例如，糖皮质激素)的作用具有抗性的细胞。如本文所用，对试剂具有“抗性或耐受性”的细胞表示细胞已经遗传修饰，从而使该细胞在存在一定量的抑制或防止未经修饰的细胞增殖的试剂的情况下增殖。当与类固醇接触时，本发明的类固醇抗性细胞表现出最小的生理变化或没有生理变化。有效地，类固醇抗性细胞不与类固醇相互作用(例如，结合)。评估类固醇抗性细胞是否对类固醇的作用具有抗性的各种方法为本领域已知。例如，可以使用细胞计数技术或藉由基于报告物的技术来测量类固醇存在情况下的细胞存活。本领域技术人员将能够使用本领域已知的各种方法来确定类固醇对类固醇抗性细胞的作用。

在一些实施方式中，类固醇抗性通过对一个或多个内源性表达的基因进行基因编辑来实现。因此，本公开提供了基因编辑的类固醇抗性细胞(例如，基因编辑的类固醇抗性多潜能干细胞，基因编辑的类固醇抗性Treg，修饰的造血细胞或其前体细胞)。在一些实施方式中，细胞经基因编辑以破坏一种或多种内源性表达的基因的表达，其中破坏导致一种或多种内源性表达的基因的表达减少、缺失、消除、敲除或破坏，从而赋予细胞类固醇抗性。

在一些实施方式中，本公开的类固醇抗性细胞经基因编辑以破坏一种或多种内源性基因的表达，所述内源性基因编码一种或多种核受体。核受体是存在于细胞内一类蛋白质，其负责感知类固醇和甲状腺激素以及其他分子。这些受体与其他蛋白质共同调节特定基因的表达。各种核受体为本领域所已知，并且被广泛地分类为亚家族，例如：亚家族1，甲状腺激素受体样；亚家族2，类视黄醇X受体样；亚家族3，雌激素受体样；亚家族4，神经生长因子IB样；和亚家族5，类固醇生成因子样，亚家族6，生殖细胞核因子样。核受体的各亚家族可以进一步分组。例如，属于亚家族3的核受体可以进一步分类为例如：A类，雌激素受体；B类，雌激素相关受体；和C类，3-酮类固醇受体。属于亚家族3的C类的核受体的多个成员是已知的。例如，NR3C1基因(NCBI参照序列NG_009062.1)编码糖皮质激素受体，NR3C2基因(NCBI参照序列NG_013350.1)编码盐皮质激素受体，NR3C3基因(NCBI参照序列NG_016475.1)编码孕酮受体，和NR3C4基因(NCBI参照序列NG_009014.2)编码雄激素受体。

在某些实施方式中，本公开的类固醇抗性细胞经基因编辑以破坏NR3C1的表达。NR3C1编码糖皮质激素受体(GR或GCR)。糖皮质激素是与糖皮质激素受体结合的一类皮质类固醇，通常以其在调节葡萄糖代谢和肾上腺皮质合成中的作用而闻名。本文所用术语“糖皮质激素”和“糖皮质类固醇”可以互换使用。糖皮质激素包括但不限于，孕酮型糖皮质激素，氢化可的松型糖皮质激素，美沙酮型糖皮质激素和丙酮化合物型糖皮质激素。糖皮质激素包括但不限于倍他米松，布地奈德，可的松，地氟沙酮，脱氧皮质酮，地塞米松，氟氢可的松，氢化可的松(皮质醇)，氯替泼诺，甲基泼尼松龙，泼尼松龙，泼尼松和曲安西龙，及其衍生物和类似物。

因此，在一些实施方式中，本公开的类固醇抗性细胞(例如，基因编辑的类固醇抗性多潜能干细胞，类固醇抗性造血细胞或其前体细胞)经基因编辑(通过经由核苷酸结合试剂的一个或多个DNA或RNA碱基改变、插入、缺失、取代或转化限定，所述核苷酸结合试剂诸如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a(Cpf1)、Cas9直向同源物、旁系同源物、Cas相关家族成员、锌指、TALEN或大范围核酸酶候选物，其靶向NR3C1基因座，从而导致破坏或干扰NR3C1表达(例如，通过将插入缺失和/或取代引入NR3C1基因座(以包括调节区、一个或多个外显子和一个或多个内含子))，其中所述类固醇抗性细胞对选自下组的一种或多种糖皮质激素具有抗性：孕酮型糖皮质激素、氢化可的松型糖皮质激素、美沙酮型糖皮质激素和丙酮化合物型糖皮质激素。在一些实施方式中，本公开的类固醇抗性细胞经基因编辑以破坏NR3C1的表达，其中所述类固醇抗性细胞对选自下组的一种或多种糖皮质激素具有抗性：倍他米松、布地奈德、可的松、地夫可特、脱氧皮质酮、地塞米松、氟氢可的松、氢化可的松(皮质醇)、氯替泼诺、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松和曲安西龙及其衍生物和类似物。在某些实施方式中，本公开的类固醇抗性细胞经基因编辑以破坏NR3C1的表达，其中所述类固醇抗性细胞对地塞米松具有抗性。

在一些实施方式中，本公开的类固醇抗性细胞(例如，基因编辑的类固醇抗性多潜能干细胞、类固醇抗性造血细胞或其前体细胞)在类固醇(例如，地塞米松)存在的情况下表现出细胞存活增加。在一些实施方式中，经基因编辑以破坏NR3C1表达(例如，通过将插入缺失和/或一个或多个取代引入NR3C1基因座(以包括调节区、一个或多个外显子和一个或多个内含子))的类固醇抗性细胞在类固醇存在的情况下表现出细胞存活增加。在某些实施方式中，经基因编辑以破坏NR3C1表达的类固醇抗性细胞在地塞米松存在的情况下表现出细胞存活增加。在一些实施方式中，细胞存活增加是至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少205％、至少210％、至少215％、至少220％、至少225％、至少230％、至少235％、至少240％、至少245％、至少250％、至少255％、至少260％、至少265％、至少270％、至少275％、至少280％、至少285％、至少290％、至少295％、至少300％、至少350％、至少400％或更多。

钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞

如本文所述，当治疗患有移植物抗宿主疾病(GVHD)的对象时，钙依赖磷酸酶抑制剂(CNI)代表预防性护理标准，并且可以降低效应T细胞(Teff)功能并且直接抑制Treg的持久性和功能。钙依赖磷酸酶抑制剂可能直接影响细胞的存活，例如，在类固醇地塞米松存在的情况下，Treg的存活大大降低。

本公开提供了CNI抗性细胞(例如，CNI抗性多潜能干细胞，CNI抗性调节T细胞(Treg)，CNI抗性造血细胞或其前体细胞)。如本文所用，“钙依赖磷酸酶抑制剂抗性”细胞指对CNI(例如，环孢菌素)的作用具有抗性的细胞。当与CNI接触时，本发明的CNI抗性细胞表现出最小的生理变化或没有生理变化。有效地，CNI抗性细胞不与CNI相互作用(例如，结合)。评估CNI抗性细胞是否对CNI的作用具有抗性的各种方法为本领域已知。例如，可以使用细胞计数技术或藉由基于报告物的技术来测量CNI存在情况下的细胞存活。本领域技术人员将能够使用本领域已知的各种方法来确定CNI对CNI抗性细胞的作用。

钙依赖磷酸酶是异二聚体钙和钙调蛋白依赖性丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，其对T细胞活化至关重要。进入T细胞受体后，钙依赖磷酸酶使转录因子NFAT(活化的T细胞的核因子)去磷酸化，使其易位至细胞核并激活关键靶基因，诸如IL-2(白介素2)。与FKBP12(FK506结合蛋白)复合的FK506(他克莫司；藤霉素)或与CyPA(亲环蛋白A)复合的CsA(环孢菌素A)阻止NFAT进入钙依赖磷酸酶的活性位点，防止其去磷酸化作用，从而抑制T细胞活化。钙依赖磷酸酶由两个亚基形成：A是负责其磷酸酶活性的催化亚基(CnA)，而B是对胞内钙特别有反应性并调节CnA活化的调节亚基(CnB)。

钙依赖磷酸酶是称为钙依赖磷酸酶抑制剂的一类药物的靶标，其包括但不限于，环孢菌素、沃罗孢素(voclosporin)、吡美莫司和他克莫司及其衍生物和类似物。钙依赖磷酸酶抑制剂(CNI)在环孢菌素A(CsA；在本领域中也称为环孢菌素)的情况下结合称为免疫亲和素：亲环蛋白的胞内蛋白，而在他克莫司(也称为FK506)的情况下结合FK结合蛋白。然后，该复合物结合钙依赖磷酸酶，导致其活性受到抑制，从而抑制T细胞活化。环孢菌素是具有N-甲基化氨基酸的内葵肽(endecapeptide)，其使分子对胃肠道失活具有抗性，因此可用作口服免疫抑制药物。沃罗孢素是环孢菌素的类似物，其对钙依赖磷酸酶的作用增强并且代谢稳定性更高。他克莫司(FK506；藤霉素)是一种大环内酯类抗生素。吡美莫司和他克莫司属于大内酰胺免疫抑制剂的子囊霉素类，其通过钙依赖磷酸酶途径抑制T细胞活化以及抑制多种炎性细胞因子的释放起作用。

在一些实施方式中，如本文所述，可以通过将钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因引入细胞中来实现CNI抗性。因此，本公开提供了对CNI具有抗性的修饰的细胞(例如，CNI抗性多潜能干细胞，经修饰的CNI抗性Treg)。在一些实施方式中，修饰细胞以表达钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因。当修饰细胞以表达CNI抗性基因时，可以进一步修饰所述细胞以破坏内源性钙依赖磷酸酶基因的表达。

在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因包括这样的钙依赖磷酸酶变体：已经在其关键氨基酸残基处进行了修饰，以破坏FK506-FKBP12和CsA-CyPA中的任一个或两者的对接，从而产生对FK506和/或CsA具有抗性的钙依赖磷酸酶突变体。本发明的钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因可以是编码对钙依赖磷酸酶抑制剂如FK506和/或CsA具有抗性的钙依赖磷酸酶变体的核酸序列。在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶变体结合FK506，但是不结合钙依赖磷酸酶，从而导致隔离药物并预防钙依赖磷酸酶抑制。

在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶变体在选自下组的一个或多个位置处可以包含野生型钙依赖磷酸酶异二聚体A的一个或多个取代：V314、Y341、M347、T351、W352、L354和K360。在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶变体在例如位置T351和L354或V314和Y341处可以包含野生型钙依赖磷酸酶异二聚体A的双取代。在一些实施方式中，SEQ ID NO：1的位置341处的缬氨酸残基可以被赖氨酸或精氨酸残基替代，位置341处的酪氨酸残基可以被苯丙氨酸残基替代；位置347处的甲硫氨酸可以被谷氨酸、精氨酸或色氨酸残基替代；位置351处的苏氨酸可以被谷氨酸残基替代；位置352处的色氨酸残基可以被半胱氨酸、谷氨酸或丙氨酸残基替代，位置353处的丝氨酸可以被组氨酸或天冬酰胺残基替代，位置354处的亮氨酸可以被丙氨酸残基替代；位置360处的赖氨酸可以被丙氨酸或苯丙氨酸残基替代。本文所述的氨基酸位置的对应关系通常相对于SEQ ID NO：1(GenBank：ACX34092.1)中所示野生型人钙依赖磷酸酶异二聚体A多肽形式的氨基酸的位置表示。在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶变体在选自下组的一个或多个位置处可以包含野生型钙依赖磷酸酶异二聚体B的一个或多个取代：V120、N123、L124或K125。在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶变体在例如位置L124和K125处可以包含野生型钙依赖磷酸酶异二聚体B的双取代。在一些实施方式中，位置120处的缬氨酸可以被丝氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸残基替代；位置123处的天冬酰胺可以被色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸或丝氨酸替代；位置124处的亮氨酸可以被苏氨酸残基替代；位置125处的赖氨酸可以被丙氨酸、谷氨酸、色氨酸替代或者两个残基，诸如亮氨酸-精氨酸或异亮氨酸-谷氨酸可以添加到氨基酸序列SEQ ID NO：2中位置125处的赖氨酸之后。本文所述的氨基酸位置的对应关系通常相对于SEQ ID NO：2(GenBank：ACX34095.1)中所示野生型人钙依赖磷酸酶异二聚体B多肽形式的氨基酸的位置表示。钙依赖磷酸酶变体述于Brewin等，2009，Blood，114(23)：4792-4803中，通过引用其全部内容纳入。

在某些实施方式中，本公开的CNI抗性细胞(例如，CNI抗性多潜能干细胞、CNI抗性造血细胞或其前体细胞)经修饰以表达钙依赖磷酸酶变体。在某些实施方式中，钙依赖磷酸酶变体选自下组：CNa12(SEQ ID NO：3；GenBank：GQ463594.1)、CNa22(SEQ ID NO：4；GenBank：GQ463595.1)和CNb30(SEQ ID NO：5；GenBank：GQ463597.1)。

钙依赖磷酸酶的靶标以及由此钙依赖磷酸酶抑制剂是转录因子NFAT，其在CD28的下游被激活并且是Treg发育所需的。在一些实施方式中，CNI抗性通过对一个或多个内源性表达的NFAT基因进行基因编辑来实现。因此，本公开提供了基因编辑的CNI抗性细胞(例如，基因编辑的类固醇抗性Treg)。在一些实施方式中，细胞经基因编辑以破坏一种或多种NFAT基因的表达，其中破坏导致一种或多种内源性表达的基因的表达减少、缺失、消除、敲除或破坏，从而赋予细胞CNI抗性。

在一些实施方式中，本公开的CNI抗性细胞(例如，CNI抗性多潜能干细胞、CNI抗性造血细胞或其前体细胞)经基因编辑以破坏一个或多个NFAT基因的表达。NFAT转录因子家族包含五个成员：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4和NFAT5。NFAT c1-c4受钙信号传导的调节，并被称为NFAT家族的经典成员。活化的钙依赖磷酸酶使NFAT蛋白质的氨基末端中富含丝氨酸的区域和SP重复快速地磷酸化，从而导致暴露核定位信号的构象变化，从而导致NFAT核输入。在一些实施方式中，本公开的CNI抗性细胞经基因编辑以破坏选自下组的一个或多个内源性表达的基因：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4和NFAT5。在某些实施方式中，本公开的CNI抗性细胞经基因编辑以破坏选自下组的一个或多个内源性表达的基因：NFATc1、NFATc2和NFATc4。

在一些实施方式中，本公开的CNI抗性细胞(例如，CNI抗性多潜能干细胞、CNI抗性造血细胞或其前体细胞)经修饰以表达NFAT抑制剂，所述NFAT抑制剂阻断所有NFAT同种型的活性。在一些实施方式中，CNI抗性细胞经修饰以表达包含VIVIT肽(SEQ ID NO：6)的NFAT抑制剂。本领域已知能够抑制NFAT活性的各种含VIVIT肽试剂。在一些实施方式中，例如，含VIVIT肽试剂是钙依赖磷酸酶介导的NFAT活化的抑制剂，其包含SEQ ID NO：67中所示序列(可获自互联网网址tocris.com/products/nfat-inhibitor_3930处)。

在一些实施方式中，本公开的CNI抗性细胞(例如，CNI抗性多潜能干细胞、CNI抗性造血细胞或其前体细胞)在CNI(例如，CsA)存在的情况下表现出细胞存活增加。在一些实施方式中，CNI抗性细胞经修饰以表达钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因，并且该CNI抗性细胞在CNI存在的情况下表现出细胞存活增加。在一些实施方式中，本公开的CNI抗性细胞在选自下组的CNI存在的情况下表现出细胞存活增加：环孢菌素，伏孢素，吡美莫司和他克莫司及其衍生物和类似物。在某些实施方式中，经修饰以表达钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因的CNI抗性细胞在CsA和/或他克莫司(FK506)及其衍生物和类似物存在的情况下表现出细胞存活增加。在一些实施方式中，细胞存活增加是至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少205％、至少210％、至少215％、至少220％、至少225％、至少230％、至少235％、至少240％、至少245％、至少250％、至少255％、至少260％、至少265％、至少270％、至少275％、至少280％、至少285％、至少290％、至少295％、至少300％、至少350％、至少400％或更多。

糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞

如本文所述，糖皮质激素抗性可以通过破坏内源性表达的NR3C1基因实现。钙依赖磷酸酶抑制剂抗性可以通过将钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因(例如，钙依赖磷酸酶的变体)引入细胞实现。

本公开提供了糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞(例如，糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抗性多潜能干细胞、糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抗性造血细胞或其前体细胞)。这类细胞经修饰以破坏NR3C1表达(例如，通过将插入缺失和/或一个或多个取代引入NR3C1基因座(以包括调节区、一个或多个外显子和一个或多个内含子))，以及表达CNI抗性基因。在一些实施方式中，本公开的糖皮质激素和CNI抗性细胞是这样的细胞，其经修饰以破坏NR3C1表达，并进一步经修饰以表达CNI抗性基因(例如，钙依赖磷酸酶变体)。在一些实施方式中，可以通过靶向或随机整合将CNI抗性基因整合到细胞的基因组中。靶向整合和随机整合的各种方法为本领域已知并在本文中描述。在某些实施方式中，将CNI抗性基因整合到细胞的基因组中，进入NR3C1基因座内靶向的位点中。在一些实施方式中，将CNI抗性基因整合NR3C1基因座外的细胞基因组中。在将CNI抗性基因整合到NR3C1基因座外的细胞基因组中的情况中，可能需要选择不将CNI抗性基因整合到基因组编码区的引入方法(例如，可能需要将CNI抗性基因整合到基因组的非编码区中)。

在某些实施方式中，本公开的糖皮质激素和CNI抗性细胞(例如，糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性多潜能干细胞、糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性造血细胞或其前体细胞)是这样的细胞，其经修饰以破坏NR3C1表达(例如，通过将插入缺失和/或一个或多个取代引入NR3C1基因座(以包括调节区、一个或多个外显子和一个或多个内含子))，并进一步经修饰以在NR3C1基因座内表达CNI抗性基因(例如，钙依赖磷酸酶变体)。这类细胞具有对糖皮质激素(例如，地塞米松)和钙依赖磷酸酶抑制剂(例如，CsA和/或FK506)的抗性。在一些实施方式中，经修饰以破坏NR3C1表达并表达CNI抗性基因(例如，钙依赖磷酸酶变体)的糖皮质激素和CNI抗性细胞在糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抑制剂及其衍生物和类似物存在的情况下表现出细胞存活增加。在一些实施方式中，在糖皮质激素(例如，地塞米松)或其衍生物和类似物存在的情况下，所述细胞存活增加为至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少205％、至少210％、至少215％、至少220％、至少225％、至少230％、至少235％、至少240％、至少245％、至少250％、至少255％、至少260％、至少265％、至少270％、至少275％、至少280％、至少285％、至少290％、至少295％、至少300％、至少350％、至少400％或更多。在一些实施方式中，在CNI(例如，FK506，CsA)或其衍生物和类似物存在的情况下，所述细胞存活增加为至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少205％、至少210％、至少215％、至少220％、至少225％、至少230％、至少235％、至少240％、至少245％、至少250％、至少255％、至少260％、至少265％、至少270％、至少275％、至少280％、至少285％、至少290％、至少295％、至少300％、至少350％、至少400％或更多。

其他免疫抑制剂药物抗性细胞

在治疗和管理患病对象中GVHD的过程中，可以使用其他免疫抑制剂药物。如同糖皮质激素和CNI，这些免疫抑制剂药物也可能降低Treg持久性和功能。

例如，西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司及其类似物和衍生物(也称为雷帕洛斯(rapalogs))属于雷帕霉素家族，并且可以用于免疫抑制疗法，例如用于实体器官移植和造血干细胞移植。这些雷帕霉素家族免疫抑制剂通过与胞内受体FKBP12相关联来抑制雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶标。FKBP12-雷帕霉素复合物直接结合mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合(FRB)结构域，从而抑制其活性。在一些实施方式中，本公开的免疫抑制剂药物抗性细胞对mTOR抑制(例如，mTOR抑制剂抗性Treg)具有抗性。本公开的mTOR抑制剂抗性细胞可包括但不限于，经修饰以防止形成FKBP12-雷帕霉素复合物的细胞(例如，FKBP12中的特定突变)，和经修饰以防止FKBP12-雷帕霉素复合物与FRB结构域(例如，FRB结构域中的特定突变)结合的细胞。因为mTOR途径是经过充分研究的生物学途径，所以本领域技术人员已知实现对mTOR抑制的抗性的多种方法。

免疫抑制剂药物的另一个示例是麦考酚酸(也称为麦考酚酯)。麦考酚酸是肌苷5′-单磷酸脱氢酶(IMPDH)的强效、可逆、非竞争性抑制剂，所述IMPDH是由肌苷-5′-单磷酸(IMP)从头合成鸟苷5′-单磷酸(GMP)所必需的酶。另一种免疫抑制剂药物是甲氨蝶呤(以前称为氨甲蝶呤)。甲氨蝶呤是抗叶酸类型的抗代谢物，并且可抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)，该酶参与四氢叶酸合成。因此，在一些实施方式中，本公开的免疫抑制剂药物抗性细胞对麦考酚酸和/或甲氨蝶呤及其类似物和衍生物具有抗性(例如，麦考酚酸和/或甲氨蝶呤抗性Treg)。本公开的麦考酚酸和/或甲氨蝶呤抗性细胞可以包括，例如，这样的细胞，所述细胞经修饰以表达包含取代L22F和F31S的人DHFR变体和/或表达包含取代T333I和S351Y的肌苷单磷酸脱氢酶II(IMPDH2)变体。

免疫抑制剂药物的其他实例包括但不限于，氟达拉滨、喷司他丁(脱氧同型霉素)和环磷酰胺(细胞膦(cytophosphane))。氟达拉滨是嘌呤类似物并且通过干扰核糖核苷酸还原酶和DNA聚合酶来抑制DNA合成。喷司他丁是嘌呤类似物并且模拟核苷腺苷和抑制腺苷脱氨酶，从而干扰细胞加工DNA的能力。环磷酰胺通过(例如，细胞色素P450系统的)混合功能氧化酶转化为活性代谢物，包括但不限于，4-羟基环磷酰胺和磷酰胺氮芥。磷酰胺氮芥在鸟嘌呤N-7位置的DNA链之间和之内形成DNA交联(分别称为链间和链内交联)。对这些药物的抗性机制为本领域已知，并且可用于产生本公开的免疫抑制剂药物抗性细胞，例如，对氟达拉滨、喷司他丁和/或环磷酰胺具有抗性的修饰的细胞(例如，修饰的造血细胞或其前体细胞)。

C.产生修饰的细胞的方法

本发明的细胞经基因编辑以破坏本文所述的任何内源性基因的表达。因此，在一些实施方式中，本发明的修饰的细胞(例如，包含钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因的修饰的细胞)经基因编辑以破坏本文所述的一种或多种内源性基因的表达。

各种基因编辑技术是本领域技术人员已知的。基因编辑技术包括但不限于，归巢内切核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)，转录激活因子样效应物(TALE)核酸酶(TALEN)，规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(Cas9)基因组编辑系统和CRISPR-Cpf1基因组编辑系统。归巢内切核酸酶通常将其DNA底物切割为二聚体，并且没有明显的结合和切割结构域。ZFN识别由两个锌指结合位点组成的靶位点，所述锌指结合位点侧接FokI切割域识别的5-7个碱基对(bp)的间隔子序列。TALEN识别由两个TALE DNA结合位点组成的靶位点，所述TALE DNA结合位点侧接FokI切割域识别的12-20bp的间隔子序列。Cas9核酸酶靶向与单向导RNA(gRNA)内靶向序列互补的DNA序列，所述单向导RNA刚好位于可能存在于DNA螺旋任一链上的相容原型间隔子邻近基序(PAM)上游。因此，本领域技术人员将能够为本发明选择合适的基因编辑技术。

