治疗肺高压的组合物和方法
阅读说明：本技术 治疗肺高压的组合物和方法 (Compositions and methods for treating pulmonary hypertension ) 是由 谢子建 王佳艳 桑德里纳·V·皮埃尔 约瑟夫·I·夏皮罗 于 2018-05-11 设计创作，主要内容包括：提供了治疗肺高压、包括肺动脉高压的方法,所述方法包括向需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。所述多肽拮抗剂的施用减少肺动脉加速时间,减少右心室肥大的量,减少右心室壁厚度,减少肺血管壁厚度的量,减少所述对象的肺中丛状病灶的量,减少肺血管中胶原沉积的量,减少肺血管中膜或外膜中胶原沉积的量,和/或减少右心室纤维化的量。还提供了减少肺血管壁厚度的方法,所述方法包括施用所述Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。(Methods of treating pulmonary hypertension, including pulmonary arterial hypertension, are provided, the methods comprising administering to a subject in need thereof a polypeptide antagonist of a Na/K atpase/Src receptor complex. Administration of the polypeptide antagonist reduces pulmonary artery acceleration time, reduces the amount of right ventricular hypertrophy, reduces right ventricular wall thickness, reduces the amount of pulmonary vessel wall thickness, reduces the amount of plexiform lesions in the lungs of the subject, reduces the amount of collagen deposition in pulmonary vessels, reduces the amount of collagen deposition in the tunica media or adventitia in pulmonary vessels, and/or reduces the amount of right ventricular fibrosis. Also provided are methods of reducing lung vessel wall thickness comprising administering a polypeptide antagonist of the Na/K atpase/Src receptor complex.)
相关申请
本申请要求2017年5月11日提交的美国临时申请系列号62/504,947的优先权，所述临时申请的全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开的主题内容主要涉及用于治疗肺高压的组合物和方法。具体来说，本公开的主题内容的某些实施方式涉及多肽和使用所述多肽治疗肺高压、包括肺动脉高压和相关的血管壁增厚的方法。
背景技术
Na/K-ATP酶在大多数真核细胞中普遍表达，并通过将Na+泵出细胞并将K+泵入细胞来帮助维持跨膜离子梯度。Na/K-ATP酶通过至少两个结合基序直接与Src相互作用：一个在α1亚基的CD2与Src SH2之间，另一个涉及第三胞质结构域(CD3)和Src激酶结构域。这种Na/K-ATP酶与Src的复合体的形成充当哇巴因的受体，以唤起蛋白激酶级联。具体来说，哇巴因与Na/K-ATP酶的结合将破坏后期相互作用，然后引起不同途径包括ERK级联、PLC/PKC途径的组装和激活和ROS的生产。此外，这种相互作用将Src保持在无活性状态下。因此，Na/K-ATP酶起到内源性Src负调控物的作用。也参见国际专利申请号WO 2008/054792和WO 2010/071767，两者都通过引用并入本文。
Src家族的激酶是52-62-kDa的膜相关非受体酪氨酸激酶，并且它们参与几个与酪氨酸磷酸化相关的信号传导途径以响应各种不同的细胞外配体。例如，Src含有至少三个蛋白质相互作用结构域。SH3结构域结合到聚脯氨酸基序，并且SH2结构域与磷酸化的酪氨酸残基相互作用。激酶结构域与所述核苷酸反应并将底物磷酸化。蛋白质配体与所述SH3或SH2结构域的结合可以激活Src。据报道，与Src的激酶结构域结合的蛋白质也能够调控Src活性。
还进一步认识到，所述Na+/K+-ATP酶与Src和Src家族的激酶相互作用，以形成功能性受体。哇巴因与该受体的结合激活Src，其进而将各种不同的效应物磷酸化，引起不同途径包括Ras/Raf/ERK1/2和磷脂酶C/蛋白激酶C级联的组装和激活，以及细胞内Ca2+和细胞ROS生产的增加。这些信号传导途径的激活最终导致心和肾功能的改变，刺激细胞增殖和组织纤维化，保护组织免于缺血/再灌注损伤，抑制癌细胞生长等。尽管许多已知的Src和Src家族激酶抑制剂被开发为与ATP竞争与这些激酶竞争的ATP类似物，但这些Src抑制剂缺乏途径特异性。就此而言，以前已经观察到通过被称为“pNaKtide”(SEQ IDNO：5)的多肽阻断NKA/Src活化，有效地废止了ROS扩增回路的形成，导致病理性ROS信号传导的抑制。pNaKtide也在肥胖症中降低ROS胁迫和信号传导，并且在***心肌病的动物模型中有效地阻断并逆转左心室肥大和纤维化。
由静息时平均肺动脉压高于25mmHg或运动时高于30mmHg所定义的肺动脉高压(PAH)是一种致死性疾病，其中肺血管重塑和缩窄逐渐导致右心室功能障碍和衰竭。PAH的特征在于内皮细胞增殖、肺血管重塑、远端血管修剪和肺阻力增加，最终导致右心衰竭和死亡。PAH的估算患病率在每百万人10至52例的范围内。当前的登记表明PAH患者的3年和5年生存率分别为51-71％和48-58％。PAH的特征性肺血管病变包括中膜肥大、内膜的增殖性和纤维化变化、外膜增厚、复合病变和血栓形成病变。异常的血管重塑和肺血管缩窄导致肺循环阻力和右心室后负荷升高，引起作为补偿性机制的右心室肥大的发生。心输出量一开始维持，但随着阻力的持续增加，发生进行性的收缩功能障碍，导致代偿、扩张和右心室衰竭。此外，在PAH的病理条件下，ROS的增加是作为肺血管系统中不良重塑的病理基础的内皮细胞和平滑肌细胞增殖和炎症的关键。PAH患者的存活与右心室功能密切相关，并且细胞肥大和心肌纤维化的发展也与ROS的过度生成和脂质过氧化相关。
尽管在PAH的管理方面取得了长足的进步，但是各种疗法的局限性和复杂性带来了对治疗PAH的新方式的需求。目前，主要批准了PAH的四种治疗方式：钙通道阻断，前列环素类似物，内皮素途径拮抗剂和一氧化氮途径药剂。钙通道阻断剂抑制钙流入血管细胞，导致平滑肌松弛和血管舒张。这可能是一种有用的疗法，但仅适用于6-7％的具有血管舒张响应的PAH患者。钙通道阻断剂在非响应者中是禁忌的，因为它们可能提高发病率和死亡率。前列环素(PGI2)这种由内皮细胞产生的对肺动脉血管床具有强力血管舒张、抗增殖、抗血栓形成和抗炎活性的内源性物质，在PAH中被破坏。
因此，已设计了前列环素合成物和类似物作为PAH中的治疗剂。此外，内皮素-1(ET-1)途径与PAH有关。具体来说，ET-1通过与其在肺血管系统中的受体ET-A(血管平滑肌细胞)结合来促进血管收缩和增殖。在PAH中，ET-1、ET-A和ET-B(内皮ET-1受体)被上调，因此已开发了内皮素受体拮抗剂(ERA)作为PAH疗法。在PAH中，肺血管中的一氧化氮(NO)生物可利用性降低。NO由内皮细胞产生，并激活平滑肌细胞中的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)以催化环状鸟苷单磷酸(cGMP)，从而导致血管扩张、血小板聚集的抑制和平滑肌细胞增殖。磷酸二酯酶(PDE)是使cGMP失活的酶。PDE-5是在肺中大量表达的同功酶，并已知在PAH中被上调。PDE-5抑制剂保持cGMP水平并促进内源性NO的作用，包括肺动脉平滑肌细胞松弛以及可能的血管平滑肌细胞的生长抑制，使这类药物对治疗PAH有益。
当前尚无治愈肺动脉高压的方法，但目前批准的治疗选项包括***素类药物、内皮素受体拮抗剂和5型磷酸二酯酶抑制剂，已显示出提高生存率。依前列醇这种合成的PGI2，是由USFDA于1995年批准的首个靶向PAH的疗法。迄今为止，它是唯一被证实在PAH中降低死亡率的治疗。尽管具有临床益处，但这种药物的半衰期短(3-5分钟)，在重建后缺乏稳定性因此需要使用冰袋进行冷却，以及连续且不间断的IV施用，使该药的使用麻烦。与依前列醇有关的最严重不良事件涉及留置的隧道导管，例如部位感染、脓毒症和与导管相关的静脉血栓形成。如果泵出现故障或输注通过其他方式被中断，则还可能存在致命的PAH反弹的危险。与所有PGI2药物相似，常见的副作用包括头痛、潮红、下巴疼痛和腹泻。具有较长半衰期/稳定性的其他类***素类似物以及允许包括SC、IV、口服和吸入的多种施用途径的剂型已获批准，并且它们作为单一疗法或联合疗法对血液动力学、症状、生活质量和/或6分钟步行距离有积极影响。同样，前列环素受体的高选择性激动剂积极影响终点，作为前列环素类似物的口服替代物用于PAH的治疗，但无论采用何种背景疗法，都不降低死亡率。
自2001年以来，双重或选择性ERA也已被开发和改进。总体而言，它们在PAH患者中已显示出运动能力的持续改善，并且临床恶化和死亡的风险较低。对于某些人而言，仍然存在对药物相互作用的担忧，包括所有常见的***类避孕药以及常用的药物例如环孢菌素、辛伐他汀、华法林和利福平。重要的是，所有的ERA、包括波生坦，都具有与许多用于治疗HIV和AIDS的抗反转录病毒疗法发生药物相互作用的可能性。它们也是致畸的，妊娠是正式禁忌症。
目前，两种PDE-5i和一种可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂被US FDA批准了用于PAH的治疗。总体而言，它们对WHO功能分级和临床恶化前的时间具有有利效果。药物相互作用和由系统性血管舒张效应造成的低血压风险(以及头痛、潮红、鼻充血、消化不良和肌痛)是主要风险。
显然，对肺高压患者的护理存在着尚未满足的需求。因此，对用于治疗肺高压的组合物和方法，仍存在着需求。
本公开的主题内容满足了一些或所有上述需求，正如对于本领域普通技术人员来说在研究了本文件中提供的信息之后将变得显而易见的。
本概述描述了本公开的主题内容的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和排列。该概述仅仅是众多不同实施方式的示例。给定实施方式的一个或多个代表性特点的提及同样是示例性的。这样的实施方式通常可以具有或不具有所提到的特点；同样，这些特点可以应用于本公开的主题内容的其他实施方式，无论是否在本概述中列出。为了避免过多的重复，本概述并未列出或提出这些特点的所有可能组合。
本公开的主题内容包括用于治疗肺高压的组合物和方法。具体来说，本公开的主题内容的某些实施方式包括多肽和使用所述多肽治疗肺高压、包括肺动脉高压和相关的血管壁增厚的方法。
在某些实施方式中，提供了一种治疗肺高压的方法，所述方法包括向需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。在某些实施方式中，所述多肽拮抗剂包含SEQ ID NO：1的序列或其功能性片段和/或功能性变体。在某些实施方式中，所述多肽拮抗剂还包括由选自SEQ ID NO：2-4的氨基酸序列编码的细胞穿透多肽。在某些实施方式中，这种包括细胞穿透肽的多肽拮抗剂包含SEQ ID NO：5的序列或其功能性片段和/或功能性变体。
