用于抑制acss2的组合物和方法
阅读说明：本技术 用于抑制acss2的组合物和方法 (Compositions and methods for inhibiting ACSS2 ) 是由 菲利普·梅夫斯 谢利·L·贝格尔 杰弗里·D·温克勒 安德鲁·格拉斯 西蒙·戴维·彼得·鲍 于 2018-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于调节组蛋白乙酰化或者用于治疗或预防神经疾病或病症的用于抑制ACSS2的组合物和方法。(The present invention provides compositions and methods for inhibiting ACSS2 for modulating histone acetylation or for treating or preventing a neurological disease or disorder.)
相关申请的引证
本申请主张2017年9月26日提交的美国临时申请序列号No.62/563,148的优先权，该申请的内容以其全部内容作为参考并入本文。
有关联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院提供的经费No.P01AG031862的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
记忆形成包括突触重构(synaptic restructuring)并且需要通过尚不太理解的修饰染色质的过程的神经元基因的协同表达(Kandel,E.R.等人,2014,Cell,157:163–186；Zovkic,I.B.等人,2013,Learn.Mem.,20:61–74)。组蛋白乙酰化是记忆存储的关键调节因子，并且在已涉及学习和记忆的不同的脑区域中，最显著地在海马(海马体)中重构染色质(Graff,J.等人,2013,Nat.Rev.Neurosci.,14:97–111)。海马记忆巩固需要转录因子CREB和辅激活蛋白CREB结合蛋白(CBP)，特别是CBP的组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性(Wood,M.A.等人,2005,Learn.Mem.,12:111–119；Korzus,E.等人,2004,Neuron,42:961–972)。此外，组蛋白脱乙酰酶抑制剂增强记忆巩固(Graff,J.等人,2013,Nat.Rev.Neurosci.,14:97–111)。然而，调控长期记忆中神经元组蛋白乙酰化的机制尚未完全理解。
通过染色质-修饰酶，如乙酰转移酶的中间代谢产物的直接感应可以动态改变染色质结构和基因表达(Kaelin,W.G.Jr.等人,2013,Cell,153:56–69；Katada,S.,等人,2012,Cell,148:24–28)。胞内乙酰-CoA混合组(pools)的改变操纵组蛋白乙酰化(Cai,L.等人,2011,Mol.Cell,42:426–437；Wellen,K.E.等人,2009,Science,324:1076–1080)；因此，产生核乙酰-CoA的代谢酶可以直接控制组蛋白乙酰化和基因表达(Gut,P.等人,2013,Nature,502:489–498；Pietrocola,F.等人,2015,Cell Metab.,21:805–821)。在哺乳动物细胞中，存在两种主要的产生用于组蛋白乙酰化的乙酰-CoA的酶：乙酸酯-依赖性乙酰CoA合酶2(ACSS2)和柠檬酸酯-依赖性ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)(Pietrocola,F.等人,2015,Cell Metab.,21:805–821)。ACSS2和ACL对于核组蛋白乙酰化的相对重要性根据组织类型、发育状态和疾病而不同(Wellen,K.E.等人,2009,Science,324:1076–1080；Pietrocola,F.等人,2015,Cell Metab.,21:805–821)，但是这些酶在有丝***后的神经元细胞中的作用仍未知。
因此，在本领域中仍需要治疗神经和认知疾病和病症(障碍)的疗法。本发明解决了这种未满足的需要。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗神经和认知疾病和病症的组合物和方法。在一些实施方式中，本发明提供了用于治疗记忆-相关疾病和病症的组合物和方法。在多个实施方式中，本发明所述的组合物和方法在治疗焦虑疾病和病症，如恐惧症、恐慌症、心理社会应激(psychosocial stress)(例如，如灾害、大灾难(巨灾，catastrophe)或暴力受害者中所见)、强迫症、广泛性焦虑障碍和创伤后应激障碍(PTSD)中是有用的。在一些实施方式中，本发明所述的组合物和方法对于调节长期记忆存储或巩固是有用的。
本发明还涉及用于治疗成瘾和/或与成瘾有关的疾病或病症的组合物和方法。在多个实施方式中，本发明所述的组合物和方法对于预防或治疗急性酒精引起的记忆减退(alcohol induced memory deficit)和慢性酒精引起的记忆减退是有用的。
在一些实施方式中，本发明所述的方法包括调节染色质乙酰化。在一个实施方式中，本发明所述的方法降低了染色质乙酰化。在一个实施方式中，所述染色质是神经元染色质。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的包含ACSS2抑制剂的组合物。
在某些情况下，本文所述的组合物和方法涉及抑制乙酸酯-依赖性乙酰CoA合酶2(ACSS2)。在一个实施方式中，本发明所述的组合物包含ACSS2的抑制剂。在一个实施方式中，所述ACSS22的抑制剂抑制ACSS2的表达、活性或两者。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料。
通常，本文所使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验程序是本领域中熟知且常用的那些。
将标准技术用于核酸和肽的合成。通常根据本领域中的常规方法以及多种一般参考文献进行所述技术和程序(例如，Sambrook and Russell,2012,Molecular Cloning,ALaboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY和Ausubel等人,2002,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)，在整个文档中提供了所述技术和程序。
如本文所使用的，以下术语中的每一个具有在该部分中与之有关的含义。
冠词"一个"在本文中用于表示一个或多于一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。举例来说，"一个元素"表示一个元素或多于一个元素。
当表示可测值，如量、时距等时，如本文所使用的"约"意味着涵盖了所指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，照此这些变化对于实施所公开的方法是适合的。
当在生物、组织、细胞或其组分的背景中使用时，术语"异常的"是指至少一个可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、时间等)不同于显示出"正常的"(预期的)各个特征的那些生物、组织、细胞或其组分的那些生物、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型正常或预期的特征可以对于不同的细胞或组织类型是异常的。
"反义"具体表示编码蛋白的双链DNA分子的非编码链的核酸序列，或者表示与所述非编码链基本同源的序列。如本文所定义的，反义序列与编码蛋白的双链DNA分子的序列互补。反义序列不必需仅与DNA分子的编码链的编码部分互补。反义序列可以与编码蛋白的DNA分子的编码链上所指明的调控序列互补，所述调控序列控制所述编码序列的表达。
"疾病"是动物的健康状态，其中所述动物不可以维持稳态，并且其中如果所述疾病未得到改善，则所述动物的健康持续变差。
相反，动物中的"病症"是其中所述动物能够维持稳态，但是其中所述动物的健康状态不如不存在所述病症的情况下的状态良好的健康状态。如果保持不治疗，则病症不必然导致所述动物的健康状态进一步降低。
如果疾病或病症的病征或症状的严重程度，患者经历这种病征或症状的频率，或两者降低，则所述疾病或病症"减轻(缓解)"。
化合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以为施用所述化合物的受试者提供有益作用的化合物的量。
“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列，如基因、cDNA或mRNA用作生物过程中用于具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或者具有从中所获得的限定的氨基酸序列和生物学性质的其它聚合物和大分子的合成的模板的固有性质。因此，如果对应于所述基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生了蛋白，则所述基因编码所述蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链两者可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其它产物。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中是可互换使用的并且表示无论体外还是体内对本文所述的方法顺从的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方式中，所述患者、受试者或个体是人。
“治疗性”治疗是出于减轻或消除那些病征或症状的目的，施用于显示出疾病或病症的病征或症状的受试者的治疗。
如本文所使用的，“治疗疾病或病症”表示降低患者所经历的疾病或病症的病征或症状的严重程度和/或频率。
对于抗体来说，如本文所使用的术语“特异性结合”表示识别特异性抗原，但是基本不识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的抗原的抗体还可以结合至来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种的反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合至抗原的抗体还可以结合至所述抗原不同的等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。
在一些情况下，术语“特异性结合”可以与抗体、蛋白或肽与第二化学物质的相互作用结合，用于表示所述相互作用取决于所述化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，通常，抗体识别并结合至特异性蛋白结构，而不是蛋白。如果抗体对表位“A”特异，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，含有表位A的分子(或者游离的未标记的A)的存在将降低结合至所述抗体的标记的A的量。
基因的“编码区”包括所述基因的编码链的核苷酸残基以及所述基因的非编码链的核苷酸，其分别与通过所述基因的转录所产生的mRNA分子的编码区同源或互补。
mRNA分子的“编码区”还包括所述mRNA分子的核苷酸残基，其与所述mRNA分子翻译期间的转运RNA分子的反密码子区相匹配或者其编码了终止密码子。因此，所述编码区可以包括包含在所述mRNA分子所编码的成熟蛋白中不存在的氨基酸残基(例如，蛋白输出信号序列中的氨基酸残基)的密码子的核苷酸残基。
如本文用于表示核酸的“互补的”是指两条核酸链的区域之间或者相同核酸链的两个区域之间的序列互补性的广泛概念。已知第一核酸区的腺嘌呤残基能够与反向平行于所述第一区的第二核酸区的残基(如果所述残基为胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特异性氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与反向平行于所述第一链的第二核酸链的残基(如果所述残基是鸟嘌呤)碱基配对。如果当以反向平行的方式布置所述两个区，且所述第一区的至少一个核苷酸残基能够与所述第二区的残基碱基配对，则核酸的第一区与具有相同或不同核酸的第二区互补。在一个实施方式中，所述第一区包括第一部分，所述第二区包括第二部分，其中当以反向平行方式布置所述第一和第二部分时，所述第一部分的核苷酸残基的至少约50％能够与所述第二部分中的核苷酸残基碱基配对。在一个实施方式中，所述第一部分的核苷酸残基的至少约75％、至少约90％或者至少约95％能够与所述第二部分中的核苷酸残基碱基配对。在一个实施方式中，所述第一部分的所有核苷酸残基能够与所述第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
如本文所使用的术语“DNA”的定义为脱氧核糖核酸。
将如本文所使用的术语“表达”定义为通过启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所使用的术语“表达载体”是指含有编码至少一部分能够被转录的基因产物的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子随后被翻译为蛋白、多肽或肽。在其它情况下，这些序列未被翻译，例如，在反义分子、siRNA、核糖酶等的产生中。表达载体可以含有多种控制序列，其表示特定宿主生物中可操作性连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可以含有还起到其它功能的核酸序列。
术语“融合多肽”是指含有与异源序列(例如，非荧光素酶氨基酸或蛋白)连接的所关心的蛋白(例如，荧光素酶)的嵌合蛋白。
术语“同源性”是指互补性程度。可以存在部分同源或完全同源(即，同一性)。通常使用序列分析软件测量同源性(例如，Sequence Analysis Software Package of theGenetics Computer Group.University of Wisconsin Biotechnology Center.1710University Avenue.Madison,Wis.53705)。这种软件通过向多种替换、缺失、***和其它修饰分配同源性程度来匹配类似的序列。保守性替换通常包括下列范围内的替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“分离的”表示相对于天然状态改变或从天然状态中除去。例如，在其正常背景中天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然背景中共存的材料部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以处于基本纯化的形式，或者可以存在于非天然环境中，如(例如)宿主细胞。