在一些方面中，通过使用RNA引导的核酸酶的基因编辑来进行破坏，如CRISPR-Cas系统，诸如针对被破坏的基因(例如，NR3C1)特异性的CRISPR-Cas9系统或CRISPR-Cpf1系统。在一些实施方式中，将试剂引入细胞中，所述试剂包含Cas9和向导RNA(gRNA)，所述gRNA包含靶向基因座区域的靶向结构域。在一些实施方式中，试剂是或包含Cas9多肽和gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物(Cas9/gRNA RNP)。在一些实施方式中，引入包括将试剂或其部分与细胞在体外接触，这可以包括将细胞和试剂培养或孵育长达24、36或48小时或3、4、5、6、7或8天。在一些实施方式中，引入还可以包括将试剂递送到细胞中。在各种实施方式中，根据本发明的方法、组合物和细胞将Cas9和gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物直接递送至细胞，例如通过电穿孔。在一些实施方式中，RNP复合物包括gRNA，所述gRNA已经修饰以包含3′多聚A尾和5′防倒转帽类似物(ARCA)帽。

CRISPR/Cas9系统是用于诱导定向遗传改变的简便且高效的系统。通过Cas9蛋白的靶标识别需要向导RNA(gRNA)内的“种子”序列和保守二核苷酸，所述保守二核苷酸包含gRNA结合区上游的原型间隔子邻近基序(PAM)序列。通过重新设计gRNA细胞，可以对CRISPR/Cas9系统进行工程改造以切割几乎任何DNA序列。CRISPR/Cas9系统可以通过共表达单一Cas9蛋白和两个或多个gRNA来同时靶向多个基因组基因座，从而使该系统适合靶基因的多基因编辑或协同激活。

Cas9蛋白和向导RNA形成识别和切割靶序列的复合物。Cas9由六个结构域组成：REC I、REC II、桥螺旋(Bridge Helix)、PAM相互作用、HNH和RuvC。REC I结构域结合向导RNA，而桥螺旋结合靶DNA。HNH和RuvC结构域是核酸酶结构域。向导RNA经工程改造具有与靶DNA序列互补的5′端。向导RNA与Cas9蛋白结合后，构象变化激活了该蛋白质。激活后，Cas9通过结合与其原型间隔子邻近基序(PAM)序列匹配的序列来搜索靶DNA。PAM是两个或三个核苷酸碱基序列，其在与向导RNA互补的区域下游的一个核苷酸内。在一个非限制性实例中，PAM序列是5′-NGG-3′。当Cas9蛋白发现其具有适当PAM的靶序列时，它会融化PAM上游的碱基并将其与向导RNA上的互补区配对。然后，RuvC和HNH核酸酶结构域切割PAM上游第三个核苷酸碱基之后的靶DNA。

美国专利申请公开号US20140068797表述了用于抑制基因表达的CRISPR/Cas系统的一个非限制性示例——CRISPR干扰(CRISPRi)。CRISPRi利用缺少内切核酸酶活性的催化死亡的Cas9。当与向导RNA共表达时，生成DNA识别复合物，其特异性干扰转录延伸，RNA聚合酶结合或转录因子结合。该CRISPRi系统高效抑制靶向的基因的表达。

CRISPR/Cas基因破坏发生在将Cas内切核酸酶和靶基因特异性的引导核酸序列引入细胞并形成复合物时，所述复合物使Cas内切核酸酶能够在靶基因处引入双链断裂。在某些实施方式中，CRISPR/Cas系统包括表达载体，例如但不限于，pAd5F35-CRISPR载体。在其他实施方式中，Cas表达载体诱导Cas9内切核酸酶的表达。也可以使用其他内切核酸酶，包括但不限于，Cas12a(Cpf1)，T7，Cas3，Cas8a，Cas8b，Cas10d，Cse1，Csy1，Csn2，Cas4，Cas10，Csm2，Cmr5，Fok1，其他本领域已知的核酸酶及其任何组合。

在某些实施方式中，CRISPR/Cas系统可以包括活性改变的Cas9的变体。示例性的变体Cas9核酸酶包括但不限于，Cas9切口酶(nCas9)，催化死亡的Cas9(dCas9)，超精确Cas9(HypaCas9)(Chen等Nature，550(7676)，407-410(2017))，高保真Cas9(Cas9-HF)(Kleinstiver等Nature 529(7587)，490-495(2016))，特异性增强Cas9(eCas9)(Slaymaker等Science 351(6268)，84-88(2016))，和扩增的PAM Cas9(xCas9)(Hu等Nature doi：10.1038/nature26155(2018))。

在某些实施方式中，诱导Cas表达载体包括将细胞暴露于激活Cas表达载体中诱导型启动子的试剂。在这类实施方式中，Cas表达载体包括诱导型启动子，如可通过暴露于抗生素(例如，通过四环素或四环素衍生物，例如多西环素)诱导的启动子。也可以使用本领域技术人员已知的其他诱导型启动子。诱导剂可以是导致诱导型启动子诱导的选择性条件(例如，暴露于试剂例如抗生素)。这导致Cas表达载体的表达。

本文所用术语“向导RNA”或“gRNA”指促进细胞中RNA导向核酸酶如Cas9特异性关联(或“靶向”)靶序列(例如，基因组或附加型序列)的任何核酸。本领域技术人员将理解的是，可以用尿嘧啶或“U”核苷酸代替胸腺嘧啶或“T”核苷酸来叙述gRNA序列。

如本文所用，“模块化(modular)”或“双RNA”向导包括不止一个，并且通常包括两个独立的RNA分子，如CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，它们通常彼此之间相互关联，例如通过双链体化。在整个文献中描述了gRNA及其组成部分(参见例如，Bnerer等Mol.Cell，56(2)，333-339(2014)，其通过引用纳入)。

如本文所用，“单分子gRNA”、“嵌合gRNA”或“单向导RNA(sgRNA)”包括单个RNA分子。sgRNA可以是连接在一起的crRNA和tracrRNA。例如，crRNA的3′端可以连接至tracrRNA的5′端。crRNA和tracrRNA可以结合成单个单分子或嵌合gRNA，例如通过将四个核苷酸(例如，GAAA)“四环”或“接头”序列桥接crRNA(在其3′端)和tracrRNA(在其5′端)的互补区。

如本文所用，“重复”序列或区域是crRNA的3′端处或附近的核苷酸序列，其与tracrRNA的抗重复序列互补。

如本文所用，“抗重复”序列或区域是tracrRNA的5′端或附近的核苷酸序列，其与crRNA的重复序列互补。

关于向导RNA结构和功能，包括用于基因组编辑的gRNA/Cas9复合物的其他详细描述可以至少在Mali等Science，339(6121)，823-826(2013)；Jiang等Nat.Biotechnol.31(3).233-239(2013)；和Jinek等Science，337(6096)，816-821(2012)中找到；其通过引用纳入本文。

如本文所用，“向导序列”或“靶向序列”指gRNA的核苷酸序列，无论是单分子的或是模块化的，其与需要进行编辑的细胞基因组中DNA序列内靶结构域或靶多核苷酸完全或部分互补。向导序列的长度通常为10-30个核苷酸，优选为16-24个核苷酸(例如，长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且位于Cas9 gRNA的5′末端或其附近。

如本文所用，“靶结构域”或“靶多核苷酸序列”或“靶序列”是细胞基因组中与gRNA的向导序列互补的DNA序列。

在形成CRISPR复合物的情况中，“靶序列”指向导序列被设计成对其具有一些互补性的序列其中靶序列和向导序列之间的杂交促进了CRISPR复合物的形成。并不必然需要完全互补，前提是有充足的互补性产生杂交并促进CRISPR复合物形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在某些实施方式中，靶序列位于细胞的核或细胞质中。在其他实施方式中，靶序列可以在真核细胞的细胞器内，例如线粒体或细胞核。通常，在CRISPR系统中，CRISPR复合物(包括与靶序列杂交并与一个或多个Cas蛋白复合的向导序列)的形成导致切割靶序列中或其附近(例如，在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)的一条链或两条链。与靶序列一样，据信不需要完全的互补性，只要这足以起作用即可。

在某些实施方式中，驱动CRISPR系统的一个或多个元件表达的一个或多个载体被导入宿主细胞(例如，多潜能干细胞)中，使得CRISPR系统的元件表达在一个或多个靶位点处指导CRISPR复合物形成。例如，Cas核酸酶、crRNA和tracrRNA可各自可操作地连接分开的载体上的分开的调节元件。如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上核酸序列的联合，使得一个的功能被另一个所影响。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制下)，启动子与编码序列可操作地连接。

或者，从相同或不同调节元件表达的元件中的两个或更多个可在单一载体中组合，一个或多个其他载体提供不包括在第一载体内的CRISPR系统的任意组分。在单一载体中组合的CRISPR系统元件可以任意合适的取向排列，使得一个元件位于第二元件的5′(“上游”)或3′(“下游”)。一个元件的编码序列可位于第二元件的编码序列的相同或相反链上，并且可以相同或相反方向取向。在某些实施方式中，单一启动子驱动编码CRISPR酶的转录本和一种或多种以下的表达：引导序列、tracr伴侣序列(任选地可操作地连接引导序列)、和包埋在一个或多个内含子序列内的tracr序列(例如，各自在不同内含子中，2个或更多个在至少一个内含子中，或者全部在单一内含子中)。

在某些实施方式中，CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如，除CRISPR酶外，约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个结构域)的融合蛋白的部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何其他蛋白质序列，和任选地任意两个结构域之间的接头序列。可与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的示例包括但不限于，表位标签、报告基因序列和具有下述一种或多种活性的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。可形成包括CRISPR酶的融合蛋白的部分的其他结构域描述于美国专利申请公开号US20110059502，其通过引用纳入本文。在某些实施方式中，带标签的CRISPR酶用于鉴定靶序列的位置。

可采用常规基于病毒和非病毒的转基因方法来将核酸引入哺乳动物和非哺乳动物细胞(例如，人多潜能干细胞)或靶组织中。这类方法可用于向培养物中或宿主生物中的细胞给予编码CRISPR系统组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述载体的转录本)、裸核酸和与递送载体(例如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加型或整合的基因组(Anderson，1992，Science256：808-813；和Yu，等，1994，Gene Therapy 1：13-26)。

在一些实施方式中，CRISPR/Cas源自II型CRISPR/Cas系统。在其他实施方式中，CRISPR/Cas系统源自Cas9核酸酶。可以用于本发明的示例性Cas9核酸酶包括但不限于，酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9(SaCas9)，嗜热链球菌(S.thermophilus)Cas9(StCas9)，脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)Cas9(NmCas9)，空肠弯曲杆菌(C.jejuni)Cas9(CjCas9)，和地芽孢杆菌属(Geobacillus)Cas9(GeoCas9)。

通常，Cas蛋白包含至少一个RNA识别和/或RNA结合结构域。RNA识别和/或RNA结合结构域与向导RNA相互作用。Cas蛋白还可包括核酸酶结构域(即，DNA酶或RNA酶结构域)，DNA结合结构域，解旋酶结构域，RNA酶结构域，蛋白质-蛋白质相互作用结构域，二聚化结构域，以及其它结构域。Cas蛋白可经修饰以增加核酸结合亲和性和/或特异性，改变酶活性，和/或改变该蛋白质的另一性质。在某些实施方式中，融合蛋白的Cas样蛋白可源自野生型Cas9蛋白或其片段。在其它实施方式中，Cas可以源自修饰的Cas9蛋白。例如，Cas9蛋白的氨基酸序列可经修饰以改变该蛋白质的一种或多种性质(例如，核酸酶活性、亲和力、稳定性等)。或者，可从蛋白中消除该不参与RNA引导的切割的Cas9蛋白的结构域，从而使经修饰的Cas9蛋白小于野生型Cas9蛋白。通常，Cas9蛋白包含至少两个核酸酶(即DNA酶)结构域。例如，Cas9蛋白可以包含RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域共同作用以切割单链，从而在DNA中产生双链断裂。(Jinek，等，2012，Science，337：816-821)。在某些实施方式中，可修饰Cas9衍生的蛋白质以仅包含一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶结构域)。例如，可修饰Cas9衍生的蛋白质，使得核酸酶结构域之一被缺失或突变，从而使其不再起作用(即不存在核酸酶活性)。在其中核酸酶结构域之一失活的一些实施方式中，Cas9衍生的蛋白质能够将切口引入双链核酸(这类蛋白质称为“切口酶”)，但是不切割双链DNA。在任何上述实施方式中，可以使用熟知的方法通过一个或多个缺失突变、插入突变和/或取代突变使任意或全部核酸酶结构域失活，如定点诱变，PCR介导的诱变，和全基因合成，以及本领域已知的其他方法。

如本文所用，“碱基编辑器”是这样的蛋白质或融合蛋白，其包含能够结合向导RNA的CRISPR失活或切口DNA结合结构域，而这进而通过链杂交结合靶核酸序列，并且进一步包含能够编辑靶核酸序列碱基的碱基编辑域。在某些实施方式中，CRISPR系统包含碱基编辑器和向导RNA。

术语“碱基编辑器”涵盖“下一代”碱基编辑器，如第三代碱基编辑器(BE3系统)、第四代碱基编辑器(BE4系统)和腺嘌呤碱基编辑器。其中碱基切除修复抑制剂UGI与Cas9切口酶融合的第三代碱基编辑器(BE3系统)在未修饰的DNA链产生切口，从而鼓励细胞将编辑后的链用作错配修复的模板。因此，细胞使用含U链(通过胞苷脱氨作用引入)作为模板修复DNA，复制了碱基编辑。第四代碱基编辑器(BE4系统)使用碱基切除修复抑制剂UGI的两个拷贝。已开发了腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，其将基因组DNA中靶向的A·T碱基对高效地转化为G·C(在人细胞中效率为0-100％)，其产物纯度高(通常至少99.9％)并且插入缺失率低(通常不超过0.1％)。参见例如，Gaudelli等，Nature 551：464-471(2017)。应当理解的是，其他碱基编辑器，包括在ATG“起始”密码子处引入空突变以破坏靶向的基因表达的那些碱基编辑器，适合根据本文所述方法的用途。

碱基编辑器可以包含任何合适的CRISPR失活或切口DNA结合结构域，其可以结合向导RNA。在一些实施方式中，CRISPR失活或切口DNA结合结构域是Cas9核酸酶，其具有两个失活的DNA切割结构域之一，即，Cas9是切口酶。核酸酶失活Cas9蛋白可以称为“dCas9”蛋白(对于核酸酶“死”Cas9)。已知用于生成具有失活DNA切割结构域的Cas9蛋白(或其片段)的方法(参见例如，Jinek等，Science.337：816-821(2012)；Qi等，“改变CRISPR的用途作为基因表达序列特异性控制的RNA导向的平台(Repurposing CRISPR as an RNA-GuidedPlatform for Sequence-Specific Control of Gene Expression)”(2013)Cell.28；152(5)：1173-83，其各自的全部内容通过引用纳入本文)。例如，已知Cas9的DNA切割结构域包括两个亚结构域，HNH核酸酶亚结构域和RuvC1亚结构域。HNH亚结构域切割与gRNA互补的链，而RuvC1亚结构域切割非互补链。这些亚结构域中的突变可使Cas9的核酸酶活性沉默。例如，突变D10A和H840A使酿脓链球菌Cas9的核酸酶活性完全失活(Jinek等，Science.337：816-821(2012)；Qi等，Cell.28；152(5)：1173-83(2013))。合适的CRISPR失活或切口DNA结合结构域包括但不限于，核酸酶失活的变体Cas9结构域，其包括D10A，D10A/D839A/H840A和D10A/D839A/H840A/N863A突变结构域，如WO2015089406A1中所述，其通过引用纳入本文。

一旦引入靶细胞或基因组，CRISPR失活或缺口DNA结合域(例如，核酸酶失活的Cas9)通过结合与其原型间隔子邻近基序(PAM)序列匹配的序列来搜索靶DNA。在一些实施方式中，CRISPR失活或切口DNA结合结构域可以识别非规范的PAM序列(例如，非NGG PAM序列)。这类PAM序列是本领域已知的，包括但不限于：5’-NGA-3’；5’-NGCG-3’；5’-NGAG-3’；5’-NNGRRT-3’；和5’-NNNRRT-3’。具有本领域知识的技术人员将能够确定通过给定的CRISPR核酸酶识别的适当PAM序列。

术语“碱基编辑域”指这样的物质，其包含能够对核酸序列(例如，DNA或RNA)内碱基(例如，A、T、C、G或U)进行修饰(例如，碱基替换)的多肽。在一些实施方式中，碱基编辑结构域是DNA编辑结构域。在一些实施方式中，碱基编辑结构域能够使核酸内的碱基脱氨基。在一些实施方式中，碱基编辑器能够使DNA分子内的碱基脱氨基。在一些实施方式中，碱基编辑结构域是脱氨酶结构域。

在一些实施方式中，脱氨酶是腺苷脱氨酶。在一些实施方式中，腺苷脱氨酶能够使腺嘌呤脱氨基。在一些实施方式中，腺苷脱氨酶能够使DNA脱氧腺苷残基中的腺嘌呤脱氨基。腺苷脱氨酶可以源自任何合适的生物(例如，大肠杆菌)。在一些实施方式中，腺嘌呤脱氨酶是天然存在的腺苷脱氨酶，其包括对应本文所提供的任意突变的一个或多个突变(例如，ecTadA中的突变)。在一些实施方式中，腺苷脱氨酶来自原核生物。在一些实施方式中，腺苷脱氨酶来自细菌。在一些实施方式中，腺苷脱氨酶来自大肠杆菌，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，新月形杆菌(Caulobacter crescentus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一些实施方式中，腺苷脱氨酶来自大肠杆菌。在一些实施方式中，脱氨酶经合理地工程改造和/或进化以获取或增强活性。

在某些示例性实施方式中，脱氨酶是胞苷脱氨酶。在一些实施方式中，脱氨酶是载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶。在一些实施方式中，脱氨酶是APOBEC1家族脱氨酶。在一些实施方式中，脱氨酶是活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)。在一些实施方式中，脱氨酶是ACF1/ASE脱氨酶。在一些实施方式中，脱氨酶是腺苷脱氨酶。在一些实施方式中，脱氨酶是ADAT家族脱氨酶。在一些实施方式中，碱基编辑结构域与Cas9结构域的N末端融合。在一些实施方式中，碱基编辑结构域与Cas9结构域的C末端融合。在一些实施方式中，Cas9结构域和碱基编辑结构域通过接头融合。

美国专利公开号US20150166985A1、US20150166980A1、US20150166984A1、US20170121693A1和US20180073012A1以及美国专利号9,068,179和9,840,699中描述了碱基编辑器蛋白的各种CRISPR失活或切口DNA结合域和碱基编辑域，其全部内容通过引用纳入本文。

在一个非限制性实施方式中，载体驱动CRISPR系统的表达。本领域充满了可用于本发明的合适载体。待用载体适用于在真核细胞中复制，以及任选地，整合。典型的载体包含用于调节所需核酸序列表达的转录和翻译终止子，起始序列和启动子。本发明的载体还可以用于核酸标准基因递送方案。本领域已知用于基因递送的方法(美国专利号5,399,346、5,580,859和5,589,466，通过引用其全部内容纳入本文)。

此外，载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于例如Sambrook等(第4版，《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL)》，纽约州冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约，2012)，以及其它病毒学和分子学生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，辛德毕斯病毒，γ逆转录病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含：在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。

在一些实施方式中，向导RNA和Cas9或碱基编辑器可以作为核糖核蛋白(RNP)复合物(例如，Cas9/RNA-蛋白质复合物)递送至细胞。RNP包含与gRNA复合的纯化Cas9蛋白或纯化碱基编辑器，并且本领域中众所周知其将高效递送至多种类型的细胞，包括但不限于干细胞和免疫细胞(艾德基因公司(Addgene)，马萨诸塞州剑桥，Mirus生物有限责任公司(Mirus Bio LLC)，威斯康星州麦迪逊)。在一些实施方式中，通过电穿孔将Cas9或碱基编辑器/RNA-蛋白质复合物递送到细胞中。

在一些实施方式中，使用CRISPR/Cas9编辑本公开基因编辑的细胞，以破坏细胞(例如，Treg)中的一个或多个内源性基因。在一些实施方式中，CRISPR/Cas9用于破坏内源性NR3C1，从而导致NR3C1表达下调。在一些实施方式中，使用碱基编辑器对本公开基因编辑的细胞进行碱基编辑(例如，将取代引入细胞中)，以破坏细胞(例如，Treg)中的一个或多个内源性基因。在一些实施方式中，碱基编辑器用于破坏内源性NR3C1，从而导致NR3C1表达下调。

如本文所述，NR3C1的下调导致对类固醇(例如，糖皮质激素)的抗性。因此，在一些实施方式中，本公开提供了类固醇抗性细胞(例如，糖皮质激素抗性Treg)，其中CRISPR/Cas9用于破坏内源性NR3C1，从而导致NR3C1表达下调。因此，本公开的类固醇抗性CRISPR修饰的细胞在编码NR3C1的基因座中包含CRISPR介导的插入和/或缺失(插入缺失)，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达。因此，本发明的类固醇抗性CRISPR修饰的细胞在编码NR3C1的基因座中包含碱基编辑(例如，靶向碱基取代)，其中所述碱基编辑能够消融/下调NR3C1的基因表达。。

根据NCBI参照序列：NM_001018074.1，NR3C1基因座包含9个外显子。在一些实施方式中，编码NR3C1的基因座中的CRISPR介导的插入缺失位于NR3C1的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8或外显子9。因此，在一些实施方式中，gRNA包含向导序列，所述向导序列与NR3C1的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8或外显子9内的靶序列足够互补。在某些实施方式中，编码NR3C1的基因座中的插入缺失位于NR3C1外显子2中。在某些实施方式中，向导RNA包含与NR3C1外显子2中靶序列足够互补的向导序列。表1显示了用于破坏内源性NR3C1的合适gRNA。在某些实施方式中，向导序列与NR3C1基因中的靶序列足够互补，并且包含SEQ IDNO：7-10中任一项所示的核酸序列。

表1：

在一些实施方式中，编码NR3C1的基因座中酿脓链球菌CRISPR/Cas9碱基编辑器介导的取代引入了提早终止密码子。因此，在一些实施方式中，gRNA包含与靶序列足够互补的向导序列，所述靶序列中一个或多个碱基对取代会将正常的野生型密码子转化为终止密码子。在某些实施方式中，编码NR3C1的基因座中的取代位于NR3C1的外显子中。在某些实施方式中，向导RNA包含与NR3C1外显子中靶序列足够互补的向导序列。表2显示了用于介导导致内源性NR3C1中引入提早终止密码子的取代的合适gRNA。在某些实施方式中，向导序列与NR3C1基因中的靶序列足够互补，并且包含SEQ ID NO：17-54中任一项所示的核酸序列。

表2

*小写字母残基表示脱氨(取代)的位点。

在一些实施方式中，编码NR3C1的基因座中CRISPR介导的取代位于NR3C1的剪接受体或剪接供体。因此，在一些实施方式中，gRNA包含与包含NR3C1的剪接受体或剪接供体的靶序列足够互补的向导序列。在某些实施方式中，编码NR3C1的基因座中的取代位于NR3C1的剪接受体或剪接供体处或附近，其中取代能够破坏NR3C1的正常剪接，从而下调/消融NR3C1的表达。在某些实施方式中，向导RNA包含与包含NR3C1的剪接受体的靶序列足够互补的向导序列。在某些实施方式中，向导RNA包含与包含NR3C1的剪接供体的靶序列足够互补的向导序列。表3显示了用于介导导致NR3C1的剪接受体或剪接供体处或附近的取代的合适gRNA。在某些实施方式中，向导序列与NR3C1基因中的靶序列足够互补，并且包含SEQ IDNO：55-56中任一项所示的核酸序列。

表3：

*小写字母残基表示脱氨(取代)的位点。

因此，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：7所示核酸序列。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：8所示核酸序列。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：9所示核酸序列。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：10所示核酸序列。

因此，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子中产生取代，其中所述取代能够下调NR3C1的基因表达。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子中产生取代，其中所述取代能够下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：17-54中任一项所示的核酸序列。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子中产生取代，其中所述取代能够下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：20或21所示的核酸序列。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子中产生取代，其中所述取代能够下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：20所示核酸序列。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子中产生取代，其中所述取代能够下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：21所示核酸序列。

因此，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1的剪接受体或剪接供体中产生取代，其中所述取代能够破坏NR3C1的正常剪接，从而下调NR3C1的基因表达。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，修饰的多潜能干细胞，修饰的Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1的剪接受体或剪接受体中产生取代，其中所述取代能够破坏NR3C1的正常剪接，从而下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：55或56所示的核酸序列。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1的剪接受体或剪接受体中产生取代，其中所述取代能够破坏NR3C1的正常剪接，从而下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQ ID NO：55所示核酸序列。在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1的剪接受体或剪接受体中产生取代，其中所述取代能够破坏NR3C1的正常剪接，从而下调NR3C1的基因表达，其中所述CRISPR系统包含向导RNA，所述向导RNA包含SEQID NO：56所示核酸序列。