在某些实施方式中，根据的本公开的主题内容的多肽拮抗剂的施用减轻或治疗肺高压的一种或多种根本病因和/或症状。例如，在某些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少肺动脉加速时间，减少右心室肥大的量，减少右心室壁厚度，减少肺血管壁厚度的量，减少所述对象的肺中丛状病灶的量，减少肺血管中胶原沉积的量，减少肺血管中膜或外膜中胶原沉积的量，减少右心室纤维化的量，和/或减少所述对象中IL-6的量。
在某些实施方式中，根据本公开的主题内容治疗的肺高压是肺动脉高压，因此在某些实施方式中，提供了一种用于治疗肺动脉高压的方法，所述方法包括向需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。
此外，在某些实施方式中，提供了减少肺血管壁厚度的方法。在某些实施方式中，提供了一种减少肺血管壁厚度的方法，所述方法包括向需要的对象施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。在某些实施方式中，这种对象具有肺动脉高压。
对于本领域普通技术人员来说，在研究了本文件中的描述、附图和非限制性实例后，本公开的主题内容的其他特点和优点将变得明显。
序列表简述
下面是本文随附并整体通过引用并入本文的序列表的简述。
SEQ ID NO：1是编码根据本公开的主题内容的多肽的实施方式的氨基酸序列(NaKtide，SATWLALSRIAGLCNRAVFQ)；
SEQ ID NO：2是编码TAT细胞穿透肽的氨基酸序列(GRKKRRQRRRPPQ)；
SEQ ID NO：3是编码穿膜肽(AP)细胞穿透肽的氨基酸序列(RQIKIWFQNRRMKWK K)；
SEQ ID NO：4是编码氨基酸序列Na/K-ATP酶的α1亚基的N-端聚赖氨酸结构域的氨基酸序列(A1N，KKGKKGKK)；
SEQ ID NO：5是编码根据本公开的主题内容的另一个多肽的实施方式的氨基酸序列(pNaKtide，GRKKRRQRRRPPQSATWLALSRIAGLCNRAVFQ)；
SEQ ID NO：6是用于分析IL-6表达的正向引物(TTC TCT CCGCAA GAG ACT TCC)；
SEQ ID NO：7是用于分析IL-6表达的反向引物(TGT GGG TGGTAT CCT CTG TGA)；
SEQ ID NO：8是用于分析β-肌动蛋白表达的正向引物(AGATCA AGA TCA TTG CTCCT)；并且
SEQ ID NO：9是用于分析β-肌动蛋白表达的反向引物(ACG CAGCTC AGT AAC AGTCC)。
附图说明
图1A-1E包括显示pNaKtide降低肺动脉高压(PAH)和右心室(RV)肥大的图，其包括的图示出了：(图1A)肺动脉加速时间(PAAT)；(图1B)富尔敦指数；(图1C)通过超声波心动描记术评估的RV厚度；(图1D)右心室收缩压(RVSP)的代表性迹线；和(图1E)RVSP。值是平均值±SEM。**、***和****指示相对于所指明的组p<0.01、p<0.001和p<0.0001。每组n＝4-14。
图2包括的图示出了在实验中pNaKtide以剂量依赖性方式减少PAH中的肺血管重塑，在所述实验中将肺分离，加压灌注，固定并切成5-μm切片，并且其中所述图显示了来自于常氧组、HxSu组和使用不同剂量pNaKtide的治疗组的代表性平滑肌肌动蛋白(SMA)和血管性血友病因子(vWF)染色的肺小动脉。
图3A-3B是显示了pNaKtide在低剂量下减少丛状病灶(PL)的图像和图，其包括：(图3A)显示了HxSu和使用pNaKtide的治疗组的H&E染色切片中的代表性PL的图像；并且(图3B)显示了PL的数目的图。值是平均值±SEM，*和**指示相对于所指明的组p<0.05和p<0.01。每组n＝4-8。标尺条＝100μm。
图4包括显示了pNaKtide在HxSu大鼠中减少胶原沉积的图像，其中示出了常氧组、HxSu组和pNaKtide治疗组的代表性天狼猩红(PSR)染色图像。
图5A-5B包括示出了pNaKtide在HxSu大鼠中减少胶原沉积的图像和图，其包括：(图5A)使用PSR染色的右心室中胶原积累的代表性图像；和(图5B)心纤维化的定量的图。每组n＝4。***，介质相对于对照p<0.001；###，pNaKtide相对于介质p<0.001。标尺条＝100μm。
图6是显示了pNaKtide在HxSu大鼠模型中降低IL-6mRNA水平的图，其中基因表达的定量变化通过定量实时聚合酶链反应来分析(ΔΔCt法)，并且其中对照(常氧)中的平均表达被指派为倍数变化为1，并将相关样品与其相比。值是平均值±SEM，*指示P<0.05，每组n＝4-6。
图7A-7B包括显示了pNaKtide在肺中减弱HxSu诱导的蛋白质羰基化的图像和图，其包括：(图7A)肺匀浆物中蛋白质羰基化的代表性Western印迹的图像；和(图7B)示出了非匀浆物中蛋白质羰基化的定量数据的图。值是平均值±SEM，*和**指示P<0.05和P<0.01，每组n＝3-5。
图8A-8D包括显示了cCBM杂合子小鼠中RV肥大和PH的图，其包括：(图8A)示出了mCBM小鼠中RV/LV+S重量比的图，其中将包括隔膜(S)的右心室和左心室从年龄和性别匹配的6月龄小鼠不含***地剖出并称重；(图8B)示出了mCBM杂合子小鼠中RV/体重的增加的图；(图8C)代表性RVSP描记图像；和(图8D)mCBM杂合子小鼠中RVSP的提高，其中RVSP在年龄和性别匹配的6月龄小鼠中测量。数据被表示为平均值±SEM。*P<0.01，**P<0.01。mCBMWT相比于杂合子(n＝6–8)。
图9A-9B包括示出了Het小鼠中肺动脉肌化的图和图像，其中将来自于wt和het小鼠的左肺充满10％***，进行用于组织学评估的处理，然后用抗vWF抗体和抗α–SMA抗体染色，所述图和图像包括：(图9A)wt和het小鼠中肺血管的代表性免疫组织化学图像；(图9B)示出了α–SMA染色的程度的图像和图，其作为在小血管(30μm–70μm)中所评估的肺动脉肌化的度量，其中所述血管被指派为未肌化(无α–SMA染色)、部分肌化或完全肌化(厚的、完整的平滑肌壁)，并且其中为每组计算每一者的分布百分率。对每只动物的每个肺切片的15个视野(放大倍数20×)中的血管进行计数。数据是平均值±SEM，每组n＝4-6。*P<0.05，**P<0.01，并且***P<0.001。标尺条：50μm。
示例性实施方式的描述
在本文件中阐述了本公开的主题内容的一个或多个实施方式的详情。对于本领域普通技术人员来说，在研究了本文件中提供的信息之后，对本文件中描述的实施方式以及其他实施方式的修改将是显而易见的。本文件中提供的信息、特别是所描述的示例性实施方式的具体细节的提供，主要是为了理解的清晰性，并且应该理解不由此产生不必要的限制。
应该理解，当前公开的主题的各种细节可以在不背离本文公开的主题内容范围的情况下改变。此外，本文提供的描述仅出于说明的目的，而非出于限制的目的。
此外，尽管相信本文中使用的术语应该已被本领域普通技术人员很好地理解，但仍阐述了定义以便于对本公开主题内容的解释。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开的主题内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本公开的主题内容的实践或测试中可以使用许多与本文所述相似或相当的方法、装置和材料，但是现在将描述代表性的方法，装置和材料。
此外，遵循长期的专利法惯例，当在本申请、包括权利要求书中使用时，没有具体数目的指称是指“一个或多个”。因此，例如，对“多肽”的指称包括多个这样的多肽，等等。除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示成分、性质例如反应条件等的所有数字，均应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据试图通过本公开的主题内容获得的所需特性而变。
当在本文中使用时，术语“约”在指称质量、重量、时间、体积、浓度或百分率的值或量时，意图在某些实施方式中涵盖距所规定的量±20％、在某些实施方式中±10％、在某些实施方式中±5％、在某些实施方式中±1％、在某些实施方式中±0.5％、在某些实施方式中±0.1％的变动，因为这种变动对于执行本公开的方法来说是适合的。还应理解，本文公开了许多值，并且除了所述值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则“约10”也被公开。还应理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。
本公开的主题内容包括用于治疗肺动脉高压的组合物和方法。术语“肺高压”在本文中用于指称对象肺的血管中影响该血管以及对象心脏右侧的高压力。这种肺高压可以在所述肺高压的病因的基础上分成许多组，并且可以包括肺动脉高压、由左侧心脏疾病引起的肺高压、由肺病引起的肺高压、由血凝块引起的肺高压以及由其他病症引起的肺高压。
然而，在某些实施方式中，根据本公开的主题内容治疗的肺高压是肺动脉高压。就此而言，当在本文中使用时，术语“肺动脉高压”被用于指称通常被分类为由世界肺高压研讨会所定义的I类肺高压的肺动脉高压，并包括特发性和可遗传的PAH，以及与***的疾病(硬皮病、狼疮等)相关的PAH，由药物或毒素、HIV感染、门静脉高压、先天性心脏病和血吸虫病引起的PAH。
在本公开的主题内容的某些实施方式中，提供了利用或包括可用于治疗肺高压的多肽的方法和组合物。在某些实施方式中，所述多肽是降低或抑制Na/K-ATP酶和Src复合体的受体功能的多肽。在某些实施方式中，所述多肽是Na/K-ATP酶和Src复合体的受体功能的拮抗剂。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用，是指蛋白质氨基酸的聚合物，而不论其尺寸或功能如何。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，也指称基因产物、同源物、直向同源物、横向同源物、片段、任何蛋白酶产生的肽(片段)以及氨基酸聚合物的其他等同物、变体和类似物。
在某些实施方式中，所述多肽由SEQ ID NO：1的序列(NaKtide)或其片段和/或变体构成。当针对这种参比多肽使用时，术语“多肽片段”或“片段”是指其中与所述参比多肽本身相比氨基酸残基被缺失，但剩余的氨基酸序列通常与所述参比多肽中的相应位置一致的多肽。这些缺失可能发生在所述参比多肽的氨基端、所述参比多肽的羧基端或两者处。多肽片段也可包括“功能性片段”，在这种情况下所述片段保留所述参比多肽的一些或所有的活性。
当在本文中使用时，术语“变体”是指与参比多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方式中，变体多肽可以与参比多肽相差一个或多个氨基酸替换。例如，NaKtide多肽变体可以与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽相差一个或多个氨基酸替换，即突变。就此而言，包含两个或更多个突变的组合的多肽变体可以分别被称为双重突变体、三重突变体等。应该认识到，某些突变可以引起多肽功能的显著变化，而其他突变将引起所述多肽功能的很少到没有显著变化。
在某些实施方式中，本发明的多肽包括与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少75％同源性的多肽。在某些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少85％的同源性。在某些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少90％的同源性。在某些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少95％的同源性。
“同一性百分比”或“同源性百分比”当在本文中用于描述氨基酸序列或核苷酸序列相对于参比序列时，可以使用由Karlin和Altschul描述的公式来确定。这种公式被并入到Altschul等的基本局部对比搜索工具(BLAST)程序中。