当结合核酸使用时，如在“分离的寡核苷酸”或者“分离的多核苷酸”中，术语“分离的”是指鉴别且与在其来源中通常与之相关的至少一种污染物分离的核酸序列。因此，分离的核酸以不同于它在自然界中所存在的形式或环境的形式或环境存在。相反，非分离的核酸(例如，DNA和RNA)以它们在自然界中存在的状态存在。例如，给定DNA序列(例如，基因)与相邻基因邻近存在于宿主细胞染色体上；RNA序列(例如，编码特定蛋白的特定mRNA序列)作为与编码大量蛋白的多种其它mRNA的混合物存在于细胞中。然而，举例来说，分离的核酸包括通常表达该核酸的细胞中的这种核酸，其中所述核酸处于不同于天然细胞的染色***置中，或者另外侧接了不同于自然界中所存在的核酸序列。分离的核酸或寡核苷酸可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸或寡核苷酸用于表达蛋白时，所述寡核苷酸含有至少正义链或编码链(即，所述寡核苷酸可以是单链的)，但是可以含有正义链和反义链两者(即，所述寡核苷酸可以是双链的)。
当结合多肽使用时，如在“分离的蛋白”或者“分离的多肽”中，术语“分离的”是指鉴别且与在其来源中通常与之相关的至少一种污染物分离的多肽。因此，分离的多肽以不同于它在自然界中所存在的形式或环境的形式或环境存在。相反，非分离的多肽(例如，蛋白和酶)以它们在自然界中存在的状态存在。
“核酸”表示任何核酸，无论它是由脱氧核糖核苷或核糖核苷组成，并且无论它是由磷酸二酯键或修饰的键，如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、桥连的氨基磷酸酯、桥连的亚甲基膦酸酯、硫代磷酯、膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、桥连的硫代磷酯或砜键以及这些键的组合所组成。术语核酸还具体地包括由5种生物学存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基所组成的核酸。术语“核酸”通常是指大的多核苷酸。
在本文中使用常规表示法来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左端是5'-端；双-链多核苷酸序列的左手方向称为5'-方向。
向新生RNA转录本5'至3'添加核苷酸的方向被称为转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链被称为“编码链”；位于DNA上参考点的5'端的DNA链上的序列被称为“上游序列”；位于DNA上参考点的3'端的DNA链上的序列被称为“下游序列”。
“表达盒”表示包含可操作性地连接至编码序列的转录和任选地翻译所必需的启动子/调控序列的编码序列的核酸分子。
如本文所使用的术语“可操作性地连接”表示处于产生能够指导给定基因的转录和/或所期望的蛋白质分子的合成的核酸分子的方式的核酸序列的连接。该术语还表示处于产生功能性(例如，酶活性、能够结合至结合伴侣、能够抑制等)蛋白或多肽的方式的编码氨基酸的序列的连接。
如本文所使用的，术语“启动子/调控序列”表示可操作性地连接至启动子/调控序列的基因产物的表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其它实例中，该序列还可以包括增强子序列以及基因产物表达所需的其它调控元件。所述启动子/调控序列可以(例如)是以可诱导方式表达基因产物的启动子/调控序列。
“诱导型”启动子是当与编码或指明基因产物的多核苷酸可操作性地连接时，只有在存在对应于所述启动子的诱导剂时，导致基因产物显著产生的核苷酸序列。
“组成型”启动子是当与编码或指明基因产物的多核苷酸可操作性地连接时，导致基因产物在细胞的大部分或全部生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。
如本文所使用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有以下常识：核酸是多核苷酸，其可以水解为单体“核苷酸”。所述单体核苷酸可以水解为核苷。如本文所使用的多核苷酸包括(但不限于)通过本领域中可用的任何方式获得的所有核酸序列，所述方式无限制地包括重组方式，即，使用常规克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组中对核酸序列的克隆，和通过合成方式。
在本发明的背景中，使用了以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸腺嘧啶核苷，并且“U”是指尿嘧啶核苷。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”是可互换使用的，并且表示由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且不限制蛋白或肽序列可以包含的最大氨基酸数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何的肽或蛋白。如本文所使用的，该术语是指短链和长链两者，所述短链在本领域中通常称为(例如)肽、寡肽和寡聚物，并且长链在本领域中通常称为蛋白，其存在多种类型。“多肽”包括(例如)生物学活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同型二聚体、杂二聚物、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
如本文所使用的，“拟肽”是含有能够模拟母体肽的生物作用的非肽结构成分的化合物。拟肽可以包含或可以不包含肽键。
如本文所使用的术语“RNA”定义为核糖核酸。
“重组多核苷酸”是指具有非天然结合在一起的序列的多核苷酸。扩增或组装的重组多核苷酸可以包括在适合的载体中，并且所述载体可以用于转化适合的宿主细胞。
重组多核苷酸还可以起非编码功能(例如，启动子、复制起点、核糖体-结合位点等)。
如本文所使用的术语“重组多肽”的定义为通过使用重组DNA方法所产生的多肽。
如本文所使用的，“结合的”是指一个分子与第二分子的共价连接。
如本文所使用的，术语“反式显性负性突变基因”是指编码防止未突变(即，具有野生型序列)的相同基因或基因产物的其它拷贝正确起作用(例如，通过抑制野生型蛋白功能)的多肽或蛋白产物的基因。反式显性负性突变基因的产物在本文中称为“显性负性”或“DN”(例如，显性负性蛋白或DN蛋白)。
如本文所使用的短语“抑制”表示将分子、反应、相互作用、基因、mRNA和/或蛋白的表达、稳定性、功能或活性降低可测量的量或者完全防止。抑制剂是(例如)结合至、部分或完全阻断刺激、降低、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调蛋白、基因和mRNA稳定性、表达、功能和活性的化合物，例如，拮抗剂。
作为在本文中使用的术语，“变体”是分别与参考核酸序列或肽序列在序列方面不同的核酸序列或肽序列，但是它们保留了参考分子的基本生物性质。核酸变体的序列变化可以不改变通过参考核酸所编码的肽的氨基酸序列，或者可以导致氨基酸替换、添加、缺失、融合和截短。肽变体的序列变化通常是有限的或保守的，从而所述参考肽和所述变体的序列在整体上是非常类似的，并且在多个区域是相同的。变体和参考肽可以在氨基酸序列方面以任意组合相差一个或多个替换、添加、缺失。核酸或肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或者可以是已知不是天然存在的变体。可以通过突变技术或者通过直接合成制备核酸和肽的非天然存在的变体。
“载体”是包含分离的核酸并且可以用于向细胞内部递送分离的核酸的物质组合物。多种载体在本领域中是已知的，其包括(但不限于)线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应被视为包括有利于核酸向细胞递送的非质粒和非病毒化合物，如(例如)聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括(但不限于)腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、反转录病毒载体等。
如本文所使用的，术语“药物组合物”是指在本发明的范围内有用的至少一种化合物与药物可用的载体的混合物。药物组合物有利于所述化合物向患者或受试者的施用。在本领域中存在多种施用化合物的技术，其包括(但不限于)静脉内、口腔、气溶胶、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。
如本文所使用的，术语“药物可用的”是指材料，如载体或稀释剂，其不消除所述化合物的生物活性或性质并且是相对无毒的，即所述材料可以施用于个体而不会导致不希望的生物作用或以有害方式与其中它所包含的任何组合物组分相互作用。
如本文所使用的，语言“药物可用的盐”是指从药物可用的无毒的酸(包括无机酸、有机酸、其溶剂化物、水合物或笼形物(包合物，clathrate))所制备的所施用的化合物的盐。这些无机酸的实例为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、乙酸、六氟磷酸、柠檬酸、葡萄糖酸、苯甲酸、丙酸、丁酸、磺基水杨酸、马来酸、月桂酸、苹果酸、反丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、水甘草酸(amsonic)、双羟萘酸(帕莫酸，pamoic)、p-甲苯磺酸和甲磺酸。适当的有机酸可以选自(例如)有机酸的脂肪酸、芳香酸、羧酸和磺酸类，它们的实例为甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、樟脑磺酸、柠檬酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、羟乙基磺酸、乳酸、苹果酸、粘液酸(粘酸)、酒石酸、对-甲苯磺酸、乙醇酸、葡萄糖醛酸、马来酸、糠酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸、苯乙酸、扁桃酸、扑酸(双羟萘酸)、甲磺酸、乙磺酸、泛酸、苯磺酸(苯磺酸酯)、硬脂酸、磺胺酸(sulfanilic)、海藻酸、半乳糖醛酸等。此外，通过非限制性实例，药物可用的盐包括碱土金属盐(例如，钙或镁)、碱金属盐(例如，钠-相关的或钾)和铵盐。
如本文所使用的，术语“药物可用的载体”是指参与在患者内或向患者携带或输送在本发明的范围内有用的化合物，从而使其可以发挥其预期作用的药物可用的材料、组合物或载体，如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料。通常，将这些构建体从一个器官或身体部分携带或输送至另一个器官或身体部分。每种载体必须在与所述制剂的其它成分相容的意义上是“可接受的”，包括在本发明内有用的化合物，而不是对所述患者是有害的。可以用作药物可用的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油剂，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和在药物制剂中使用的其它无毒相容物质。如本文所使用的，“药物可用的载体”还包括与在本发明的范围内有用的化合物的活性相容且对患者是生理学可用的任何和所有涂层、抗细菌和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。还可以将补充性活性化合物引入所述组合物中。“药物可用的载体”还可以包括在本发明的范围内有用的化合物的药物可用的盐。可以包括在本发明的实践中所使用的药物组合物中的其它附加成分在本领域中是已知的并且描述于(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences(Genaro主编，MackPublishing Co.,1985,Easton,PA)，该文献作为参考并入本文。
如本文所使用的，术语“效力”是指产生半最大反应所需的剂量(ED50)。
如本文所使用的，术语“药效”是指在测定内实现的最大效果(Emax)。
除非另作说明，否则如本文所使用的术语“烷基”单独或作为另一个取代基的一部分表示具有所指明的碳原子数目(即C1-6表示1至6个碳原子)并且包括直链、支链或环状取代基基团的直链或支链烃。实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基和环丙基甲基。
如本文所使用的，术语“取代的烷基”表示被1、2或3个取代基取代的如上定义的烷基，所述取代基选自卤素、-OH、烷氧基、-NH2、氨基、叠氮基、-N(CH3)2、-C(＝O)OH、三氟甲基、-C≡N、-C(＝O)O(C1-C4)烷基、-C(＝O)NH2、-SO2NH2、-C(＝NH)NH2和-NO2。取代的烷基的实例包括(但不限于)2,2-二氟丙基、2-羧基环戊基和3-氯丙基。
除非另作说明，否则如本文所使用的术语“杂烷基”单独或与另一个术语结合表示由指定数目的碳原子和一个或两个选自O、N和S的杂原子所组成的稳定直链或支链烷基，并且其中所述氮和硫原子可以任选地被氧化并且所述氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子可以位于杂烷基的任何位置，包括位于其余的杂烷基和它所连接的片段之间，并且可以连接至杂烷基中最远端的碳原子。实例包括：-O-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-OH、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-S-CH2-CH3和-CH2CH2-S(＝O)-CH3。多至两个杂原子可以是连续的，如(例如)-CH2-NH-OCH3或-CH2-CH2-S-S-CH3。
除非另作说明，否则如本文所使用的术语“烷氧基”单独或与其它术语结合使用以表示通过氧原子连接到其余分子的如上定义的具有指定个数的碳原子的烷基，如(例如)甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基(异丙氧基)和更高碳(higher)同系物和异构体。
除非另作说明，否则如本文所使用的术语“卤代”或“卤素”单独或作为另一个取代基的一部分表示氟、氯、溴或碘原子。
如本文所使用的，术语“环烷基”是指单环或多环非芳基，其中形成所述环的每个原子(即骨架原子)是碳原子。在一个实施方式中，所述环烷基是饱和或部分不饱和的。在另一个实施方式中，所述环烷基与芳香环稠合。环烷基包括具有3至10个环原子的基团。环烷基的说明性实例包括(但不限于)以下部分：
单环环烷基包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。双环环烷基包括(但不限于)四氢萘基、茚满基和四氢戊搭烯。多环环烷基包括金刚烷和降莰烷。术语环烷基包括“不饱和的非芳香族碳环基”或者“非芳香族不饱和碳环基”基团，两者均表示如本文所定义的非芳香族碳环，其含有至少一个碳双键或一个碳三键。
如本文所使用的，术语“杂环烷基”或“杂环基”是指含有1至4个分别选自O、S和N的环杂原子的杂脂环族基。在一个实施方式中，每个杂环烷基在其环系统中具有4至10个原子，但条件是所述基团的环不含两个相邻的O或S原子。在另一个实施方式中，所述杂环烷基与芳香环稠合。在一个实施方式中，所述氮和硫杂原子可以任选地被氧化，并且所述氮原子可以任选地被季铵化。除非另作说明，否则所述杂环系统可以在提供稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接。杂环在本质上可以是芳香族的或非芳香族的。在一个实施方式中，所述杂环是杂芳基。