在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，并且其还包括将外源性钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因插入细胞的基因组中。在一些实施方式中，CNI抗性基因的插入发生在NR3C1中插入缺失的位点。在一些实施方式中，NR3C1中的插入缺失在NR3C1外显子2中。在一些实施方式中，CNI抗性基因编码钙依赖磷酸酶变体，其中所述钙依赖磷酸酶变体是钙依赖磷酸酶A(CNa)基因的突变形式或钙依赖磷酸酶B(CNb)基因的突变形式，所述CNa基因选自下组：PPP3Ca、PPP3Cb和PPP3Cc(催化亚基的3个同种型)，所述CNb选自下组：PPP3R1和PPP3R2(调剂亚基的2个同种型)。在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶变体选自下组：CNa12(SEQ ID NO：3)、CNa22(SEQ ID NO：4)和CNb30(SEQ ID NO：5)。

在一些实施方式中，用于生成本公开的类固醇抗性和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1中产生取代，其中所述取代能够下调NR3C1的基因表达，并且其还包括将外源性钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因插入细胞的基因组中。在一些实施方式中，NR3C1中的取代在NR3C1外显子中。在一些实施方式中，NR3C1中的取代在NR3C1外显子2中。在一些实施方式中，NR3C1中的取代在NR3C1的剪接受体中。在一些实施方式中，NR3C1中的取代在NR3C1的剪接供体中。在一些实施方式中，CNI抗性基因的插入发生在NR3C1中取代的位点处、附近或下游(例如，NR3C1基因座内)。在一些实施方式中，CNI抗性基因的插入发生在NR3C1基因座外)。在一些实施方式中，CNI抗性基因编码钙依赖磷酸酶变体，其中所述钙依赖磷酸酶变体是钙依赖磷酸酶A(CNa)基因的突变形式或钙依赖磷酸酶B(CNb)基因的突变形式，所述CNa基因选自下组：PPP3Ca、PPP3Cb和PPP3Cc，所述CNb基因选自下组：PPP3R1和PPP3R2。在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶变体选自下组：CNa12(SEQ ID NO：3)、CNa22(SEQ ID NO：4)和CNb30(SEQ IDNO：5)。

因此，用于生成类固醇抗性和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，并且其还包括将外源性CNI抗性基因插入NR3C1中插入缺失的位点，其中所述外源性CNI抗性基因编码包含SEQ ID NO：3所述氨基酸序列的钙依赖磷酸酶变体。因此，用于生成类固醇抗性和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，并且其还包括将外源性CNI抗性基因插入NR3C1中插入缺失的位点，其中所述外源性CNI抗性基因编码包含SEQ ID NO：4所述氨基酸序列的钙依赖磷酸酶变体。因此，用于生成类固醇抗性和钙依赖磷酸酶抑制剂抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在NR3C1外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达，并且其还包括将外源性CNI抗性基因插入NR3C1中插入缺失的位点，其中所述外源性CNI抗性基因编码包含SEQ ID NO：5所述氨基酸序列的钙依赖磷酸酶变体。

在一些情况中，修饰的细胞是修饰的多潜能干细胞，无论是胚胎的或诱导的。在这类情况中，本文提供的方法还包括在促进修饰的多潜能干细胞分化成造血前体细胞或造血细胞的条件下对修饰的多潜能干细胞进行分化。在一些情况中，该方法包括在分化因子存在的条件下对修饰的多潜能干细胞进行培养，所述分化因子对于获得修饰的造血前体和分化的造血细胞类型是必需的和足够的。然后，修饰的多潜能干细胞可以根据任何适当的分化方法进行分化，诸如述于例如美国专利号9574179，8093049中的那些，从而产生修饰的多潜能干细胞衍生的造血细胞或其前体。

因此，在一些情况中，用于生成类固醇抗性和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法包括向多潜能干细胞引入CRISPR系统，所述CRISPR系统在编码NR3C1的基因座中产生取代，其中所述取代能够下调NR3C1的基因表达，并且在一些情况中，其还包括将外源性钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因的插入引入多潜能细胞的基因组中。

在一些方面，所提供的组合物和方法包括其中细胞组合物中至少或大于约25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的细胞包含所需的遗传修饰的组合物和方法。例如，其中引入了用于敲除或遗传破坏(例如，插入缺失和/或取代)内源性基因(例如，NR3C1)的试剂(例如，gRNA/Cas核酸酶)的细胞组合物中约25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的细胞包含遗传破坏；不表达靶向的内源性多肽，不包含靶向的基因的连续和/或功能性拷贝。在一些实施方式中，根据本公开的方法、组合物和细胞包括这样的方法、组合物和细胞，其中引入了用于敲除或遗传破坏(例如，插入缺失和/或取代)靶向的基因的试剂(例如，gRNA/Cas核酸酶)的细胞组合物中至少或大于约25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的细胞不表达靶向的多肽。在一些实施方式中，其中引入了用于敲除或遗传破坏(例如，插入缺失和/或取代)靶向的基因的试剂(例如，gRNA/Cas核酸酶)的细胞组合物中至少或大于约25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的细胞在两个等位基因中被敲除，即在这类百分比的细胞中，包含双等位基因缺失。

在一些实施方式中，提供了这样的组合物和方法，其中靶基因中或其附近(例如，在切割位点上游或下游100个碱基对之内或约100个碱基对之内，50个碱基对之内或约50个碱基对之内，25个碱基对之内或约25个碱基对之内或10个碱基对之内或约10个碱基对之内)的Cas9介导的切割效率(例如，％插入缺失，％取代)是其中已经引入了用于敲除或遗传破坏靶向的基因的试剂(例如，gRNA/Cas)的细胞组合物中的细胞的至少或大于约25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％。

在一些实施方式中，提供的细胞、组合物和方法导致其中引入了用于敲除或遗传破坏靶向的基因的试剂(例如，gRNA/Cas核酸酶)的细胞组合物中至少或大于约25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的细胞中内源性传递的信号减少或破坏。

在一些实施方式中，在相同条件下评估时，相较于对应或参照组合物中细胞的表型，组合物中的细胞保留了细胞的表型。在一些实施方式中，在相同条件下评估时，相较于对应或参照组合物中细胞的表型，除了破坏靶基因对细胞的影响外，组合物中的细胞保留了细胞的表型。

在一些实施方式中，组合物中的细胞包括但不限于，原初细胞，效应记忆细胞，中心记忆细胞，干中心记忆细胞，效应记忆细胞和长寿命效应记忆细胞。在一些实施方式中，细胞包括但不限于，免疫抑制细胞，如调节T细胞(Treg)，经修饰具有直接免疫抑制性的非Treg(例如，通过分泌IL-10或TGF-B)，和经修饰具有间接免疫抑制性的非Treg(例如，杀伤抗原呈递细胞(APC)的细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。在一些实施方式中，细胞包括但不限于，树突细胞，骨髓衍生的抑制细胞，免疫调节巨噬细胞，间充质干细胞，多能成年祖细胞，胚胎干细胞，诱导型多潜能干细胞，胸腺祖细胞，免疫调节B细胞，免疫调节NK细胞，免疫调节单核细胞，反抑细胞，先天淋巴样细胞，非变异天然杀伤(NK)T细胞。在一些实施方式中，细胞包括造血细胞及其前体细胞。在一些实施方式中，细胞包括如本文所述修饰的效应T细胞。在一些实施方式中，细胞是任何前述细胞类型的体外衍生的，多潜能干细胞衍生的细胞。

在一些实施方式中，表现出未活化的长寿的记忆或中心记忆表型的包含遗传破坏靶向的基因(例如，NR3C1)的细胞的百分比与不包含遗传破坏的对应或参照群体或细胞组合物相同或基本相同的。在一些实施方式中，可以在体外试验中测量这类性质、活性或表型，如通过测定细胞的免疫抑制活性。在一些实施方式中，可以在电穿孔或其他方式引入试剂之后多天，如在3、4、5、6、7天之后或至多这些天后，评估任何评估的活性、性质或表型。在一些实施方式中，相较于相同条件下包含不含遗传破坏靶向的基因的细胞的对应组合物的活性，组合物中至少80％，85％，90％，95％或100％的细胞保留了这类活性、特性或表型。

如本文所用，述及“对应(的)组合物”或“对应(的)细胞群”(也称为“参照组合物”或“参照细胞群”)指在相同或基本相同的条件下获得、分离、生成、产生和/或孵育的细胞(例如，Treg，Teff)，不同之处在于该细胞或细胞群并未引入所述试剂。在一些方面，除了不包含所述试剂的引入以外，这类细胞以与引入所述试剂的细胞相同或基本相同的方式处理，因此，除了引入所述试剂外，可能会影响细胞活性或性质的任何一种或多种条件(包括抑制性分子的上调和表达)在细胞之间没有改变或者没有显著改变。

用于评估细胞标志物(例如，Treg标志物)表达和/或水平的方法和技术是本领域已知的。用于检测这些标志物的试剂和抗体是本领域已知且易于获得的。用于检测这样的标志物的试验和方法包括但是不限于，流式细胞术，包括胞内流式细胞术，ELISA，ELISPOT，流式微珠阵列或其它多重化的方法，Western印迹和其它基于免疫亲和性的方法。在一些实施方式中，可以通过针对这类细胞特有的标志物的表达的流式细胞术或其他基于免疫亲和力的方法来检测修饰的细胞，然后可以将这类细胞与另一标志物共染色。

在一些实施方式中，所述细胞、组合物和方法提供了待过继转移的造血细胞或其前体细胞(例如，Treg，Teff)中靶基因表达的缺失、敲除、破坏或减少。在一些实施例中，针对原代细胞，诸如自对象的原代造血细胞或其前体细胞(例如，Treg，Teff)，离体进行所述方法。在一些方面中，产生或生成这类细胞的方法包括将能够破坏编码待靶向的内源性基因的基因(例如，NR3C1)的一种或多种试剂引入细胞中，并将钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因引入细胞中。本文所使用术语“引入”涵盖将DNA引入细胞的各种体外或体内方法，这类方法包括转化、转导、转染(例如，电穿孔)和感染。在引入涉及电穿孔的情况中，可以电穿孔多核苷酸(例如，质粒、单链DNA、小环DNA)。载体可用于将DNA编码分子导入细胞。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体，慢病毒载体或其他载体，如腺病毒载体或腺相关载体。

细胞群可以是获自对象的细胞，诸如获自外周血单核细胞(PBMC)样品，脐带血样品，未分级分离的T细胞样品，淋巴细胞样品，白细胞样品，单采产物或白细胞去除术产物。

在一些实施方式中，引入编码钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因的核酸的步骤和引入试剂(例如，Cas/gRNA RNP)的步骤可以同时或以任意顺序依次进行。在一些实施方式中，引入钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因和一种或多种基因编辑试剂(例如，Cas/gRNA RNP)后，将细胞在刺激细胞扩增和/或增殖的条件下培养或孵育。

因此，提供了增强过继细胞疗法中细胞(如Treg)功能的细胞、组合物和方法，包括提供功效改善的那些，诸如通过增加给予的修饰的细胞的活性和效力，同时保持持久性或随着时间暴露于转移的细胞，或者诸如通过增加给予的修饰的细胞的持久性和/或存活。在一些实施方式中，相较于某些可获得的方法，在将修饰的细胞体内给予对象时，其表现出扩增和/或持久性增强。在一些实施方式中，在将所提供的细胞体内给予对象时，其表现出持久性增强。在一些实施方式中，在给予后，对象中修饰的细胞的持久性大于通过其他方法将实现的持久性，所述其他方法诸如涉及给予通过这样方法遗传工程改造的细胞的那些，所述方法中未向细胞引入这样的试剂，所述试剂减少编码内源性基因(例如，NR3C1)的基因的表达或破坏编码内源性基因(例如，NR3C1)的基因。在一些实施方式中，持久性增大至少或至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。

在一些实施方式中，细胞给予对象后，可以对给予的细胞的持久性的程度或范围进行检测或定量。例如，在一些实施方式中，使用定量PCR(qPCR)来评价对象血液或血清或器官或组织(例如，疾病部位)中修饰的细胞的量。在一些实施方式中，将持久性定量为每微克DNA中编码例如钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因的DNA或质粒的拷贝，或每微升样品(例如，血液或血清)中表达CNI抗性基因的细胞的数量，或每微升样品中的外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或Treg的总数。在一些实施方式中，还可以进行通常使用对例如钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因编码的蛋白质具有特异性的抗体来检测细胞的流式细胞试验。基于细胞的试验还可以用于检测功能细胞的数量或百分比。

本公开提供了用于产生或生成本发明钙依赖磷酸酶抑制剂抗性修饰的细胞(例如，Treg)的方法。一般通过引入编码外源性钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因产物的一种或多种遗传工程改造的核酸对细胞进行工程改造。在一些实施方式中，还将编码外源CNI抗性基因产物的核酸与能够破坏靶向的基因(例如，NR3C1)的试剂(例如，Cas9/gRNA RNP)同时或依次引入细胞。

在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因(例如，编码钙依赖磷酸酶变体)通过同源性定向修复(HDR)插入基因组。如本文所用，“同源性定向修复”或“HDR”是修复细胞中双链DNA断裂的机制。HDR通常依赖于同源重组的过程，从而将一段核酸序列同源物用于修复双链DNA断裂。在HDR期间，核酸供体的同源序列的一条链侵入或杂交切割的DNA的切除部分。使用切除的DNA作为引物的DNA聚合酶使用侵入的供体序列作为模板延长切割的DNA。延伸和断裂修复后，切割位点处的新序列具有修复过程中使用的核酸供体中存在的任何序列。HDR的过程进一步描述于Jasin等(冷泉港出版社.Perspect.Biol.2013年11月；5(11)：a012740)中，通过引用纳入本文。

在一些实施方式中，核酸供体模板(例如，用于插入CNI抗性基因)可以与基因编辑复合物(例如，CRISPR/Cas系统)一起使用，以在宿主细胞同源靶核酸中的特定核苷酸位置处能够进行基因组工程改造(例如，在特定等位基因处为复合杂合的同源染色体)。在一些方面，本公开提供了用于靶向的基因编辑的方法，该方法包括将重组基因编辑复合物的至少一种组分与核酸供体模板一起递送至细胞(例如，疾病对象的细胞)，在这样的条件下，使得重组基因编辑复合物在染色体中的靶位点中引起遗传损伤(例如，缺口或双链断裂)，并且本发明的供体模板介导修复机制(例如，HDR)，从而修复损伤。

在某些实施方式中，核酸供体模板(在本文中也称为外源性供体DNA序列)促进钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因(例如，突变/变体钙依赖磷酸酶基因)经由同源重组插入NR3C1基因座中。因此，在某些实施方式中，使用包含SEQ ID NO：11所示核酸序列的外源性供体DNA序列通过同源重组将突变型钙依赖磷酸酶基因插入NR3C1基因座中。本文在图15提供了外源性供体DNA序列的示意图。

在一些实施方式中，供体DNA序列可以包含转录控制元件，例如但不限于，MND启动子、CMB启动子、EF-1α启动子、PGK启动子。在一些实施方式中，供体DNA序列可以包含报告分子，例如但不限于，荧光标志物(例如，GFP)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经生长因子受体(NGFR)、诱导型胱天蛋白酶。在供体DNA序列包含主要插入元件(例如，CNI抗性基因)和次要元件(例如，报告分子)的情况中，可能需要协同表达。协同表达一种或多种基因的各种方法为本领域所知。在一些实施方式中，主要插入元件(例如，CNI抗性基因)和次要插入元件(例如，GFP)通过接头分开。用于本公开的接头允许由同一核酸序列(例如，多顺反子或双顺反子序列)编码多个蛋白质，其被翻译成将解离成单独的蛋白质组分的多蛋白。例如，用于本公开包含CNI抗性基因和报告基因的供体核酸的接头允许CNI抗性基因产物和报告基因产物翻译成将解离成单独的CNI抗性基因产物和报告基因产物组分的多蛋白。

在一些实施方式中，接头包含编码内部核糖体进入位点(IRES)的核酸序列。如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”指促进直接内部核糖体进入蛋白质编码区起始密码子(如ATG)，从而引起该基因的帽非依赖性翻译的元件。各种内部核糖体进入位点是本领域技术人员已知的，包括但不限于，可从病毒或细胞mRNA来源获得的IRES，例如，免疫球蛋白重链结合蛋白或结合免疫球蛋白(BiP)；血管内皮生长因子(VEGF)；成纤维细胞生长因子2；胰岛素样生长因子；翻译起始因子eIF4G；酵母转录因子TFIID和HAP4；和可获自例如心病毒、鼻病毒、水痘病毒、HCV，弗云德(Friend)鼠白血病病毒(FrMLV)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)的IRES。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适IRES。

在一些实施方式中，接头包含编码自切割肽的核酸序列。如本文所用，“自切割肽”或“2A肽”指寡肽，其允许将多种蛋白质编码为在翻译后解离成组分蛋白质的多蛋白。术语“自切割”的使用并不旨在暗示蛋白水解切割反应。多种自切割或2A肽为本领域技术人员已知，包括但不限于，小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)病毒科成员中发现的那些，例如，口蹄疫疾病病毒(FMDV)，马鼻炎A病毒(ERAV，明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒和猪捷申病毒1(porcine tescho virus-1，PTV-1)；和卡瑞病毒(carioviruses)，如泰勒病毒(Theilovirus)和脑心肌炎病毒。衍生自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽在本文中分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适自切割肽。

在一些实施方式中，接头还包含编码弗林蛋白酶切割位点的核酸序列。弗林蛋白酶是普遍表达的蛋白酶，其位于反式高尔基体中并在蛋白质前体分泌之前对其进行加工。弗林蛋白酶在其共有识别序列的COOH-末端切割。本领域技术人员已知多种弗林蛋白酶共有识别序列(或“弗林蛋白酶切割位点”)，包括但不限于，Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO：12)或Arg-X-Arg-Arg(SEQ ID NO：13)，X1-Arg-X-X1-Arg(SEQ ID NO：14)和Arg-XX-Arg(SEQ IDNO：15)，如Arg-Gln-Lys-Arg(SEQ ID NO：16)，其中X是任何天然存在的氨基酸，而X1是Arg或Lys。本领域技术人员将能够选择用于本发明的合适弗林蛋白酶切割位点。

本文所用术语“核酸供体”或“核酸供体模板”或“供体模板”或“供体序列”或“供体”或“核酸插入物”或“插入物”指任何核酸序列，例如，脱氧核糖核酸，其可以在修复机制中用作修复模板(例如，同源定向修复(HDR))。核酸供体可以是双链或单链的，例如，双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA)。本公开内容的核酸供体可以包含不同的多核苷酸长度。在某些实施方式中，核酸供体的长度可以小于约100个核苷酸，长度为约100个核苷酸，长度为约200个核苷酸，长度为约300个核苷酸，长度为约400个核苷酸，长度为约500个核苷酸，长度为约600个核苷酸，长度为约700个核苷酸，长度为约800个核苷酸，长度为约900个核苷酸，长度为约1000个核苷酸，或长度大于约1000个核苷酸。长度小于或等于200个核苷酸的核酸供体也可以称为“短”核酸供体。在某些实施方式中，核酸供体是单链供体寡核苷酸(ssODN)。待插入细胞基因组中的核酸供体可以具有如技术人员所需的任何核苷酸长度。例如，但不以任何方式限制，核苷酸部分可以短至单个核苷酸或大于10千碱基。

在一些实施方式中，本公开的核酸供体包含待插入细胞基因组中的核苷酸序列，例如，待插入细胞基因组中的外源性序列。外源性序列可以包含基因(例如，钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因)。该基因可以编码蛋白质，如治疗性蛋白质或可选择标志物蛋白质(例如，钙依赖磷酸酶变体)。在某些实施方式中，可选择标志物可以编码可选择标志物蛋白质，其赋予对减少细胞生长或导致细胞死亡的试剂的抗性。这类试剂的实例包括但不限于，氨苄青霉素、杀稻瘟素、博来霉素(bleomycin)、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、新霉素、草丁膦，嘌呤霉素，四环素和博莱霉素(zeocin)。在其他实施方式中，可选择标志物可以编码荧光或发光蛋白(例如，荧光素酶或GFP)。该基因可以源自将要插入基因的细胞的同一物种有生物体。该基因可以源自将要插入基因的细胞的不同物种生物体。该基因可以是包含多个物种的序列的嵌合序列。核酸供体可以包含编码非编码RNA的序列。非编码RNA的实例包括但不限于，转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小RNA，如siRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、外泌体RNA(exRNA)。核酸供体可以包含未表达的序列。核酸供体可以包含减少或消除细胞中内源性基因表达的序列。

在HDR介导的基因编辑的情况中，本公开的核酸供体进一步在5′端和3′端包含同源臂，例如，第一同源臂和第二同源臂。同源臂是与细胞基因组中靶位点具有足够同源性以介导HDR的核酸序列。各同源臂可以包含不同的多核苷酸长度。本领域技术人员将理解的是，同源臂核酸序列是如上所述现有核酸供体序列的延伸。

在某些实施方式中，第一同源臂的长度可以为约20个核苷酸至约1000个核苷酸。在某些实施方式中，第一同源臂的长度可以小于约20个核苷酸，长度为约20个核苷酸，长度为约30个核苷酸，长度为约40个核苷酸，长度为约50个核苷酸，长度为约60个核苷酸，长度为约70个核苷酸，长度为约80个核苷酸，长度为约90个核苷酸，长度为约100个核苷酸，长度为约200个核苷酸，长度为约300个核苷酸，长度为约400个核苷酸，长度为约500个核苷酸，长度为约600个核苷酸，长度为约700个核苷酸，长度为约800个核苷酸，长度为约900个核苷酸长，长度为约1000个核苷酸长或长度大于约1000个核苷酸。

在某些实施方式中，第二同源臂的长度可以为约20个核苷酸至约1000个核苷酸。在某些实施方式中，第二同源臂的长度可以小于约20个核苷酸，长度为约20个核苷酸，长度为约30个核苷酸，长度为约40个核苷酸，长度为约50个核苷酸，长度为约60个核苷酸，长度为约70个核苷酸，长度为约80个核苷酸，长度为约90个核苷酸，长度为约100个核苷酸，长度为约200个核苷酸，长度为约300个核苷酸，长度为约400个核苷酸，长度为约500个核苷酸，长度为约600个核苷酸，长度为约700个核苷酸，长度为约800个核苷酸，长度为约900个核苷酸长，长度为约1000个核苷酸长或长度大于约1000个核苷酸。

在某些实施方式中，核酸供体的第一和第二同源臂可以包含不同的核苷酸长度。作为出于说明性目的的示例，而非限制，核酸供体5′端处的同源臂(第一同源臂)的长度可以是100个核苷酸，而核酸供体3′端处的同源臂酸(第二同源臂)的长度可以是150个核苷酸。

在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因(例如，编码钙依赖磷酸酶变体)通过表达载体引入细胞。本文提供了包含编码本发明的钙调神经磷酸变体的核酸序列的表达载体。合适的表达载体包括，慢病毒载体，γ逆转录病毒载体，泡沫病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体，腺病毒载体，工程改造的杂交病毒，裸DNA，包括但不限于转座子介导的载体，如睡美人(Sleeping Beauty)、Piggybac和整合酶，如Phi31。一些其他合适的表达载体包括单纯疱疹病毒(HSV)和逆转录病毒表达载体。

腺病毒表达载体基于腺病毒，其整合到基因组DNA中的能力低，但转染宿主细胞的效率高。腺病毒表达载体包含腺病毒序列，所述腺病毒序列足以：(a)支持表达载体的包装和(b)最终在宿主细胞中表达钙依赖磷酸酶变体。在一些实施方式中，腺病毒基因组是36kb的线性双链DNA，其中外源DNA序列(例如，编码钙依赖磷酸酶变体的核酸)可以插入以取代大片段的腺病毒DNA，从而制造本发明的表达载体(参见例如，Danthinne和Imperiale，GeneTherapy(2000)7(20)：1707-1714)。