本发明的多肽的实施方式还可以包含一个或多个前导序列，并且在某些实施方式中，所述前导序列包括但不限于细胞穿透肽(CPP)。术语“细胞穿透肽”(CPP)在本文中用于泛指细胞中存在的可以或有助于促进分子运载物跨过质膜的运输的短肽。在某些情况下，所述分子运载物包括另一个多肽，例如本文中描述的多肽。当然，所述细胞穿透肽可以通过多种方式中的任一者包括共价键和/或非共价键偶联到所述分子运载物(例如多肽)。然而，在许多情况下，这些细胞穿透肽通常包括相对高浓度的带正电荷的氨基酸例如赖氨酸和精氨酸，并且将具有含有带电荷(极性)和不带电荷的氨基酸的交替模式的序列。
在本公开的主题内容的某些实施方式中，示例性的前导序列或细胞穿透肽可以包括反式激活性转录激活物(TAT)细胞穿透肽，其由SEQ ID NO：2的序列表示。向NaKtide添加TAT序列产生pNaKtide。另一个示例性的前导序列包括穿膜肽(AP)，其由SEQ ID NO：3的序列表示。另一个示例性的前导序列包含编码Na/K-ATP酶的α1亚基的N-端聚赖氨酸结构域(A1N)的氨基酸序列，其由SEQ ID NO：4的序列表示。普通技术人员将会认识到，其他前导序列包括其他细胞穿透肽也可以与本发明公开的多肽联合使用。在某些实施方式中，包括附连到SEQ ID NO：1的NaKtide序列的前导序列例如细胞穿透肽的多肽，在本文中被称为pNaKtide(例如SEQ ID NO：5；GRKKRRQRRRPPQSATWLALSRIAGLCNRAVFQ，其包括融合到SEQ IDNO：1的NaKtide序列的SEQ ID NO：2的TAT细胞穿透肽)。
本公开的主题内容还包括并利用包含本文描述的多肽以及可药用载体的药物组合物。事实上，当涉及本文中的某些实施方式时，术语“多肽”和/或“组合物”可以在本文中互换使用，指称包括所述多肽的药物组合物。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散系、悬液或乳液，以及用于在即将使用前重构成无菌可注射溶液或分散系的无菌粉剂。适合的流动性可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散系的情况下通过维持所需的粒子尺寸以及通过使用表面活性剂来维持。这些组合物也可以含有辅助剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。微生物作用的防止，可以通过包含各种不同的抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。也可能需要包括等渗剂例如糖、氯化钠等。
可注射药物形式的延长吸收，可以通过包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。可注射的储库形式，通过形成所述药物在生物可降解聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中的微包胶的基质来制造。取决于所述多肽与生物可降解聚合物的比率和所使用的特定生物可降解聚合物的本质，可以控制多肽释放的速率。储库型可注射剂型也可以通过将所述多肽捕获在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。所述可注射剂型可以例如通过经拦截细菌的滤膜过滤或通过并入杀菌剂来除菌，所述杀菌剂采取无菌固体组合物的形式，所述杀菌剂可以在即将使用之前溶解或分散在无菌水或其他无菌注射用介质中。适合的惰性载体可以包括糖例如乳糖。
适合的剂型还可以包括水性和非水性无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、杀细菌抗生素和使所述剂型与目标受体的体液等渗的溶质，还可以包括水性和非水性无菌悬液，所述悬液可以包括悬浮剂和增稠剂。
所述组合物也可以采取例如在油性或水性介质中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述多肽可以采取粉剂形式，在使用前用适合的介质例如无菌无热原水配制。
所述剂型可以存在于单剂或多剂容器例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下，只需在即将使用之前添加无菌液体载体。
对于口服施用来说，所述组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，其通过常规技术，使用可药用赋形剂例如粘合剂(例如预明胶化薏米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶体纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)来制备。所述片剂可以通过本领域中已知的方法包衣。
用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或悬液的形式，或者它们可以作为干燥产品存在，在使用前用水或其他适合的介质配制。这些液体制剂可以通过常规技术，使用可药用添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或***树胶)、非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)来制备。所述制剂视情况而定也可以含有缓冲盐类、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可以被适合地配制，以提供活性化合物的受控释放。对于颊施用来说，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂或含片的形式。
所述组合物也可以被配制成用于植入或注射的制剂。因此，例如，所述化合物可以用适合的聚合或疏水材料(例如作为在可接受的油中的溶液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶性衍生物(例如作为微溶性盐)。所述化合物也可以被配制在直肠组合物、霜剂或洗剂或透皮贴片中。
正如本文中指明的，本公开的主题内容还包括使用本公开的主题内容的多肽(例如SEQ ID NO：5的多肽)治疗肺高压、包括肺动脉高压的方法。在某些实施方式中，提供了一种治疗肺高压的方法，所述方法包括向需要的对象施用本文公开的多肽之一。在某些实施方式中，这种多肽的施用通过抑制或降低Na/K-ATP酶和Src复合体的受体功能来治疗肺高压。在某些实施方式中，所述多肽通过充当所述Na/K-ATP酶和Src复合体的拮抗剂来抑制或降低所述受体功能。
术语“降低”、“抑制”及其语法变化形式不必定在所有情况下是指完全失活所有靶生物活性的能力。相反，专业技术人员应该理解，这些术语是指降低靶的生物活性，例如当配体结合所述靶的位点、所述靶的生物化学途径中的蛋白质被阻断、与靶形成非本源复合体等时可以发生的。这种生物活性的降低可以相对于对照来确定，其中所述对照可以代表其中未施用抑制剂的环境。例如，在某些实施方式中，相对于对照的活性降低可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的降低。在某些实施方式中，本文描述的提高和/或降低可以参比于具有肺高压并且尚未用本发明公开的多肽之一治疗的对照对象。在其他实施方式中，本文描述的提高和/或降低可以参比于在需要治疗但尚未开始特定治疗方案的对象中获得的基线。
当在本文中使用时，术语“治疗”是指对象的医学管控，其意在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍。该术语包括积极治疗，其是特异性针对疾病、病理状况或障碍的改善的治疗，并且也包括病因治疗，其是针对相关疾病、病理状况或障碍的病因的去除的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，其是被设计用于症状缓解而不是疾病、病理状况或障碍的治愈的治疗；预防性治疗，其是旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状态或障碍的发展的治疗；和支持性治疗，其是用于补充针对相关疾病、病理状况或障碍的改善的另一种疗法的治疗。
肺高压的治疗可以以几种不同方式来测量和定量。例如，在某些实施方式中，肺动脉高压的治疗可以通过尤其是前毛细血管肺高压(升高的平均肺动脉压≥25mmHg，正常的肺动脉楔压≤15mmHg)和肺血管阻力(PVR)>3伍德单位、右心室的重塑、右侧心衰、右心室收缩压、血管内皮功能障碍、肺动脉壁肥大或其组合来测量和定量。可选地或此外，肺动脉高压的治疗可以通过6分钟行走距离、恶化前的时间、死亡的发生、对肺移植的需求、对房间隔造口术的需求来评估。肺动脉高压的治疗也可以通过所述对象在用本发明公开的多肽之一治疗之前的内皮细胞增殖、肺血管重塑、远端血管修剪和肺阻力测量值的降低来表征。
在某些实施方式中，根据本公开的主题内容的多肽拮抗剂的施用减轻或治疗了肺高压的一种或多种根本病因和/或症状。例如，在某些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少肺动脉加速时间，减少右心室肥大的量，减少右心室壁厚度，减少肺血管壁厚度的量，减少所述对象的肺中丛状病灶的量，减少肺血管中胶原沉积的量，减少肺血管中膜或外膜中胶原沉积的量，减少右心室纤维化的量，和/或减少所述对象中IL-6的量。在某些实施方式中，提供了一种降低肺血管壁厚度的方法，所述方法包括施用本公开的主题内容的多肽拮抗剂。这些上述减少的测量可以使用本领域普通技术人员已知的常规程序来进行。
对于本文所公开的治疗性组合物(例如SEQ ID NO：5的多肽)的施用来说，在施用到鼠类动物模型的剂量的基础上外推人类剂量的常规方法，可以使用用于将小鼠剂量转换为人类剂量的转换因数来进行：每kg人类剂量＝每kg小鼠剂量/12(Freireich等，(1966)Cancer Chemother Rep.50:219-244)。药物剂量也可以以每平方米身体表面积的毫克数为单位给出，因为是这种方法而不是体重实现了与某些代谢和***功能的良好相关性。此外，身体表面积可以在成人和儿童以及不同动物物种中用作药物剂量的共同分母，正如由Freireich等人描述的(Freireich等，(1966)Cancer Chemother Rep.50:219-244)。简单来说，为了将任何给定物种中的mg/kg剂量表示成等同的mg/sq m剂量，将所述剂量乘以适合的km系数。在成人中，100mg/kg等同于100mg/kg×37kg/sq m＝3700mg/m2。
用于根据本公开的主题内容的方法施用治疗性组合物的适合方法包括但不限于系统性施用、肠胃外施用(包括血管内、肌肉内和/或动脉内施用)、口服递送、颊递送、直肠递送、皮下施用、腹膜内施用、吸入、气管内滴注、手术植入、透皮递送、局部注射、鼻内递送和超高速注射/轰击。在适用情况下，连续输注可以提高靶位点处的药物积累(参见例如美国专利号6,180,082)。在某些实施方式中，所述组合物的施用通过口服施用、透皮施用、吸入施用、鼻施用、局部施用、耳内施用、直肠施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、玻璃体内施用、结膜下施用、前房内施用、眼内施用或其组合。
不论施用途径如何，本公开的主题内容的组合物通常以有效实现所需响应的量施用。因此，术语“有效量”在本文中用于指称治疗性组合物(例如SEQ ID NO：5的多肽和药物介质、载体或赋形剂)的足以产生可测量的生物学响应(例如肺高压的降低)的量。本发明的治疗性组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便施用对特定对象和/或应用来说有效实现所需治疗响应的活性化合物的量。当然，在任何特定情况下，所述有效量将取决于各种不同因素，包括所述治疗性组合物的活性、剂型、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗的病症的严重性和所治疗对象的身体状况和既往医疗史。优选地，施用最低剂量，并将所述剂量在不存在限制剂量的毒性的情况下逐步提高到最低有效量。治疗有效剂量的确定和调整以及何时和如何做出这些调整的评估，对于本领域普通技术人员来说是已知的。