3-元杂环烷基的实例包括且不局限于氮丙啶。4-元杂环烷基的实例包括且不局限于氮杂环丁烷和β内酰胺。5-元杂环烷基的实例包括且不局限于吡咯烷、噁唑烷和噻唑烷二酮。6-元杂环烷基的实例包括且不局限于哌啶、吗啉和哌嗪。杂环烷基的其它非限制性实例是：
非芳香族杂环的实例包括单环基团，如氮丙啶、环氧乙烷、硫杂丙环(硫杂环丙烷，thiirane)、氮杂环丁烷、环氧丙烷、噻呾(硫杂环丁烷，thietane)、吡咯烷、吡咯啉、吡唑烷、咪唑啉、二氧戊环、环丁砜、2,3-二氢呋喃、2,5-二氢呋喃、四氢呋喃、噻吩烷、哌啶、1,2,3,6-四氢吡啶、1,4-二氢吡啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、吡喃、2,3-二氢吡喃、四氢吡喃、1,4-二恶烷、1,3-二恶烷、高哌嗪、高哌啶、1,3-二氧杂环己烷(1,3-dioxepane)、4,7-二氢-1,3-二氧杂卓(4,7-dihydro-1,3-dioxepin)和环氧己烷。
如本文所使用的，术语“芳香族的”是指具有一个或多个多不饱和环且具有芳香性，即具有(4n+2)个离域π(pi)电子(其中n是整数)的碳环或杂环。
除非另作说明，否则如本文所使用的术语“芳基”单独或与其它术语结合使用以表示含有一个或多个环(通常1、2或3个环)的碳环芳香族系统，其中这些环可以以侧基方式连接在一起，如联苯，或者可以是稠合的，如萘。芳基的实例包括苯基、蒽基和萘基。
如本文所使用的，术语“芳基-(C1-C3)烷基”表示其中1-至3-碳亚烷基链连接至芳基的官能团，例如，-CH2CH2-苯基。在一个实施方式中，芳基-(C1-C3)烷基是芳基-CH2-或芳基-CH(CH3)-。术语“取代的芳基-(C1-C3)烷基”表示其中芳基是取代的芳基-(C1-C3)烷基官能团。类似地，术语“杂芳基-(C1-C3)烷基”表示其中1至3碳亚烷基链连接至杂芳基的官能团，例如，-CH2CH2-吡啶基。术语“取代的杂芳基-(C1-C3)烷基”表示其中杂芳基是取代的杂芳基-(C1-C3)烷基官能团。
如本文所使用的，术语“杂芳基”或“杂芳香的”是指具有芳香性的杂环。多环杂芳基可以包括部分饱和的一个或多个环。实例包括以下部分：
杂芳基的实例还包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(具体地2-和4-嘧啶基)、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(具体地2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、恶唑基、吡唑基(具体地3-和5-吡唑基)、异噻唑基、1,2,3-***基、1,2,4-***基、1,3,4-***基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-氧杂二唑基、1,3,4-噻二唑基和1,3,4-氧杂二唑基。
多环杂环和杂芳基的实例包括吲哚基(具体地，3-、4-、5-、6-和7-吲哚基)、二氢吲哚基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基(具体地，1-和5-异喹啉基)、1,2,3,4-四氢异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基(具体地，2-和5-喹喔啉基)、喹唑啉基、2,3-二氮杂萘基(phthalazinyl)、1,8-萘啶基、1,4-苯并二噁烷、香豆素、二氢香豆素、1,5-萘啶基、苯并呋喃基(具体地，3-、4-、5-、6-和7-苯并呋喃基)、2,3-二氢苯并呋喃基、1,2-苯并异噁唑基、苯并噻吩基(具体地，3-、4-、5-、6-和7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(具体地，2-苯并噻唑基和5-苯并噻唑基)、嘌呤基(purinyl)、苯并咪唑基(具体地，2-苯并咪唑基)、苯并***基、硫代黄嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯里西啶基和喹诺里西啶基。
如本文所使用的，术语“取代的”是指原子或原子团作为连接至另一个基团的取代基替换氢。术语“取代的”还表示任何取代水平，即单-、二-、三-、四-或五-取代，其中这种取代是允许的。独立选择取代基，并且取代可以位于任何化学可接近的位置。在一个实施方式中，取代基在1至4之间的数值改变。在另一个实施方式中，取代基在1至3之间的数值改变。在另一个实施方式中，取代基在1至2之间的数值改变。
如本文所使用的，术语“可选地取代的”是指所提及的基团可以是取代的或未取代的。在一个实施方式中，所提及的基团任选地被零个取代基取代，即所提及的基团是未取代的。在另一个实施方式中，所提及的基团任选地被一个或多个单独且独立地选自本文所述的基团的其它基团取代。
在一个实施方式中，所述取代基独立地选自氧、卤素、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、烷基(包括直链、支链和/或不饱和烷基)、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、氟代烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烷氧基、氟代烷氧基、-S-烷基、S(＝O)2烷基、-C(＝O)NH[取代的或未取代的烷基或者取代的或未取代的苯基]、-C(＝O)N[H或烷基]2、-OC(＝O)N[取代的或未取代的烷基]2、-NHC(＝O)NH[取代的或未取代的烷基或者取代的或未取代的苯基]、-NHC(＝O)烷基、-N[取代的或未取代的烷基]C(＝O)[取代的或未取代的烷基]、-NHC(＝O)[取代的或未取代的烷基]、-C(OH)[取代的或未取代的烷基]2和-C(NH2)[取代的或未取代的烷基]2。在另一个实施方式中，举例来说，任选的取代基选自氧、氟、氯、溴、碘、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CF3、-CH2CF3、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCF3、-OCH2CF3、-S(＝O)2-CH3、-C(＝O)NH2、-C(＝O)-NHCH3、-NHC(＝O)NHCH3、-C(＝O)CH3、-ON(O)2和-C(＝O)OH。在另一个实施方式中，所述取代基独立地选自C1-6烷基、-OH、C1-6烷氧基、卤代、氨基、乙酰胺基、氧和硝基。在另一个实施方式中，所述取代基独立地选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代、乙酰胺基和硝基。如本文所使用的，当取代基是烷基或烷氧基时，碳链可以是支链、直链或环状的。
范围：在整个发明公开中，本发明的多个方面可以以范围格式存在。应理解以范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应将其视为对本发明范围的刻板限制。因此，对范围的描述应认为具有具体公开的所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围，如1至6的描述应认为具有具体公开的子范围，如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这是适用的，而无需考虑范围的宽度。
描述
本发明涉及用于治疗或预防记忆-相关疾病或病症，如(但不限于)PTSD、成瘾和成瘾-相关疾病或病症的组合物和方法。本发明部分基于以下发现：ACSS2调节组蛋白乙酰化和神经元基因转录。ACSS2表达(如通过RNA干扰)或者ACSS2活性(如通过小分子)的抑制降低了组蛋白乙酰化并且损害长期(长时，long-term)空间记忆。因此，本发明涉及抑制ACSS2以抑制组蛋白乙酰化和治疗记忆-相关疾病或病症的组合物和方法。
在一些实施方式中，本发明所述的组合物包含ACSS2活性抑制剂。在一些实施方式中，所述组合物包含ACSS2表达抑制剂。因此，在多个实施方式中，所述组合物包含降低细胞中ACSS2的表达水平的分离的核酸(例如，siRNA、miRNA、核糖酶、反义RNA等)。
在一些实施方式中，所述组合物包含ACSS2活性抑制剂。因此，在多个实施方式中，所述组合物包含降低ACSS2活性的小分子、核酸、肽、抗体、拮抗剂、适体或拟肽。
在一些实施方式中，本发明提供了用于治疗受试者中神经或认知疾病或病症的方法。在一个实施方式中，所述神经或认知疾病或病症是记忆-相关疾病或病症。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的包含ACSS2抑制剂的组合物。在一个实施方式中，所述方法在治疗PTSD中是有用的。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于治疗受试者中成瘾或成瘾相关疾病或病症的方法。在一些实施方式中，本发明所述的方法在治疗急性酒精引起的记忆减退中是有用的。在其它实施方式中，本发明所述的方法在治疗慢性酒精引起的记忆减退中是有用的。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的包含ACSS2抑制剂的组合物。
抑制剂
在一些实施方式中，本发明提供了用于治疗受试者中神经或认知疾病或病症的组合物。在一个实施方式中，所述神经或认知疾病或病症是记忆-相关疾病或病症。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的包含ACSS2抑制剂的组合物。在另一个实施方式中，本发明提供了用于治疗受试者中成瘾或成瘾相关疾病或病症的组合物。在一些实施方式中，本发明所述的方法在治疗急性酒精引起的记忆减退中是有用的。在其它实施方式中，本发明所述的方法在治疗慢性酒精引起的记忆减退中是有用的。在某些实施方式中，所述组合物抑制受试者中ACSS2的表达、活性或两者。
在一个实施方式中，本发明所述的组合物包含ACSS2的抑制剂。在多个实施方式中，所述ACSS2的抑制剂是降低、抑制或防止ACSS2的表达、活性或功能的任何化合物、分子或试剂。因此，ACSS2的抑制剂是降低ACSS2的表达、活性或两者的任何化合物、分子或试剂。在多个实施方式中，所述ACSS2的抑制剂是核酸、肽、小分子、siRNA、核糖酶、反义核酸、拮抗剂、适体、拟肽或它们的任意组合。
小分子抑制剂
在一些实施方式中，所述抑制剂是小分子。当所述抑制剂是小分子时，可以使用技术人员已知的标准方法获得小分子。这些方法包括化学有机合成或生物方法。生物方法包括使用本领域中熟知的方法，从生物来源纯化、重组合成和体外翻译系统。在一个实施方式中，本发明的小分子抑制剂包含有机分子、无机分子、生物分子、合成分子等。
在治疗多种疾病和病况中潜在有用的分子多样性化合物的组合文库以及制备文库的方法在本领域中是熟知的。所述方法可以使用多种技术人员熟知的技术，其包括固相合成、溶液法、单个化合物的平行合成、化学混合物的合成、刚性核芯结构(rigid corestructure)、柔性线性序列、反卷积策略(deconvolution strategies)、标签技术和产生用于先导化合物发现的无偏分子图谱(unbiased molecular landscape)vs.用于先导化合物开发的偏向结构(biased structure)。
在小型文库合成的一般方法中，将激活的核芯分子与多个构建块(buildingblock)缩合，从而导致产生了共价连接的核芯-构建块集合体的组合文库。所述核芯的形状和刚性决定了所述构建块在形状空间中的取向。可以通过改变核芯、键或构建块使文库偏倚以靶向特征化生物结构(“针对性文库(focused libraries)”)或者可以使用柔性核芯以较低的结构偏倚合成文库。
即使未显示盐，本文所述的小分子和小分子化合物可以作为盐存在，并且应理解本发明涵盖了本文所示的抑制剂的所有盐和溶剂化物以及所述抑制剂的非盐和非溶剂化物形式，如技术人员所熟知的。在一些实施方式中，本发明所述的抑制剂的盐是药物可用的盐。
当对于任何本文所述的抑制剂可以存在互变异构形式时，每种互变异构形式旨在包含在本发明中，尽管可能仅明确显示了一种或一些互变异构形式。例如，当显示2-羟基吡啶基部分时，还预期显示了相应的2-吡啶酮互变异构体。
本发明还包括任何或全部立体化学形式，包括所述抑制剂的任何对映体或非对映体形式。在本文中对结构或名称的列举旨在涵盖所示抑制剂的全部可能的立体异构体。本发明还涵盖了所述抑制剂的所有形式，如所述抑制剂的晶体或非晶体形式。还预期了包含本发明的抑制剂的组合物，如包含其特定立体化学形式的基本纯的抑制剂的组合物，或者以任何比例包含本发明的抑制剂的混合物(包括两种或更多种立体化学形式)的组合物，如外消旋或非外消旋混合物。
在一个实施方式中，本发明所述的小分子抑制剂包括本文所述的抑制剂的类似物或衍生物。
在一个实施方式中，本文所述的小分子是用于衍生化的候选分子。照此，在某些情况下，本文包括了具有调节的效力、选择性和溶解度的本文所述的小分子的类似物并且提供了用于药物发现和药物开发的有用的先导化合物。因此，在某些情况下，在优化期间，考虑药物递送、代谢、新颖性和安全性等问题，设计了新型类似物。
在一些情况下，如组合和药物化学领域中所熟知的，将本文所述的小分子抑制剂衍生化/类似物化。可以通过在不同位置上添加和/或取代官能团来制备类似物或衍生物。照此，可以使用熟知的化学合成程序将本文所述的小分子转化为衍生物/类似物。例如，可以选择性修饰所有氢原子或取代基以产生新的类似物。另外，可以将连接原子或基团修饰成具有碳主链或杂原子的更长或更短的接头。另外，可以改变所述环基团以在所述环中具有不同个数的原子和/或以包含杂原子。此外，芳香族可以转化为环，并且反之亦然。例如，所述环可以为5-7个原子，并且可以是同素环(碳环，homocycles)或杂环。
如本文所使用的，术语“类似物”或“衍生物”意在表示通过一种或多种化学反应从母体化合物或分子所制备的化合物或分子。照此，类似物可以是具有与本文所述的小分子抑制剂类似的结构的结构或者可以基于本文所述的小分子抑制剂的骨架，但是相对于某些组件或结构组成而与之不同，其在代谢上可以具有类似或相反的作用。根据本发明的任何小分子抑制剂的类似物或衍生物可以用于治疗自身免疫病或病症。
在一个实施方式中，可以通过将氢基彼此独立地修饰为其它取代基来使本文所述的小分子抑制剂独立地衍生化/类似物化。也就是说，可以相对于相同分子上的其它原子来独立地修饰每个分子上的每个原子。可以使用用于产生衍生物/类似物的任何常规修饰。例如，所述原子和取代基可以独立地由氢、烷基、脂族、直链脂族、具有链杂原子的脂族、支链脂族、取代的脂族、环脂族、具有一个或多个杂原子的杂环脂族、芳族、杂芳族、多芳族、聚氨基酸、肽、多肽、其组合、卤素、卤素-取代的脂族等组成。另外，可以使化合物上的任何环基团衍生化以提高和/或降低环尺寸以及将主链原子改变为碳原子或杂原子。
在一个实施方式中，所述小分子抑制剂是式(1)所表示的化合物
其中，X11选自C(R14)(R15)、O、S和NR15；
每次出现的X12选自C(R14)(R15)、O、S和NR15；
R11选自氢、-OR15、烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中R11是可选地取代的；
R12和R13分别独立地选自氢、烷基、芳基和杂芳基，其中R12和R13是可选地取代的；
每次出现的R14和R15独立地选自氢、卤素、-OH和烷基；和
n是0-8的整数。
在一个实施方式中，n是0。在一个实施方式中，n是1。在一个实施方式中，n是2。在一个实施方式中，n是3。
在一个实施方式中，R11是OR15。在一个实施方式中，R15是烷基。在一个实施方式中，R15是甲基。
在一个实施方式中，R11是哌啶基。