另一表达载体基于腺相关病毒，其利用了腺病毒偶联的系统。该AAV表达载体整合到宿主基因组中的频率高。其可以感染未分裂的细胞，因此使其能够用于将基因传递到哺乳动物细胞中，例如，在组织培养物中或体内。AAV载体具有广泛的感染宿主范围。本领域已知各种AAV载体，包括但不限于，衍生自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9或AAVrh10的那些。关于AAV载体的产生和使用的细节在美国专利号5,139,941和4,797,368中描述。

逆转录病毒表达载体能够整合到宿主基因组中，递送大量外来遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型，并且在特殊的细胞系中进行包装。逆转录病毒载体这样构建：通过将核酸(例如，编码钙依赖磷酸酶变体的核酸)插入病毒基因组中某些位置，以产生复制缺陷型病毒。虽然逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型，但是钙依赖磷酸酶变体的整合和稳定表达需要宿主细胞分裂。

慢病毒载体源自慢病毒，慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env，还包含其他具有调节性或结构功能的基因(例如，参见美国专利号6,013,516和5,994，136)。慢病毒的一些示例包括人免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体是通过对HIV毒力基因进行多重减毒产生的，例如，将env、vif、vpr、vpu和nef基因删除，从而产生生物学上安全的载体。慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可以用于体内和离体基因转移和表达，例如，编码钙依赖磷酸酶变体的核酸的体内和离体基因转移和表达(参见，例如，美国专利号5,994,136)。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法将包含本公开的核酸的表达载体引入宿主细胞。如果需要，表达载体可以包括用于转染的病毒序列。或者，可以通过融合、电穿孔、基因枪、转染、脂转染等引入表达载体。可以在引入表达载体之前在培养基中培养并扩增宿主细胞，然后进行适当的处理以引入和整合载体。然后扩增宿主细胞，并可以通过载体中存在的标志物进行筛选。可以使用的各种标志物是本领域已知的，并且可以包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。在一些实施方式中，宿主细胞是造血细胞或其前体，例如，Treg、T细胞、NK细胞或NKT细胞。

本发明还提供了遗传工程改造的细胞，其包含并稳定表达本公开的钙依赖磷酸酶变体。在一些实施方式中，遗传工程改造的细胞是能够产生与治疗相关的后代的遗传工程改造的调节T细胞(Treg)，T淋巴细胞(T细胞)，原初T细胞(TN)，记忆T细胞(例如，中心记忆T细胞(TCM)，效应记忆细胞(TEM))，天然杀伤细胞(NK细胞)和巨噬细胞。在一个实施方式中，遗传工程改造的细胞是自体的细胞。

可以通过用包含本公开的核酸的表达载体稳定转染宿主细胞来产生修饰的细胞(例如，包含钙依赖磷酸酶变体)。生成本公开修饰的细胞的其他方法包括但不限于，化学转化方法(例如，使用磷酸钙、树状聚合物、脂质体和/或阳离子聚合物)，非化学转化方法(例如，电穿孔、光学转化、基因电转移和/或流体力学递送)和/或基于颗粒的方法(例如，纳米纤维插入(impalefection)，使用基因枪和/或磁转染)。表达本公开钙依赖磷酸酶变体的转染细胞可以离体扩增。

用于将表达载体引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法为本领域所熟知。参见例如，Sambrook等(2001)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约。用于将表达载体引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂，胶束，混合胶束和脂质体。

适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获自密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，Mo.)；磷酸二十六烷基酯(“DCP”)可以获自从K＆K实验室公司(纽约州普莱恩维尤)；胆固醇(“Choi)可以获自卡巴开-贝林公司(Calbiochem-Behring)；肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以获自阿凡提极性脂质制品有限公司(Avanti Polar Lipids，Inc.)(阿拉巴马州的伯明翰)。在氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储液可以储存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。”脂质体“是通用术语，包括通过产生封闭的脂质双分子层或聚集体形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有水性介质隔开的多重脂质层。当磷脂悬浮在过量水溶液中时其自动形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自我重排，并且在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等，1991Glycobiology 5：505-10)。也包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质体(lipofectamine)-核酸复合物。

无论用于将外源核酸引入宿主细胞中还是以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了证实宿主细胞中核酸的存在，可以进行多种试验。这类试验包括，例如，本领域技术人员熟知的分子生物学试验，例如Southern和Northern印迹，RT-PCR和PCR；生物化学试验，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)或通过本文所述试验鉴定落入本发明范围内的试剂。

在一个实施方式中，引入宿主细胞的核酸是RNA。在另一实施方式中，RNA是mRNA，其包含体外转录的RNA或合成RNA。可以使用聚合酶链反应(PCR)生成的模板通过体外转录产生RNA。使用适当的引物和RNA聚合酶，可以通过PCR将来自任何来源感兴趣的DNA直接转化为模板用于体外mRNA合成。例如，DNA的来源可以是基因组DNA，质粒DNA，噬菌体DNA，eDNA，合成DNA序列或任何其他合适来源的DNA。

PCR可用于产生用于体外转录mRNA的模板，然后将其引入细胞。进行PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与将用作PCR模板的DNA区域基本互补的区域。本文所用“基本互补”指其中引物序列中的大部分或全部碱基是互补的核苷酸序列。基本互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与目标DNA靶标退火或杂交。引物可以设计成与DNA模板的任何部分基本互补。例如，引物可以设计成扩增通常在细胞中转录的基因的部分(开放阅读框)，包括5′和3′UTR。引物还可以设计成扩增编码感兴趣的特定结构域的基因的部分。在一个实施方式中，引物被设计成扩增人cDNA的编码区，包括5′和3′UTR的全部或部分。通过本领域众所周知的合成方法生成能够用于PCR的引物。“正向引物”是这样的引物，其包含与待扩增DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本互补的核苷酸区域。本文所用“上游”指相对于编码链，待扩增的DNA序列的5位置。“反向引物”是这样的引物，其包含与待扩增DNA序列下游的双链DNA模板基本互补的核苷酸区域。本文所用“下游”指相对于编码链，待扩增的DNA序列3’的位置。

也可以使用具有促进RNA稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选具有5′和3′UTR。在一个实施方式中，5′UTR的长度为0至3000个核苷酸。可以通过不同的方法改变待添加至编码区的5′和3′UTR序列的长度，包括但不限于，设计退火至UTR不同区域的PCR引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以在转录的RNA转染后修饰实现最佳翻译效率所需的5′和3′UTR长度

5′和3′UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源性5′和3′UTR。或者，通过将UTR序列纳入正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰，可以添加对于感兴趣的基因不具有内源性的UTR序列。使用对于感兴趣的基因不具有内源性的UTR序列对于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率可以是有用的。例如，已知3′UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域众所周知的UTR的特性来选择或设计3′UTR以增加转录的RNA的稳定性。

在一个实施方式中，5′UTR可以包含内源性基因的Kozak序列。或者，在对于感兴趣的基因不具有内源性的5′UTR是如上所述通过PCR添加时，可以通过添加5′UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以增加某些RNA转录本的翻译效率，但似乎并非所有RNA的高效翻译所需要。本领域已知许多mRNA对Kozak序列的需求。在其他实施方式中，5′UTR可以衍生自RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方式中，各种核苷酸类似物可用于3′或5′UTR，以阻碍mRNA的外切核酸酶降解。

为了能够在不需要基因克隆的情况下由DNA模板合成RNA，应当将转录的启动子连接到待录的序列上游的DNA模板上。在将作为RNA聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5′端时，RNA聚合酶启动子被纳入待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个实施方式中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他有用的启动子包括但不限于，T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列为本领域已知。

在一个实施方式中，mRNA具有5′端上的帽和3′多聚(A)尾，其确定核糖体结合，翻译的起始和细胞中mRNA的稳定性。在环状DNA模板(例如质粒DNA)上，RNA聚合酶产生长共聚产物，其不适合在真核细胞中表达。在3′UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在真核转染中不起作用，即使其在转录后经聚腺苷酸化。

在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录本的3′端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf，Nuc Acids Res.，13：6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.，270：1485-65(2003))。

转录DNA模板的多聚A/T区段可以这样产生：在PCR期间通过使用含有多聚T尾(如100T尾(大小可以为50-5000T))的反向引物，或在PCR后通过任何其他方法，包括不限于DNA连接或体外重组。多聚(A)尾还为RNA提供了稳定性并减少其降解。通常，多聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一个实施方式中，多聚(A)尾为100-5000个腺苷。

使用多聚(A)聚合酶，如大肠杆菌多聚A聚合酶(E-PAP)在体外转录后可以进一步延长RNA的多聚(A)尾。在一个实施方式中，将多聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300-400个核苷酸之间导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，将不同的化学基团连接到3′端可以增加mRNA稳定性。这类附连可以包含修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用多聚(A)聚合酶将ATP类似物纳入多聚(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA稳定性。

5′帽也为RNA分子提供稳定性。在一个优选实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5′帽。使用本领域已知的以及本文所述的技术提供5′帽(Cougot，等，Trends inBiochem.Sci.，29：436-444(2001)；Stepinski，等，RNA，7：1468-95(2001)；Elango，等，Biochim.Biophys.Res.Commun.，330：958-966(2005))。

在一些实施方式中，将RNA电穿孔到细胞中，诸如体外转录的RNA。可以包括适合电穿孔的任何溶质，其可以包含促进细胞渗透性和活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。

在一些实施方式中，编码本公开钙依赖磷酸酶变体的核酸将是RNA，例如，体外合成的RNA。本领域已知用于RNA体外合成的方法；可以使用任何已知方法来合成包含编码钙依赖磷酸酶变体序列的RNA。将RNA引入宿主细胞的方法是本领域已知的。参见例如，Zhao等Cancer Res.(2010)15：9053。将包含编码钙依赖磷酸酶变体的核苷酸序列的RNA引入宿主细胞可以在体外或离体或体内进行。例如，可以用包含编码钙依赖磷酸酶变体的核苷酸序列的RNA在体外或离体电穿孔宿主细胞(例如，Treg、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)。

在癌症、干细胞、急性和慢性感染、自身免疫性疾病、细胞疗法和基因疗法的领域中，公开的方法可以适用于基础研究和治疗中调节T细胞活性，包括评估遗传修饰的T细胞杀伤靶癌细胞的能力。

所述方法还提供了通过改变例如启动子或输入RNA的量来在宽范围内控制表达水平的能力，从而可以单独调节表达水平。此外，基于PCR的mRNA生产技术极大地促进了具有不同结构及其结构域组合的mRNA的设计。

本发明的RNA转染方法的一个优点是RNA转染基本上是瞬时的且无载体。可以在短暂的体外细胞激活后将RNA转基因作为最小表达盒递送到淋巴细胞并在其中表达，无需任何其他病毒序列。在这些条件下，整合转基因到宿主细胞基因组中的可能性不大。因为RNA的转染效率及其均一修饰整个淋巴细胞群的能力，所以克隆细胞不是必须的。

用体外转录的RNA(IVT-RNA)对细胞进行遗传修饰利用了两种不同的策略，这两种策略已在多种动物模型中进行了连续测试。通过脂质转染或电穿孔用体外转录的RNA转染细胞。希望的是使用各种修饰来稳定IVT-RNA，从而实现转移的IVT-RNA的表达延长。

一些IVT载体在文献中是已知的，其以标准化方式用作体外转录的模板，并且已经以产生稳定的RNA转录物的方式进行了遗传修饰。当前，本领域中使用的方案基于具有下述结构的质粒载体：能够进行RNA转录的5′RNA聚合酶启动子，随后是通过非翻译区(UTR)侧接3′和/或5′的感兴趣的基因，和包含50-70个A核苷酸的3′聚腺苷酸盒。体外转录前，通过II型限制酶将聚腺苷酸盒下游的环状质粒线性化(识别序列对应于切割位点)。因此，聚腺苷酸盒对应转录本中的后一个多聚(A)序列。该过程的结果是一些核苷酸在线性化后仍然作为酶切割位点的部分，并在3′端延伸或掩盖了多聚(A)序列。尚不清楚这种非生理性突出端是否会影响由这类构建体胞内产生的蛋白质的量。

在另一方面中，RNA构建体通过电穿孔递送到细胞中。参见例如，如US2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教导的将核酸构建体电穿孔到哺乳动物细胞中的制剂和方法。在相关研究文献以及该领域中的许多专利和申请中通常已知各种参数，包括任何已知细胞类型的电穿孔所需的电场强度。参见例如，美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗应用的装置是可以商购的，例如，MedPulser^TM DNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics公司，加利福尼亚州圣地亚哥)，并且述于专利中，诸如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223，美国专利号5,993,434，美国专利号6,181,964，美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482；电穿孔还可以用于体外细胞转染，如US20070128708A1中所述。还可以利用电穿孔将核酸体外递送到细胞中。因此，利用本领域技术人员已知的多种可用装置和电穿孔系统中任一种将核酸(包括表达构建体)电穿孔介导地给予细胞提供了令人兴奋的新手段，用于将感兴趣的RNA递送到靶细胞。

在一些实施方式中，可以在引入编码外源性钙依赖磷酸酶变体和基因编辑剂(例如，Cas9/gRNA RNP)的核酸分子之前、期间和/或之后孵育或培养细胞(例如，多潜能干细胞，Treg)。在一些实施方式中，可以在引入编码外源性受体的核酸分子之前、期间或之后，如在用编码所述外源性受体的病毒载体(例如，慢病毒载体)转导细胞之前、期间或之后，孵育或培养细胞(例如，多潜能干细胞，Treg)。在一些实施方式中，可以在引入基因编辑剂(例如，Cas9/gRNA RNP)之前、期间或之后，如在将细胞与所述基因编辑剂接触之前、期间或之后或在将所述试剂递送到细胞中，例如经由电穿孔，之前、期间或之后，孵育或培养细胞(例如，T细胞)。在一些实施方式中，可以在引入编码外源性受体的核酸分子并引入基因编辑剂(例如，Cas9/gRNA RNP)的情况下进行孵育。

在一些实施方式中，在引入编码钙依赖磷酸酶变体的核酸分子之后，引入基因编辑剂，例如，Cas9/gRNA RNP。在一些实施方式中，在引入试剂之前，细胞是静置的，例如通过去除任何刺激剂或活化剂。在一些实施方式中，在引入试剂之前，不除去刺激剂或活化剂和/或细胞因子。本领域技术人员将能够确定将一个或多个核酸序列中各核苷酸序列引入宿主细胞的顺序。

因此，提供了用于生成修饰的造血细胞或其前体细胞的方法，其包括将CRISPR系统引入细胞，所述CRISPR系统在NR3C1的外显子2中产生插入缺失，其中所述插入缺失能够下调NR3C1的基因表达。在一个示例性的实施方式中，该方法还包括将外源性钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因插入细胞的基因组，其中所述插入发生在插入缺失NR3C1的位点。

D.核酸和表达载体

本公开提供了编码外源性钙依赖磷酸酶变体的核酸。在一些实施方式中，本公开的核酸可以操作性地连接转录控制元件，例如启动子和增强子等。本领域技术人员已知合适的启动子和增强子元件。

为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于，lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于，轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于逆转录病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和各种本领域已知的组织特异性启动子。本领域已知合适的可逆启动子，包括可逆诱导型启动子。这类可逆启动子可以分离并衍生自许多生物体，例如，真核生物和原核生物。本领域熟知修饰衍生自第一生物体的可逆启动子以用于第二生物中，例如第一原核生物和第二真核生物、第一真核生物和第二原核生物等。这类可逆启动子以及基于这类可逆启动子但是还包含其他对照蛋白的系统包括但不限于，乙醇调节型启动子(例如，乙醇脱氢酶I(alcA)基因启动子，对乙醇反式激活蛋白(A1cR)有反应的启动子等)，四环素调节型启动子(例如，包括TetActivator、TetON、TetOFF等的启动子系统)，类固醇调节型启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统，人雌激素受体启动子系统，类视黄醇启动子系统，甲状腺启动子系统，蜕皮激素启动子系统，米非司酮启动子系统等)，金属调节型启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)，病程相关调节型启动子(例如，水杨酸调节型启动子，乙烯调节型启动子，苯并噻二唑调节型启动子等)，温度调节型启动子(例如，热激诱导型启动子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆热激启动子等)，光调节型启动子，合成诱导型启动子等。

在一些实施方式中，启动子是CD8细胞特异性启动子，CD4细胞特异性启动子，嗜中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。例如，可以使用CD4基因启动子；参见例如，Salmon等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：7739；和Marodon等(2003)Blood 101：3416。作为另一示例，可以使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可以通过使用NcrI(p46)启动子来实现；参见例如，Eckelhart等.Blood(2011)117：1565。

为了在酵母细胞中表达，合适的启动子是组成型启动子，如ADH1启动子，PGK1启动子，ENO启动子，PYK1启动子等；或可调节启动子，如GAL1启动子，GAL10启动子，ADH2启动子，PHOS启动子，CUP1启动子，GALT启动子，MET25启动子，MET3启动子，CYC1启动子，HIS3启动子，ADH1启动子，PGK启动子，GAPDH启动子，ADC1启动子，TRP1启动子，URA3启动子，LEU2启动子，ENO启动子，TP1启动子和AOX1(例如，用于毕赤酵母(Pichia)中)。选择适当的载体和启动子完全在本领域普通技术人员的能力范围内。适合用于原核宿主细胞的启动子包括但不限于，噬菌体T7 RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如，lac/tac杂合启动子，tac/trc杂合启动子，trp/lac启动子，T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；araBAD启动子；体内调节型启动子，如ssaG启动子或相关启动子(参见例如，美国专利公开号20040131637)，pagC启动子(Pulkkinen和Miller，J.Bacteriol.(1991)173(1)：86-93；Alpuche-Aranda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21)：10079-83)，nirB启动子(Harborne等Mol.Micro.(1992)6：2805-2813)等(参见例如，Dunstan等，Infect.Immun.(1999)67：5133-5141；McKelvie等，Vaccine(2004)22：3243-3255；和Chatfield等，Biotechnol.(1992)10：888-892)；σ70启动子，例如，共有σ70启动子(参见例如，GenBank登录号AX798980、AX798961和AX798183)；固定相启动子，例如，dps启动子、spv启动子等；源自致病岛SPI-2的启动子(参见例如，WO96/17951)；actA启动子(参见例如，Shetron-Rama等，Infect.Immun.(2002)70：1087-1096)；rpsM启动子(参见例如，Valdivia和FalkowMol.Microbiol.(1996).22：367)；tet启动子(参见例如，Hillen，W.和Wissmann，A.(1989)In Saenger，W.和Heinemann，U.(编著)，《分子和结构生物学专题：蛋白质-核酸相互作用》(Topics in Molecular and Structural Biology，Protein--Nucleic AcidInteraction).麦克米伦出版社(Macmillan)，英国伦敦，第10卷，第143-162页)；SP6启动子(参见例如，Melton等，Nucl.Acids Res.(1984)12：7035)；等。用于原核生物如大肠杆菌的合适的强启动子包括但不限于，Trc、Tac、T5、T7和Pλ。用于细菌宿主细胞的操纵子的非限制性示例包括乳糖启动子操纵子(LacI阻遏蛋白在与乳糖接触时改变构象，从而防止Lad阻遏蛋白与操纵子结合)，色氨酸启动子操纵子(与色氨酸复合时，TrpR阻遏蛋白具有结合操纵子的构象；在不存在色氨酸的情况下，TrpR阻遏蛋白具有不与操纵子结合的构象)和tac启动子操纵子(参见例如，deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80：21-25)。

合适的启动子的其他示例包括立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其操作性连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于，猿猴病毒40(SV40)早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)或人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子，MoMuLV启动子，禽白血病病毒启动子，EB病毒立即早期启动子，鲁斯氏肉瘤病毒启动子，EF-1α启动子，以及人基因启动子，例如但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应当被限制于组成型启动子的使用。还考虑了诱导型启动子作为本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其能够在需要与其操作性连接的多核苷酸序列表达时开启这样的表达，或者在不需要表达时关闭这样的表达。诱导型启动子的示例包括但不限于，金属硫蛋白启动子，糖皮质激素启动子，孕酮启动子和四环素启动子。

在一些实施方式中，通过诱导型系统的诱导不可逆地切换含有合适启动子的基因座或构建体或转基因。本领域熟知用于诱导不可逆开关的合适系统，例如，诱导不可逆开关可以使用Cre-lox介导的重组(参见例如，Fuhrmann-Benzakein，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28：e99，其公开内容通过引用纳入本文)。本领域已知的重组酶、内切核酸酶、连接酶、重组位点等的任何合适的组合可用于生成不可逆开关启动子。本文其他地方描述的用于进行位点特异性重组的方法、机制和要求可用于生成不可逆开关启动子，并且是本领域众所周知的，参见例如，Grindley等生物化学年评(Annual Reviewof Biochemistry)(2006)567-605；和Tropp，《分子生物学》(Molecular Biology)(2012)(琼斯和巴特利特出版社(Jones＆Bartlett Publishers)，马萨诸塞州萨德伯里)，其公开内容通过引用纳入本文。

本公开的核酸可以存在于表达载体和/或克隆载体内。表达载体可以包括可选择标志物、复制起点和提供载体复制和/或维持的其他特征。合适的表达载体包括例如质粒、病毒载体等。大量合适的载体和启动子为本领域技术人员已知；许多可以商购，用于生成对象重组构建体。下述载体作为示例提供，并且无论以任何方式都不应认为是限制性的：细菌：pBs，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBs KS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(司查塔基公司(Stratagene)，美国加利福尼亚州拉由拉市)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540和pRIT5(法玛西亚公司(Pharmacia)，瑞典乌普萨拉)；真核生物：pWLneo，pSV2cat，pOG44，PXR1，pSG(司查塔基公司)pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL(法玛西亚公司)。

表达载体通常具有位于启动子序列附近方便的限制性位点，以提供编码异源性蛋白的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中可操作的可选择标志物。合适的表达载体包括但不限于，病毒载体(例如，基于牛痘病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如，Li等，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35：2543-2549；Borras等，Gene Ther.(1999)6：515-524；Li and Davidson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：7700-7704；Sakamoto等，H.Gene Ther.(1999)5：1088-1097；WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如，Ali等，Hum.Gene Ther.(1998)9：81-86，Flannery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6916-6921；Bennett等，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38：2857-2863；Jomary等，Gene Ther.(1997)4：683690，Rolling等，Hum.Gene Ther.(1999)10：641-648；Ali等，Hum.Mol.Genet.(1996)5：591-594；Srivastava的WO 93/09239，Samulski等，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等，Virol.(1988)166：154-165；和Flotte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见例如，Miyoshi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：10319-23；Takahashi等，J.Virol.(1999)73：7812-7816)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒，脾坏死病毒，和衍生自诸如下述逆转录病毒的载体，如劳斯肉瘤病毒，哈维肉瘤病毒，禽白血病病毒，人免疫缺陷病毒，骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)；等等。

适合使用的其他表达载体是，例如但不限于，慢病毒载体，γ逆转录病毒载体，泡沫病毒载体，腺相关病毒载体，腺病毒载体，痘病毒载体，疱疹病毒载体，工程改造的杂交病毒载体，转座子介导的载体等。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于例如Sambrook等，2012，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第1-4卷，纽约州冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，以及其它病毒学和分子学生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含：在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。

本发明的载体可以是自灭活载体。本文所用术语“自灭活载体”指其中3′LTR增强子启动子区(U3区)已经修饰(例如，通过缺失或取代)的载体。自灭活载体可能在第一轮病毒复制后阻止病毒转录。因此，自灭活载体可能仅能感染一次然后整合入宿主基因组(例如哺乳动物基因组)，并且不能进一步传递。因此，自灭活载体可能极大地降低了产生具有复制能力的病毒的风险。

在一些实施方式中，本发明的核酸可以是RNA，例如，体外合成的RNA。本领域技术人员已知用于RNA体外合成的方法；可以使用任何已知方法来合成RNA，所述RNA包含编码本公开钙依赖磷酸酶变体的序列。将RNA引入宿主细胞的方法是本领域已知的。参见例如，Zhao等Cancer Res.(2010)15：9053。将包含编码本公开钙依赖磷酸酶变体的核苷酸序列的RNA引入宿主细胞可以在体外或离体或体内进行。例如，可以用包含编码本公开钙依赖磷酸酶变体的核苷酸序列的RNA在体外或离体电穿孔宿主细胞(例如，Treg、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)。