关于剂型和剂量的其他指导，参见美国专利号5,326,902；5,234,933；PCT国际公布号WO 93/25521；Berkow等，(1997)《Merck医学信息手册》(The Merck Manual ofMedical Information)，Home主编，Merck Research Laboratories,Whitehouse Station,New Jersey；Goodman等，(1996)《Goodman&Gilman的治疗剂的药理学基础》(Goodman&Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics)，第9版，McGraw-Hill HealthProfessions Division,New York；Ebadi,(1998)《CRC临床药理学桌面参考》(CRC DeskReference of Clinical Pharmacology)，CRC Press,Boca Raton,Florida；Katzung,(2001)《基础和临床药理学》(Basic&Clinical Pharmacology)，第8版，Lange MedicalBooks/McGraw-Hill Medical Pub.Division,New York；Remington等，(1975)《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Pub.Co.,Easton,Pennsylvania；和Speight 等，(1997)《Avery的药物治疗：疾病管理中药物的性质、选择、治疗用途和经济价值指南》(Avery's Drug Treatment:A Guide to the Properties,Choice,Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management)，第4版，Adis International,Auckland/Philadelphia；Duch等，(1998)Toxicol.Lett.100-101:255-263。
本发明的方法可以在广泛种类的对象上进行。事实上，当在本文中使用时，术语“对象”没有特别限制。术语“对象”包括脊椎动物例如哺乳动物，并且术语“对象”可以包括人类和兽医对象。因此，本文公开的方法的对象可以是人类、非人类灵长动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、奶牛、猫、豚鼠、啮齿动物等。该术语不指定特定年龄或性别。因此，打算覆盖成年和新生对象以及胎儿，不论是男性还是女性。
除非另有指明，否则本公开的主题内容的实践可以利用本领域技术范围之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中被充分解释。参见例如《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning ALaboratory Manual)(1989)，第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis主编，Cold SpringHarbor Laboratory Press，第16和17章；美国专利号4,683,195；《DNA克隆》(DNACloning)，第I和II卷，Glover主编，1985；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)，M.J.Gait主编，1984；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，D.Hames&S.J.Higgins主编，1984；《转录和翻译》(Transcription and Translation)，B.D.Hames&S.J.Higgins主编，1984；《动物细胞的培养》(Culture Of Animal Cells)，R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987；《固定化细胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)，IRL Press,1986；Perbal(1984)，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide To Molecular Cloning)；参见《酶学方法》(Methods In Enzymology)(Academic Press,Inc.,N.Y.)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells)，J.H.Miller和M.P.Calos主编，Cold Spring Harbor Laboratory,1987；《酶学方法》(Methods InEnzymology)，第154和155卷，Wu等主编，Academic Press Inc.,N.Y.；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)，Mayer和Walker主编，Academic Press,London,1987；《实验免疫学手册》(Handbook OfExperimental Immunology)，第I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell主编，1986。
本公开的主题内容通过下述特定而非限制性实施例进一步说明。所述实施例可能包括代表了在与本公开的主题内容相关的开发和实验的过程中的各个不同时间收集的数据的数据汇编。
实施例
材料和方法
Sugen5416/缺氧(HxSu)诱导的PAH的大鼠模型和pNaktide治疗。将体重为300-330g的8周龄成年雄性Sprague-Dawley大鼠每周用Sugen 5416皮下注射，并如以前所述在低氧仓室中饲养长达4周。动物每周通过腹膜内注射以1、10和25mg/kg的剂量接受pNaKtide或介质(正常盐水)治疗。
超声波心动描记术评估。在4周时，通过超声对2％异氟烷麻醉的大鼠进行经胸超声波心动描记术。如所述获得右心室壁厚度、肺动脉加速时间(PAAT)、心输出量(CO)和HR。
右心室收缩压测量。在超声波心动描记术后，将所述动物用***/甲苯噻嗪混合物麻醉。将右颈外静脉从周围的***中暴露并分离出来。将微压计导管(Millar压力导管，1.0F)***到静脉中并向前推入右心室中。在软件中监测压力迹线以确认导管位置并确定RV压力。记录2分钟的压力测量值。压力数据使用LabChart Pro.8.0来分析。
右心室肥大测量。在超声波心动描记术后，将大鼠安乐死并将它们的心脏分离分离出来，用盐水冲洗并剖开，以将右心室(RV)与左心室(LV)加隔膜(S)分开。确定作为RV重量与LV+S重量之比(RV/LV+S)的富尔敦指数，以提供RV肥大的度量。
组织学和免疫组织化学分析。如所述将肺收获并处理。简单来说，将肺在20cm H2O压力下充满10％***，并在10％***中固定过夜。将左叶在石蜡中制块并包埋。所有切片以5μm切出。将通过肺门的代表性的苏木精和曙红染色(H&E)的肺切片编号，并对10–150μm范围内的肺动脉的重塑进行盲评。每个小动脉的血管壁厚度使用Image J来测量，并表示为：1)公式(Ed-Id)/Ed×100的血管直径的百分率，其中Ed是外径，Id是内径；2)公式(面积ext-面积int)/面积ext的血管面积的百分率，其中面积ext和面积int分别是中膜壁的外部和内部边界内的面积。对每只动物进行10至20次之间的测量，并计算平均值。为了显示小肺血管的肌化，通过如前所述用抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体和抗小鼠血管性血友病因子(vWF)抗体对切片进行双重免疫染色来进行免疫组织化学(IHC)染色。HxSu大鼠中的丛状病灶被定义为突出到血管外部(动脉瘤样)和在血管腔内形成的病灶。在每只动物的通过肺门的H&E染色的肺切片中20×放大倍数下的20个随机图像中计数丛状病灶(PL)的数目。
天狼猩红染色和定量。天狼猩红(PSR)染色如前所述在5μm石蜡切片中进行。然后使用彼此平行和正交取向的分析仪和偏光仪对切片进行连续成像。在所有样品的整个成像中维持显微镜条件(灯亮度、聚光镜开口、物镜、缩放、曝光时间和增益参数)。在适合的对照切片上为每个实验设置最小阈值，其中只包括通过正交取向的偏光仪的代表了纤维状结构的光(即并包括来自于黑背景的残余光)。在每个实验中，为横跨所有条件的所有图像维持所述阈值。计算被所述阈值条件下的光覆盖的转移区的面积，并将每种条件下每个血管的至少10个切片一起进行平均(NIH ImageJ软件)。
定量RT-PCR分析。使用Qiagen RNeasy小量试剂盒，按照制造商的说明书(Qiagen,Crawley,UK)从捣碎的全肺纯化总RNA。使用QuantiTect反转录试剂盒(Qiagen)将500纳克总RNA转录成cDNA。使用序列检测系统ABI Prism 7700(Applied Biosystems,Warrington,UK)，使用TaqMan通用PCR主混合物、无AmpErase UNG(料号4324018)和下述基因表达测定体系进行定量实时RT-PCR：IL-6(正向：5’-TTC TCT CCG CAA GAG ACT TCC-3’(SEQ ID NO：6)；反向：5’-TGF GGG TGG TAT CCT CTG TGA-3’(SEQ ID NO：7))和β-肌动蛋白(正向：5’-AGA TCA AGA TCA TTG CTC CT-3’(SEQ ID NO：8)；反向：5’-ACG CAG CTC AGT AAC AGTCC-3’(SEQ ID NO：9))。样品运行一式三份。使用比较Ct法确定每个样品中的基因表达水平。
蛋白质羰基化的评估。使用RIPA缓冲液制备肺组织匀浆物。将来自于每种样品的等量的总蛋白(15μg)用6％SDS(终浓度)变性，用1x DNPH(从100％三氟乙酸中100mM的10xDNPH储用溶液用蒸馏水新鲜稀释)衍生以形成DNP腙衍生物，然后用中和缓冲液(2M Tris中的30％甘油)中和。然后通过Western印迹进行蛋白质羰基化测定。将膜丽春红S染色用于蛋白质羰基化的载样对照。为了定量羰基化水平，对来自于每一道的蛋白质条带的光信号密度进行定量。使用丽春红S染色作为载样对照，将对照样品的信号密度值归一化到1.0。
表达α1 Na/K-ATP酶的突变体小窝蛋白结合基序的小鼠的产生。使用以前开发的策略来产生表达上述CBM突变体α1的敲入小鼠株系。具体来说，通过α1同工酶基因的外显子4中的4-bp突变引入F97A和F100A替换。此外，将Pyu II和Nhe I限制性酶位点作为两个沉默突变引入，以便于靶等位基因的鉴定。所述CBM突变体小鼠使用Cre/LoxP基因靶向策略来产生。
所有数据使用GraphPad Prism Software,Inc.(La Jolla,CA,USA)来作图，并表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。将来自于对照和治疗样品的结果使用方差分析，随后使用Neumann-Keuls多重比较检验进行比较。所有分析使用95％置信区间来完成。当p<0.05时，数据被认为是显著的。
实施例1-在HxSu大鼠中pNaKtide降低PAH和RV肥大
为了评估HxSu大鼠模型中PAH的发展，通过对2％异氟烷麻醉的大鼠进行经胸超声波心动描记术，来确定与平均PAP和肺血管阻力反相关的PAAT。在HxSu组中，与常氧组相比PAAT显著恶化。使用pNaKtide(25mg/kg/周)的治疗显示出PAAT的显著逆转(图1A)。
RV肥大的进展通过富尔敦指数和超声波心动描记术来测量。在HxSu大鼠(0.55±0.04)中，与常氧大鼠(0.20±0.01)相比富尔敦指数(RV/LV+S)显著提高，并在用pNaKtide治疗后降低(0.36±0.004)(图1B)。同样地，在HxSu大鼠(1.65±0.07mm)中，与常氧大鼠(1.12±0.03mm)相比通过超声波心动描记术评估的RV厚度显著增加，并在用pNaKtide治疗后减小(1.37±0.11mm)(图1C)。