在一个实施方式中，R11是吗啉基。
在一个实施方式中，R11是吡咯烷基。
在一个实施方式中，R11是呋喃基。
在一个实施方式中，R11被羟基取代。
在一个实施方式中，R12是烷基。在一个实施方式中，R12是甲基。
在一个实施方式中，R12是芳基。在一个实施方式中，R12是苯基。
在一个实施方式中，R12是C5-C6杂芳基。在一个实施方式中，R12是呋喃。在一个实施方式中，R12是苯硫基。在一个实施方式中，R12是吡啶基。
在一个实施方式中，R13是烷基。在一个实施方式中，R13是甲基。
在一个实施方式中，R13是芳基。在一个实施方式中，R13是苯基。
在一个实施方式中，R13是C5-C6杂芳基。在一个实施方式中，R13是呋喃。在一个实施方式中，R13是苯硫基。在一个实施方式中，R13是吡啶基。
在一个实施方式中，R12和R13是相同的。
在一个实施方式中，式(1)所表示的化合物包括(但不限于)：
在一个实施方式中，所述小分子抑制剂是式(2)所表示的化合物：
其中，
R21选自-C(R23)m、环烷基、杂环基、环烷基-酮(cycloalkyl-one)和杂环基-酮(heterocycyl-one)；
R22选自烷基、芳基、杂芳基、烷基-芳基和烷基-杂芳基；
每次出现的R23独立地选自氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、-OH和-CN；和
m是1-3的整数。
在一个实施方式中，每次出现的R23独立地选自苯基、-OH、甲基、乙基和-CN。
在一个实施方式中，当m为3时，两次出现的R23是相同的并且一次出现的R23是不同的。在一个实施方式中，当m为3时，每次出现的R23是相同的。
在一个实施方式中，R1是式(2a)所表示的基团
其中X21选自O、N或S；和
R24选自氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环基。
在一个实施方式中，式(2)所表示的化合物包括(但不限于)：
在一个实施方式中，所述小分子抑制剂是式(3)所表示的化合物
其中R31选自-C(R35)p、环烷基、杂环基、环烷基-酮(cycloalkyl-one)、杂环基-酮(heterocycyl-one)；
R32选自烷基、芳基、杂芳基、-C1-C3烷基-(C3-C6芳基)和-C1-C3烷基-(C3-C6杂芳基)；
R33和R34分别独立地选自氢、卤素、烷基、芳基、杂芳基；
每次出现的R35独立地选自氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基、-OH和-CN；和
p是1-3的整数。
在一个实施方式中，R32是乙基。
在一个实施方式中，R33和R34分别独立地选自氢和-Cl。
在一个实施方式中，R33和R34是相同的。
在一个实施方式中，每次出现的R35独立地选自苯基、-OH、甲基、乙基和-CN。
在一个实施方式中，当p为3时，两次出现的R35是相同的并且一次出现的R35是不同的。在一个实施方式中，当p为3时，每次出现的R35是相同的。
在一个实施方式中，式(3)所表示的化合物包括(但不限于)：
在一个实施方式中，所述小分子抑制剂是式(4)所表示的化合物：
其中，
X41选自O和S；
R41选自烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基及其组合，其中R41可以是可选地取代的；和
R42和R43分别独立地选自苯基、苯硫基和呋喃基。
在一个实施方式中，R42和R43是相同的。
在一个实施方式中，R41是金刚烷基。
在一个实施方式中，R41是哌啶基。
在一个实施方式中，R41是吗啉基。
在一个实施方式中，R41是吡咯烷基。
在一个实施方式中，R41是呋喃基。
在一个实施方式中，R41是烷基。在一个实施方式中，R41是C1-C25烷基。在一个实施方式中，所述烷基是支链烷基。在一个实施方式中，所述烷基是直链烷基。
在一个实施方式中，R21是-C3-C10环烷基，其可以是可选地取代的。在一个实施方式中，所述环烷基是取代的。在一个实施方式中，所述环烷基是未取代的。在一个实施方式中，所述环烷基是单环的。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基等。在另一个实施方式中，所述环烷基是多环的。例如，可以通过连接两个或更多个-C3-C10环烷基来形成多环环烷基。多环环烷基的非限制性实例包括金刚烷和降莰烷。在一个实施方式中，所述环烷基是金刚烷，其可以是可选地取代的。环烷基还可以是双环的，其包括(但不限于)四氢萘基、茚满基和四氢戊搭烯。在一个实施方式中，所述环烷基是饱和或部分不饱和的。饱和或部分不饱和的环烷基的非限制性实例包括环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环已二烯基、环庚烯基、环庚二烯基、环庚三烯基、环辛烯基、环辛二烯基、环辛三烯基、环辛四烯基、环壬烯基、环壬二烯基、环癸烯基、环癸二烯基、环辛炔基、环壬炔基、环癸炔基等。在一个实施方式中，所述环烷基与芳香环稠合。
在一个实施方式中，式(4)所表示的化合物选自
本发明所述的小分子抑制剂的制备
可以通过本文所述的一般方案，使用本领域技术人员已知的合成方法制备式(1)-(4)所表示的化合物。以下实例显示了本发明的非限制性实施方式。
在非限制性实施方式中，通过用二酮(b)处理4-硝基-o-苯二胺(a)以形成6-硝基喹喔啉(c)，随后通过Pd/C-催化的氢化使其还原以产生6-氨基喹喔啉(d)来完成式(1)和(4)所表示的化合物的合成。可以使用本领域中已知的方法产生二酮(a)(Tet.Lett.,1995,36:7305-7308，以上文献以其全部内容作为参考并入本文)。
然后，用异氰酸酯处理喹喔啉d以形成式(1)或(4)所表示的化合物。
在另一个非限制性实施方式中，首先用三光气处理喹喔啉d，然后添加胺以形成式(1)或(4)所表示的化合物。
本发明所述的化合物可以具有一个或多个立构中心，并且每个立构中心可以独立地以R或S构型存在。在一个实施方式中，本文所述的化合物以光学活性形式或外消旋形式存在。应理解本文所述的化合物涵盖了具有本文所述的治疗有用性质的外消旋、光学-活性、区域异构和立体异构形式或其组合。以任何适合的方式实现光学活性形式的制备，其通过非限制性实例包括通过重结晶技术的外消旋形式的拆分、从光学-活性起始材料合成、手性合成或者使用手性固定相的色谱分离。在一个实施方式中，使用一种或多种异构体的混合物作为本文所述的治疗化合物。在另一个实施方式中，本文所述的化合物含有一个或多个手性中心。通过任何方式制备这些化合物，其包括立体选择性合成、对映选择性合成和/或对映异构体和/或非对映异构体的混合物的分离。通过任何方式实现化合物及其异构体的分离，其通过非限制性实例包括化学法、酶催化法、分级结晶、蒸馏和色谱法。
本文所述的方法和制剂包括具有任何本发明所述的化合物的结构的化合物的N-氧化物(如果适合的话)、结晶形式(也称为多晶形物)、溶剂化物、非晶质相和/或药物可用的盐以及具有相同类型的活性的这些化合物的代谢产物和活性代谢产物的使用。溶剂化物包括水、醚(例如，四氢呋喃、甲基叔丁基醚)或醇(例如，乙醇)溶剂化物、乙酸酯等。在一个实施方式中，本文所述的化合物以具有药物可用的溶剂，如水和醇的溶剂化物形式存在。在另一个实施方式中，本文所述的化合物以非溶剂化物形式存在。
在一个实施方式中，本发明所述的化合物可以作为互变异构体存在。所有互变异构体包括在本文所提供的化合物的范围内。
本文所述的化合物还包括同位素-标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数，但是原子量或质量数不同于通常在自然界中所存在的原子量或质量数的原子取代。适合于在本文所述的化合物中包含的同位素的实例包括且不局限于2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P和35S。通过任何适合的方法或者通过使用适当的同位素-标记的试剂代替另外使用的非标记的试剂的方法制备同位素-标记的化合物。
在一个实施方式中，通过其它方式标记本文所述的化合物，其包括(但不限于)发色团或荧光部分、生物发光标签或化学发光标签的使用。
使用本文所述的技术和材料，并且如(例如)Fieser&Fieser's Reagents forOrganic Synthesis,1-17卷(John Wiley和Sons,1991)；Rodd's Chemistry of CarbonCompounds,1-5卷和增刊(Elsevier Science Publishers,1989)；Organic Reactions,1-40卷(John Wiley和Sons,1991),Larock's Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.,1989),March,Advanced Organic Chemistry第4版,(Wiley1992)；Carey&Sundberg,Advanced Organic Chemistry第4版.,A和B卷(Plenum 2000,2001)和Green&Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis第3版,(Wiley 1999)(对于该公开内容，以上所有文献作为参考并入)中所述，合成了本文所述的化合物以及具有不同取代基的其它相关化合物。对于如本文所提供的化学式中所存在的多种部分的引入，通过使用适当的试剂和条件来改变用于制备如本文所述的化合物的一般方法。
使用从得自商品化来源的化合物起始的任何适合的程序合成本文所述的化合物，或者使用本文所述的程序制备本文所述的化合物。
在一个实施方式中，保护反应性官能团，如羟基、氨基、亚氨基、硫基或羧基以避免它们不希望地参与反应。使用保护基来阻断一些或全部反应性部分并且防止这些基团参与化学反应直至除去所述保护基。在另一个实施方式中，每个保护基是通过不同方式可除去的。在完全不相干的反应条件下切割的保护基满足差异性除去的要求。
在一个实施方式中，通过酸、碱、还原条件(如(例如)氢解)和/或氧化条件除去保护基。基团，如三苯甲基、二甲氧三苯甲基、乙缩醛和叔-丁基二甲基甲硅烷基是酸不稳定的并且用于在存在用通过氢解可除去的Cbz基团和用碱不稳定的Fmoc基团保护的氨基的情况下保护羧基和羟基反应性部分。在存在用酸不稳定基团，如叔-丁基氨基甲酸酯，或者用酸和碱稳定但水解可除去的氨基甲酸酯阻断的胺的情况下，用碱不稳定基团，如(但不限于)甲基、乙基和乙酰基阻断羧酸和羟基反应性部分。
在一个实施方式中，用水解可除去的保护基，如苯甲基阻断羧酸和羟基反应性部分，而用碱不稳定基团，如Fmoc阻断能够与酸形成氢键的胺基。通过转化为如本文中举例说明的简单的酯化合物，包括转化为烷基酯来保护羧酸反应性部分，或者用氧化-可除去的保护基，如2,4-二甲氧基苯甲基阻断，同时用氟化物不稳定的甲硅烷基氨基甲酸酯阻断共存的氨基。
烯丙基封端基团在存在酸-和碱-保护基的情况下是有用的，因为前者是稳定的并随后通过金属或pi-酸催化剂除去。例如，在存在酸不稳定的叔-丁基氨基甲酸酯或者碱-不稳定的乙酸酯胺保护基的情况下，通过钯-催化的反应使烯丙基-阻断的羧酸脱保护。另一种形式的保护基是化合物或中间产物所连接的树脂。只要残基连接至树脂，则官能团被阻断且不反应。一旦从树脂释放，则官能团可用于反应。
通常，阻断/保护基可以选自：
其它保护基以及适用于保护基的产生和它们的除去的技术的详细说明描述于Greene&Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley&Sons,NewYork,NY,1999和Kocienski,Protective Groups,Thieme Verlag,New York,NY,1994，对于该公开内容，以上文献作为参考并入本文。
核酸抑制剂
在一些实施方式中，所述抑制剂是核酸。在多个实施方式中，所述抑制剂是siRNA、miRNA、shRNA或反义分子，其抑制ACSS2。在一个实施方式中，所述核酸包括启动子/调控序列，从而所述核酸能够指导抑制剂核酸的表达。因此，本发明涵盖了用于将外源DNA引入细胞，并伴随着所述外源DNA在所述细胞中的表达的表达载体和方法，如(例如)Sambrook等人(2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork)中和Ausubel等人(1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York)中以及本文其它处所述的那些。
在本发明的另一个方面，可以通过使ACSS2失活和/或多价螯合ACSS2来抑制ACSS2。照此，可以通过使用反式显性负性突变体来完成ACSS2活性的抑制。
在一个实施方式中，将siRNA用于降低ACSS2蛋白的水平。RNA干扰(RNAi)是其中双-链RNA(dsRNA)向广泛的生物和细胞类型中的引入导致互补mRNA降解的现象。在细胞中，通过被称为Dicer的核糖核酸酶将长dsRNA切割成短的21-25个核苷酸的小干扰RNA或siRNA。随后，将siRNA与蛋白组分组装成RNA-诱导的沉默复合体(RISC)，其在该过程中解旋。然后，将激活的RISC通过siRNA反义链和mRNA之间的碱基配对相互作用结合至互补转录本。将结合的mRNA切割，并且mRNA的序列特异性降解导致了基因沉默。参见，例如，美国专利No.6,506,559；Fire等人,1998,Nature 391(19):306-311；Timmons等人,1998,Nature395:854；Montgomery等人,1998,TIG 14(7):255-258；David R.Engelke主编,RNAInterference(RNAi)Nuts&Bolts of RNAi Technology,DNA Press,Eagleville,PA(2003)；和Gregory J.Hannon主编,RNAi A Guide to Gene Silencing,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2003)。Soutschek等人(2004,Nature432:173-178)描述了对辅助静脉内全身递送的siRNA的化学修饰。siRNA的优化包括对整体G/C含量、末端C/T含量、Tm和3'悬突的核苷酸含量的考虑。参见，例如，Schwartz等人,2003,Cell,115:199-208和Khvorova等人,2003,Cell 115:209-216。因此，本发明还包括使用RNAi技术降低ACSS2水平的方法。
在另一个方面，本发明包括包含siRNA或反义核酸的载体。在一个实施方式中，所述siRNA或反义多核苷酸能够抑制靶标多肽的表达，其中所述靶标多肽为ACSS2。所期望的多核苷酸向载体的掺入以及载体的选择在本领域中是熟知的，如(例如)Sambrook等人(2012)和Ausubel等人(1997)以及本文其它处所述。
在某些实施方式中，本文所述的表达载体编码短发夹RNA(shRNA)抑制剂。shRNA抑制剂在本领域中是熟知的并且针对靶标的mRNA，借此降低了所述靶标的表达。在某些实施方式中，通过细胞表达所编码的shRNA，然后加工成siRNA。例如，在某些情况下，细胞具有切割shRNA以形成siRNA的天然酶(例如，dicer)。
可以将siRNA、shRNA或反义核酸克隆到如在本文其它地方所述的一些类型的载体中。对于siRNA或反义多核苷酸的表达，每个启动子中的至少一个模块(module)起作用以定位用于RNA合成的起始位点。