为了评估多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可含有可选择标志物基因或报告基因或两者，以便于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在一些实施方式中，可选择标志物可以由分开的DNA片段携带并用于共转染程序中。可选择标志物和报告基因都可以侧接适当的调控序列，以使其在宿主细胞中表达。有用的可选择标志物包括但不限于抗生素抗性基因。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评估调节序列的功能。通常，报告基因是这样的基因，其在受体生物体或组织中不存在或不表达并且编码多肽，所述多肽的表达通过一些易于检测的性质例如酶活性予以显示。在将DNA引入受体细胞后的合适时间评估报告基因的表达。合适的报告基因可以包括但不限于这样的基因，其编码荧光素酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters 479：79-82)。

E.细胞的来源

适用于本发明的细胞包括但不限于，原初细胞，效应记忆细胞，中心记忆细胞，干中心记忆细胞，效应记忆细胞和长寿命效应记忆细胞。在一些实施方式中，细胞包括但不限于，免疫抑制细胞，如调节T细胞(Treg)，经修饰具有直接免疫抑制性的非Treg(例如，通过分泌IL-10或TGF-β)，和经修饰具有间接免疫抑制性的非Treg(例如，杀伤抗原呈递细胞(APC)的细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。在一些实施方式中，细胞包括但不限于，树突细胞，骨髓衍生的抑制细胞，免疫调节巨噬细胞，间充质干细胞，多能成年祖细胞，胚胎干细胞，诱导型多潜能干细胞，先天淋巴样细胞，非变异天然杀伤(NK)T细胞。在一些实施方式中，细胞包括造血细胞及其前体细胞。

扩增前，由对象获得免疫细胞源用于离体操作。用于离体操作的靶细胞的来源还可包括例如自体同源或异源性供体血液、脐带血或骨髓。例如，免疫细胞的来源可以来自将用本发明修饰的免疫细胞治疗的对象，例如对象的血液、对象的脐带血或对象的骨髓。对象的非限制性示例包括人，狗，猫，小鼠，大鼠及其转基因物种。优选地，对象是人。

免疫细胞可以获自许多来源，包括血液、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带、淋巴或淋巴器官。免疫细胞是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如，骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多能和多潜能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)和诱导性多潜能干细胞(iPSC)。在一些方面中，细胞是人细胞。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。细胞一般是原代细胞，如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些细胞。

在某些实施方式中，免疫细胞是T细胞，例如，CD8+T细胞(例如，CD8+原初T细胞，中心记忆T细胞或效应记忆T细胞)，CD4+T细胞，天然杀伤T细胞(NKT细胞)，调节T细胞(Treg)，干细胞记忆T细胞，淋巴样祖细胞，造血干细胞，天然杀伤细胞(NK细胞)或树突细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。在一个实施方式中，靶细胞是诱导性多潜能干(iPS)细胞或衍生自iPS细胞的细胞，例如，这样的iPS细胞，其产生自对象，经操纵以改变(例如，诱导突变)或操纵一个或多个靶基因的表达，和分化成例如T细胞，例如CD8+T细胞(例如，CD8+原初T细胞，中心记忆T细胞或效应记忆T细胞)，CD4+T细胞，干细胞记忆T细胞，淋巴样祖细胞或造血干细胞。

在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位，和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况，和/或分化程度限定的那些。T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括：原初T(T_N)细胞、效应T细胞(T_EFF)、记忆T细胞及其亚型，如干细胞记忆T(T_SCM)、中心记忆T(T_CM)、效应记忆T(T_EM)、或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的非变体T(MAIT)细胞、天然产生的和过继性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/β T细胞，和δ/γT细胞。在某些实施方式中，可以使用本领域现有的任何数量的T细胞系。

在一些实施方式中，该方法包括由对象分离免疫细胞，制备，加工，培养和/或工程改造它们。在一些实施方式中，经工程改造的细胞的制备包括一种或多种培养和/或一个或多个制备步骤。如所述工程改造的细胞可分离自样品，如生物样品，例如，获自或衍生自对象的生物样品。在一些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有一定疾病或病症或需要细胞治疗或将给予细胞治疗的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗性介入的人，如过继细胞疗法，用于该疗法的细胞是经分离、加工和/或经工程改造的。因此，在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。所述样品包括直接取自对象的组织、体液和其他样品，以及获自一个或多个处理步骤，例如分离、离心、遗传工程改造(例如，采用病毒载体的转导)、洗涤和/或孵育的样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑膜液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。

某些方面，作为衍生或分离细胞来源的样品是血液或血液源性的样品，或者为或衍生自单采或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关的淋巴样组织、粘膜相关的淋巴样组织、脾、其他淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或源自其中的细胞。在细胞治疗(例如，过继细胞治疗)中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方式中，所述细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类，和猪。在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或非基于亲和性的细胞分离步骤。在一些实施例中，细胞在一种或多种反应剂的存在下经洗涤、离心和/或孵育，例如，以去除不需要的组分，富集所需组分，裂解或去除对某些反应剂敏感的细胞。在一些实施例中，细胞基于一种或多种特性如封闭、粘附性质、尺寸、对某些组分的敏感性和/或抗性来分离。

在一些实施例中，通过例如单采或白细胞去除术，获得对象循环血液的细胞。某些方面，所述样品包括淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核血液白细胞、血红细胞和/或血小板，某些方面包括血红细胞和血小板之外的细胞。在一些实施方式中，采自对象的血液细胞经洗涤如去除血浆部分，然后将其置于合适的缓冲液或培养基中留待后用。在一些实施方式中，所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些方面中，洗涤步骤按照生产商说明，通过内切流过滤(TFF)完成。在一些实施方式中，在洗涤后，将细胞重悬于多种生物相容缓冲液中。在某些实施方式中，血液细胞样品中的组分去除后细胞直接重悬于培养基中。在一些实施方式中，所述方法包括基于封闭的细胞分离方法，如通过裂解血红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心来从外周血制备血液白细胞。

在一个实施方式中，免疫细胞获自通过单采或白细胞分离术获得的个体的循环血液。单采产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞、红细胞和血小板。通过单采收集的细胞可以经洗涤以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或缺少钙、并且可能缺少镁、或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子的洗涤液中，用于后续处理步骤。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如，无Ca，无Mg的PBS。或者，可以去除单采样品中不需要的组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方式中，所述分离方法包括，基于细胞中一种或多种特定分子，例如表面标志物，例如，表面蛋白质、胞内标志物或核酸的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可采用任何基于此类标志物进行分离的已知方法。在一些实施方式中，所述分离是基于亲和性或基于免疫亲和性的分离。例如，某些方面，所述分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性地结合此类标志物的抗体或结合伴侣孵育，随后通常是清洗步骤，将已结合所述抗体或结合伴侣的细胞与从未结合至所述抗体或结合伴侣的那些细胞分离。

这类分离步骤可基于正选择，保留已结合所述反应剂的细胞被用于后续应用，和/或负选择，保留未结合至所述抗体或结合伴侣的细胞。在一些实施例中，两种级份均保留用于后续应用。某些方面，当没有可用于在异质群中特异性地鉴定细胞类型的抗体时，负选择可能是特别有用的，这样，分离最好是基于细胞表达的标志物而不是基于想要的细胞群。所述分离的结果必需是特定细胞群或表达特定标志物的细胞的100％的富集或去除。例如，特定类型细胞(如表达某标志物的细胞)的正选择或富集指的是提高此类型细胞的数量或百分数，其结果不必是使不表达该标志物的细胞完全消失。同样地，特定类型细胞(如表达某标志物的细胞)的负选择、去除或消除指的是减少此类细胞的数量或百分数，其结果不必是此类细胞的完全清除。

在一些实施例中，进行多轮分离步骤，其中，对来自一个步骤的正或负选择的级份进行另一分离步骤，例如后续的正或负选择。在一些实施例中，单一分离步骤同时消除表达多种标志物的细胞，例如通过将细胞与分别对负选择目标标志物具有特异性的多种抗体或结合伴侣一同孵育。同样地，可同时正选择多种细胞类型，通过将细胞与不同类型细胞上表达的多种抗体或结合伴侣一同孵育。

在一些实施方式中，富集或消耗的T细胞群中的一种或多种是：呈阳性(标志物⁺)或表达高水平(标志物^高)的一种或多种具体标志物(例如表面标志物)的细胞，或呈阴性(标志物^-)或表达相对较低的水平(标志物^低)的一种或多种标志物的细胞。例如，某些方面，通过正或负选择技术分离特定T细胞亚群，例如一种或多种表面标志物阳性细胞或高表达T细胞，例如，CD28⁺、CD62L⁺、CCR7⁺、CD27⁺、CD127⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺和/或CD45RO⁺T细胞。在一些情况中，此类标志物在某些T细胞群(例如非记忆细胞)上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其它T细胞群(例如记忆细胞)上存在或以相对较高的水平表达的那些。在一个实施方式中，对所述细胞(如CD8⁺细胞或T细胞，例如，CD3⁺细胞)富集(即，正选择)CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L呈阳性或表达高表面水平的CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞，和/或，消耗(例如，负选择)CD45RA阳性或表达高表面水平的CD45RA的细胞。在一些实施方式中，对细胞富集或消耗CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Rα(CD127)阳性细胞或表达高表面水平CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)的细胞。在一些实例中，对CD8⁺T细胞富集CD62L和CD45RO阳性(或CD45RA阴性)细胞。例如，CD3⁺、CD28⁺T细胞可以采用CD3/CD28磁珠(例如，M-450 CD3/CD28 T细胞扩增仪)来正选择。

在一些实施方式中，通过对非T细胞(如B细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标志物(如CD14)进行负选择来从PBMC样品分离T细胞。某些方面，使用CD4⁺或CD8⁺选择步骤来分离CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞。通过针对一种或多种未免疫的、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对高表达的标志物进行正或负选择，可将此类CD4⁺和CD8⁺群进一步分选成亚群。在一些实施方式中，在CD8⁺细胞中进一步富集或消除原初、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞，例如通过基于相应亚群相关表面抗原的正选择或负选择。在一些实施方式中，富集中心记忆T(T_CM)细胞以提高功效，如以改善长期存活、扩增和/或给予后的植入，某些方面，其在此类亚群中特别强势。在一些实施方式中，将T_CM-富集的CD8⁺T细胞与CD4⁺T细胞合并进一步增强功效。

在实施方式中，记忆T细胞存在于CD8⁺外周血淋巴细胞的CD62L⁺和CD62L-亚组。可在PBMC中富集或消除CD62L-CD8⁺和/或CD62L⁺CD8⁺部分，例如采用抗CD8和抗CD62L抗体。在一些实施方式中，对CD4+T细胞群和CD8+T细胞亚群，例如，富集中心记忆(T_CM)细胞的亚群。在一些实施方式中，针对中心记忆T(T_CM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、和/或CD127阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于对表达或高度表达CD45RA和/或端粒酶B的细胞进行负选择。在一些方面中，针对T_CM细胞富集的CD8+群的分离通过如下方式进行：消耗表达CD4、CD14、CD45RA的细胞，和正选择或针对表达CD62L的细胞进行富集。某一方面，富集中心记忆T(T_CM)细胞从基于CD4表达的负选择细胞级份开始，对该级份进行基于CD14和CD45RA表达的负选择和基于CD62L的正选择。某些方面，这些选择同时进行，而在其他方面的内容中，这些选择按任意顺序依次进行。某些方面，将用于制备CD8⁺细胞群或亚群的基于CD4表达的相同选择步骤用于产生CD4⁺细胞群或亚群，这样，基于CD4分离的阳性和阴性级份均被保留用于后续步骤，可以是任选地继以一种或多种进一步的正选择或负选择步骤之后。

通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将辅助CD4⁺T辅助细胞分选成原初、中心记忆和效应细胞。CD4⁺淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，原初CD4⁺T淋巴细胞是CD45RO^-、CD45RA⁺、CD62L⁺、CD4⁺T细胞。在一些实施方式中，中心记忆CD4⁺细胞是CD62L⁺和CD45RO⁺。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。在一个实例中，为了通过负选择针对CD4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD1 1b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方式中，使所述抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质如磁珠或顺磁珠，从而能够分离正选择和/或负选择的细胞。

在一些实施方式中，在遗传工程改造之前或与遗传工程改造一起孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、孵育、刺激、活化、和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育细胞或组合物。这类条件包括设计成诱导群中细胞增殖、繁殖、活化，和/或存活，模拟抗原接触，和/或细胞预备以备基因改造如导入重组抗原受体的那些条件。所述条件可包括如下一项或多项：特定培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、用剂如营养物、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和设计用来活化细胞的任何其他物质。在一些实施方式中，刺激条件或用剂包括一种或多种物质如配体，它能够活化TCR复合物的胞内信号传导结构域。某些方面，所述物质打开或启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号传导级联。这样的物质可包括抗体如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如抗-CD3、抗-CD28，所述抗体可以例如结合在固体支持物如珠上，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(如以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体。在一些实施方式中，刺激剂包括1L-2和/或IL-15，例如，至少约10单位/mL浓度的IL-2。

在其他实施方式中，通过将红血细胞裂解并消耗单核细胞，例如，通过PERCOLL^TM梯度离心，由外周血分离T细胞。或者，T细胞可以分离自脐带。在任何情况中，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定T细胞亚群。

可以消耗如此分离的脐带血单核细胞中表达某些抗原的细胞，包括但不限于，CD34、CD8、CD14、CD19和CD56。可以使用分离的抗体，包含抗体的生物样品(如腹水)，与物理支持物结合的抗体和细胞结合抗体来完成这些细胞的消耗。

通过负选择进行的T细胞群富集可以使用抗体的组合实现，所述抗体针对负选择细胞独有的表面标志物。优选的方法是通过使用单克隆抗体混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述单克隆抗体混合物针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物。例如，为了通过负选择针对CD4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR，和CD8的抗体。

对于通过正或负选择分离所需细胞群，可以不同的细胞或表面(例如，颗粒，如珠)浓度。在某些实施方式中，人们可能希望显著地降低珠和细胞混合在一起的体积(即，升高细胞的浓度)以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用了20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用了10亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用了大于1亿细胞/ml。在另一实施方式中，使用了1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万细胞/ml的浓度。在另一实施方式中，使用了7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿细胞/ml的浓度。在其他实施方式中，使用了1.25亿或1.5亿/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产率增加、细胞活化和细胞扩增。

T细胞也可以在洗涤步骤之后冷冻，这不需要单核细胞去除步骤。虽然不希望受到理论的束缚，但是冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞提供了更均匀的产物。经过移除血浆和血小板的清洗步骤后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且将在此上下文中有用，但是在非限制性实例中，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后，以1℃/分钟的速率冷冻细胞至-80℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。可以使用控制冷冻的其他方法，以及在-20℃或液氮中进行不受控制的立即冷冻。

在一个实施方式中，T细胞群包含在这样的细胞中，所述细胞诸如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。在另一实施方式中，外周血单核细胞包含T细胞群。在另一实施方式中，纯化的T细胞包含T细胞群。

在某些实施方式中，T调节细胞(Treg)可以分离自样品。样品可以包括但不限于脐带血或外周血。在某些实施方式中，通过流式细胞术分选分离Treg。可以通过本领域已知的任何方法在分离之前对样品进行针对Treg的富集。使用前，分离的Treg可以冷冻保存，和/或扩增。用于分离Treg的方法述于美国专利号7,754,482、8,722,400和9,555,105和美国专利申请号13/639,927中，其内容通过引用其全部内容纳入本文。

F.细胞的扩增

无论是在细胞修饰之前或之后，该细胞，例如免疫细胞可以被激活并扩增其数量，使用例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利公开号20060121005中所述的方法。

用于扩增Treg细胞的方法的示例是技术人员众所周知的，包括但不限于：使用吸附在磁珠或纳米颗粒上的刺激性抗体(通常为抗CD3和抗CD28)和使用刺激性细胞因子(通常选自IL-2、IL-15和IL-4)；使用刺激性抗体(通常为抗CD3和抗CD28)；和使用对吸附在磁珠或纳米颗粒上的刺激性抗体具有特异性的配体和使用刺激性细胞因子(通常选自IL-2、IL-15和IL-4)；使用刺激性抗体，通常为抗CD3和抗CD28，其涂覆在细胞培养容器表面，和使用刺激性细胞因子(通常来自IL-2、IL-15和IL-4)；和使用饲养细胞，如WO2006/108882中所述，他们通过引用纳入本文。用于将T细胞分化成调节T细胞的方法的示例是本领域众所周知的，包括但不限于，暴露于雷帕霉素，地塞米松，IL-10，IFN-α，致耐受性抗原呈递细胞如树突细胞等。

在一些实施方式中，调节T细胞可以通过Wakkach等(Immunity2003年5月；18(5)：605-17)中描述的方法获得，并且包括下述步骤：a)由对象分离祖细胞群；b)在IL-10存在的情况下(在培养基中浓度范围为50-250U/ml，优选100U/ml)通过培养祖细胞群来获得树突细胞群；c)在特异性抗原存在的情况下将步骤b)的细胞与分离自对象的CD4+T淋巴细胞群接触，以允许针对抗原的CD4+T细胞分化成调节T细胞群；和d)由步骤c)回收调节T细胞群。该方法还可以使用地塞米松和维生素D3或耐受的或不成熟的DC替代步骤b)的DC进行。

在一些实施方式中，调节T细胞可以通过专利US6746670中描述的方法获得，并且包括下述步骤：a)在具有适当量IFN-α(优选为5ng/ml培养基)的培养基中培养分离自对象针对特定抗原的CD4+T细胞群；和b)回收调节T细胞群。在步骤a)中，培养基可以进一步包含适当量的IL-10，优选为lOOU/ml。在步骤b)中，调节T细胞群体可以在包含IL-15的培养基中培养以允许增殖，IL-15在培养基中优选为5ng/ml。

在一些实施方式中，调节T细胞可以通过专利申请WO02/092793中描述的方法获得，并且包括下述步骤：a)在通过人工抗原呈递细胞呈递的特定抗原存在的情况下体外激活CD4+T细胞群；和b)回收包含至少10％调节T细胞的活化的CD4+T细胞。在一些实施方式中，人工抗原呈递细胞表达HLA II系统分子和人LFA-3分子，并且不表达共刺激分子B7-1、B7-2、B7-H1、CD40、CD23和ICAM-I。

在一些实施方式中，调节T细胞可以通过Groux等(Nature 1997，389(6652)：737-42)中描述的方法获得，并且包括下述步骤：a)在特异性抗原和适当量的IL-10(优选为100U/ml的培养基)存在的情况下，体外激活CD4+T细胞群；和b)回收调节T细胞群。优选地，IL-10存在于培养基中。

在一些实施方式中，调节T细胞可以通过专利申请WO2007/010406中描述的方法获得，并且包括下述步骤：a)用特定抗原刺激白细胞群或外周血单核细胞(PBMC)群；b)由经刺激的群体中回收抗原特异性Treg细胞群；和c)任选地，扩增抗原特异性Treg细胞群。

本领域已知获得调节T细胞的其他方法，包括例如，由非Treg群诱导Treg的产生，如美国专利号9,228,172和美国公开号US201601571471A1中所述。

在一些实施方式中，可以通过美国专利号7,651,855、8,129,185和9,181,526中描述的方法获得离体培养扩增的调节T细胞。在一些实施方式中，调节T细胞可以分离自获自脐带血的细胞群，如美国专利号9,273,282和9,187,727中所述。扩增调节T细胞的方法也在美国专利公开号20130101567中描述。在一些实施方式中，根据美国专利号9,228,172和美国专利公开号20160151471中所描述的方法，可以通过将非Treg转化为Treg来获得Treg。在一些实施方式中，根据美国专利号9,644,179和美国专利公开号20170211042中所描述的方法，可以通过将T细胞转化为Treg来获得调节T细胞。

白细胞涵盖多种类型的细胞，其特征在于其重要性、分布、数量、寿命和潜力。这些类型如下所示：多核或粒状白细胞，其中人们发现了嗜酸性、嗜中性和嗜碱性白细胞，以及单核细胞或外周血单核细胞(PBMC)，它们是大的白细胞，并且由免疫系统的主要细胞类型(淋巴细胞和单核细胞)组成。白细胞或PBMC可以通过本领域技术人员已知的任何方法与外周血分离。有利地是，为了分离PBMC，可以使用离心，优选密度梯度离心，优选不连续密度梯度离心。一种替代方法是使用特异性单克隆抗体。在某些实施方式中，通常通过Ficoll-Hypaque，使用标准程序由全血产物分离PBMC。在其他实施方式中，PBMC通过白细胞去除术回收。

在一些实施方式中，调节T细胞可以这样获得：a)在特定抗原存在的情况下用间充质干细胞培养白细胞群或外周血单核细胞(PBMC)群；和b)回收Treg细胞群。还可以使用原初或记忆T细胞代替PBMC或白细胞进行这类方法。

在一些实施方式中，可以通过在IL-2和TGF-β存在的情况下培养T细胞来获得Treg细胞(Davidson等The Journal of Immunology，2007，178：4022-4026)。在另一实施方式中，可以通过在TGF-B存在的情况下培养T细胞来获得Treg细胞。

通过本文所公开的方法扩增细胞可以增加约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多倍，以及它们之间的任何及所有整数或部分整数。

培养后，可以将细胞在培养设备中的细胞培养基中培养一段时间或直到细胞达到最佳传代的汇合或高细胞密度，然后再将细胞传递到另一培养设备中。培养设备可以是通常用于体外培养细胞的任何培养设备。优选地，在将细胞传递到另一培养设备之前，汇合水平为70％或更高。更优选地，汇合水平为90％或更高。一段时间可以是适合于体外细胞培养的任何时间。可以在细胞培养期间的任何时间更换细胞培养基。优选地，大约每2-3天更换一次细胞培养基。然后，由培养设备收获细胞，随后可以立即使用细胞或将其冷冻保存以备以后使用。在一个实施方式中，本发明包括冷冻保存扩增的细胞。在将核酸引入细胞之前，将冷冻保存的细胞解冻。

在一些实施方式中，该方法包括分离细胞并扩增细胞。在另一个实施方式中，本发明还包括在扩增之前冷冻保存细胞。在另一实施方式中，将冻存的细胞解冻，用于用编码嵌合膜蛋白的RNA电穿孔。

本文所述的培养步骤(与本文所述的试剂接触或在电穿孔后)可以非常短，例如少于24小时，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。本文所述的培养步骤(与本文所述的试剂接触)可以更长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

使用各种术语描述培养中的细胞。细胞培养物通常指取自活生物体并在受控条件下生长的细胞。原代细胞培养物是直接取自生物体的细胞、组织或器官并且在第一次继代培养之前的培养物。当在有利于细胞生长和/或分裂的条件下将细胞置于生长培养基中时，细胞在培养中扩增，从而导致更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，细胞增殖的速率通常通过细胞数量倍增所需的时间量来测量，也称为倍增时间。

各轮继代培养称为传代。当继代培养细胞时，将它们称为已经传代。特定细胞群或细胞系有时通过其已经传代的次数来指代或表征。例如，已经传代10次的培养的细胞群可以称为P10培养物。原代培养，即由组织分离细胞后的第一次培养，称为P0。第一次继代培养后，将细胞描述为第二代培养物(P1或传代1)。第二次继代培养后，细胞成为第三代培养物(P2或传代2)，依此类推。本领域技术人员将理解的是，在传代期间可能有许多群体倍增；因此，培养物倍增的群体的数量大于传代数量。在传代之间的时间段内细胞的扩增(即倍增群体的数量)取决于许多因素，包括但不限于，接种密度、底物、培养基和传代之间的时间。

在一个实施方式中，可将细胞培养数小时(约3小时)至约14天或介于两者之间的任何小时的整数值。适用于Treg细胞培养的条件包括适当的培养基，所述培养基可能包含增殖和活力所必需的因子，和/或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于，表面活性剂，质体酸盐和还原剂，如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20，优选添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，要么是无血清，要么补充了适量血清(或血浆)或确定了一组激素，和/或足以使Treg生长和扩增量的细胞移植。例如青霉素和链霉素的抗抗生素仅包括在试验培养物中，不包括在待输注到对象中的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO₂)。

通过本文所公开的方法分离的细胞可以扩增大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1，000,000倍、10,000,000倍或更多倍。在一个实施方式中，Treg在约20倍至约50倍或更大的范围内扩增。在一个实施方式中，人T调节细胞通过抗CD3抗体涂覆的KT64.86人工抗原呈递细胞(aAPC)扩增。本文描述了扩增和激活Treg的方法。