暴露于HxSu的大鼠与常氧组相比也发生明显更高的右心室收缩压(RVSP)(122.6±3.9相比于18.7±0.3mmHg)。使用pNaKtide的治疗(25mg/kg/周)显著降低RVSP(49.7±0.5mmHg)(图1D-1E)。
实施例2-pNaKtide以剂量依赖性方式减少PAH中的肺血管重塑
与对照大鼠相比HxSu大鼠发生严重的血管壁增厚。肺末端小动脉的代表性图像示出在图2中。pNaKtide的腹膜内注射在1mg/kg-25mg/kg下剂量依赖性地降低中膜壁增厚。
实施例3-pNaKtide治疗对丛状病灶(PL)的影响
在每只动物中，以20×放大倍数观察通过肺门的H&E染色的肺切片的总共20个随机视野。在常氧大鼠中没有发现PL。HxSu大鼠中PL的数目为13.80±4.23。pNaKtide治疗显著减少PL的数目，即使在最低剂量下(2.16±1.081mg/kg/周)(图3B)。代表性的PL示出在图3A中。
实施例4–pNaKtide治疗对胶原沉积的影响
天狼猩红染色显示，与常氧组相比，在来自于HxSu组的血管中膜和外膜以及肺实质中胶原沉积增加。使用pNaKtide的治疗(25mg/kg/周)与HxSu组相比减弱胶原沉积(图4)。长期缺氧和Su5416引起严重的RV纤维化，其由胶原的积累指示。使用pNaKtide的治疗使所述纤维化恢复正常(图5A-5B)。
实施例5–在HxSu大鼠模型中pNaKtide降低IL-6mRNA水平
进一步发现，与常氧组相比，在HxSu组中肺中的IL-6mRNA水平明显更高。HxSu引起肺中IL-6mRNA水平的4倍提高。使用pNaKtide的治疗(25mg/kg/周)与HxSu组相比将IL-6mRNA水平降低40％(图6)。
实施例6–pNaKtide在肺中减弱HxSu诱导的蛋白质羰基化
为了评估蛋白质氧化，在HxSu大鼠中测试了蛋白质羰基化。与常氧组相比，HxSu显著诱导广范围的蛋白质的羰基化(图7A)。使用pNaKtide的治疗(25mg/kg/周)将羰基化降低到正常水平(图7B)。
实施例7–α1NaKATP酶的小窝蛋白结合基序(CBM)的突变引起PAH和右心室肥大
已经观察到Na/K-ATP酶介导的信号转导需要它与小窝蛋白-1的相互作用。此外已证实，Na/K-ATP酶的α1亚基的N-端处的保守的小窝蛋白结合基序(CBM)为它与小窝蛋白-1的相互作用和信号传导所需，但是不为执行离子泵送功能所需。此外，纯合子基因型(在Na/K-ATP酶α1基因的两个等位基因上带有敲入CBM突变体(F97A和F100A))引起胚胎致死性，而杂合子基因型(mCBM Het)不显示出明显表型。为了解决pNaKtide的潜在的脱靶效应并提供α1Na/K-ATP酶是PAH的关键控制机制的遗传证据，对CBM Het小鼠的肺血管系统和右心进行了进一步研究。
与cCBM WT小鼠(0.22±0.01，n＝8；P<0.01)相比，mCBM杂合子(Het)小鼠(0.26±0.01，n＝6)的富尔敦指数显著提高(图8A)。与mCBM WT小鼠(0.65±0.03，n＝8；P<0.05)相比，mCBM杂合子小鼠(0.77±0.04，n＝6)的RV/体重比也升高(图8B)。右心室收缩压(RVSP)被用于估算肺动脉收缩压。与WT小鼠相比mCBM杂合子小鼠具有明显提高的RVSP(32.25±1.61mmHg相比于24.41±2.63mmHg)(图8C-8D)。
实施例9–mCBM Het小鼠发展自发肺血管肌化
在wt小鼠中，大部分肺小血管是非肌化的(89.1％)，其余的小鼠显示出部分(8.9％)或完全肌化(2％)。CBM het小鼠显示出更多的部分(19.6％)和完全肌化的血管(5.6％)，减少的未肌化的血管(78.1％)(图9A-9B)。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单个出版物、专利或专利申请被具体且单个地指明通过引用并入，包括下面的列表中阐述的参考文献：
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23.Bertero,T.等，血管僵硬机械激活YAP/TAZ依赖性谷氨酰胺分解以驱动肺高压(Vascular stiffness mechanoactivates YAP/TAZ-dependent glutaminolysis todrive pulmonary hypertension)，J Clin Invest,2016。
24.Yan,Y.等，活性氧物质参与Na/K-ATP酶介导的信号转导的正馈机制(Involvement of reactive oxygen species in a feed-forward mechanism of Na/K-ATPase-mediated signaling transduction)，J Biol Chem,2013.288(47):p.34249-58。
25.Dostanic,I.等，Na,K-ATP酶的α1同工酶调控心脏收缩，并与心脏中的Na/Ca交换蛋白功能性相互作用和共定位(The alpha 1isoform of Na,K-ATPase regulatescardiac contractility and functionally interacts and co-localizes with theNa/Ca exchanger in heart)，J Biol Chem,2004.279(52):p.54053-61。
26.Cai,T.等，小窝蛋白-1膜转运被Na/K-ATP酶的调控(Regulation ofcaveolin-1membrane trafficking by the Na/K-ATPase)，J Cell Biol,2008.182(6):p.1153-69。
27.Liu,J.等，在LLC-PK1细胞中质膜Na/K-ATP酶的哇巴因诱导的内吞需要小窝蛋白-1(Ouabain-induced endocytosis of the plasmalemmal Na/K-ATPase in LLC-PK1cells requires caveolin-1)，Kidney Int,2005.67(5):p.1844-54。
28.Wang,H.等，哇巴因通过小窝Na+/K+-ATP酶组装信号传导级联(Ouabainassembles signaling cascades through the caveolar Na+/K+-ATPase)，J Biol Chem,2004.279(17):p.17250-9。
应该理解，本文公开的主题内容的各种不同细节可以在不背离本文公开的主题内容的范围的情况下改变。此外，上述描述仅仅是出于说明的目的而不是限制的目的。
序列表
<110> 马歇尔大学科研协会（Marshall University Research Corporation）
<120> 治疗肺高压的组合物和方法
<130> MA408/0MA50
<150> 62/504,947
<151> 2017-05-11
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Ser Ala Thr Trp Leu Ala Leu Ser Arg Ile Ala Gly Leu Cys Asn Arg
1 5 10 15
Ala Val Phe Gln
20
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒
<400> 2
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）
<400> 3
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys
1 5
<210> 5
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT NaKtide融合多肽（pNaKtide）
<400> 5
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ser Ala Thr
1 5 10 15
Trp Leu Ala Leu Ser Arg Ile Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe
20 25 30
Gln
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL6正向引物
<400> 6
ttctctccgc aagagacttc c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL6反向引物
<400> 7
tgtgggtggt atcctctgtg a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β肌动蛋白正向引物
<400> 8
agatcaagat cattgctcct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β肌动蛋白反向引物
<400> 9
acgcagctca gtaacagtcc 20
具体实施方式
图1A-1E包括显示pNaKtide降低肺动脉高压(PAH)和右心室(RV)肥大的图，其包括的图示出了：(图1A)肺动脉加速时间(PAAT)；(图1B)富尔敦指数；(图1C)通过超声波心动描记术评估的RV厚度；(图1D)右心室收缩压(RVSP)的代表性迹线；和(图1E)RVSP。值是平均值±SEM。**、***和****指示相对于所指明的组p<0.01、p<0.001和p<0.0001。每组n＝4-14。
图2包括的图示出了在实验中pNaKtide以剂量依赖性方式减少PAH中的肺血管重塑，在所述实验中将肺分离，加压灌注，固定并切成5-μm切片，并且其中所述图显示了来自于常氧组、HxSu组和使用不同剂量pNaKtide的治疗组的代表性平滑肌肌动蛋白(SMA)和血管性血友病因子(vWF)染色的肺小动脉。
图3A-3B是显示了pNaKtide在低剂量下减少丛状病灶(PL)的图像和图，其包括：(图3A)显示了HxSu和使用pNaKtide的治疗组的H&E染色切片中的代表性PL的图像；并且(图3B)显示了PL的数目的图。值是平均值±SEM，*和**指示相对于所指明的组p<0.05和p<0.01。每组n＝4-8。标尺条＝100μm。
图4包括显示了pNaKtide在HxSu大鼠中减少胶原沉积的图像，其中示出了常氧组、HxSu组和pNaKtide治疗组的代表性天狼猩红(PSR)染色图像。
图5A-5B包括示出了pNaKtide在HxSu大鼠中减少胶原沉积的图像和图，其包括：(图5A)使用PSR染色的右心室中胶原积累的代表性图像；和(图5B)心纤维化的定量的图。每组n＝4。***，介质相对于对照p<0.001；###，pNaKtide相对于介质p<0.001。标尺条＝100μm。
图6是显示了pNaKtide在HxSu大鼠模型中降低IL-6mRNA水平的图，其中基因表达的定量变化通过定量实时聚合酶链反应来分析(ΔΔCt法)，并且其中对照(常氧)中的平均表达被指派为倍数变化为1，并将相关样品与其相比。值是平均值±SEM，*指示P<0.05，每组n＝4-6。
图7A-7B包括显示了pNaKtide在肺中减弱HxSu诱导的蛋白质羰基化的图像和图，其包括：(图7A)肺匀浆物中蛋白质羰基化的代表性Western印迹的图像；和(图7B)示出了非匀浆物中蛋白质羰基化的定量数据的图。值是平均值±SEM，*和**指示P<0.05和P<0.01，每组n＝3-5。
图8A-8D包括显示了cCBM杂合子小鼠中RV肥大和PH的图，其包括：(图8A)示出了mCBM小鼠中RV/LV+S重量比的图，其中将包括隔膜(S)的右心室和左心室从年龄和性别匹配的6月龄小鼠不含***地剖出并称重；(图8B)示出了mCBM杂合子小鼠中RV/体重的增加的图；(图8C)代表性RVSP描记图像；和(图8D)mCBM杂合子小鼠中RVSP的提高，其中RVSP在年龄和性别匹配的6月龄小鼠中测量。数据被表示为平均值±SEM。*P<0.01，**P<0.01。mCBMWT相比于杂合子(n＝6–8)。