为了评价siRNA、shRNA或反义核酸的表达，要引入到细胞中的表达载体还可以含有可选择标志物基因或报告基因或两者，以有利于从试图使用病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴别和选择出表达细胞。在其它实施方式中，所述可选择标志物可以携带在单独的DNA片段上并在共转染程序中使用。可选择标志物和报告基因两者均可以侧接适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标志物在本领域中是已知的并且包括(例如)抗生素-抗性基因，如新霉素抗性等。
因此，在另一个方面，本发明涉及载体，其包含本发明的核苷酸序列或者本发明的构建体。载体的选择将取决于其中它随后将引入的宿主细胞。在具体的实施方式中，本发明所述的载体为表达载体。适合的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞。在具体的实施方式中，所述表达载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物细胞载体。原核生物-和/或真核生物-载体基系统可以用于和本发明一起使用以产生多核苷酸或者它们的同源多肽。众多这类系统是可商购的和广泛可用的。
此外，可以以病毒载体的形式向细胞提供所述表达载体。病毒载体技术在本领域中是熟知的并且(例如)在Sambrook等人(2012)中和在Ausubel等人(1997)中并且在其它病毒学和分子生物学手册中有描述。作为载体有用的病毒包括(但不限于)反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般地，适合的载体含有在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择标志物。(参见，例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利No.6,326,193。
通过说明，其中引入核酸序列的载体可以是质粒，当引入细胞时，它整合或未整合到宿主细胞的基因组中。其中可以***本发明所述的核苷酸序列或者本发明所述的基因构建体的载体的说明性的非限制性实例包括用于在真核生物细胞中表达的tet-on诱导型载体。
可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得载体(Sambrook等人,2012)。在具体的实施方式中，所述载体是用于转化动物细胞的载体。
在一个实施方式中，重组表达载体还可以含有核酸分子，其编码本文其它处所述的本发明的肽或拟肽抑制剂。
启动子可以是与基因或多核苷酸序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于所述编码段和/或外显子上游的5'非编码序列获得。这种启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与多核苷酸序列天然结合的增强子，其位于所述序列的下游或上游。作为另外一种选择，通过将编码多核苷酸段置于重组或异源启动子的控制之下将获得某些优势，所述启动子是指在其天然环境中通常不与所述多核苷酸序列结合的启动子。重组或异源增强子还表示在其天然环境中通常不与所述多核苷酸序列结合的增强子。这些启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，和分离自任何其它原核、病毒或真核细胞的启动子或增强子，和非“天然存在的”启动子或增强子，即，含有不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变的启动子或增强子。除通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以结合本文所公开的组合物，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR，产生序列(美国专利4,683,202、美国专利5,928,906)。此外，考虑还可以使用在非核细胞器，如线粒体、叶绿体等内指导序列的转录和/或表达的控制序列。
天然地，使用在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物中有效指导DNA段的表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员通常已知如何使用启动子、增强子和细胞类型的组合来用于蛋白表达，例如，参见Sambrook等人(2012)。所使用的启动子可以是组成型的，组织-特异的、诱导型的和/或在适当条件下有用的以指导所引入的DNA段的高水平表达，如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。所述启动子可以是异源的或内源的。
重组表达载体还可以含有可选择标志物基因，其有利于转化或转染的宿主细胞的选择。适合的可选择标志物基因是编码蛋白，如赋予对某些药物的抗性的G418和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光虫荧光素酶或免疫球蛋白或其部分，如免疫球蛋白的Fc部分，例如，IgG的基因。可以在来自所关心的核酸的单独的载体上引入可选择标志物。
在siRNA多核苷酸产生后，技术人员将理解siRNA多核苷酸将具有可以修饰以改善作为治疗化合物的siRNA的某些特征。因此，还可以通过对其进行修饰以包括硫代磷酸酯或其它键、膦酸甲酯、砜、硫酸酯、羰游基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等来设计siRNA多核苷酸以耐受降解(参见，例如，Agrwal等人,1987,Tetrahedron Lett.28:3539-3542；Stec等人,1985Tetrahedron Lett.26:2191-2194；Moody等人,1989Nucleic AcidsRes.12:4769-4782；Eckstein,1989Trends Biol.Sci.14:97-100；Stein,In:Oligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of Gene Expression,Cohen主编,Macmillan Press,London,97-117页(1989))。
还可以修饰任何多核苷酸以提高其体内稳定性。可能的修饰包括(但不限于)在5'和/或3'端添加侧接序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2'O-甲基，而不是磷酸二酯键；和/或包含非常规碱基，如肌苷、Q核苷(queosine)和怀丁苷等以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基-、甲基-、硫代-和其它修饰形式。
在本发明的一个实施方式中，将通过质粒载体表达的反义核酸序列用于抑制ACSS2蛋白表达。将反义表达载体用于转染哺乳动物细胞或哺乳动物本身，借此导致ACSS2的内源表达降低。
反义分子和它们用于抑制基因表达的使用在本领域中是熟知的(参见，例如，Cohen,1989,In:Oligodeoxyribonucleotides,Antisense Inhibitors of GeneExpression,CRC Press)。如在本文其它处定义的术语，反义核酸是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub,1990,Scientific American 262:40)。在细胞中，反义核酸杂交至相应mRNA，从而形成双链分子，借此抑制基因的翻译。
反义方法抑制基因翻译的使用在本领域中是已知的，并且描述于(例如)Marcus-Sakura(1988,Anal.Biochem.172:289)。可以使用编码反义分子的DNA，通过基因表达向细胞提供这些反义分子，如Inoue,1993,美国专利No.5,190,931所教导的。
作为另外一种选择，可以通过合成制备本发明的反义分子，然后向细胞提供。在一个实施方式中，所述反义寡聚物在约10至约30个核苷酸之间。在一个实施方式中，所述反义寡聚物为约15个核苷酸。在一个实施方式中，约10至约30个核苷酸的反义寡聚物是容易合成的并将其引入靶细胞。通过本发明所考虑的合成反义分子包括本领域中已知的寡核苷酸衍生物，与未修饰的寡核苷酸相比，其具有改善的生物活性(参见美国专利No.5,023,243)。
在本发明的一个实施方式中，核糖酶用于抑制ACSS2蛋白的表达。可以通过将靶标序列引入基本的核糖酶结构中来设计用于抑制靶标分子表达的核糖酶，所述靶标序列(例如)与编码ACSS2的mRNA序列是互补的。可以使用可商购的试剂(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)合成靶向ACSS2的核糖酶，或者可以从编码它们的DNA通过基因表达它们。
在一个实施方式中，ACSS2的抑制剂可以包含CRISPR-Cas系统的一种或多种组分。CRISPR法使用了CRISPR-关联(Cas)的核酸酶，其与作为向导的小RNA(gRNA)复合，从而以序列特异性的方式切割任何基因组位置中前间区序列邻近基序(PAM)上游的DNA。CRISPR可以使用被称为crRNA和tracrRNA的单独的向导RNA。这两种不同的RNA已组合成单个RNA，从而使得位点-特异性哺乳动物基因组能够切割通过短向导RNA的设计。可以通过已知方法合成Cas和向导RNA(gRNA)。Cas/向导-RNA(gRNA)使用非特异性DNA切割蛋白Cas和寡聚RNA以杂交至靶标并招募Cas/gRNA复合物。在一个实施方式中，靶向编码ACSS2的基因的向导RNA(gRNA)和CRISPR-关联(Cas)的肽形成复合物以在靶标基因内引起突变。在一个实施方式中，所述抑制剂包括gRNA或者编码gRNA的核酸分子。在一个实施方式中，所述抑制剂包括Cas肽或者编码Cas肽的核酸分子。
多肽抑制剂
在一些实施方式中，所述抑制剂是抑制ACSS2的肽或多肽抑制剂。例如，在一个实施方式中，本发明所述的肽抑制剂直接通过结合至ACSS2，借此防止ACSS2的正常功能活性，从而抑制ACSS2。在另一个实施方式中，本发明所述的肽抑制剂通过与内源ACSS2竞争来抑制ACSS2。在另一个实施方式中，本发明所述的肽抑制剂通过作为反式显性负性突变体起作用来抑制ACSS2的活性。
根据本发明的肽和多肽的变体可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基替换的变体，并且该替换的氨基酸残基可以是或可以不是通过遗传密码编码的氨基酸残基，(ii)其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基，例如，通过取代基团的连接所修饰的残基的变体，(iii)其中所述多肽是本发明所述的多肽的可变剪接变体的变体，(iv)所述多肽的片段和/或(v)其中所述多肽与另一个多肽，如前导或分泌序列或者用于纯化(例如，His-标签)或者用于检测(例如，Sv5表位标签)的序列融合的变体。所述片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)所产生的多肽。变体可以翻译后修饰或者化学修饰。根据本文的教导内容，这些变体被认为在本领域技术人员的范围内。
抗体抑制剂
在一些实施方式中，所述抑制剂是抗体或抗体片段。在一些实施方式中，所述抑制剂是特异性结合至ACSS2的抗体或抗体片段。也就是说，所述抗体可以抑制ACSS2以提供有益作用。
所述抗体可以是完整单克隆或多克隆抗体，和免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、人源化抗体、基因工程单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)或嵌合抗体，例如，含有鼠科抗体的结合特异性，但是其中剩余部分是人源的抗体。可以使用本领域技术人员已知的方法制备抗体，包括单克隆和多克隆抗体、人源化抗体、片段和嵌合体。
所述抗体可以包含重链和轻链互补决定区(“CDR”)集，其分别***到为CDR提供支持并且限定CDR相对于彼此的空间关系的重链和轻链框架(“FR”)集之间。CDR集可以含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N-末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包括6个CDR，其包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集。
所述抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是(例如)IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包括VL区和CL区。
所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体。所述抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲合成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。所述人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，其结合具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的所期望的抗原。
所述抗体可以是双重特异性抗体。所述双重特异性抗体可以结合两个抗原或者与两个抗原反应，例如，如以下更详细地描述的抗原中的两个。所述双重特异性抗体可以由本文所述的抗体中的两个的片段组成，借此使得所述双重特异性抗体能够结合两个所期望的靶标分子或与两个所期望的靶标分子反应，所述靶标分子可以包括如以下更详细地描述的抗原、配体(包括用于受体的配体)、受体(包括受体上的配体-结合位点)、配体-受体复合物和标志物。双重特异性抗体可以包含特异性结合至第一靶标的第一抗原结合位点和特异性结合至第二靶标的第二抗原结合位点，其具有特别有利的性质，如可产生性、稳定性、结合亲合力、生物活性、某些T细胞的特异性靶向、靶向效率和低毒性。在一些情况下，存在双重特异性抗体，其中所述双重特异性抗体以高亲合力结合至第一靶标，而以低亲合力结合至第二靶标。在其它实例中，存在双重特异性抗体，其中所述双重特异性抗体以低亲合力结合至第一靶标，而以高亲合力结合至第二靶标。在其它实例中，存在双重特异性抗体，其中所述双重特异性抗体以所期望的亲合力结合至第一靶标，且以所期望的亲合力结合至第二靶标。
可以使用完整多肽或含有所关心的免疫性抗原的片段制备抗体。用于使动物免疫的多肽或寡肽可以得自RNA的翻译或化学合成，并且如果需要，可以结合至载体蛋白。可以化学偶联至肽的适合的载体包括牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白、钥孔血蓝素。然后，偶联的多肽可以用于使动物(例如，小鼠、大鼠或兔)免疫。
组合
在一些实施方式中，本发明所述的组合物包含本文所述的ACSS2抑制剂的组合。在某些实施方式中，包含本文所述的抑制剂的组合的组合物具有累加效果，其中所述组合的整体效果与每种单独的抑制剂的效果之和近似相等。在其它实施方式中，包含本文所述的抑制剂的组合的组合物具有协同作用，其中所述组合的整体效果大于每种单独的抑制剂的效果之和。