在一个实施方式中，扩增Treg的方法可以进一步包括分离扩增的Treg用于进一步的应用。在另一实施方式中，扩增的方法可以进一步包括对扩增的Treg进行后续电穿孔，然后进行培养。后续电穿孔可以包括将编码试剂的核酸引入到扩增的Treg群中，诸如转导扩增的Treg，转染扩增的Treg或用核酸电穿孔扩增的Treg，其中试剂进一步刺激Treg。试剂可以刺激Treg，诸如通过刺激进一步的扩展，或功能。

G.治疗方法

本文所述修饰的细胞(例如，Treg)可以包含在用于免疫疗法，特别是抑制性免疫疗法的组合物中。该组合物可以包括药物组合物，并且还包括药学上可接受的运载体。可以给予治疗有效量包含修饰的细胞的药物组合物。

在一个方面中，本发明包括用于过继细胞转移疗法的方法，其包括向有此需要的对象给予本发明的修饰的T细胞。在另一方面中，本发明包括治疗对象中疾病或病状的方法，其包括向由此需要的对象给予修饰的T细胞群。

还包括的是治疗有此需要的对象中疾病或病症的方法，其包括向对象给予基因编辑的修饰的细胞(例如，基因编辑的修饰的Treg，基因编辑的修饰的Teff)。在一个实施方式中，治疗有此需要的对象中疾病或病症的方法包括向对象给予本公开的类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂和/或免疫抑制剂药物抗性细胞。

给予过继细胞治疗所用免疫细胞的方法是已知的，可与本文方法和组合物联用。例如，过继T细胞疗法方法描述于，例如，Gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10)：577-85)。参见例如Themeli等.(2013)Nat Biotechnol.31(10)：928-933；Tsukahara等.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1)：84-9；Davila等.(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338。在一些实施方式中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中细胞分离自和/或在其它情况中制备自接受所述细胞疗法的对象，或从源自这类对象的样品分离和/或制备。因此，某些方面，细胞源自需要治疗的对象(例如，患者)，并在分离和处理后回输给同一对象。

在一些实施方式中，细胞疗法(例如过继T细胞疗法)通过同种异体移植进行，其中，细胞分离和/或以其他方法制备自不是待接受或最终接受细胞疗法的对象(例如第一对象)。在这类实施方式中，然后将细胞给予相同物种的不同对象，例如第二对象。在一些实施方式中，所述第一和第二对象遗传相同。在一些实施方式中，所述第一和第二对象遗传学相似。在一些实施方式中，所述第二对象表达与第一对象病毒相同的HLA类或超型。

在一些实施方式中，在给予细胞或包含细胞的组合物之前，已经用靶向疾病或病症(例如GVHD)的治疗剂治疗对象。在一些实施方式中，对象对于其他治疗剂是难治性的或非响应性的。在一些实施方式中，对象具有持续或复发的疾病，例如，在用另一种治疗性介入之后，包括化疗、放射、和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT。在一些实施方式中，所述给予有效地治疗对象，无论该对象是否已对另一种疗法具有抗性。在一些实施方式中，已经用GVHD的预防护理标准，如类固醇(例如，糖皮质激素)和/或钙依赖磷酸酶抑制剂(例如，FK506，CsA)治疗对象。

在一些情况中，如本文所述，细胞是基因编辑的Teff。在一些实施方式中，该方法包括向经糖皮质激素或CaNI治疗的造血干细胞移植患者对象给予经基因编辑的Teff。不受任何特定理论或作用方式的束缚，据信给予修饰的Teff增加或维持了这类患者中的Teff存活，所述修饰的Teff中的糖皮质激素受体基因座已经被修饰以增加对类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂的敏感性。在一些情况中，修饰的Teff对于特定肿瘤类型具有肿瘤特异性或针对特定肿瘤类型富集。在一些情况中，修饰的Teff是病原体特异性的(例如，对巨细胞病毒或BK病毒具有特异性)。

在一些实施方式中，对象对其他治疗剂有响应性并且用治疗剂治疗降低了疾病负荷。在一些方面中，对象初始对治疗剂有响应性，但是随着时间显示出疾病或病症的复发。在一些实施方式中，对象还没有复发。在一些这类实施方式中，所述对象经测定具有复发风险，如处于复发高风险中，并且由此预防性地给予细胞，例如，以减小复发可能性或预防复发。在一些方面中，对象还没有接受用另一种治疗剂的在先治疗。

在一些实施方式中，对象具有持续或复发的疾病，例如，在用另一种治疗性介入之后，包括化疗、放射、和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如，同种异体HSCT。在一些实施方式中，所述给予有效地治疗对象，无论该对象是否已对另一种疗法具有抗性。

在一些实施方式中，对象已经接受了干细胞移植，或者是干细胞移植的候选者。在一些实施方式中，对象已经接受了实体器官移植，或者是实体器官移植的候选者。在一些实施方式中，对象患有自身免疫疾病。在一些实施方式中，对象患有移植物抗宿主疾病(GVHD)。在一些实施方式中，对象患有1型糖尿病。

在一个实施方式中，治疗有此需要的对象中疾病或病症的方法包括向对象给予治疗有效量的本发明的类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞。在一个实施方式中，治疗有此需要的对象中疾病或病症的方法包括向对象给予治疗有效量的类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性Treg。

本发明的类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞能够在免疫疗法的常规常规护理标准条件下(如给予抑制和/或诱导淋巴造血系统的细胞中衰老和/或细胞毒性的糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抑制剂)移植、存活、持续和/或增殖。因此，本发明的细胞能够在更长和持续时间内发挥其治疗作用。

在给予本发明的类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞时，保护移植的组织免于排斥。在一个实施方式中，类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞可以介导持续的免疫抑制。在一个实施方式中，类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞可以抑制应答同种异体抗原的T细胞增殖。在一些实施方式中，在细胞、组织和/或器官移植后，同种异体抗原可以在移植的细胞、组织和/或器官上普遍表达。在这类情况中，可能发生大量的免疫细胞浸入移植的细胞、组织和/或器官中，导致破坏移植的细胞、组织和/或器官。因此，在一些实施方式中，本发明的类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞能够减少免疫细胞的浸润，并因此保护移植的细胞、组织和/或器官免遭破坏。在一些情况中，移植的细胞、组织和/或器官可能介导毒性。因此，在一些实施方式中，本发明的类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞能够减少移植的细胞、组织和/或器官介导的毒性。

因此，本发明提供了在有此需要的对象中实现预防性治疗作用的方法，和/或在有此需要的对象(例如，正在经历同种异体反应或自身免疫应答的人)中实现免疫抑制作用的方法。在一些实施方式中，在有此需要的对象中实现预防性治疗作用的方法，和/或在具有同种异体反应或自身免疫应答的有此需要的对象中实现免疫抑制作用的方法，包括向该对象给予本发明的类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞。

本发明的方法应当解释为包括防止任何类型的移植器官、组织或细胞的排斥，包括但不限于肺，心脏(例如，心肌细胞)，心脏瓣膜，皮肤(例如，成纤维细胞)，肝脏(例如，肝细胞)，手，肾脏，胰腺，肠，胃，胸腺，骨，腱，角膜，睾丸，神经，静脉，血液(例如，全血、白细胞、红细胞、血小板、血浆、血清)，骨髓(例如，单核细胞、巨噬细胞、间充质干细胞)，干细胞(例如，间充质干细胞(MSC)，造血干细胞(HSC))，朗格汉斯细胞的胰岛，神经细胞(例如，神经元、巨胶质细胞、小胶质细胞)，免疫细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞或NKT(自然杀伤T)细胞)和造血细胞及其组分。该方法可为其提供防止排斥的其他组织和细胞类型包括但不限于，上皮细胞，成纤维细胞，神经细胞，角质细胞，造血细胞，黑素细胞，软骨细胞，淋巴细胞(B和T)，巨噬细胞，单核细胞(monocyte)，单核细胞(mononuclear cell)，心肌细胞，其他肌肉细胞，颗粒细胞，卵丘细胞，表皮细胞，内皮细胞，朗格汉斯细胞的胰岛细胞，胰腺胰岛素分泌细胞，胰腺α-2细胞，胰腺β细胞，胰腺α-1细胞，骨细胞，骨前体细胞，神经元干细胞，原始干细胞，肝细胞，主动脉内皮细胞，微血管内皮细胞，脐静脉内皮细胞，成纤维细胞，肝星状细胞，主动脉平滑肌细胞，心肌细胞，神经元，库普弗(Kupffer)细胞，平滑肌细胞，施旺(Schwann)细胞，红细胞，血小板，嗜中性粒细胞，淋巴细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，脂肪细胞，软骨细胞，胰腺胰岛细胞，甲状腺细胞，甲状旁腺细胞，腮腺细胞，神经胶质细胞，星形胶质细胞，红细胞，白细胞，巨噬细胞，体细胞，垂体细胞，肾上腺细胞，毛细胞，膀胱细胞，肾细胞，视网膜细胞，杆状细胞，视锥细胞，心脏细胞，肝细胞，起搏细胞，脾细胞，抗原呈递细胞，记忆细胞，T细胞，B细胞，浆细胞，肌肉细胞，卵巢细胞，子宫细胞，前列腺细胞，阴道上皮细胞，精子细胞，睾丸细胞，生殖细胞，卵细胞，睾丸间质细胞，小管周细胞，睾丸支持细胞，叶黄素细胞，宫颈细胞，子宫内膜细胞，乳腺细胞，滤泡细胞，粘液细胞，纤毛细胞，非角化上皮细胞，角化上皮细胞，肺细胞，杯状细胞，柱状上皮细胞，多巴胺能细胞，鳞状上皮细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，胚胎干细胞，纤维母细胞和成纤维细胞。本发明的方法还包括针对移植物抗宿主疾病(GVHD)的保护。

在某些实施方式中，除了类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性细胞外，还可以给予对象次级治疗，如免疫抑制药物。免疫抑制药的示例包括但不限于，泼尼松、硫唑嘌呤，他克莫司和环孢霉素A。在一些实施方式中，次级治疗为类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂。在一些实施方式中，类固醇是皮质类固醇。在一些实施方式中，类固醇是选自下组的糖皮质类固醇：孕酮型糖皮质激素、氢化可的松型糖皮质激素、美沙酮型糖皮质激素和丙酮化合物型糖皮质激素。在一些实施方式中，糖皮质激素选自下组：地塞米松、倍他米松、氢化可的松(皮质醇)、泼尼松、泼尼松龙、氯替泼诺、地夫可特、甲基泼尼松龙、曲安西龙、氟氢可的松和脱氧皮质酮及其衍生物和类似物。在一些实施方式中，钙依赖磷酸酶抑制剂选自下组：环孢菌素、伏孢素、吡美莫司和他克莫司及其衍生物和类似物。

在一些实施方式中，向对象提供次级治疗。次级治疗包括但不限于，化疗、放疗、手术和药物治疗。

本发明的细胞可以适当临床前和临床实验和试验中确定的剂量和途径和时间给予。细胞组合物可以在这些范围内的剂量多次给予。如本领域技术人员所确定的，给予本发明的细胞可以与能够用于治疗所需疾病或病症的其他方法组合。

相对于接受治疗的对象，待给予的本发明的细胞可以是自体同源的。

本发明的细胞的给予可以本领域技术人员已知的任何方便的方式进行。本发明的细胞可以通过气雾吸入、注射、摄入、输注、植入或移植来给予对象。本文所述的组合物可以经动脉，皮下，皮内，瘤内，结节内，髓内，肌肉内，通过静脉内(i.v.)注射，或腹腔内给予患者。在其他情况中，将本发明的细胞直接注射到对象中炎症的位点，对象中的局部疾病位点，淋巴结，器官，肿瘤等中。

在一些实施方式中，细胞以所需剂量给予，其在一些方面中包括所需剂量或细胞数量或细胞类型和/或所需细胞类型比率。因此，在一些实施方式中，细胞剂量基于细胞的总数(或每kg体重的数量)和所需个体群或亚型比率。在一些实施方式中，细胞剂量基于个体群中细胞或个体细胞类型的所需总数(或每kg体重的数量)。在一些实施方式中，剂量基于这类特征的组合，如所需总细胞数量、所需比率，和个体群中所需的细胞总数量。

在一些实施方式中，细胞群或亚型以总细胞的所需剂量(如T细胞的所需剂量)容许的差异或在其容许的差异之内给予。在一些方面中，所需剂量是所需细胞数量或所需细胞数量/向其给予所述细胞的对象的体重单位，例如，细胞/kg。在一些方面中，所需剂量是或高于最小细胞数量或最小细胞数量/体重单位。在一些方面中，在以所需剂量给予的总细胞中，个体群或亚型以或接近所需的输出比存在，例如，在该比例某些容许的差异或误差内。

在一些实施方式中，细胞以一种或多种细胞个体群或亚型的所需剂量容许的差异或在其容许的差异之内给予。在一些方面中，所需剂量是所述亚型或群的所需细胞数量，或此类细胞的所需数量/向其给予所述细胞的对象的体重单位，例如，细胞/kg。在一些方面中，所需剂量是或高于所述群或亚型的最小细胞数量，或所述群或亚型的最小细胞数量/体重单位。因此，在一些实施方式中，所述剂量基于总细胞的所需固定剂量和所需比率，和/或基于所述个体亚型或亚群的一种或多种，例如，各自，的所需固定剂量。

在某些实施方式中，细胞，或细胞亚型的个体群，以如下范围给予所述对象：约100万至约1000亿个细胞，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞，约2500万个细胞，约500亿个细胞，约10亿个细胞，约50亿个细胞，约200亿个细胞，约300亿个细胞，约400亿个细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，例如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞，约3000万个细胞，约4000万个细胞，约6000万个细胞，约7000万个细胞，约8000万个细胞，约9000万个细胞，约100亿个细胞，约250亿个细胞，约500亿个细胞，约750亿个细胞，约900亿个细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，和在一些情况中，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞，约2.5亿个细胞，约3.5亿个细胞，约4.5亿个细胞，约6.5亿个细胞，约8亿个细胞，约9亿个细胞，约30亿个细胞，约300亿个细胞，约450亿个细胞)或这些范围之间任何值。

在一些实施方式中，总细胞剂量和/或细胞个体亚群剂量在如下范围内：介于是或约是1x10⁵个细胞/kg-约1x10¹¹个细胞/kg 10⁴和是或约是10¹¹个细胞/千克(kg)体重，如介于10⁵和10⁶个细胞/kg体重，例如，是或约是1x10⁵个细胞/kg、1.5x10⁵个细胞/kg、2x10⁵个细胞/kg或1x10⁶个细胞/kg体重。例如，在一些实施方式中，细胞以下述量或在其一定误差范围内给予：介于是或约是10⁴和是或约是10⁹个T细胞/千克(kg)体重之间，如介于10⁵和10⁶个T细胞/kg体重之间，例如，是或约是1x10⁵个T细胞/kg，1.5x10⁵个T细胞/kg，2x10⁵个T细胞/kg或1x10⁶个T细胞/kg体重。在其他示例性实施方式中，用于本公开方法的修饰的细胞的合适剂量范围包括但不限于约1x10⁵个细胞/kg-约1x10⁶个细胞/kg，约1x10⁶个细胞/kg-约1x10⁷个细胞/kg，约1x10⁷个细胞/kg-约1x10⁸个细胞/kg，约1x10⁸个细胞/kg-约1x10⁹个细胞/kg，约1x10⁹个细胞/kg-约1x10¹⁰个细胞/kg，约1x10¹⁰个细胞/kg-约1x10¹¹个细胞/kg。在一个示例性实施方式中，用于本公开方法的合适剂量为约1×10⁸个细胞/kg。在一个示例性实施方式中，用于本公开方法的合适剂量为约1×10⁷个细胞/kg。在其他实施方式中，合适剂量为约1x10⁷总细胞-约5x10⁷总细胞。在一些实施方式中，合适剂量为约1x10⁸总细胞-约5x10⁸总细胞。在一些实施方式中，合适剂量为约1.4x10⁷总细胞-约1.1x10⁹总细胞。在一个示例性实施方式中，用于本公开方法的合适剂量为约7×10⁹总细胞。

在一些实施方式中，细胞以下述量或在其一定误差范围内给予：介于是或约是10⁴和是或约是10⁹个细胞/千克(kg)体重之间，如介于10⁵和10⁶个细胞/kg体重之间，例如，是或约是1x10⁵个细胞/kg，1.5x10⁵个细胞/kg，2x10⁵个细胞/kg，或1x10⁶个细胞/kg体重。在一些实施方式中，细胞以下述量或其一定误差范围内，大于和/或至少约下述量给予：1x10⁶、约2.5x10⁶、约5x10⁶、约7.5x10⁶或约9x10⁶个细胞。在一些实施方式中，细胞以下述量或其一定误差范围内给予：介于约10⁸和10¹²之间或介于约10¹⁰和10¹¹之间的T细胞，介于约10^s和10¹²或介于约10¹⁰和10¹¹个细胞。

在一些实施方式中，细胞以多种细胞群或亚型所需输出比率的容许范围或在其容许范围内给予。在一些方面中，所需比率可以是特定比率或可以是比率范围，例如，在一些实施方式中，所需比率介于是或约是5∶1和是或约是5∶1(或大于约1∶5和小于约5∶1)之间，或介于是或约是1∶3和是或约是3∶1(或大于约1∶3和小于约3∶1)之间，如介于是或约是2∶1和是或约是1∶5(或大于约1∶5和小于约2∶1，如是或约是5∶1、4.5∶1、4∶1、3.5∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1.9∶1、1.8∶1、1.7∶1、1.6∶1、1.5∶1、1.4∶1、1.3∶1、1.2∶1、1.1∶1、1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5、1∶1.6、1∶1.7、1∶1.8、1∶1.9∶1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4、1∶4.5或1∶5。在一些方面中，所述允许的差异是所需比率的约1％，约2％，约3％，约4％约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％之内，包括这些范围之间的任何值。

在一些实施方式中，修饰的细胞的剂量以单一剂量或多个剂量给予有此需要的对象。在一些实施方式中，修饰的细胞的剂量以多个剂量给予，例如，每周或每7天一次，每2周或每14天一次，每3周或每21天一次，每4周或每28天一次。在一个示例性实施方式中，修饰的细胞的单一剂量给予有此需要的对象。在一个示例性实施方式中，修饰的细胞的单一剂量通过快速静脉内输注给予有此需要的对象。

对于预防或治疗疾病，合适剂量可取决于待治疗的疾病类型，重组受体或细胞类型，疾病的严重程度和疾病病程、该细胞是否给予用于预防性或治疗性目的、先前治疗、对象的临床史和对所述细胞的响应，以及主治医师的判断。在一些实施方式中，组合物和细胞适合在一个时间点或以一系列治疗来给予对象。

在一些实施方式中，细胞作为联合治疗的一部分给予，例如与另一治疗性干预(如抗体或经工程改造的细胞或受体或药剂(如细胞毒性或治疗行药剂))同时或以任何顺序依次给予。在一些实施方式中，细胞与一种或多种其他治疗剂共同给予或与另一治疗干预联合给予，或者同时或者以任何顺序依次进行。在一些情况中，细胞与其他治疗共同给予，时间上足够接近从而细胞群增强一种或多种其他治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其他治疗剂之前给予。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其他治疗剂之后给予。在一些实施方式中，一种或多种其他治疗剂包括细胞因子，例如用于以增强持久性。在一些实施方式中，所述方法包括给予化疗剂。

在给予细胞之后，在一些实施方式中，检测经工程改造细胞群的生物活性，例如采用任意已知方法。用以评估的参数包括：工程改造的或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，体内方式(例如，通过成像)或离体方式(例如，通过ELISA或流式细胞术)。在某些实施方式中，工程改造的细胞破坏靶细胞的能力可采用本领域已知的任何合适的方法来检测，例如描述于如下文献的细胞毒性试验，例如，Kochenderfer等，J.Immunotherapy，32(7)：689-702(2009)，和Herman等.J.Immunological Methods，285(1)：25-40(2004)。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在某些方面中，生物活性通过评估临床效果来测量，如肿瘤负荷或负载的减少。

H.药物组合物和制剂

还提供了本发明的造血细胞或其前体细胞的群体，包含这类细胞和/或针对这类细胞富集的组合物，诸如其中表达重组受体的细胞构成至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多组合物中的总细胞或某些类型的细胞如T细胞或CD8+或CD4+细胞。组合物包括用于给药的药物组合物和制剂，如用于过继细胞治疗。还提供治疗方法，例如，将所述细胞和组合物给予对象(例如患者)的治疗方法。

还提供了包括用于给药的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，如来自包括给定剂量或其部分的用于给药的细胞数量的单位剂型组合物。所述药物组合物和制剂一般包括一种或多种任选的药学上可接受的运载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述组合物包括至少一种其它治疗剂。

术语“药物制剂”指此类形式的制剂：所述其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含对待接受该制剂的对象具有不可接受的毒性的其他成分。“药学上可接受的运载体”指药物制剂中的一种成分，其不是活性成分，其对对象无毒。药学上可接受的运载体包括但是不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。某些方面，运载体的选择部分决定于具体的细胞和/或给药方法。因此，存在多种合适的配方。例如，所述药物组合物可以包含防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。某些方面，采用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％至约2％(以组合物总重量计)。运载体描述于，例如，《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol，A.编(1980)。在所用剂量和浓度下，药学上可接受的运载体通常是对受者无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。

缓冲剂在某些方面中包含在组合物中。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。某些方面，采用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法具体描述于，例如，《雷明顿：药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，LWW公司(LippincottWilliams＆Wilkins)；第21版(2005年5月1日)。

该制剂可以包含水溶液。所述制剂或组合物还可以包含多于一种活性成分，该活性成分可用于待用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选对所述细胞具有补充活性的那些，其中相应活性剂彼此不产生负面影响。这类活性成分适合以有效用于所需目的的用量联合存在。因此，在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，和/或长春新碱。在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量，如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的对象来监测治疗或预防功效。所需剂量可以通过单药丸给予所述细胞，通过多药丸给予所述细胞或通过连续输注给予细胞来递送。

制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、粘膜、舌下或栓剂给药的那些。在一些实施方式中，所述细胞群胃肠外给予。本文所用的术语“胃肠外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，所述细胞通过静脉内，腹膜内或皮下注射采用外围全身递送给予对象。在一些实施方式中，组合物是无菌液体制剂，例如等渗水性溶液、悬液、乳液、分散系或粘性组合物，其某些方面可缓冲至选定pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物一定程度上多少更便于给药，尤其是通过注射给药。在另一方面，粘性组合物可配制在合适的粘度范围以延长与特定组织的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及以上合适的混合物。

可通过将所述细胞纳入溶剂中，例如与合适的运载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等活化，来制备无菌可注射溶液。组合物可含有辅助性物质，如润湿、分散、或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、和/或色素，取决于所需的给药和制备途径。某些方面，可查阅标准文件来制备合适制备物。

可添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、和山梨酸确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)延长可注射药物形式的吸收。

用于体内给药的制剂一般为无菌的。例如，可通过无菌滤膜过滤方便地地做到无菌。

J.动物模型

本发明提供了移植(例如，细胞或组织)后的疾病或病症的体内动物模型。在一些实施方式中，动物模型是同种异体移植(例如，细胞或组织)后的疾病或病症的动物模型。在一些实施方式中，动物模型是异种移植(例如，细胞或组织)后的疾病或病症的动物模型。在某些实施方式中，本发明提供了同种异体移植(例如，细胞或组织)后的移植物抗宿主疾病(GVHD)的体内动物模型。在某些实施方式中，本发明提供了异种移植(例如，细胞或组织)后的移植物抗宿主疾病(GVHD)的体内动物模型。本发明还提供了制造这类动物模型的方法。

在一些实施方式中，同种异体或异种移植后的GVHD的体内动物模型包括包含同种异体细胞群的动物。如本文所用，术语“同种异体”指遗传上不相似但是是同一物种的物质，其可能在免疫学上不相容。例如，同种异体细胞或组织是源自同一物种遗传上不相似来源的细胞或组织。本文所用术语“异种”指属于不同物种的物质。例如，异种细胞或组织是源自不同物种的细胞或组织。

如本文所提供，GVHD的体内动物模型是GVHD的鼠模型。在一些实施方式中，同种异体细胞是同种异体血浆血液单核细胞(PBMC)。在一些实施方式中，异种细胞是异种PBMC。在一些实施方式中，鼠GVHD模型包括免疫缺陷型小鼠，其包含同种异体(即源自遗传上不相似的小鼠)或异种(即源自不同物种)PBMC群。