图9A-9B包括示出了Het小鼠中肺动脉肌化的图和图像，其中将来自于wt和het小鼠的左肺充满10％***，进行用于组织学评估的处理，然后用抗vWF抗体和抗α–SMA抗体染色，所述图和图像包括：(图9A)wt和het小鼠中肺血管的代表性免疫组织化学图像；(图9B)示出了α–SMA染色的程度的图像和图，其作为在小血管(30μm–70μm)中所评估的肺动脉肌化的度量，其中所述血管被指派为未肌化(无α–SMA染色)、部分肌化或完全肌化(厚的、完整的平滑肌壁)，并且其中为每组计算每一者的分布百分率。对每只动物的每个肺切片的15个视野(放大倍数20×)中的血管进行计数。数据是平均值±SEM，每组n＝4-6。*P<0.05，**P<0.01，并且***P<0.001。标尺条：50μm。
示例性实施方式的描述
在本文件中阐述了本公开的主题内容的一个或多个实施方式的详情。对于本领域普通技术人员来说，在研究了本文件中提供的信息之后，对本文件中描述的实施方式以及其他实施方式的修改将是显而易见的。本文件中提供的信息、特别是所描述的示例性实施方式的具体细节的提供，主要是为了理解的清晰性，并且应该理解不由此产生不必要的限制。
应该理解，当前公开的主题的各种细节可以在不背离本文公开的主题内容范围的情况下改变。此外，本文提供的描述仅出于说明的目的，而非出于限制的目的。
此外，尽管相信本文中使用的术语应该已被本领域普通技术人员很好地理解，但仍阐述了定义以便于对本公开主题内容的解释。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开的主题内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本公开的主题内容的实践或测试中可以使用许多与本文所述相似或相当的方法、装置和材料，但是现在将描述代表性的方法，装置和材料。
此外，遵循长期的专利法惯例，当在本申请、包括权利要求书中使用时，没有具体数目的指称是指“一个或多个”。因此，例如，对“多肽”的指称包括多个这样的多肽，等等。除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示成分、性质例如反应条件等的所有数字，均应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据试图通过本公开的主题内容获得的所需特性而变。
当在本文中使用时，术语“约”在指称质量、重量、时间、体积、浓度或百分率的值或量时，意图在某些实施方式中涵盖距所规定的量±20％、在某些实施方式中±10％、在某些实施方式中±5％、在某些实施方式中±1％、在某些实施方式中±0.5％、在某些实施方式中±0.1％的变动，因为这种变动对于执行本公开的方法来说是适合的。还应理解，本文公开了许多值，并且除了所述值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则“约10”也被公开。还应理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。
本公开的主题内容包括用于治疗肺动脉高压的组合物和方法。术语“肺高压”在本文中用于指称对象肺的血管中影响该血管以及对象心脏右侧的高压力。这种肺高压可以在所述肺高压的病因的基础上分成许多组，并且可以包括肺动脉高压、由左侧心脏疾病引起的肺高压、由肺病引起的肺高压、由血凝块引起的肺高压以及由其他病症引起的肺高压。
然而，在某些实施方式中，根据本公开的主题内容治疗的肺高压是肺动脉高压。就此而言，当在本文中使用时，术语“肺动脉高压”被用于指称通常被分类为由世界肺高压研讨会所定义的I类肺高压的肺动脉高压，并包括特发性和可遗传的PAH，以及与***的疾病(硬皮病、狼疮等)相关的PAH，由药物或毒素、HIV感染、门静脉高压、先天性心脏病和血吸虫病引起的PAH。
在本公开的主题内容的某些实施方式中，提供了利用或包括可用于治疗肺高压的多肽的方法和组合物。在某些实施方式中，所述多肽是降低或抑制Na/K-ATP酶和Src复合体的受体功能的多肽。在某些实施方式中，所述多肽是Na/K-ATP酶和Src复合体的受体功能的拮抗剂。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用，是指蛋白质氨基酸的聚合物，而不论其尺寸或功能如何。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，也指称基因产物、同源物、直向同源物、横向同源物、片段、任何蛋白酶产生的肽(片段)以及氨基酸聚合物的其他等同物、变体和类似物。
在某些实施方式中，所述多肽由SEQ ID NO：1的序列(NaKtide)或其片段和/或变体构成。当针对这种参比多肽使用时，术语“多肽片段”或“片段”是指其中与所述参比多肽本身相比氨基酸残基被缺失，但剩余的氨基酸序列通常与所述参比多肽中的相应位置一致的多肽。这些缺失可能发生在所述参比多肽的氨基端、所述参比多肽的羧基端或两者处。多肽片段也可包括“功能性片段”，在这种情况下所述片段保留所述参比多肽的一些或所有的活性。
当在本文中使用时，术语“变体”是指与参比多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方式中，变体多肽可以与参比多肽相差一个或多个氨基酸替换。例如，NaKtide多肽变体可以与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽相差一个或多个氨基酸替换，即突变。就此而言，包含两个或更多个突变的组合的多肽变体可以分别被称为双重突变体、三重突变体等。应该认识到，某些突变可以引起多肽功能的显著变化，而其他突变将引起所述多肽功能的很少到没有显著变化。
在某些实施方式中，本发明的多肽包括与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少75％同源性的多肽。在某些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少85％的同源性。在某些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少90％的同源性。在某些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽具有至少95％的同源性。
“同一性百分比”或“同源性百分比”当在本文中用于描述氨基酸序列或核苷酸序列相对于参比序列时，可以使用由Karlin和Altschul描述的公式来确定。这种公式被并入到Altschul等的基本局部对比搜索工具(BLAST)程序中。
本发明的多肽的实施方式还可以包含一个或多个前导序列，并且在某些实施方式中，所述前导序列包括但不限于细胞穿透肽(CPP)。术语“细胞穿透肽”(CPP)在本文中用于泛指细胞中存在的可以或有助于促进分子运载物跨过质膜的运输的短肽。在某些情况下，所述分子运载物包括另一个多肽，例如本文中描述的多肽。当然，所述细胞穿透肽可以通过多种方式中的任一者包括共价键和/或非共价键偶联到所述分子运载物(例如多肽)。然而，在许多情况下，这些细胞穿透肽通常包括相对高浓度的带正电荷的氨基酸例如赖氨酸和精氨酸，并且将具有含有带电荷(极性)和不带电荷的氨基酸的交替模式的序列。
在本公开的主题内容的某些实施方式中，示例性的前导序列或细胞穿透肽可以包括反式激活性转录激活物(TAT)细胞穿透肽，其由SEQ ID NO：2的序列表示。向NaKtide添加TAT序列产生pNaKtide。另一个示例性的前导序列包括穿膜肽(AP)，其由SEQ ID NO：3的序列表示。另一个示例性的前导序列包含编码Na/K-ATP酶的α1亚基的N-端聚赖氨酸结构域(A1N)的氨基酸序列，其由SEQ ID NO：4的序列表示。普通技术人员将会认识到，其他前导序列包括其他细胞穿透肽也可以与本发明公开的多肽联合使用。在某些实施方式中，包括附连到SEQ ID NO：1的NaKtide序列的前导序列例如细胞穿透肽的多肽，在本文中被称为pNaKtide(例如SEQ ID NO：5；GRKKRRQRRRPPQSATWLALSRIAGLCNRAVFQ，其包括融合到SEQ IDNO：1的NaKtide序列的SEQ ID NO：2的TAT细胞穿透肽)。
本公开的主题内容还包括并利用包含本文描述的多肽以及可药用载体的药物组合物。事实上，当涉及本文中的某些实施方式时，术语“多肽”和/或“组合物”可以在本文中互换使用，指称包括所述多肽的药物组合物。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散系、悬液或乳液，以及用于在即将使用前重构成无菌可注射溶液或分散系的无菌粉剂。适合的流动性可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散系的情况下通过维持所需的粒子尺寸以及通过使用表面活性剂来维持。这些组合物也可以含有辅助剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。微生物作用的防止，可以通过包含各种不同的抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。也可能需要包括等渗剂例如糖、氯化钠等。
可注射药物形式的延长吸收，可以通过包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。可注射的储库形式，通过形成所述药物在生物可降解聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中的微包胶的基质来制造。取决于所述多肽与生物可降解聚合物的比率和所使用的特定生物可降解聚合物的本质，可以控制多肽释放的速率。储库型可注射剂型也可以通过将所述多肽捕获在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。所述可注射剂型可以例如通过经拦截细菌的滤膜过滤或通过并入杀菌剂来除菌，所述杀菌剂采取无菌固体组合物的形式，所述杀菌剂可以在即将使用之前溶解或分散在无菌水或其他无菌注射用介质中。适合的惰性载体可以包括糖例如乳糖。
适合的剂型还可以包括水性和非水性无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、杀细菌抗生素和使所述剂型与目标受体的体液等渗的溶质，还可以包括水性和非水性无菌悬液，所述悬液可以包括悬浮剂和增稠剂。
所述组合物也可以采取例如在油性或水性介质中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述多肽可以采取粉剂形式，在使用前用适合的介质例如无菌无热原水配制。
所述剂型可以存在于单剂或多剂容器例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下，只需在即将使用之前添加无菌液体载体。
对于口服施用来说，所述组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，其通过常规技术，使用可药用赋形剂例如粘合剂(例如预明胶化薏米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶体纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)来制备。所述片剂可以通过本领域中已知的方法包衣。
用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或悬液的形式，或者它们可以作为干燥产品存在，在使用前用水或其他适合的介质配制。这些液体制剂可以通过常规技术，使用可药用添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或***树胶)、非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)来制备。所述制剂视情况而定也可以含有缓冲盐类、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可以被适合地配制，以提供活性化合物的受控释放。对于颊施用来说，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂或含片的形式。