在一些实施方式中，本发明所述的组合物包含ACSS2抑制剂和第二治疗剂的组合。例如，在一个实施方式中，所述第二治疗剂包括(但不限于)PTSD治疗、焦虑治疗和物质滥用治疗。
在一些实施方式中，所述第二治疗剂(治疗，therapeutic)是PTSD治疗。示例性的治疗剂包括(但不限于)抗-焦虑治疗、抗抑郁剂和肾上腺素能剂。在一个实施方式中，所述PTSD治疗是疗法治疗。例如，在一个实施方式中，所述PTSD治疗包括精神疗法、行为或认知行为疗法、眼动脱敏再处理(EMDR)集体疗法、经颅磁刺激、深部脑刺激和神经反馈技术以及药物治疗，包括***和d-环丝氨酸。
在一个实施方式中，急诊室或重症监护室中ACSS2抑制剂的施用可以用于PTSD预防。在围创伤期，重新激活的记忆痕迹对于破环是脆弱的，因此ACSS2抑制提供了影响创伤记忆再巩固的潜能。
在一些实施方式中，所述第二治疗剂是物质滥用治疗。例如，在一个实施方式中，物质滥用治疗包括(但不限于)纳曲酮、双硫仑、阿坎酸、托吡酯、尼古丁代替疗法、烟碱样受体拮抗剂、烟碱样受体部分激动剂、舒倍生、左醋美沙朵、双氢可待因、丁丙诺啡、***、***和二氢埃托啡。
包含抑制剂组合的组合物包含处于任何适合比例的各个抑制剂。例如，在一个实施方式中，所述组合物包含1:1比例的两种单独的抑制剂。然而，所述组合不局限于任何特定的比例。而是，涵盖了证明有效的任何比例。
方法
在一些实施方式中，本发明提供了在对其有需要的受试者中抑制ACSS2的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含ACSS2抑制剂的组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了调节受试者中染色质乙酰化的方法。在一个实施方式中，所述染色质乙酰化是组蛋白乙酰化。在一个实施方式中，所述染色质是神经染色质。在一个实施方式中，本发明的方法调节受试者中的神经元可塑性。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的包含ACSS2抑制剂的组合物。在一个实施方式中，ACSS2的抑制剂降低组蛋白乙酰化。
在一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中神经或认知疾病或病症的方法。在一个实施方式中，所述神经或认知疾病或病症是记忆-相关疾病或病症。在一个实施方式中，所述神经或认知疾病或病症是神经精神病学病症。例如，在一个实施方式中，所述神经精神病学病症包括(但不限于)焦虑症、精神病性障碍、情绪病症(情绪障碍)和躯体形式障碍。
示例性的神经或认知疾病或病症包括(但不限于)创伤后应激障碍(PTSD)、双相障碍(躁郁症)、抑郁症、抽动秽语综合症(妥瑞症，Tourette’s Syndrome)、精神***症、强迫症、广泛性焦虑障碍、恐慌症、恐惧症、人格障碍，包括***人格障碍以及涉及记忆困难的其它病症。在一个实施方式中，所述神经或认知疾病或病症是PTSD。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于治疗受试者中成瘾或成瘾相关疾病或病症的方法。在一个实施方式中，成瘾包括(但不限于)对以下物质成瘾：酒精、烟草、阿片样物质、镇静剂、安眠剂、抗焦虑药、***、***、***、迷幻剂、吸入剂、苯环利定、冲动控制障碍和行为成瘾。
在一个实施方式中，所述成瘾是酒精成瘾。在一个实施方式中，本发明所述的方法治疗急性和/或慢性酒精引起的记忆减退。
在一个实施方式中，本发明提供了在强化精神疗法(augmented psychotherapy)中用于治疗酒精-相关记忆和环境-诱发的渴求感(环境诱发的渴求感，cue-inducedcraving)的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的包含ACSS2抑制剂的组合物。在一个实施方式中，ACSS2的抑制剂降低组蛋白乙酰化。
在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的降低或抑制ACSS2的表达或活性的组合物。
本领域技术人员将理解可以单独或以任意组合施用本发明所述的抑制剂。此外，可以在时间意义上单独或以任意组合施用本发明所述的抑制剂，其中它们可以同时，或者在彼此之前和/或之后施用。本领域的技术人员将理解，基于本文所提供的发明公开，本发明所述的抑制剂组合物可以用于预防或治疗自身免疫疾病或病症，或者抑制剂组合物可以单独或与另一种调节剂以任意组合使用以影响治疗结果。在多个实施方式中，本文所述的本发明的任何抑制剂组合物可以单独或者和与自身免疫疾病有关的其它分子的其它调节剂组合施用。
在一个实施方式中，本发明包括方法，所述方法包括施用本文所述的抑制剂的组合。在某些实施方式中，所述方法具有累加效果，其中施用抑制剂的组合的整体效果与施用每种单独的抑制剂的效果之和近似相等。在其它实施方式中，所述方法具有协同效果，其中施用抑制剂的组合的整体效果大于施用每种单独的抑制剂的效果之和。
所述方法包括以任何适合的比例施用抑制剂的组合。例如，在一个实施方式中，所述方法包括以1:1的比例施用两种单独的抑制剂。然而，所述方法不局限于任何特定比例。而是，涵盖了证明有效的任何比例。
药物组合物和制剂
本发明还涵盖了本发明的药物组合物或其盐用于实践本发明所述方法的应用。这种药物组合物可以由处于适合于施用于受试者的形式的至少一种本发明的调节剂(例如，抑制剂)组合物或其盐组成，或者所述药物组合物可以包含至少一种本发明的调节剂(例如，抑制剂)组合物或其盐和一种或多种药物可用的载体、一种或多种其它成分或者这些的一些组合。本发明所述的化合物可以以生理学可用的盐的形式(如与本领域中熟知的生理学可用的阳离子或者阴离子结合)存在于药物组合物中。
在一个实施方式中，可以施用用于实践本发明所述的方法的药物组合物以递送1ng/kg/天至100mg/kg/天的剂量。在另一个实施方式中，可以施用用于实践本发明的药物组合物以递送1ng/kg/天至500mg/kg/天的剂量。
在本发明的药物组合物中，所述活性成分、所述药物可用的载体和任何其它成分的相对量将基于所治疗的受试者的身份(特性，identity)、体型和状况并且还基于施用所述组合物的途径而改变。举例来说，所述组合物可以包括0.1％至100％(w/w)之间的活性成分。
可以适合地开发用于口服、直肠、***、肠胃外、局部、肺部、鼻内、口腔、眼部施用或另一种施用途径的在本发明所述的方法中有用的药物组合物。在本发明所述的方法内有用的组合物可以直接施用于皮肤或者哺乳动物的任何其它组织。其它所考虑的制剂包括脂质体制剂、包含活性成分的重新包封的红细胞和基于免疫学的制剂。施用途径对于技术人员来说将是显而易见的并且将取决于多种因素，其包括要治疗的疾病的类型和严重程度，要治疗的动物或人受试者的类型和年龄等。
可以通过任何药学领域中已知的或此后发展的方法制备本文所述的药物组合物的制剂。一般地，这些制备方法包括使活性成分与载体或一种或多种其它辅助成分结合的步骤，然后，如有必要或者如果希望，将所述产物成形或包装成所期望的单剂量或多剂量单元。
如本文所使用的，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的单个的量(离散的量，discrete amount)。所述活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量或者该剂量的便捷的部分(convenient fraction)，如(例如)该剂量的一半或三分之一。单位剂量形式可以用于单一日剂量或者多个日剂量(例如，每天约1至4次或更多次)之一。当使用多个日剂量时，对于每个剂量，单位剂量形式可以是相同或不同的。
在一个实施方式中，使用一种或多种药物可用的赋形剂或载体配制本发明所述的组合物。在一个实施方式中，本发明所述的药物组合物包含治疗有效量的本发明所述的化合物或结合物和药物可用的载体。有用的药物可用的载体包括(但不限于)甘油、水、盐水、乙醇及其它药物可用的盐溶液，如磷酸盐和有机酸盐。这些及其它药物可用的载体的实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences(1991,Mack Publication Co.,NewJersey)。
所述载体可以是含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和植物油的溶剂或分散媒介。可以(例如)通过使用涂层，如卵磷脂，就分散系来说通过维持所需的粒径，和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯(parabens)、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现对微生物作用的防止。在多数情况下，在所述组合物中包含等张剂，例如，糖、氯化钠或多元醇，如甘露糖醇和山梨糖醇。可以通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝或明胶来导致可注射组合物的延长吸收。在一个实施方式中，药物可用的载体不是单独的DMSO。
可以与常规赋形剂，即本领域已知的适合于口服、***、肠胃外、鼻部、静脉内、皮下、肠内或任何其它适合的施用形式的药物可用的有机或无机载体物质混合使用制剂。所述药物制剂可以灭菌并且如果需要，可以与助剂，例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压缓冲剂的盐、着色剂、调味剂和/或芳香物质等混合。当需要时，它们还可以与其它活性剂，例如，其它止痛剂混合。
如本文所使用的，“其它成分”包括(但不限于)以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；粘结剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学可降解的组成(组分，compositions)，如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；助悬剂；分散剂或润湿剂；乳化剂，镇痛剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药物可用的聚合物或疏水性材料。可以包含在本发明的药物组合物中的其它“其它成分”在本领域中是已知的并且描述于，例如，Genaro主编(1985,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA)，该文献作为参考并入本文。
本发明所述的组合物可以包含所述组合物总重量的约0.005％至2.0％的防腐剂。在暴露于环境中的污染物的情况下，防腐剂用于防止腐败。根据本发明有用的防腐剂的实例包括(但不限于)选自苯甲醇、山梨酸、对羟苯甲酸酯、咪唑烷基脲(imidurea)及其组合的那些。示例性的防腐剂是约0.5％至2.0％的苯甲醇和0.05％至0.5％的山梨酸的组合。
在一个实施方式中，所述组合物包括抑制化合物降解的抗-氧化剂和螯合剂。用于一些化合物的示例性抗氧化剂包括处于约0.01％至0.3％的优选的范围内的BHT、BHA、α-生育酚和抗坏血酸。在一个实施方式中，所述抗氧化剂是处于所述组合物总重量的按重量计的0.03％至0.1％的范围内的BHT。在一个实施方式中，所述螯合剂以所述组合物总重量的按重量计的0.01％至0.5％的量存在。示例性的螯合剂包括在约0.01％至0.20％的重量范围内的乙二胺四乙酸盐(例如，乙二胺四乙酸二钠)和柠檬酸。在一个实施方式中，所述螯合剂在所述组合物总重量的按重量计的0.02％至0.10％的范围内。所述螯合剂对于螯合所述组合物中对所述制剂的货架期可能有害的金属离子是有用的。尽管BHT和乙二胺四乙酸二钠分别是示例性的抗氧化剂和螯合剂，但是对于一些化合物，其它适合的和等价的抗氧化剂和螯合剂因此可以替代，如本领域技术人员将已知的。
可以使用常规方法制备液体混悬液，从而在水性或油性媒介物中实现活性成分的混悬液。水性媒介物包括(例如)水和等渗盐水。油性媒介物包括(例如)杏仁油、油性酯、乙醇、植物油，如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏植物油和矿物油，如液体石蜡。液体混悬液还可以包含一种或多种其它成分，其包括(但不限于)助悬剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、镇痛剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调味剂、着色剂和甜味剂。油性混悬液还可以包含增稠剂。已知的助悬剂包括(但不限于)山梨糖醇糖浆、氢化可食用脂、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶、***树胶和纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。已知的分散剂或润湿剂包括(但不限于)天然存在的磷脂，如卵磷脂、环氧烷与脂肪酸、与长链脂肪醇、与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯或者与来源于脂肪酸和已糖醇酐的偏酯的缩合产物(分别例如，聚乙二醇硬脂酸酯(polyoxyethylene stearate)、十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯(polyoxyethylene sorbitolmonooleate)和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate))。已知的乳化剂包括(但不限于)卵磷脂和***胶。已知的防腐剂包括(但不限于)对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、抗坏血酸和山梨酸。已知的甜味剂包括(例如)甘油、丙二醇、山梨糖醇、蔗糖和糖精。已知的用于油性混悬液的增稠剂包括(例如)蜂蜡、固体石蜡和鲸蜡醇。
可以以与液体混悬液基本相同的方式在水性或油性溶剂中制备活性成分的液体溶液，其主要差异在于所述活性成分是溶解的，而不是在溶剂中混悬的。如本文所使用的，“油性”液体是包含含碳液体分子并且显示出小于水的极性性质的液体。本发明的药物组合物的液体溶液可以包含对于液体悬浮液所述的每种组分，应理解助悬剂将不必需辅助活性成分在溶剂中的溶解。水性溶剂包括(例如)水和等渗盐水。油性溶剂包括(例如)杏仁油、油性酯、乙醇、植物油，如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏植物油和矿物油，如液体石蜡。
可以使用已知的方法制备本发明的药物制剂的粉末和颗粒制剂。这些制剂可以直接施用于受试者，用于(例如)形成片剂，填充胶囊剂，或者通过向其中添加水性或油性媒介物来制备水性或油性混悬液或溶液。这些制剂中的每一种还可以包含一种或多种分散剂或润湿剂、助悬剂和防腐剂。其它赋形剂，如填充剂和甜味剂、调味剂或着色剂也可以包含在这些制剂中。
还可以以水包油乳剂或油包水乳剂的形式制备、包装或出售本发明的药物组合物。所述油相可以是植物油，如橄榄油或花生油、矿物油，如液体石蜡，或者这些的组合。这些组合物还可以包含一种或多种乳化剂，如天然存在的树胶，如***树胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，如大豆或卵磷脂磷脂、来源于脂肪酸和已糖醇酐的组合的酯或偏酯，如单油酸脱水山梨糖醇酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。这些乳剂还可以含有其它成分，包括(例如)甜味剂或调味剂。