本领域已知多种免疫缺陷型小鼠品系，包括但不限于，“裸”、“scid”，“rag缺陷型”和“高阶多基因(higher-order，multigenic)”变体的免疫缺陷型小鼠品系。裸鼠对于Foxn1^nu突变是纯合的。Foxn1编码毛囊和胸腺发育所需的转录因子。在其不存在的情况下，小鼠既无毛又无胸腺。因为胸腺无法形成，所以CD4+和CD8+T细胞无法分化和成熟，产生裸纯合子T细胞缺陷。Scid小鼠对于Prkdc^scid突变是纯合的。Prkdc基因编码DNA修复和封闭T细胞受体(TCR)和免疫球蛋白(Ig)基因体重组期间发生的双链DNA断裂所需的DNA依赖性蛋白激酶的催化亚基。在不存在Prkdc蛋白的情况下，TCR和Ig基因无法重排，导致小鼠为T细胞和B细胞缺陷型的。rag缺陷型小鼠是无法表达功能性Rag1或Rag2蛋白的小鼠。类似于Prkdc基因，TCR和Ig基因的体细胞重组需要Rag1和Rag2，并且缺失这两个基因任一基因导致T细胞和B细胞缺陷。携带Rag1^tm1Mom或Rag2^tm1.1Cgn突变的小鼠具有非常相似的表型，如果不是完全相同的。高阶多基因免疫缺陷型小鼠由Prkdc^scid或Rag缺陷型小鼠构建，并携带其他免疫缺陷增强突变。在这些小鼠中是我们的NSG和NRG小鼠，其携带分别与Prkdc^scid和Rag1^tm1Mom组合的白介素2受体γ亚基基因中的特定突变(Il2rg^tm1Wj1)。这些小鼠是B、T和NK细胞缺陷型的。此外，因为它们都具有NOD/ShiLtJ遗传背景，所以它们是溶血补体缺陷型的并携带对巨噬细胞和树突状细胞功能产生不利影响的等位基因。在某些实施方式中，免疫缺陷型小鼠是BALB/c小鼠。在某些实施方式中，免疫缺陷型小鼠是NOD/Scid/IL-2Rg-/-(NSG)小鼠。

在一些实施方式中，同种异体PBMC群可以源自遗传上不相似的供体小鼠。在某些实施方式中，供体小鼠是C57BL/6小鼠。在某些实施方式中，同种异体PBMC群源自C57BL/6小鼠骨髓。因此，本发明的同种异体GVHD鼠模型包括免疫缺陷型BALB/c小鼠，其包含源自供体C57BL/6小鼠骨髓的同种异体PBMC群。

在一些实施方式中，异种PBMC群可以源自人。因此，本发明的异种GVHD鼠模型包括免疫缺陷型NSG小鼠，其包含源自人的异种PBMC群。

在一些实施方式中，制造本公开的GVHD动物模型的方法包括将同种异体或异种PBMC群注射到/给予宿主动物(例如，小鼠)中。在一些实施方式中，制造本公开的GVHD鼠模型的方法包括将同种异体或异种PBMC群注射到/给予免疫缺陷型小鼠中。在一些实施方式中，制造本公开的同种异体GVHD鼠模型的方法包括将同种异体PBMC群注射到/给予免疫缺陷型小鼠中。在一些实施方式中，制造本公开的异种GVHD鼠模型的方法包括将异种PBMC群注射到/给予免疫缺陷型小鼠中。

在一些实施方式中，在用同种异体或异种PBMC注射前，免疫缺陷型小鼠经非致死性辐照。在某些实施方式中，对免疫缺陷型小鼠进行非致死性地辐照包括使小鼠接受约50rad至约200rad的辐射剂量。在一些实施方式中，对免疫缺陷型小鼠进行非致死性地辐照包括使小鼠接受这样的辐射剂量：约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约175、约180、约185、约190、约195、约200、约205、约210、约215、约220、约225rad或之间的任意值。本领域技术人员将能够确定适当的非致死性放射剂量以给予小鼠。

在某些实施方式中，免疫缺陷型小鼠被注射/给予约1x10⁶-约20x10⁶同种异体或异种PBMC。在某些实施方式中，免疫缺陷型小鼠被注射/给予约0.5x10⁶、0.6x10⁶、0.7x10⁶、0.8x10⁶、0.9x10⁶、1x10⁶、1.1x10⁶、1.2x10⁶、1.3x10⁶、1.4x10⁶、1.5x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、10x10⁶、15x10⁶、16x10⁶、17x10⁶、18x10⁶、19x10⁶、19.5x10⁶、19.6x10⁶、19.7x10⁶、19.8x10⁶、19.9x10⁶、20x10⁶、20.1x10⁶、20.2x10⁶、20.3x10⁶、20.4x10⁶、20.5x10⁶、21x10⁶、22x10⁶、23x10⁶、24x10⁶、25x10⁶同种异体或异种PBMC，或之间的任意值。本领域技术人员将能够确定适当数量的PBMC以注射到免疫缺陷型小鼠中。

在一些实施方式中，相较于野生型动物，在用类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂治疗时，本发明的GVHD动物模型的存活降低。在一些实施方式中，相较于野生型小鼠，在用类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂治疗时，本发明的GVHD鼠模型的存活降低。

本文所提及或引用的文章、专利和专利申请的内容以及所有其他文件和电子可用信息的全部内容通过引用其全部内容纳入本文，如同每个单独的出版物或专利被明确单独指明通过引用纳入。申请人保留将来自任何这类文章、专利、专利申请或其他物理和电子文档的任何和所有物质和信息以物理方式纳入本申请的权利。

虽然参考具体实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员应理解的是，可在不背离本发明真正精神和范围的情况下作出各种改变并且可以用等同方式替代。对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不背离本文所公开的实施方式的范围的情况下，可以使用合适的等同方式对本文所述的方法进行其他适当的修改和改变。此外，可以做出许多修改以使特定的情况、材料、物质组成、过程、一个或多个处理步骤适应适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。现在已经详细描述了某些实施方式，通过参照下述实施例将更清楚地理解它们，并且这些实施例仅出于说明的目的而被包括并不旨在进行限制。

实施例

下述实验性实施例并不旨在进行限制，而是涉及用于生成类固醇和/或钙依赖磷酸酶抑制剂抗性免疫细胞的组合物和方法。

材料和方法：

GMP合规Treg

通过两步程序由人血单采术产品纯化Treg，由此使用GMP级mAb偶联的磁珠阳性选择CD25+细胞(包括Treg)，然后分选原初和记忆Treg PB(分别为CD4+25++127-45RA+和CD4+25++127-45RA-)(图1)。用GMP质量的人工抗原呈递细胞(aAPC)刺激纯化的细胞，并在高剂量IL-2(300U/ml)中培养14天。在第14天将扩增的Treg储存(冷冻)。对于本文所述的实验，将Treg解冻并用GMP合规的抗CD3/28珠再刺激7-10天。在培养结束时评估Treg的纯度和体外抑制功能。原初和记忆Treg的培养物显示出相似的Foxp3+细胞数量，并且所有培养物具有体外抑制作用。

实施例1：地塞米松对Treg存活和扩增的影响

为了确定Treg是否对糖皮质激素受体激活的免疫抑制作用敏感，生成了储存的Treg来源。由磁珠富集的外周血细胞生成储存的Treg(4+25++127lo并且对于原初和效应记忆细胞分别为CD45RA+和CD45RA-变异体)。使用加载抗CD3 mAb的IL-2，K562-CD64/86细胞在14天的培养物中扩增纯化的Treg，以在重复实验中提供更大的一致性。解冻储存的tTreg，使用抗CD3/28mAb珠再刺激，然后按照指示进一步扩增4±1天或更长时间。然后将Treg分为培养物±地塞米松(Dex：10、30、100μg/ml)，并在2-3天后通过使用活力染料并计数珠的流式细胞仪评估相对存活。

Dex以剂量依赖性方式降低培养物中的Treg数量(图2B)。不受任何理论的束缚，由于在雷帕霉素不存在的情况下并使用磁珠而非流动分选进行了扩增培养，Treg扩增培养物包含10-35％Foxp3-细胞。为了排除细胞数量减少是由于优先丧失Treg的可能性，还用CD127和Foxp3对上述培养物进行了染色，并确定了Treg(CD4+CD127-Foxp3+)和非Treg对Dex的相对敏感性(图2C)。Dex处理并未显著影响Treg培养物的纯度，这表明Dex对Treg活力/存活有不利影响。测试了±30μg/ml Dex生长的Treg的抑制功能(图2D)。在再扩增培养物中将Treg暴露于Dex增加了抑制功能。

实施例2：基因靶向策略

核受体亚家族3组C成员1(NR3C1)基因编码糖皮质激素受体(GR，也称为NR3C1)，其是皮质醇和其他糖皮质激素结合的受体。靶向策略是通过易错非同源末端连接途径(NHEJ)经由可编程核酸酶基因破坏和诱变DNA修复来破坏外显子2。为了明确定义Treg中基因靶向应用的条件，采取了一种全面的方法来直接破坏NR3C1的基因以及一种新型同源性定向修复方法。

通过以破坏糖皮质激素受体基因座的方式靶向插入钙依赖磷酸酶抑制剂抗性基因，开发了一种生成双重药物(类固醇和钙依赖磷酸酶抑制剂)抗性的策略。为了实现这一目标，设计了源自规律成簇的间隔回文重复(CRISPR)/Cas9系统的四种试剂用于测试。为了优化递送和药物剂量参数，在Jurkat细胞中进行了研究。测试了具有向导RNA(gRNA)的Cas9mRNA，所述gRNA经过核酸酶抗性硫代磷酸酯键特异性修饰以防止胞内降解。平行地，测试了与作为核糖核蛋白(RNP)产物的gRNA复合的Cas9蛋白。比较了两种递送方法的基因破坏和基于同源定向修复(HDR)的基因编辑。在消耗剂量，时间和电穿孔条件优化后，将Cas9 RNP鉴定为Jurkat细胞中最佳的基因破坏和修复平台。该策略不需要化学修饰的gRNA，并且在某些条件下可能代表了对于研究和临床级基因组工程改造和细胞制造更简化的工程改造、合成和递送方法。

使用这些参数，使用如图3A所示的实验方案来追求使用CRISPR/Cas9工程改造T细胞。人原代T细胞在IL-2存在的情况下生长，并用CD3/CD28珠激活48-72小时。CRISPR/Cas9试剂使用通过Neon电穿孔装置(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))递送的向导RNA转录本(Synthego公司)和重组Cas9肽(Aldevron公司)。单个候选物位于NR3C1的外显子2中，并通过MIT CRISPR设计工具进行鉴定(图3B)。使用Surveyor核酸酶试验评估核酸酶活性(图3C)，所有四个候选物均具有活性，如Surveyor DNA片段化产物所证实的(图3D)。鉴定了两个候选物，称为GR1和GR2，表现出最高活性水平(图3D)。

实施例3：Treg中CRISPR/Cas9介导的NR3C1敲除

为了确定GR1和GR2向导是否也能够敲除临床相关Treg的培养物中的NR3C1基因座，将储存的Treg解冻并用抗CD3/28珠以高剂量IL-2(300U/ml)再刺激。在第3天，在GR1或GR2 GRISPR/Cas9 RNP不存在或存在的情况下如上所示将Treg电穿孔，并在最佳扩增条件下恢复培养。2天后，收获Treg培养物，并进行再培养±地塞米松(30μg/ml)48小时(共7天)，在此时收获培养物，并通过使用活力染色和计数珠的流式细胞术评估相对存活。通过在经历CRISPR/Cas9基因修饰和0-100ug/mL地塞米松剂量的Jurkat和原代T细胞中进行β测试鉴定30ug/mL的剂量。如图4B所示，在地塞米松存在的情况下，经GR2 CRISPR/Cas9电穿孔的Treg具有显著提高的存活。通过非同源末端连接的CRISPR/Cas9基因修复导致邻近gRNA结合位点的插入和缺失(插入缺失)。因此，评估了使用称为TIDE(通过分解跟踪插入缺失)的序列跟踪分解算法的插入缺失模式。分析了地塞米松暴露前和暴露后的样品(分别为图4C和4D)。预计在添加地塞米松前导致Treg中基因失活的框外插入缺失的频率为约35％，这与经GR2 GRISPR/Cas9试剂处理的外周血T细胞的实验观察到的频率相似(约40％)。在地塞米松中培养后，插入缺失的频率增加到44％。不受任何理论的束缚，这表明基因修饰的Treg的优先存活。获得地塞米松抗性的细胞也显示出框外插入缺失的富集。

实施例4：Treg中的同源性定向修复

为了实现双重药物(类固醇和钙依赖磷酸酶抑制剂)抗性，使用Jurkat和原代T细胞来定义最佳同源性定向修复(HDR)的条件。使用报告基因HDR构建体比较和评估了Cas9mRNA和Cas9 RNP方法促进人AAVS1基因座处HDR的能力。在这些研究中，观察到Cas9 RNP后立即添加AAV病毒供体模板可以导致最大值(＞65％HDR率)。设计HDR模板并如图5A所示，并且包含了与GFP共表达并由MND启动子驱动的钙依赖磷酸酶抗性基因。与钙依赖磷酸酶抗性基因侧接的是与NR3C1基因同源的供体靶向臂，因此插入会破坏外显子2并伴有21个氨基酸的缺失(图5A)。为了定义Treg中HDR的条件，采用了对于AAV转导最适合的培养条件(Treg密度为2x10⁶细胞/ml)。供体包装在AAV-6血清型病毒颗粒中并添加到各种感染复数(MOI)下已经GR2gRNA和Cas9蛋白电穿孔的Treg中。使用内外PCR策略，在各MOI下的Treg中观察到HDR，所述内外PCR中一个PCR引物位于供体内部，而另一个位于供体以外在相邻基因组基因座处(图5B)。Sanger测序显示供体臂与内源性基因座的连接(图5C)。

实施例5：最佳Treg扩增条件下使用GR2-Cas9和AAV在Treg中进行HDR

为了在临床相关的培养环境中优化HDR，将储存的Treg解冻、刺激、扩增2天，然后用GR2-Cas9电穿孔。电穿孔后，以3×10⁵的MOI用AAV转导细胞，并返回最佳Treg扩增条件。在这些条件下，Treg扩增转导后没有受到显著影响(图6B)，并且观察到了来自HDR供体的GFP表达(图6C)。用GR2-Cas9和CnB mut处理的Treg群。用地塞米松培养时，AAV的存活提高(图6D)。

实施例5：本发明的Treg在＞3倍峰值治疗条件下对于CsA或FK506毒性不易感

为了模拟CNI对Treg存活和扩增的体内抑制作用，将保存的Treg解冻、再刺激、扩增4±1天，并用或不用环孢素(20、200和2000ng/ml)或FK506(3、10、30ng/ml)处理额外的2-3天，并通过流式细胞仪评估相对存活。使用未分离的Treg、原初Treg和记忆Treg进行研究，以确定一个子集是否对Dex和CNI具有不同的敏感性，并确定IL-2依赖性差异是否可能允许较低的IL-2浓度。在这三个群体的结果参数中未发现差异。

图7显示在这些条件下，即使浓度超过峰值治疗值3倍以上，CsA或FK506都不会对Treg体外存活产生显著影响。钙依赖磷酸酶以及CNI的主要靶标之一是转录因子NFAT，其在CD28的下游被激活并且是Treg发育所必需的。IL-2信号传导也可以激活NFAT。不受任何理论的束缚，体外对Treg缺乏CsA和FK506毒性可能是由于培养物中超过生理学的IL-2浓度。为了测试是否可以通过降低IL-2浓度来揭示一种作用，将解冻/再刺激的Treg在培养的最后3天以IL-2的滴定浓度暴露于CsA或FK506，并通过流式细胞术评估相对存活。

实施例6：建立针对GVHD体内模型的糖皮质激素和钙依赖磷酸酶抑制剂平台以验 证Treg的基因修饰在免疫抑制环境中增加功效

为了测试基因修饰的(GR2-CRISPR/Cas9)或基因编辑的(GR2-CRISPR/Cas9/AAV-CaN mut.)Treg在糖皮质激素存在的情况下是否增加体内功效，首先确定糖皮质激素(甲基泼尼松龙)如何影响临床前小鼠模型中的GVHD。出于下述多种原因，使用同种异体GVHD模型：1)建立了Csa(最佳为80mg/kg/天，相对20或40mg/kg/天无益处)和FK506[羧甲基纤维素中36mg/kg/天(第100天存活为55％-90％，相对使用载剂在第37天为0％)的最佳GVHD预防剂量，其在水溶液中在48mg/kg/天时具有一些毒性并且在12或24mg/kg/天时功效较差；n＝16-26/组)；2)建立了最佳Treg生成和扩增方案，其导致＞90％的小鼠中的GVHD预防和进一步滴定Treg剂量以确定低至无法统一预防GVHD的阈值Treg：T效应物(Teffector)比率(0.75：1被认为是次优的：0.5：1提供了水平＜50％的长期生存保护)；和3)同种异体GVHD模型非常适合GVHD病理生理学研究，包括Treg和T效应物运输，持久性和功能，有助于深入进行Treg和T效应物的研究。出于这些原因，以及同种异体GVHD模型在逻辑上更可行和更具成本效益的好处，首先对同种异体受体中优化的类固醇使用的GVHD预防和治疗进行了测试，然后将其应用于异种模型以进行测试人Treg产物。使用C57BL/6(B6)供体骨髓+2x10⁶T细胞的经致命辐照的BALB/c受体，测试了在1-28天剂量为1、3和6mg/kg/剂的甲基泼尼松龙，相对于雷帕霉素在0-14天为0.5mg/kg/天，然后3x/周直到第27天。图8显示了存活和p值。在第3天或第4天开始(而非第1天预防性的)将T细胞剂量减少至1.5x10⁶并移动至GVHD疗法，并比较无治疗与载剂与泼尼松龙(n＝8/组)。第3天使用泼尼松龙的GVHD疗法改善了结果(图9)。

将泼尼松龙治疗延迟到第4天是无效的。接下来，进行实验以确定泼尼松龙为10mg/kg d3-28时是否可再现，并且观察到确实如此(图10)。

这些数据提供了GVHD的类固醇治疗模型，其中类固醇可以拯救一定比例的小鼠，但不能治愈，为测试添加类固醇抗性或敏感性的Treg提供了讨论空间。

实施例7：在异种GVHD模型中建立基于类固醇和钙依赖磷酸酶抑制剂的GVHD预防 和治疗方案

为了确定泼尼松龙、Csa和FK506的最佳剂量，经非致死辐照(50rad)的免疫缺陷型NOD/Scid/IL-2Rg-/-(NSG)小鼠接受了15x10⁶人外周血单核细胞(PBMC)。概述于图11A中，小鼠接受高剂量的泼尼松龙(30mg/kg，第0-28天)，因为在同种异体GVHD模型中，在10mg/kg时仅观察到不完全的GVHD预防(参见图8-10)。泼尼松龙的这种剂量/时间表并未提供生存优势，并且经治疗的小鼠的中值存活较低(25天相对29天)，虽然差异并不显著(图11B)。除了存活外，已经证明体重减轻和人T细胞扩增是该异种移植GVHD模型疾病严重程度的标志物。在该实验中，经泼尼松龙处理的平均体重与对照无显著差异(图11C)。这些小鼠在第19天的血液中确实具有显著更多的人CD4+和CD8+T细胞(图11D)。

为了评估CNI对异种移植GVHD模型的作用，向小鼠正常施用人PBMC，并给予FK506，2个剂量(36或12mg/kg)或CsA(80mg/kg)(图12A)。接受高剂量FK506的小鼠的存活显著降低(p＜0.03)，而接受12mg/kg FK506的小鼠的中值存活较低(20天相对29天)，存活没有显著差异(图12B；P＝0.45)。接受CsA的小鼠的趋势是存活增加(目前为P＝0.15)。FK506和CsA均导致显著的早期体重减轻(图12C)。FK506和CsA均显著减少人CD45+、CD4+和CD8+细胞的体内扩增(图12D；对于各CNI组和各种细胞类型相对仅PBMC对照动物p＜0.05)。后续研究表明，用200rad+1x10⁷人PBMC诱导的异种移植GVHD病理学更加可重现，并且中值生存从约25天减少至约20天。为了评估较低剂量的泼尼松和CNI在这种改进的异种移植GVHD模型中的作用，小鼠经辐照(200rad)，注射人PBMC(静脉内，1x10⁷)，然后给予泼尼松(腹膜内，10mg/kg)、FK506或CsA(腹膜内，分别为2mg/kg或20mg/kg)(图13)。

实施例8：基因编辑的Treg的表征

因为在电穿孔之前需要消耗刺激性CD3/28珠，所以评估了这是否会对扩增产生负面影响。体外扩增后，将原初Treg解冻并用CD3/28珠(3∶1珠∶Treg)再刺激，并在第3天将样品分开，并从一个样品中磁力耗尽珠。珠耗尽后，将Treg再培养4天(总共7天)。如图14所示，在所示各种操作后，未发现对扩增的显著影响(n＝5)。

因为Treg对胞外DNA特别敏感，并且电穿孔可以导致坏死细胞死亡和DNA释放，所以测试了电穿孔是否会影响Treg的扩增。将体外扩增原初Treg解冻并用CD3/28珠(3∶1珠∶Treg)再刺激。在第3天，磁力耗尽珠，Treg经处理±电穿孔，之后将细胞再培养4天(总共7天)。发现电穿孔对扩增没有显著影响(图14B)。作为电穿孔功效的标志物，在体外转录的GFP mRNA存在的情况下，对Treg样品进行电穿孔。不仅mRNA具有良好的耐受性，而且GFP在所有细胞中均以高水平均匀表达，并且表达在转导后持续至少7天(图14C和14D)。

实施例9：Treg中的碱基编辑

通过将碱基编辑器以及向导RNA电穿孔来对Treg细胞进行碱基编辑，所述碱基编辑器以蛋白质或编码所述碱基编辑器的mRNA进行电穿孔，所述向导RNA靶向供所述碱基编辑器编辑的碱基。然后将编辑的细胞的基因组DNA分离，并PCR扩增靶基因座。然后通过Sanger测序对PCR扩增的基因座进行测序。通过鉴定靶位点的多个峰来观察碱基转化。然后使用EDITR方法对PCR扩增子序列数据进行分解以定量碱基编辑频率(参见，Kluesner等″EditR：使用Sanger测序的新型碱基编辑定量软件(EditR：A novel base editingquantification software using Sanger sequenceing)″.DOI：10.1101/213496.2017)。对于图19-22和24-27，通过红色空心框标记碱基编辑的序列。

图16描述了显示碱基编辑的示意图，其中CRISPR失活或切口DNA结合结构域是dCas9，而碱基编辑结构域是胞苷脱氨酶。根据图17中所示流程图在分离的Treg中进行碱基编辑。碱基编辑器可以RNP复合物递送，从而可以或可以不用硫代磷酸酯键修饰向导RNA，以防止内源性RNA酶的胞内降解。对于本申请，碱基编辑器以信使RNA递送，并且合成了向导RNA以包含5′和3′硫代磷酸酯键以防止胞内降解。碱基编辑靶向设计旨在/设计为转化核苷酸，从而引入提早终止密码子。此外，也将内含子切除和正确的开放阅读框取向和表达所需的定义为剪接供体和受体的外显子：内含子边界处的序列靶向用于转化，从而破坏剪接。保留内含子的不正确剪接的RNA使RNA不稳定，从而导致蛋白质表达降解和损失。

进行碱基编辑以在NR3C1外显子2中引入提早终止密码子。用碱基编辑器mRNA和具有SEQ ID NO：7中所示序列的向导RNA进行Treg的电穿孔。对遗传基因座进行测序表明，碱基编辑导致基因组序列中胞嘧啶(C)编辑为胸腺嘧啶(T)，从而产生提早TAA终止密码子(图18和19)。

进行碱基编辑以在NR3C1外显子2中引入提早终止密码子。用碱基编辑器mRNA和具有SEQ ID NO：8中所示序列的向导RNA进行Treg的电穿孔。对遗传基因座进行测序表明，碱基编辑导致基因组序列中胞嘧啶(C)编辑为胸腺嘧啶(T)，从而产生提早TAG终止密码子(图20和21)。