所述组合物也可以被配制成用于植入或注射的制剂。因此，例如，所述化合物可以用适合的聚合或疏水材料(例如作为在可接受的油中的溶液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶性衍生物(例如作为微溶性盐)。所述化合物也可以被配制在直肠组合物、霜剂或洗剂或透皮贴片中。
正如本文中指明的，本公开的主题内容还包括使用本公开的主题内容的多肽(例如SEQ ID NO：5的多肽)治疗肺高压、包括肺动脉高压的方法。在某些实施方式中，提供了一种治疗肺高压的方法，所述方法包括向需要的对象施用本文公开的多肽之一。在某些实施方式中，这种多肽的施用通过抑制或降低Na/K-ATP酶和Src复合体的受体功能来治疗肺高压。在某些实施方式中，所述多肽通过充当所述Na/K-ATP酶和Src复合体的拮抗剂来抑制或降低所述受体功能。
术语“降低”、“抑制”及其语法变化形式不必定在所有情况下是指完全失活所有靶生物活性的能力。相反，专业技术人员应该理解，这些术语是指降低靶的生物活性，例如当配体结合所述靶的位点、所述靶的生物化学途径中的蛋白质被阻断、与靶形成非本源复合体等时可以发生的。这种生物活性的降低可以相对于对照来确定，其中所述对照可以代表其中未施用抑制剂的环境。例如，在某些实施方式中，相对于对照的活性降低可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的降低。在某些实施方式中，本文描述的提高和/或降低可以参比于具有肺高压并且尚未用本发明公开的多肽之一治疗的对照对象。在其他实施方式中，本文描述的提高和/或降低可以参比于在需要治疗但尚未开始特定治疗方案的对象中获得的基线。
当在本文中使用时，术语“治疗”是指对象的医学管控，其意在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍。该术语包括积极治疗，其是特异性针对疾病、病理状况或障碍的改善的治疗，并且也包括病因治疗，其是针对相关疾病、病理状况或障碍的病因的去除的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，其是被设计用于症状缓解而不是疾病、病理状况或障碍的治愈的治疗；预防性治疗，其是旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状态或障碍的发展的治疗；和支持性治疗，其是用于补充针对相关疾病、病理状况或障碍的改善的另一种疗法的治疗。
肺高压的治疗可以以几种不同方式来测量和定量。例如，在某些实施方式中，肺动脉高压的治疗可以通过尤其是前毛细血管肺高压(升高的平均肺动脉压≥25mmHg，正常的肺动脉楔压≤15mmHg)和肺血管阻力(PVR)>3伍德单位、右心室的重塑、右侧心衰、右心室收缩压、血管内皮功能障碍、肺动脉壁肥大或其组合来测量和定量。可选地或此外，肺动脉高压的治疗可以通过6分钟行走距离、恶化前的时间、死亡的发生、对肺移植的需求、对房间隔造口术的需求来评估。肺动脉高压的治疗也可以通过所述对象在用本发明公开的多肽之一治疗之前的内皮细胞增殖、肺血管重塑、远端血管修剪和肺阻力测量值的降低来表征。
在某些实施方式中，根据本公开的主题内容的多肽拮抗剂的施用减轻或治疗了肺高压的一种或多种根本病因和/或症状。例如，在某些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少肺动脉加速时间，减少右心室肥大的量，减少右心室壁厚度，减少肺血管壁厚度的量，减少所述对象的肺中丛状病灶的量，减少肺血管中胶原沉积的量，减少肺血管中膜或外膜中胶原沉积的量，减少右心室纤维化的量，和/或减少所述对象中IL-6的量。在某些实施方式中，提供了一种降低肺血管壁厚度的方法，所述方法包括施用本公开的主题内容的多肽拮抗剂。这些上述减少的测量可以使用本领域普通技术人员已知的常规程序来进行。
对于本文所公开的治疗性组合物(例如SEQ ID NO：5的多肽)的施用来说，在施用到鼠类动物模型的剂量的基础上外推人类剂量的常规方法，可以使用用于将小鼠剂量转换为人类剂量的转换因数来进行：每kg人类剂量＝每kg小鼠剂量/12(Freireich等，(1966)Cancer Chemother Rep.50:219-244)。药物剂量也可以以每平方米身体表面积的毫克数为单位给出，因为是这种方法而不是体重实现了与某些代谢和***功能的良好相关性。此外，身体表面积可以在成人和儿童以及不同动物物种中用作药物剂量的共同分母，正如由Freireich等人描述的(Freireich等，(1966)Cancer Chemother Rep.50:219-244)。简单来说，为了将任何给定物种中的mg/kg剂量表示成等同的mg/sq m剂量，将所述剂量乘以适合的km系数。在成人中，100mg/kg等同于100mg/kg×37kg/sq m＝3700mg/m2。
用于根据本公开的主题内容的方法施用治疗性组合物的适合方法包括但不限于系统性施用、肠胃外施用(包括血管内、肌肉内和/或动脉内施用)、口服递送、颊递送、直肠递送、皮下施用、腹膜内施用、吸入、气管内滴注、手术植入、透皮递送、局部注射、鼻内递送和超高速注射/轰击。在适用情况下，连续输注可以提高靶位点处的药物积累(参见例如美国专利号6,180,082)。在某些实施方式中，所述组合物的施用通过口服施用、透皮施用、吸入施用、鼻施用、局部施用、耳内施用、直肠施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、玻璃体内施用、结膜下施用、前房内施用、眼内施用或其组合。
不论施用途径如何，本公开的主题内容的组合物通常以有效实现所需响应的量施用。因此，术语“有效量”在本文中用于指称治疗性组合物(例如SEQ ID NO：5的多肽和药物介质、载体或赋形剂)的足以产生可测量的生物学响应(例如肺高压的降低)的量。本发明的治疗性组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便施用对特定对象和/或应用来说有效实现所需治疗响应的活性化合物的量。当然，在任何特定情况下，所述有效量将取决于各种不同因素，包括所述治疗性组合物的活性、剂型、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗的病症的严重性和所治疗对象的身体状况和既往医疗史。优选地，施用最低剂量，并将所述剂量在不存在限制剂量的毒性的情况下逐步提高到最低有效量。治疗有效剂量的确定和调整以及何时和如何做出这些调整的评估，对于本领域普通技术人员来说是已知的。
关于剂型和剂量的其他指导，参见美国专利号5,326,902；5,234,933；PCT国际公布号WO 93/25521；Berkow等，(1997)《Merck医学信息手册》(The Merck Manual ofMedical Information)，Home主编，Merck Research Laboratories,Whitehouse Station,New Jersey；Goodman等，(1996)《Goodman&Gilman的治疗剂的药理学基础》(Goodman&Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics)，第9版，McGraw-Hill HealthProfessions Division,New York；Ebadi,(1998)《CRC临床药理学桌面参考》(CRC DeskReference of Clinical Pharmacology)，CRC Press,Boca Raton,Florida；Katzung,(2001)《基础和临床药理学》(Basic&Clinical Pharmacology)，第8版，Lange MedicalBooks/McGraw-Hill Medical Pub.Division,New York；Remington等，(1975)《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Pub.Co.,Easton,Pennsylvania；和Speight 等，(1997)《Avery的药物治疗：疾病管理中药物的性质、选择、治疗用途和经济价值指南》(Avery's Drug Treatment:A Guide to the Properties,Choice,Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management)，第4版，Adis International,Auckland/Philadelphia；Duch等，(1998)Toxicol.Lett.100-101:255-263。
本发明的方法可以在广泛种类的对象上进行。事实上，当在本文中使用时，术语“对象”没有特别限制。术语“对象”包括脊椎动物例如哺乳动物，并且术语“对象”可以包括人类和兽医对象。因此，本文公开的方法的对象可以是人类、非人类灵长动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、奶牛、猫、豚鼠、啮齿动物等。该术语不指定特定年龄或性别。因此，打算覆盖成年和新生对象以及胎儿，不论是男性还是女性。
除非另有指明，否则本公开的主题内容的实践可以利用本领域技术范围之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中被充分解释。参见例如《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning ALaboratory Manual)(1989)，第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis主编，Cold SpringHarbor Laboratory Press，第16和17章；美国专利号4,683,195；《DNA克隆》(DNACloning)，第I和II卷，Glover主编，1985；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)，M.J.Gait主编，1984；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，D.Hames&S.J.Higgins主编，1984；《转录和翻译》(Transcription and Translation)，B.D.Hames&S.J.Higgins主编，1984；《动物细胞的培养》(Culture Of Animal Cells)，R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987；《固定化细胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)，IRL Press,1986；Perbal(1984)，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide To Molecular Cloning)；参见《酶学方法》(Methods In Enzymology)(Academic Press,Inc.,N.Y.)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells)，J.H.Miller和M.P.Calos主编，Cold Spring Harbor Laboratory,1987；《酶学方法》(Methods InEnzymology)，第154和155卷，Wu等主编，Academic Press Inc.,N.Y.；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)，Mayer和Walker主编，Academic Press,London,1987；《实验免疫学手册》(Handbook OfExperimental Immunology)，第I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell主编，1986。