用于使用化学组合物浸渍或涂覆材料的方法在本领域中是已知的并且包括(但不限于)将化学组合物沉积或结合在表面上的方法，在材料合成期间将化学组合物掺入到材料结构中的方法(即，如使用生理学可降解的材料)以及在使用或不使用后续干燥的情况下，将水性或油性溶液或混悬液吸收到吸收性材料中的方法。
施用方案可以影响有效量的构成。可以在疾病诊断之前或之后将治疗制剂施用于受试者。此外，可以每天或顺序施用几个划分剂量以及交错剂量(staggered dosage)，或者可以连续输注所述剂量，或者可以弹丸注射(推注，bolus injection)所述剂量。此外，如治疗或预防情况的紧急性所指示的，可以按比例升高或降低治疗制剂的剂量。
可以使用已知程序，以对于预防或治疗疾病有效的剂量和时间段来进行本发明所述的组合物向受试者，例如，哺乳动物，包括人的施用。实现治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可以根据以下因素而改变，如所使用的具体化合物的活性；施用时间；化合物的***速率；治疗持续时间；与化合物组合使用的其它药物、化合物或材料；要治疗的受试者的疾病或病症的状态、年龄、性别、体重、状况、一般健康情况和先前病史以及医学领域中熟知的类似因素。可以调节剂量方案以提供最优的治疗反应。例如，可以每天施用几个划分剂量，或者可以如治疗情况的紧急性所指示的，按比例降低剂量。本发明的治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例为约1至5,000mg/kg体重/天。本领域的技术人员将能够研究相关因素并对于治疗化合物的有效量做出决定而无需过度实验。
可以以每天几次的频率向受试者施用所述化合物，或者它可以不太频繁施用，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或者更不频繁，如每几个月一次或甚至每年一次或更少。应理解在非限制性实例中，可以每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天施用每天剂量施用的化合物的量。例如，通过每隔一天施用，可以在星期一起始5mg每天的剂量，而在星期三施用第一个后续5mg每天的剂量，在星期五施用第二个后续5mg每天的剂量，并以此类推。所述剂量的频率对于技术人员来说将是显而易见的并且将取决于多种因素，如(但不限于)要治疗的疾病的类型和严重程度，动物的类型和年龄等。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以获得对于对特定受试者、组合物和施用形式实现所期望的治疗反应有效，而对受试者无毒的活性成分的量。
具有本领域常规技术的医生，例如，医师或兽医可以容易地确定和规定所需的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以小于实现所期望的治疗效果所需的水平的水平来起始在所述药物组合物中所使用的本发明所述的化合物的剂量，并逐渐提高所述剂量直至实现所期望的效果。
在具体的实施方式中，特别有利的是以剂量单位形式配制所述化合物以便于剂量的施用和均一性。如本文所使用的剂量单位形式是指适合作为要治疗的受试者的单位剂量的物理分散单元(physically discrete units)；每个单元含有与所需的药物媒介物结合的计算以产生所期望的治疗效果的预定量的治疗化合物。通过并且直接基于(a)治疗化合物的独特特征以及要实现的具体治疗效果，和(b)本领域中混合/配制用于受试者中疾病治疗的这些治疗化合物的固有限制确定本发明的剂量单位形式。
在一个实施方式中，以范围在每天1至5次或更多的剂量向受试者施用本发明所述的组合物。在另一个实施方式中，以包括(但不限于)每天、每两天、每三天1次至每周1次和每两周1次的剂量范围向受试者施用本发明所述的组合物。对于本领域技术人员将显而易见的是基于多种因素，包括(但不限于)年龄、要治疗的疾病或病症、性别、整体健康状况和其它因素，本发明的多种组合的组合物的施用频率将在受试者间是不同的。因此，本发明不应被视为受限于任何具体剂量方案，并且将考虑有关受试者的所有其它因素，通过主治医生确定要施用于任何受试者的确切剂量和组成。
本发明用于施用的化合物可以在以下范围内：约1mg至约10,000mg，约20mg至约9,500mg，约40mg至约9,000mg，约75mg至约8,500mg，约150mg至约7,500mg，约200mg至约7,000mg，约3050mg至约6,000mg，约500mg至约5,000mg，约750mg至约4,000mg，约1mg至约3,000mg，约10mg至约2,500mg，约20mg至约2,000mg，约25mg至约1,500mg，约50mg至约1,000mg，约75mg至约900mg，约100mg至约800mg，约250mg至约750mg，约300mg至约600mg，约400mg至约500mg，以及它们之间的任何和全部完整或部分增量。
在一些实施方式中，本发明的化合物的剂量为约1mg至约2,500mg。在一些实施方式中，在本文所述的组合物中使用的本发明的化合物的剂量为小于约10,000mg，或小于约8,000mg，或小于约6,000mg，或小于约5,000mg，或小于约3,000mg，或小于约2,000mg，或小于约1,000mg，或小于约500mg，或小于约200mg，或小于约50mg。类似地，在一些实施方式中，如本文所述的第二化合物(即，用于治疗与本发明所述的组合物所治疗的疾病相同的或另一种疾病的药物)的剂量为小于约1,000mg，或小于约800mg，或小于约600mg，或小于约500mg，或小于约400mg，或小于约300mg，或小于约200mg，或小于约100mg，或小于约50mg，或小于约40mg，或小于约30mg，或小于约25mg，或小于约20mg，或小于约15mg，或小于约10mg，或小于约5mg，或小于约2mg，或小于约1mg，或小于约0.5mg，及其任何和全部完整或部分增量。
在一个实施方式中，本发明涉及包装的药物组合物，其包含容纳单独或与第二药剂组合的治疗有效量的本发明的化合物或结合物的容器；和用于使用所述化合物或结合物来治疗、预防或减少受试者中疾病的一种或多种症状的说明书。
术语“容器”包括用于容纳所述药物组合物的任何容纳器(容器，receptacle)。例如，在一个实施方式中，所述容器是含有所述药物组合物的包装。在其它实施方式中，所述容器不是含有药物组合物的包装，即所述容器是容纳器，如含有包装的药物组合物或未包装的药物组合物以及药物组合物的使用说明书的盒子或小瓶。此外，包装技术在本领域中是熟知的。应理解药物组合物的使用说明书可以包含在含有药物组合物的包装上，并且照此所述说明书与包装产品形成了提高的功能关系。然而，应理解说明书可以含有有关所述化合物发挥其预定功能的能力，例如，治疗或预防受试者中的疾病或者向受试者递送成像剂或诊断剂的信息。
任何本发明所述的组合物的施用途径包括口服、鼻部、肠胃外、舌下、透皮、经粘膜(例如，舌下、舌、(经)口腔和鼻(内))、膀胱内、十二指肠内、胃内、直肠、腹膜内、皮下、肌内、皮内、动脉内、静脉内或者施用。
适合的组合物和剂量形式包括(例如)片剂、胶囊剂、囊片剂(caplets)、丸剂、软胶囊剂(gel caps)、锭剂、分散剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、珠剂、透皮贴片、凝胶剂、粉末剂、颗粒剂、糊剂、糖锭、乳膏剂、膏剂、硬膏剂、洗剂、盘剂(discs)、栓剂、用于鼻部或口腔施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或雾化制剂、用于膀胱内施用的组合物和制剂等。应理解将在本发明中有用的所述制剂和组合物不局限于本文所述的特定制剂和组合物。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述了本发明。除非另作说明，否则仅出于说明的目的提供了这些实施例，并且它们不意欲限制。因此，本发明决不应视为受限于以下实施例，而是应视为涵盖由于本文所提供的教导内容而变得显而易见的任何和所有改变。
在不进行进一步描述的情况下，据信本领域的技术人员可以使用以上描述和以下说明性实施例制备和使用本发明和实践所主张的方法。因此，不应以任何方式将以下工作实施例视为对本发明公开的其余部分的限制。
实施例1：乙酰-CoA合成酶调节组蛋白乙酰化和海马记忆
乙酰辅酶A(乙酰-CoA)的代谢产生与组蛋白乙酰化和基因调控有关，但是该过程的确切机制在很大程度上还是未知的。本文所提供的数据表明代谢酶乙酰-CoA合成酶2(ACSS2)直接在哺乳动物中调控神经元中的组蛋白乙酰化和空间记忆。在神经元细胞培养模型中，在分化的神经元的核中ACSS2增加并定位至组蛋白乙酰化升高的位点附近的上调神经元基因处。ACSS2的减少降低了核乙酰-CoA水平、组蛋白乙酰化和神经元基因群组的响应表达。在成年小鼠中，海马ACSS2表达的减少损害长期空间记忆，它是依赖于组蛋白乙酰化的认知过程。海马中ACSS2的减少还导致通过ACSS2预结合的记忆-相关神经元基因的缺乏性上调(defective upregulation)。这些结果显示了细胞代谢、基因调控和神经可塑性之间的联系，并且在乙酰-CoA在用于组蛋白乙酰化的染色质处的“原位(on-site)”产生和关键神经元基因的转录之间建立了联系。
ACSS2在小鼠海马中大量表达的观察结果(Lein,E.S.等人,2007,Nature,445:168-176)引导我们开始研究ACSS2在神经元组蛋白乙酰化和基因表达中的作用。这些发现支持了以下假设：神经元ACSS2通过ACSS2对染色质的直接结合，在将乙酸代谢与神经元基因调控的联系中具有重要功能，并且鉴别了该机制在海马记忆巩固中的显著作用。
现将描述在这些实验中使用的材料和方法。
小鼠实验。
未使用统计方法来预先确定样本容量；使用通过药理学或基因操纵的相关行为测定的在先实验确定当组容量为至少7-9只动物时，实现了效果。实验是随机化的并且在实验和结果评价期间，研究人员对分组是不知情的。
细胞培养
将CAD细胞(Cath.-a-分化型)在添加有2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)：Ham's F12(1：1)中生长。为了引起神经元分化，将亚汇合的CAD细胞培养物(50-60％)转移至无血清培养基(DMEM：Ham'sF12(1：1)，补充有2mM谷氨酰胺)并在15-cm2培养皿中维持5天。一旦分化，CAD神经元显示出具有神经元特征的形态变化。对于敲低实验，在含有8mg/mL聚凝胺和10％FBS的培养基中，用针对ACL(#TRCN0000055217)或ACSS2(#TRCN0000076124，#TRCN0000076125)设计的慢病毒发夹构建体(TRC系列(TCR collection))感染CAD细胞24小时。然后，将细胞在补充有0.5mg/mL嘌呤霉素的培养基中进行5天选择以获得稳定感染的群体。以20μM的最终浓度，用ACSS2i(1-(2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6-基)-3-(2-甲氧基乙基)脲(DMSO))处理细胞24小时(将单独用DMSO的处理用作对照)。
RNA-seq
为了产生用于RNA-seq的文库，根据生产商的说明，使用Dynabeads mRNA Direct试剂盒(Ambion)提取多聚(A)+RNA。使用ScriptSeq v2RNA-seq文库制备试剂盒(Illumina)，制备错义对照(scrambed control)(称为野生型)、shACL和shACSS2的RNA-seq文库。通过BioAnalyzer(Agilent)和qPCR(Kapa生物系统)评价文库的数量和质量。将多路复用文库(multiplexed libraries)混合并在Illumina NextSeq 500平台上的单个流通槽(lane)上测序(50bp，单端读序)。如下所示：使用bcl2fastq2-v02.14.01.07对NextSeq测序数据进行多路分解(解复用，demultiplexed)，制备用于分析的所有RNA-seq数据。通过RNA-STAR2.3.0.e，使用从iGenome UCSC mm10 FASTQ基因组序列产生的基因组索引mm10，将多路分解的FASTQ进行比对。使用cufflinks-2.2.1(-G参数仅定量已知的特征)和iGenomesmm10 UCSC基因组转录本基因座，将比对的读序定位至基因组特征。从goldenPath UCSCFTP下载小鼠基因组的rRNA、mRNA和tRNA并且从转录本定量中掩盖。定量后，使用pythonpandas library v.0.14.0进行所有数据处理。CAD神经元中的差异表达定义为前10％基因的倍数变化，其大致对应于1.6-倍上调或更高。使用Cuffdiff定义抑制剂和海马ACSS2敲低的体内差异表达。通过评价相对于分别为未处理的和ACSS2i-处理的细胞的两个RNA-seq复制归一化(标准化)的得分，推断CAD细胞分化和抑制剂功能之间的关系(图1G)。对这些取平均值并且放弃任一种条件中|z|<0.5的基因。以CAD分化倍数变化升序，对剩余基因的得分作图。通过取敲低中表达损失前20％的基因并将抑制剂-处理的细胞中这些基因的表达与该集以外的随机基因样本相比较来评价趋势和可重复性的统计显著性(曼-惠特尼检验)。
ChIP-seq