图22描述了破坏假设基因的剪接位点的结果的示意图。对剪接供体或剪接受体位点进行碱基编辑可以破坏基因的正常剪接，从而导致基因表达下调。

进行碱基编辑以破坏NR3C1中的剪接受体。用碱基编辑器mRNA和具有SEQ ID NO：55中所示序列的向导RNA进行Treg的电穿孔。对遗传基因座进行测序表明，碱基编辑导致基因组序列中腺苷(A)编辑为鸟嘌呤(G)，从而产生突变GG剪接受体位点(图23和24)。

进行碱基编辑以破坏NR3C1中的剪接供体。用碱基编辑器mRNA和具有SEQ ID NO：56中所示序列的向导RNA进行Treg的电穿孔。对遗传基因座进行测序表明，碱基编辑导致基因组序列中鸟嘌呤(G)编辑为腺苷(A)，从而产生突变剪接供体位点(图25和26)。

实施例10：效应T细胞中的碱基编辑

通过将碱基编辑器以及向导RNA电穿孔来对效应T细胞(Teff)进行碱基编辑，所述碱基编辑器以蛋白质或编码所述碱基编辑器的mRNA进行电穿孔，所述向导RNA靶向供所述碱基编辑器编辑的碱基。图27描述了两个实验的概况。在一个实验中，使用BE4对效应T细胞(Teff)中糖皮质激素受体基因座进行碱基编辑，其中进行了两轮珠刺激。在第二个实验中，使用BE4对效应T细胞中糖皮质激素受体基因座进行碱基编辑，但是其中仅进行一轮珠刺激。图28描述了显示来自供体经糖皮质激素受体碱基编辑后的CD4+效应T细胞(Teff)相对存活百分比的数据，所述供体在地塞米松存在或不存在的情况下使用gRNA GR2(表1中的SEQ ID NO：8)或BE4(表2中的SEQ ID NO：20)修饰。第一供体的细胞接受了两轮刺激，而第二供体的细胞接受了单轮刺激。接受两轮刺激的Teff对地塞米松(Dex)非常敏感。在两个实验中，在30μg/ml时，使用两轮BE4进行编辑比使用GR2更有效(分别为p≤0.001，p≤0.01)。

序列表

<110> 明尼苏达大学董事会（Regents of the University of Minnesota）

M·J·奥斯本（Osborn, Mark J）

K·L·西朋（Hippen, Keli L）

B·R·布拉泽（Blazer, Bruce R）

<120> 针对类固醇和钙调磷酸酶抑制剂抗性的TREG基因组工程改造

<130> 920171.00229

<150> US 62/672,868

<151> 2018-05-17

<160> 67

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 521

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Met Ser Glu Pro Lys Ala Ile Asp Pro Lys Leu Ser Thr Thr Asp Arg

1 5 10 15

Val Val Lys Ala Val Pro Phe Pro Pro Ser His Arg Leu Thr Ala Lys

20 25 30

Glu Val Phe Asp Asn Asp Gly Lys Pro Arg Val Asp Ile Leu Lys Ala

35 40 45

His Leu Met Lys Glu Gly Arg Leu Glu Glu Ser Val Ala Leu Arg Ile

50 55 60

Ile Thr Glu Gly Ala Ser Ile Leu Arg Gln Glu Lys Asn Leu Leu Asp

65 70 75 80

Ile Asp Ala Pro Val Thr Val Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe

85 90 95

Asp Leu Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg

100 105 110

Tyr Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu

115 120 125

Cys Val Leu Tyr Leu Trp Ala Leu Lys Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Leu

130 135 140

Phe Leu Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Arg His Leu Thr Glu Tyr Phe

145 150 155 160

Thr Phe Lys Gln Glu Cys Lys Ile Lys Tyr Ser Glu Arg Val Tyr Asp

165 170 175

Ala Cys Met Asp Ala Phe Asp Cys Leu Pro Leu Ala Ala Leu Met Asn

180 185 190

Gln Gln Phe Leu Cys Val His Gly Gly Leu Ser Pro Glu Ile Asn Thr

195 200 205

Leu Asp Asp Ile Arg Lys Leu Asp Arg Phe Lys Glu Pro Pro Ala Tyr

210 215 220

Gly Pro Met Cys Asp Ile Leu Trp Ser Asp Pro Leu Glu Asp Phe Gly

225 230 235 240

Asn Glu Lys Thr Gln Glu His Phe Thr His Asn Thr Val Arg Gly Cys

245 250 255

Ser Tyr Phe Tyr Ser Tyr Pro Ala Val Cys Glu Phe Leu Gln His Asn

260 265 270

Asn Leu Leu Ser Ile Leu Arg Ala His Glu Ala Gln Asp Ala Gly Tyr

275 280 285

Arg Met Tyr Arg Lys Ser Gln Thr Thr Gly Phe Pro Ser Leu Ile Thr

290 295 300

Ile Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala

305 310 315 320

Val Leu Lys Tyr Glu Asn Asn Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys

325 330 335

Ser Pro His Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp

340 345 350

Ser Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val

355 360 365

Leu Asn Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Gly Ser Glu Glu Asp Gly Phe

370 375 380

Asp Gly Ala Thr Ala Ala Ala Arg Lys Glu Val Ile Arg Asn Lys Ile

385 390 395 400

Arg Ala Ile Gly Lys Met Ala Arg Val Phe Ser Val Leu Arg Glu Glu

405 410 415

Ser Glu Ser Val Leu Thr Leu Lys Gly Leu Thr Pro Thr Gly Met Leu

420 425 430

Pro Ser Gly Val Leu Ser Gly Gly Lys Gln Thr Leu Gln Ser Ala Thr

435 440 445

Val Glu Ala Ile Glu Ala Asp Glu Ala Ile Lys Gly Phe Ser Pro Gln

450 455 460

His Lys Ile Thr Ser Phe Glu Glu Ala Lys Gly Leu Asp Arg Ile Asn

465 470 475 480

Glu Arg Met Pro Pro Arg Arg Asp Ala Met Pro Ser Asp Ala Asn Leu

485 490 495

Asn Ser Ile Asn Lys Ala Leu Thr Ser Glu Thr Asn Gly Thr Asp Ser

500 505 510

Asn Gly Ser Asn Ser Ser Asn Ile Gln

515 520

<210> 2

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp

1 5 10 15

Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu

20 25 30

Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu

35 40 45

Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr

50 55 60

Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser

65 70 75 80

Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe

85 90 95

Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu

100 105 110

Phe Gln Val Leu Lys Met Met Val Gly Asn Asn Leu Lys Asp Thr Gln

115 120 125

Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys Asp Gly

130 135 140

Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val Gly Gly Leu

145 150 155 160

Asp Ile His Lys Lys Met Val Val Asp Val

165 170

<210> 3

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

atgagcgagc ccaaggccat cgaccccaag ctgtccacca ccgacagagt ggtgaaggcc 60

gtgccctttc ccccctccca ccgcctgacc gccaaggagg tgttcgacaa cgatggcaag 120

cccagagtgg acatcctgaa agcccacctg atgaaggagg gcagactgga ggagagcgtg 180

gccctgcgca tcatcaccga gggcgccagc atcctgcgcc aggagaagaa cctgctggat 240

atcgacgccc ctgtgaccgt gtgcggcgac atccacggac agtttttcga cctgatgaag 300

ctgttcgagg tgggcggctc tcccgccaac accagatacc tgttcctggg cgactacgtg 360

gacagaggct acttctctat cgagtgcgtg ctgtacctgt gggccctgaa gatcctgtac 420

cccaagaccc tgttcctgct gagaggcaac cacgagtgcc gccacctgac cgagtacttt 480

accttcaagc aggagtgcaa gatcaagtac agcgagcgcg tgtacgatgc ctgcatggac 540

gccttcgact gtctgcccct ggccgctctg atgaaccagc agttcctgtg tgtgcacgga 600

ggcctgagcc ccgagatcaa caccctggac gacatccgga agctggaccg cttcaaggag 660

ccccctgcct atggccccat gtgcgacatc ctgtggagcg accccctgga ggactttggc 720

aacgagaaga cccaggagca ctttacccac aacaccgtga gaggctgcag ctacttctac 780

tcctaccctg ctgtgtgcga gttcctgcag cacaacaacc tgctgagcat cctgagggcc 840

cacgaggccc aggatgccgg ctaccgcatg taccgcaagt cccagaccac cggcttcccc 900

tccctgatca ccatcttctc tgcccccaac tacctggacg tgtacaacaa caaagccgct 960

gtgctgaagt acgagaacaa cgtgatgaac atccggcagt tcaactgctc cccccacccc 1020

tactggctgc ccaacttcat ggacgtgttc gagtggagcg ccccctttgt gggcgagaag 1080

gtgaccgaga tgctggtgaa cgtgctgaac atctgctccg acgatgagct gggcagcgag 1140

gaggacggct tcgatggcgc caccgctgcc gccagaaagg aggtgatccg caataagatc 1200

agagccatcg gcaagatggc cagagtgttc tccgtgctgc gcgaggagag cgagtccgtg 1260

ctgaccctga agggcctgac ccccaccggc atgctgccct ccggcgtgct gagcggaggc 1320

aagcagaccc tgcagagcgc cacagtggag gccatcgagg ccgatgaggc catcaagggc 1380

ttctcccccc agcacaagat caccagcttc gaggaggcca agggcctgga ccggatcaac 1440

gagcggatgc cacccagacg ggatgccatg cccagcgatg ccaacctgaa ctccatcaac 1500

aaggccctga ccagcgagac caacggcacc gacagcaacg gcagcaactc ctccaacatc 1560

cagtga 1566

<210> 4

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

atgagcgagc ccaaggccat cgaccccaag ctgtccacca ccgacagagt ggtgaaggcc 60

gtgccctttc ccccctccca ccgcctgacc gccaaggagg tgttcgacaa cgatggcaag 120

cccagagtgg acatcctgaa agcccacctg atgaaggagg gcagactgga ggagagcgtg 180

gccctgcgca tcatcaccga gggcgccagc atcctgcgcc aggagaagaa cctgctggat 240

atcgacgccc ctgtgaccgt gtgcggcgac atccacggac agtttttcga cctgatgaag 300

ctgttcgagg tgggcggctc tcccgccaac accagatacc tgttcctggg cgactacgtg 360

gacagaggct acttctctat cgagtgcgtg ctgtacctgt gggccctgaa gatcctgtac 420

cccaagaccc tgttcctgct gagaggcaac cacgagtgcc gccacctgac cgagtacttt 480

accttcaagc aggagtgcaa gatcaagtac agcgagcgcg tgtacgatgc ctgcatggac 540

gccttcgact gtctgcccct ggccgctctg atgaaccagc agttcctgtg tgtgcacgga 600

ggcctgagcc ccgagatcaa caccctggac gacatccgga agctggaccg cttcaaggag 660

ccccctgcct atggccccat gtgcgacatc ctgtggagcg accccctgga ggactttggc 720

aacgagaaga cccaggagca ctttacccac aacaccgtga gaggctgcag ctacttctac 780

tcctaccctg ctgtgtgcga gttcctgcag cacaacaacc tgctgagcat cctgagggcc 840

cacgaggccc aggatgccgg ctaccgcatg taccgcaagt cccagaccac cggcttcccc 900

tccctgatca ccatcttctc tgcccccaac tacctggacc ggtacaacaa caaagccgct 960

gtgctgaagt acgagaacaa cgtgatgaac atccggcagt tcaactgctc cccccacccc 1020

ttctggctgc ccaacttcat ggacgtgttc acctggtccc tgccctttgt gggcgagaag 1080

gtgaccgaga tgctggtgaa cgtgctgaac atctgctccg acgatgagct gggcagcgag 1140

gaggacggct tcgatggcgc caccgctgcc gccagaaagg aggtgatccg caataagatc 1200

agagccatcg gcaagatggc cagagtgttc tccgtgctgc gcgaggagag cgagtccgtg 1260

ctgaccctga agggcctgac ccccaccggc atgctgccct ccggcgtgct gagcggaggc 1320

aagcagaccc tgcagagcgc cacagtggag gccatcgagg ccgatgaggc catcaagggc 1380

ttctcccccc agcacaagat caccagcttc gaggaggcca agggcctgga ccggatcaac 1440

gagcggatgc cacccagacg ggatgccatg cccagcgatg ccaacctgaa ctccatcaac 1500

aaggccctga ccagcgagac caacggcacc gacagcaacg gcagcaactc ctccaacatc 1560

cagtga 1566

<210> 5

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

atgggcaacg aggccagcta ccctctggag atgtgctccc acttcgacgc cgacgagatc 60

aagcggctgg gcaagcgctt caagaagctg gacctggaca acagcggcag cctgagcgtg 120

gaggagttta tgtctctgcc cgagctgcag cagaaccccc tggtgcagcg cgtgatcgac 180

atcttcgaca ccgacggcaa cggcgaggtg gacttcaagg agttcatcga gggcgtgagc 240

cagttcagcg tgaagggcga caaggagcag aagctgcggt tcgccttccg gatctacgat 300

atggataaag atggctatat ttctaatggc gagctgttcc aggtgctgaa gatgatggtg 360

ggcaacaata ccaagctggc cgatacccag ctgcagcaga tcgtggacaa gaccatcatc 420

aacgccgaca aggacggcga cggcagaatc agcttcgagg agttctgtgc cgtggtggga 480

ggcctggata ttcacaaaaa aatggtggtg gacgtgtga 519

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Val Ile Val Ile Thr

1 5

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

aaccaaaagt cttcgctgct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

ttgagaagcg acagccagtg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

accaggagtt aatgattctt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

tcctgagcaa gcacactgct 20

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X = 任何天然产生的氨基酸

<400> 11

Arg Xaa Lys Arg

1

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X = 任何天然产生的氨基酸

<400> 12

Arg Xaa Arg Arg

1

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X = R或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X = 任何天然产生的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> X = R或K

<400> 13

Xaa Arg Xaa Xaa Arg

1 5

<210> 14

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(3)

<223> X = 任何天然产生的氨基酸

<400> 14

Arg Xaa Xaa Arg

1

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

Arg Gln Lys Arg

1

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

ugcucaggag aggggagaug 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

cuugcucagg agaggggaga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

uucucaauca gacuccaagc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

gggccaaauc agccuuuccu 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

ucagaacagc aacauuugaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

aagggccaga cuggcaccaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

ccccaaguga aaacagaaaa 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

uacugucagg caagcuuucc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

acugucaggc aagcuuuccu 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

ggaggacaga uguaccacua 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

ccuuucucaa cagcaggauc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

auuccaauuu ucggaaccaa 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

uuccaauuuu cggaaccaac 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

aggugccaag gaucuggaga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

ggucgaacag uuuuuucuaa 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 31

uaucgaaaau gucuucaggc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 32

ucuucaggcu ggaaugaacc 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 33

cuucaggcug gaaugaaccu 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 34

acagcucgaa aaacaaagaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 35

ggaauucagc aggccacuac 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 36

gaauucagca ggccacuaca 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 37

accacaacuc accccuaccc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 38

uuaccacaac ucaccccuac 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

ugauccucca aguugagucu 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 40

cuccaaguug agucuggaac 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 41

ggaugaccaa augacccuac 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 42

acauccagga guacugcagu 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 43

aacauccagg aguacugcag 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 44

aggcuucagg uaucuuauga 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 45

caggcuucag guaucuuaug 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 46

aagagccaag agcuauuuga 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 47

uuaucaacug acaaaacucu 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 48

uaucaacuga caaaacucuu 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 49

uuuaucaacu gacaaaacuc 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 50

cuuccaaaca uuuuuggaua 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 51

ccaaucagau accaaaauau 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 52

aaccacauaa cauucuauaa 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 53

guuucaucaa aagugacugc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 54

gcuguccuau auggaauaaa 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 55

uacucauuaa uaaucagauc 20

<210> 56

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 56

aaccgtaaaa t 11

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 57

gggccaaatc agcctttcct 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 58

tcagaacagc aacatttgaa 20

<210> 59

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 59

ttttattcca tataggacag cacaattacc t 31

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 60

tttattccat ataggacag 19

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 61

ttttattcca tataggacag c 21

<210> 62

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 62

gattattaat gagta 15

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 63

gatctgatta ttaatgagta 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 64

tactcattaa taatcagatc 20

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 65

tcagaacagc aacatttgaa ggg 23

<210> 66

<211> 5077

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 66

ctttaacaga agattcagtt tgaagaatag ggctctttgt tagtacttct gcttttaact 60

ctttaatctc aagctaacac ttaacgaatt tacaaataag gcagcacaac ttttgactat 120

gtaagtaagg gtatcattta ttgtaatata agaacatatt ctaaaacagc tgaatgacca 180

tgcacaacac aatatgatat tatgagacat tatactctcc tgaatttata taatttttcg 240

ttaagatatc tgttaatgag caacattatt ttaaaaatgt taaataaaat cctcaccgtt 300

ggccaatggg atactgaaaa ccactattta aggaaaaaac ctgaaatggt tacgtacaga 360

tgtcacttag gttgtctacc tttcctactt tcaaaaggcc acttaaactt attcatataa 420

aaaagcacat gaatctttag agaacacata taaatcaatg aagatttaca tctattaatc 480

taccttaaat gtaccattct taagaaacag aaaaacactg atcttacctt gaatagccat 540

tagaaaaaac tgttcgacca gggaagttca gagtccccag agaagtcaag ttgtcatctc 600

cagatccttg gcacctattc caattttcgg aaccaacggg aattggtgga atgacattaa 660

aaataggctt ctgatcctgc tgttgagaaa gggatgctgt attcatgtca tagtggtaca 720

tctgtcctcc agaggtactc acaccatgaa cagaaatggc agacatttta ttaccaatta 780

tatttgctcc aggaaagctt gcctgacagt aaactgtgcc cagtttctct tgcttaatta 840

ccccaggggt gcagagttcg atgaaatctt ctttttctgt tttcacttgg ggcagtgtta 900

cattactggg gcttgacaaa accagatctc cattatcctt aattttgggt ttagtgtccg 960

gtaaaatgag aggcttgcag tcctcattcg agtttccttc caaaaggaat gaatcgtctt 1020

ctcccgccag aggagaaagc aaacagtttt catctatcaa caggtctgat ctccaaggac 1080

tctcattcgt ctctttacct ggggacccag aagaaaactc caaatcctgc aaaatgtcaa 1140

aggtgctttg gtctgtggta tacaatttca cattgccacc gttggtgcca gtctggccct 1200

tcaaatgttg ctgttctgaa gatacatcag agtgagtttt tggaaactcc ttctctgtgg 1260

gggcagcaga cacagcagtg gatgctgaac tcttggggtt ctctggaaca ctggtcgacc 1320

tattgaggtt tgcaatgctt tcttccaaaa gctttaagtc tgtttccccc gaggaaaggc 1380

tgatttggcc ctgctgtggg aatcccaggt catttcccat cacttttgtt tctgtctctc 1440

ccatatacag tcccattgag agtgaaactg ctttggacag atctggctat cgatcacgag 1500

actagcctcg agaagcttga tatcgaattc cacggggttg gacgcgtctt aattaaggat 1560

ccaaggtcag gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 1620

gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga 1680

tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc 1740

ggtcccgccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc 1800

tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc 1860

gcgcttctgc tccccgagct ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc 1920

tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgactcta gaggatcgat 1980

cccccgggct gcaggaattc aagcgagaag acaagggcag aaagcaccat gggcaacgag 2040

gccagctacc ctctggagat gtgctcccac ttcgacgccg acgagatcaa gcggctgggc 2100

aagcgcttca agaagctgga cctggacaac agcggcagcc tgagcgtgga ggagtttatg 2160

tctctgcccg agctgcagca gaaccccctg gtgcagcgcg tgatcgacat cttcgacacc 2220

gacggcaacg gcgaggtgga cttcaaggag ttcatcgagg gcgtgagcca gttcagcgtg 2280

aagggcgaca aggagcagaa gctgcggttc gccttccgga tctacgatat ggataaagat 2340

ggctatattt ctaatggcga gctgttccag gtgctgaaga tgatggtggg caacaatacc 2400

aagctggccg atacccagct gcagcagatc gtggacaaga ccatcatcaa cgccgacaag 2460

gacggcgacg gcagaatcag cttcgaggag ttctgtgccg tggtgggagg cctggatatt 2520

cacaaaaaaa tggtggtgga cgtgctcgag ggcggcggag agggcagagg aagtcttcta 2580

acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cctagggtaa gcaaggggga ggagctgttc 2640

accggcgtag tacctatact ggtcgagttg gatggggacg tgaacggcca taaattctct 2700

gtgtctgggg agggcgaagg tgatgcgacc tacggaaagc tcaccctcaa attcatttgt 2760

acaacgggta agctgcctgt tccgtggccc accttggtaa ctaccttgac ttatggtgtc 2820

cagtgcttct ccaggtaccc agatcacatg aagcagcacg acttcttcaa atccgccatg 2880

cctgaaggct atgtgcaaga gcggacaatt ttttttaagg acgatggcaa ctataagact 2940

cgagccgaag ttaaatttga gggagacacc cttgtcaata ggatcgagct taaaggcatt 3000

gattttaagg aagacggaaa tatattgggc cataagctgg agtataacta caatagtcat 3060

aacgtgtaca tcatggctga caagcagaag aacgggatta aggtaaattt taagatcagg 3120

cataacatag aggacgggag cgtccaactt gccgaccact accagcaaaa taccccgata 3180

ggcgatggtc ctgtactgtt gccggataat cactacctct ctacgcaatc cgcgcttagt 3240

aaggatccta acgagaaacg cgaccacatg gtgcttctgg agttcgtaac tgctgctggc 3300

atcacacttg gcatggacga attgtacaaa tagcgctgat cagcctcgac tgtgccttct 3360

agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc 3420

actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt 3480

cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat 3540

agcaggcatg ctggggaagc tcgattgaga agcgacagcc agtgagggtg aagacgcaga 3600

aaccttcaca gtagctcctc ctcttagggt tttatagaag tccatcacat ctcccctctc 3660

ctgagcaagc acactgctgg ggttttcttc tctaccagga gttaatgatt ctttggagtc 3720

catcagtgaa tatcaactac aaaacaaaaa acaaaaacgg ggggaaaaca tcataagctc 3780

taaagtcaca ttatcttcct gatccgatta gtaagaggca gcttgttaaa tgaacctttt 3840

agttaactcc gaatcaaatt ctttgttacc agaagagtag tttctatctt ccagaataaa 3900

aagccatgtc ccctgctccc attcagcatg ccacatttaa aagtacaatg caatccattt 3960

gcacagctga gggcaaaagt gtatcgaact aagcttggct attcatcctg ccgctcactg 4020

aacgtgtagc tttgttaatc acagacatta taattcatta catctgatta ttctgaaggt 4080

tcaagttgat gtcaaagtat ttaatttcaa aaaaaggaag tgtgatcatt aaaattccta 4140

cctcttttca atcacggctg tttgcttttc tgagaaccaa tacatataac atttgataaa 4200

tactatgcta gaattctcaa tccctaatta cttccaaatt tccctcctac cagctagtca 4260

cacatccaaa cctttgagta caaccaactg gtgaaccatg cacgttttct ttgaaaaata 4320

aacaatgctg atctgcttat cttccgacag gctgggaaaa ggctttttaa cccatacttc 4380

tgactggatg tgcctacctc caaattttgg atatatgaaa tgagatacac tttatatagg 4440

ccaactaaaa tttagatttt aaagagcaga agagaaggtg tagtagtttc tcactacgtt 4500

gttagcttac ataacttaaa tatagctgac ccttatcata actcacaaaa acatctagat 4560

taagctacat ttgtttacat tgcttgagat cctcaatatg aaatgctatt acatctctaa 4620

gttctttcct ttccaaacaa atatcgaagt actgaaaaat ggaaaaacac agaaccgtaa 4680

aatcacattc atataaattc aggtacaact gtatccagta aaatgttcaa aataattttc 4740

tctgccttca cctatccaaa ccttcaccta tcccaattct cagcctattc tcaagagagt 4800

aagactgtta gtatatcgtt aatcagggtg ttttaagaga tgggctaaga cggagaagcg 4860

catttgggac actatagtca aatcccgtcc aataaaaggt aacttttcct atgcgatgac 4920

gttaggcagc ataaatgtca ctggccctca ctgaaaagtg aatatgaagg tagagagagg 4980

ggtgtggact tgccactaca aatcttgagg gtaaactgct tatctcccca cctctctgcc 5040

ccgtttatct gaggcgataa cgatctctaa acacgag 5077

<210> 67

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 67

Met Ala Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu

1 5 10 15