本公开的主题内容通过下述特定而非限制性实施例进一步说明。所述实施例可能包括代表了在与本公开的主题内容相关的开发和实验的过程中的各个不同时间收集的数据的数据汇编。
实施例
材料和方法
Sugen5416/缺氧(HxSu)诱导的PAH的大鼠模型和pNaktide治疗。将体重为300-330g的8周龄成年雄性Sprague-Dawley大鼠每周用Sugen 5416皮下注射，并如以前所述在低氧仓室中饲养长达4周。动物每周通过腹膜内注射以1、10和25mg/kg的剂量接受pNaKtide或介质(正常盐水)治疗。
超声波心动描记术评估。在4周时，通过超声对2％异氟烷麻醉的大鼠进行经胸超声波心动描记术。如所述获得右心室壁厚度、肺动脉加速时间(PAAT)、心输出量(CO)和HR。
右心室收缩压测量。在超声波心动描记术后，将所述动物用***/甲苯噻嗪混合物麻醉。将右颈外静脉从周围的***中暴露并分离出来。将微压计导管(Millar压力导管，1.0F)***到静脉中并向前推入右心室中。在软件中监测压力迹线以确认导管位置并确定RV压力。记录2分钟的压力测量值。压力数据使用LabChart Pro.8.0来分析。
右心室肥大测量。在超声波心动描记术后，将大鼠安乐死并将它们的心脏分离分离出来，用盐水冲洗并剖开，以将右心室(RV)与左心室(LV)加隔膜(S)分开。确定作为RV重量与LV+S重量之比(RV/LV+S)的富尔敦指数，以提供RV肥大的度量。
组织学和免疫组织化学分析。如所述将肺收获并处理。简单来说，将肺在20cm H2O压力下充满10％***，并在10％***中固定过夜。将左叶在石蜡中制块并包埋。所有切片以5μm切出。将通过肺门的代表性的苏木精和曙红染色(H&E)的肺切片编号，并对10–150μm范围内的肺动脉的重塑进行盲评。每个小动脉的血管壁厚度使用Image J来测量，并表示为：1)公式(Ed-Id)/Ed×100的血管直径的百分率，其中Ed是外径，Id是内径；2)公式(面积ext-面积int)/面积ext的血管面积的百分率，其中面积ext和面积int分别是中膜壁的外部和内部边界内的面积。对每只动物进行10至20次之间的测量，并计算平均值。为了显示小肺血管的肌化，通过如前所述用抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体和抗小鼠血管性血友病因子(vWF)抗体对切片进行双重免疫染色来进行免疫组织化学(IHC)染色。HxSu大鼠中的丛状病灶被定义为突出到血管外部(动脉瘤样)和在血管腔内形成的病灶。在每只动物的通过肺门的H&E染色的肺切片中20×放大倍数下的20个随机图像中计数丛状病灶(PL)的数目。
天狼猩红染色和定量。天狼猩红(PSR)染色如前所述在5μm石蜡切片中进行。然后使用彼此平行和正交取向的分析仪和偏光仪对切片进行连续成像。在所有样品的整个成像中维持显微镜条件(灯亮度、聚光镜开口、物镜、缩放、曝光时间和增益参数)。在适合的对照切片上为每个实验设置最小阈值，其中只包括通过正交取向的偏光仪的代表了纤维状结构的光(即并包括来自于黑背景的残余光)。在每个实验中，为横跨所有条件的所有图像维持所述阈值。计算被所述阈值条件下的光覆盖的转移区的面积，并将每种条件下每个血管的至少10个切片一起进行平均(NIH ImageJ软件)。
定量RT-PCR分析。使用Qiagen RNeasy小量试剂盒，按照制造商的说明书(Qiagen,Crawley,UK)从捣碎的全肺纯化总RNA。使用QuantiTect反转录试剂盒(Qiagen)将500纳克总RNA转录成cDNA。使用序列检测系统ABI Prism 7700(Applied Biosystems,Warrington,UK)，使用TaqMan通用PCR主混合物、无AmpErase UNG(料号4324018)和下述基因表达测定体系进行定量实时RT-PCR：IL-6(正向：5’-TTC TCT CCG CAA GAG ACT TCC-3’(SEQ ID NO：6)；反向：5’-TGF GGG TGG TAT CCT CTG TGA-3’(SEQ ID NO：7))和β-肌动蛋白(正向：5’-AGA TCA AGA TCA TTG CTC CT-3’(SEQ ID NO：8)；反向：5’-ACG CAG CTC AGT AAC AGTCC-3’(SEQ ID NO：9))。样品运行一式三份。使用比较Ct法确定每个样品中的基因表达水平。
蛋白质羰基化的评估。使用RIPA缓冲液制备肺组织匀浆物。将来自于每种样品的等量的总蛋白(15μg)用6％SDS(终浓度)变性，用1x DNPH(从100％三氟乙酸中100mM的10xDNPH储用溶液用蒸馏水新鲜稀释)衍生以形成DNP腙衍生物，然后用中和缓冲液(2M Tris中的30％甘油)中和。然后通过Western印迹进行蛋白质羰基化测定。将膜丽春红S染色用于蛋白质羰基化的载样对照。为了定量羰基化水平，对来自于每一道的蛋白质条带的光信号密度进行定量。使用丽春红S染色作为载样对照，将对照样品的信号密度值归一化到1.0。
表达α1 Na/K-ATP酶的突变体小窝蛋白结合基序的小鼠的产生。使用以前开发的策略来产生表达上述CBM突变体α1的敲入小鼠株系。具体来说，通过α1同工酶基因的外显子4中的4-bp突变引入F97A和F100A替换。此外，将Pyu II和Nhe I限制性酶位点作为两个沉默突变引入，以便于靶等位基因的鉴定。所述CBM突变体小鼠使用Cre/LoxP基因靶向策略来产生。
所有数据使用GraphPad Prism Software,Inc.(La Jolla,CA,USA)来作图，并表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。将来自于对照和治疗样品的结果使用方差分析，随后使用Neumann-Keuls多重比较检验进行比较。所有分析使用95％置信区间来完成。当p<0.05时，数据被认为是显著的。
实施例1-在HxSu大鼠中pNaKtide降低PAH和RV肥大
为了评估HxSu大鼠模型中PAH的发展，通过对2％异氟烷麻醉的大鼠进行经胸超声波心动描记术，来确定与平均PAP和肺血管阻力反相关的PAAT。在HxSu组中，与常氧组相比PAAT显著恶化。使用pNaKtide(25mg/kg/周)的治疗显示出PAAT的显著逆转(图1A)。
RV肥大的进展通过富尔敦指数和超声波心动描记术来测量。在HxSu大鼠(0.55±0.04)中，与常氧大鼠(0.20±0.01)相比富尔敦指数(RV/LV+S)显著提高，并在用pNaKtide治疗后降低(0.36±0.004)(图1B)。同样地，在HxSu大鼠(1.65±0.07mm)中，与常氧大鼠(1.12±0.03mm)相比通过超声波心动描记术评估的RV厚度显著增加，并在用pNaKtide治疗后减小(1.37±0.11mm)(图1C)。
暴露于HxSu的大鼠与常氧组相比也发生明显更高的右心室收缩压(RVSP)(122.6±3.9相比于18.7±0.3mmHg)。使用pNaKtide的治疗(25mg/kg/周)显著降低RVSP(49.7±0.5mmHg)(图1D-1E)。
实施例2-pNaKtide以剂量依赖性方式减少PAH中的肺血管重塑
与对照大鼠相比HxSu大鼠发生严重的血管壁增厚。肺末端小动脉的代表性图像示出在图2中。pNaKtide的腹膜内注射在1mg/kg-25mg/kg下剂量依赖性地降低中膜壁增厚。
实施例3-pNaKtide治疗对丛状病灶(PL)的影响
在每只动物中，以20×放大倍数观察通过肺门的H&E染色的肺切片的总共20个随机视野。在常氧大鼠中没有发现PL。HxSu大鼠中PL的数目为13.80±4.23。pNaKtide治疗显著减少PL的数目，即使在最低剂量下(2.16±1.081mg/kg/周)(图3B)。代表性的PL示出在图3A中。
实施例4–pNaKtide治疗对胶原沉积的影响
天狼猩红染色显示，与常氧组相比，在来自于HxSu组的血管中膜和外膜以及肺实质中胶原沉积增加。使用pNaKtide的治疗(25mg/kg/周)与HxSu组相比减弱胶原沉积(图4)。长期缺氧和Su5416引起严重的RV纤维化，其由胶原的积累指示。使用pNaKtide的治疗使所述纤维化恢复正常(图5A-5B)。
实施例5–在HxSu大鼠模型中pNaKtide降低IL-6mRNA水平
进一步发现，与常氧组相比，在HxSu组中肺中的IL-6mRNA水平明显更高。HxSu引起肺中IL-6mRNA水平的4倍提高。使用pNaKtide的治疗(25mg/kg/周)与HxSu组相比将IL-6mRNA水平降低40％(图6)。
实施例6–pNaKtide在肺中减弱HxSu诱导的蛋白质羰基化
为了评估蛋白质氧化，在HxSu大鼠中测试了蛋白质羰基化。与常氧组相比，HxSu显著诱导广范围的蛋白质的羰基化(图7A)。使用pNaKtide的治疗(25mg/kg/周)将羰基化降低到正常水平(图7B)。
实施例7–α1NaKATP酶的小窝蛋白结合基序(CBM)的突变引起PAH和右心室肥大
已经观察到Na/K-ATP酶介导的信号转导需要它与小窝蛋白-1的相互作用。此外已证实，Na/K-ATP酶的α1亚基的N-端处的保守的小窝蛋白结合基序(CBM)为它与小窝蛋白-1的相互作用和信号传导所需，但是不为执行离子泵送功能所需。此外，纯合子基因型(在Na/K-ATP酶α1基因的两个等位基因上带有敲入CBM突变体(F97A和F100A))引起胚胎致死性，而杂合子基因型(mCBM Het)不显示出明显表型。为了解决pNaKtide的潜在的脱靶效应并提供α1Na/K-ATP酶是PAH的关键控制机制的遗传证据，对CBM Het小鼠的肺血管系统和右心进行了进一步研究。
与cCBM WT小鼠(0.22±0.01，n＝8；P<0.01)相比，mCBM杂合子(Het)小鼠(0.26±0.01，n＝6)的富尔敦指数显著提高(图8A)。与mCBM WT小鼠(0.65±0.03，n＝8；P<0.05)相比，mCBM杂合子小鼠(0.77±0.04，n＝6)的RV/体重比也升高(图8B)。右心室收缩压(RVSP)被用于估算肺动脉收缩压。与WT小鼠相比mCBM杂合子小鼠具有明显提高的RVSP(32.25±1.61mmHg相比于24.41±2.63mmHg)(图8C-8D)。
实施例9–mCBM Het小鼠发展自发肺血管肌化
在wt小鼠中，大部分肺小血管是非肌化的(89.1％)，其余的小鼠显示出部分(8.9％)或完全肌化(2％)。CBM het小鼠显示出更多的部分(19.6％)和完全肌化的血管(5.6％)，减少的未肌化的血管(78.1％)(图9A-9B)。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单个出版物、专利或专利申请被具体且单个地指明通过引用并入，包括下面的列表中阐述的参考文献：
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应该理解，本文公开的主题内容的各种不同细节可以在不背离本文公开的主题内容的范围的情况下改变。此外，上述描述仅仅是出于说明的目的而不是限制的目的。
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Ala Val Phe Gln
20
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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Lys Lys Gly Lys Lys Gly Lys Lys
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agatcaagat cattgctcct 20
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<400> 9
acgcagctca gtaacagtcc 20
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