将CAD细胞在1％甲醛中固定10min，并且通过将甘氨酸添加至125mM使所述固定淬灭另外5min。通过刮板收获细胞，并在-80℃储存之前在1×PBS中清洗两次。如前所述，进行ChIP(Shah,P.P.等人,2013,Genes Dev.,27:1787–1799)，除了使用Covaris S220超声发生器将染色质剪切至平均大小<500bp。将来自未分化的和分化的CAD神经元的超声处理的染色质的相等等份用于每个免疫沉淀反应，并且将所述量的10％作为输入保存。使用每个样品2,000μg提取物和4μg抗体进行ACSS2 ChIP；使用每个样品500μg提取物和4μg抗体进行所有其它ChIP。使用蛋白A Dynabeads(Life Technologies)进行免疫沉淀。使用NEBNextUltra文库制备程序制备测序文库，然后通过BioAnalyzer(Agilent)和qPCR(KapaBiosystems)评价质量和数量。在Illumina NextSeq 500平台上进行测序。如下所示，准备了用于分析的所有ChIP-seq数据：使用bcl2fastq对NextSeq序列数据多路分解。使用bowtie2.2.1，将所有读序与mm9或mm10参考基因组进行比对。每个读序允许一次比对，并且在种子区(seed region)(-N1-k1)中允许一个错配。使用来自subread 1.4.6软件包的featureCounts，将读序在固定窗口中或者在iGenome mm10 UCSC注释中所提供的基因中列表。将CAD细胞ACSS2 ChIP-seq数据对输入对照归一化，而所有组蛋白乙酰化ChIP-seq数据是减去H3的。图9I中的图是为确定未分化的和分化的CAD细胞中的表达(回归量)与分化的CAD细胞中ACSS2的富集(目标量)之间的关系所实施的多重线性回归的结果。通过对于ACSS2结合的倾向性，将这种关系用于对图中的负相关空间涂色。对于体内ChIP，将来自两只动物混合的海马组织切碎并在室温下用甲醛(1％最终浓度)交联15min，随后在4℃用甘氨酸淬灭另外10min。为了产生单细胞混悬液，用冰冷的PBS清洗样品一次，并通过22G针头10次均质化。以对于体外ChIP所述的相同方式进行后续步骤。以控制在1％的错误发现率(FDR)，使用MACS v2.1.0调用体内ChIP峰(ACSS2(T)、H3K9ac、CBP-GSM1629373和H3K27ac-GSM1629397)。通过调节至数百万个比对标签并减去背景来评价峰得分。类似地，归一化轨道，并以最大值打开窗口功能(maximum value windowing function)，以5个像素平滑(体外ChIP-seq)或者使用缺省参数(体内ChIP-seq)，使用UCSC基因组浏览器显示轨道。图3B中的文氏图(Venn diagram)显示了在它们最近的TSS的1kb内具有ChIP-seq峰的基因(官方基因符号)的重叠。由于CBP结合至TSS 1kb内的少量基因，因此图3E和图11B中的文氏图显示了分配给整个ChIP-seq峰集的重叠的靶标基因集(RefSeq转录本)。通过对于饲养笼对照小鼠中的log2-转化的表达值(DESeq文库-大小调整的重复实验平均值)分类基因，然后对于在1kb距离内最接近其TSS的峰(使所有具有更远的峰的基因的得分为零)，对于每个基因显示ChIP-seq AUC(RPM-调整的ChIP减去RPM-调整的背景，长度调整的)，产生了相对于ChIP分析的体内mRNA表达(图3C)。通过TSS附近(1kb内)的峰的存在推断基因靶标。为了鉴别富集基序(图3F)，将分化的CAD细胞中上调的体内ACSS2峰靶标基因(不考虑与最近的TSS的距离)与使用HOMER选自基因-富集区的具有相同大小的区域(峰大小固定为300bp)的背景集相比较。对于在三分之一或更高的靶标峰存在且相对于基因-富集背景具有十倍或更高的富集的那些过滤所发现的基序。为了评价ACSS2和组蛋白乙酰化的重叠(图7F，图7G)，过滤ACSS2峰，从而仅包括它们最近的靶标基因上游的那些。对于类似地过滤的来自相同细胞的H3K9ac、H4K5ac和H4K12ac以及皮层H3K27ac的峰评价下游乙酰化。对于体内分析(图3B)，对它们最近的TSS的1kb内的ACSS2或H3K9ac峰的基因靶标检查重叠。通过在TSS周围采取20-kb窗并测量输入-调整的ChIP-seq信号，评价了由于诱导基因或抑制剂-敏感基因处的分化(图3D，图7P)所造成的乙酰化模式。使用CEAS(缺省参数，使用TSS和TES周围1-10kb窗)，通过与ENCODE的常规重复峰比较小鼠前脑中的H3K9ac(登录号ENCSR369RBO)验证了H3K9ac数据(图11A)。对H3K9ac(NCBI GEO：GSE82643)和H3K27ac(GSE82428)进行了其它比较，从而与输入(GSE82659)进行对比以控制超声处理效率。使用bowtie2(参数-k 1-N1-局部)，将皮层H3K27ac(NCBI GEO：GSM1629397)和CBP(GSM1629373)以及相应输入(GSM1629381)进行比对，并且使用MACS2(输入对照，FDR控制在1％)调用峰(图3E，图11B)。通过在饲养笼对照小鼠中，在ACSS2单独，H3K9ac单独，ACSS2+H3K9ac或者两者皆不靶向的基因处的表达的箱形图证明了ACSS2和组蛋白乙酰化靶向基因表达的体内综合影响(图3D)。仅考虑在启动子处(1kb的距离)被ACSS2结合的基因。
乙酰-CoA定量
为了从分化的CAD神经元中提取和定量乙酰-CoA，将4×106个细胞清洗并在裂解缓冲液中培育30min(10mM Tris pH 8，1mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM DTT)。使核以3,000g离心沉淀成粒5min，并立即在PicoProbe乙酰CoA测定试剂盒(Abcam,ab87546)所提供的乙酰CoA测定缓冲液中再混悬。根据生产商的说明准备乙酰-CoA测定，包括脱蛋白步骤。在96-孔透明底板中进行PicoProbe测定，并且使用Synergy HTX多模式酶标仪(Synergy HTXMulti-Mode Microplate Reader)(BioTek Instruments)定量所得荧光。
免疫印迹
将细胞在含有50mM Tris pH 8.0，0.5mM EDTA，150mM NaCl，1％NP40，1％SDS且添加了蛋白酶抑制剂混合物(Life Technologies，编号78446)的缓冲液中裂解。对于亚细胞分离实验，根据生产商的说明，使用用于培养细胞的亚细胞分离试剂盒(ThermoScientific，编号78840)处理细胞。通过BCA蛋白测定(Life Technologies，编号23227)确定蛋白浓度，并且在免疫共沉淀实验中使用等量的蛋白或者将等量的蛋白直接加载至聚丙烯酰胺凝胶上。使用抗体-结合的蛋白A Dynabeads(Life Technologies)，在含有20mMTris,pH 8.0，137mM NaCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，1％NP-40，10％甘油且具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及12.5U/mL benzonase(广谱核酸酶)(Novagen,70746)的缓冲液中进行内源免疫共沉淀实验。将蛋白或免疫共沉淀洗脱液加载至4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE)并分离。在转移至硝化纤维素膜之后，使用3％BSA在添加了0.1％Tween 20的TBS(TBST)中的溶液在室温下封闭所述膜1小时。将第一抗体在TBST中稀释并在4℃培育过夜。以下列出了第一抗体。用TBST清洗所述膜3次，每次10min，然后与HRP-结合的第二抗体在室温下，在TBST中培育1小时。将所述膜再次清洗3次，并使用Fujifilm LAS-4000成像仪成像。图14-16提供了原始凝胶印迹。
免疫荧光
将细胞在4％PFA在PBS中的溶液中在室温下固定20min。用PBS清洗细胞两次并用0.5％Triton X-100在PBS中的溶液使细胞透性化10min。在清洗两次后，将细胞在10％BSA在PBS中的溶液中在室温下封闭1小时。将细胞与第一抗体在5％BSA在添加了0.1％Tween20的PBS(PBST)中的溶液中在4℃培育过夜。以下列出了抗体。然后，用PBST清洗细胞4次，每次10min，接着与荧光团-结合的第二抗体在室温下，在5％BSA在PBST中的溶液中培育1小时。使用Alexa Fluor 488鬼笔环肽(Thermo A12379)标记F-肌动蛋白。然后，将细胞在PBST中清洗3次，用PBS清洗1次，并与1μg/mL DAPI培育5min。然后，用PBS清洗细胞两次并用ProLong Gold(Invitrogen)封固。使用Nikon Eclipse显微镜观察载玻片并成像。样品间的显微镜背景无变化。
抗体
所使用的抗体为抗-H3(Abcam ab1791)、抗-H3K9ac(Abcam ab4441)、抗-H3K27ac(Abcam ab4729)、抗-H3K122ac(Abcam ab33308)、抗-H4(Millipore 05-858)、抗-H4K5ac(Millipore 39-584)、抗-H4K12ac(Abcam ab1761)、抗-ACSS2(T)(Thermo MA5-145810)、抗-ACSS2(CS)(Cell Signaling 3658)、抗-ACL(Proteintech 15421-1-AP)、抗-α-微管蛋白(Sigma T8328)、抗-GAPDH(Fitzgerald Industries 10R-G109A)、抗-KAT3A/CBP(Abcamab2832)、抗-SNAP25(Abcam ab5666)、抗-突触素(Millipore MAB368)、抗-MAP2 C/D(CellSignaling 8707)、抗-NR4A2(Santa Cruz sc-991)和抗-NeuN(Millipore ABN78)抗体。
病毒载体的颅内注射
用异氟烷气体(1-5％以维持外科平面)使成年小鼠(8+周龄)麻醉并置于立体固定装置内的无菌区。在用必妥碘溶液对皮肤消毒并使用无菌手术设备通过短切口暴露颅骨之前，动物接受布比卡因注射(2.5mg/kg)用于局部麻醉。将人工眼泪应用于眼部以确保充分润滑。使用立体定位和立体定向的钻在颅骨中的目标区域上钻出小孔(约0.5mm)。将充满病毒载体的微型注射器***背海马并在注射后缓慢除去(距前囟AP，-2.0mm；DV，-1.4mm；ML，±1.5mm)。ACSS2敲低载体，AAV2/9.U6.shACSS2.CMV.EGFP；eGFP对照载体，AAV2/9.CMV.EGFP.polyA。所有动物在诱导时作为止痛法接受单一剂量的皮下美洛昔康(5mg/kg)并根据需要，在术后每天接受一个剂量并进行两天。
物***置记忆任务
将物***置记忆程序用于测试空间记忆。该程序由训练期和测试期组成。训练前，每天处理每只小鼠3min，共进行3天。在训练当天，将小鼠置于含有三个不同物体的场地(约1平方英尺)中。所使用的物体为玻璃瓶、金属塔(h×w×l，5×2×2英寸)和塑料圆柱体。使小鼠熟悉在墙壁上具有黑白条纹空间提示的空场地，然后在间隔3min的3个6-min试验中熟悉物体暴露。在试验之间用70％EtOH清洁场地和物体。为了减少偏差，在同一天，在相同场地上，使用物***置的每一种组合对对照和敲低小鼠进行记忆测试(每个研究组n＝10只小鼠)。24小时后，将各个小鼠放回测试期所使用的场地中。对于测试，将物体之一移到场地中的不同位置。使小鼠自由探索5min。使用摄像机记录每个阶段，并且离线评价探索(接近并嗅)每个物体所花费的时间。将所有动物随机分组并在测试前一天预先指定场地和物体以确保每个处理组探索每一种物体配置。
条件化情景恐惧
在发生非条件刺激(US)，1.5-mA连续足部电击之前，将小鼠置于条件反射室(MedAssociates)中5min。将轻微的2-秒，1.5-mA足部电击用作厌恶刺激；这不损害小鼠，但是提供了作为条件反射所必需的瞬间、但惊恐且厌恶的刺激。在该室中保持另外30秒后，使小鼠返回其饲养笼。24小时后，测试小鼠对发生训练的室(情境)的僵直反应。评价连续5分钟内在该室中僵直(除呼吸运动外不动)所花费的时间。
数据可用性
ChIP-seq和RNA-seq数据已在基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)资源库中以SuperSeries登录号GSE76854可用。
现将描述本实验的结果。
ACSS2调控神经元基因表达
使用来源于小鼠儿茶酚胺能细胞的Cath.-a-分化型(CAD)细胞系研究神经元中ACSS2的功能。通过血清剥夺(血清饥饿、去血清)，CAD细胞分化以形成神经元突起并变得易兴奋，这与功能性神经元类似(Qi,Y.等人,1997,J.Neurosci.,17:1217–1225)。免疫荧光显示在未分化的CAD细胞中，内源ACSS2主要是细胞质的(图1A)，但是一旦分化，则主要转变为核的(图1B，图5A)。一旦CAD细胞分化为神经元，则ACSS2的全细胞和细胞核水平提高，然而细胞质ACL表达保持不变(图1C)。在来自小鼠脑的原代海马和皮层神经元中，即使在分离后14天，ACSS2仍主要是核的而ACL主要是细胞质的(图5C，图5D，图5E，图5F)。结论如下：不同于ACL，在神经元分化期间，ACSS2定位至核。
研究了ACSS2在分化的CAD神经元中的典型神经元-特异性蛋白标志物的上调中的作用。ACSS2的分化前敲低降低了核NeuN、活性-调控的Nr4a2和细胞质标志物突触素Map2和Snap25的分化-相关表达，而在ACL中无相关降低(图5G)，这表明ACSS2在神经元分化中具有重要作用。
通过对CAD神经元分化的mRNA测序(mRNA-seq)的转录组分析鉴别了894个上调基因(图7A，图7B，图7C；表1)。基因本体分析显示这些分化-相关基因是神经元-特异性的；基因本体术语包括神经元分化、突触传递、离子转运和神经元突出形态发生(图7E)。发展了蛋白相互作用框架，其产生了以活性-依赖性信号转导和突触可塑性为中心的神经元网络：调钙蛋白1(Calm1)、谷氨酸促离子型受体NMDA型亚基1(Grin1)和肌醇1,4,5-三磷酸受体1型(Itpr1)(图7D)。Calm1在突触可塑性期间通过Ca2+介导对神经元蛋白的控制，包括Ca2+/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II(CaMKII)。通过Grin1，谷氨酸门控离子通道的NMDA受体亚型，并且还通过动员胞内Ca2+储存(它是学习期间突触可塑性潜在的活性-依赖性信号转导中的重要过程)的离子通道Itpr1调控这种Ca2+信号转导。
表1.CAD神经元分化时，上调1.6-倍或更高的基因列表，其对应于diff vsundiff.(分化相对于未分化)的倍数变化的前10％的上调基因。
对于组蛋白乙酰化，HAT酶需要代谢产物乙酰-CoA。为了研究CAD细胞向神经元的分化期间组蛋白的乙酰化，对组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9ac)、H4K5ac和H4K12ac，通过高通量DNA测序(ChIP-seq)实施了染色质免疫沉淀(参见方法)。一旦分化，在上调的神经元基因(例如，在nudix-型基序1(Nudt1))处富集了所有标记(图6F)。整体上，894个上调的神经元基因显示出高于所有其它基因的乙酰化(图6G)。
在细胞分化和RNA-seq之前，使用短发夹RNA(shRNA)降低了ACSS2或ACL的水平(图6H，图6I，图6J，图6K)。在ACSS2敲低细胞中，神经元基因的诱导丢失(Pearson r＝0.15；图1D，图1E)，然而在ACL敲低细胞中，相同基因在转录倍数变化中保留了强相关性(Pearson r＝0.53；图5L)。将分化的野生型细胞中前10％上调的基因划分成五等分位组(图1I)，并且发现ACSS2敲低强烈降低了所有五等分位组中的上调(图1I：绿色柱；P＝7.2×10-252，Wilcoxon秩和检验)。ACL-敲低细胞显示出与野生型细胞相同的上升趋势，这与ACSS2-敲低细胞中的严重缺少相反(图6M；P＝1.1×10-25，Wilcoxon秩和检验)。值得注意地，ACL-敲低细胞显示出较低的全局转录本水平(P＝1.91×10-7，曼-惠特尼U-检验)，这与ACSS2-敲低细胞不同，表明了不太严重的基因组范围的缺少(图6N；P＝0.04，曼-惠特尼U-检验)。因此，ACL对基因表达具有广泛但非特异性的作用，然而ACSS2是CAD细胞向神经元分化时，神经元基因表达程序上调所需的。
此外，使用ACSS2的小-分子特异性抑制剂(ACSS2i)测试了神经元基因表达程序是否需要ACSS2催化活性(Comerford,S.A.等人,2014,Cell,159:1591–1602)。RNA-seq显示了分化-诱导的基因中的减少(图1G)，并且其表达受ACSS2-敲低影响的基因对ACSS2i也是高度敏感的(图6O，P＝1.62×10-6)。
ACSS2向染色质的招募
使用分化的CAD细胞的ChIP-seq研究了ACSS2与染色质的直接结合(参见方法)。两种ACSS2抗体显示了对于基于模型的ChIP-seq(MACS)重叠峰分析(Spearman r＝0.82；图7A)和对于1-kb基因组窗内的全局富集(global enrichment)(Spearman r＝0.73；图7B)两者的强相关性。相对于未分化的CAD细胞，在分化的细胞中，ACSS2的结合(例如，在Nudt1和Tab2(TAK1-结合蛋白2)的启动子处的结合)与组蛋白H3K9ac、H4K5ac和H4K12ac的增加相关(图7C，图7D)。两种基因已与神经退行性病症相联系；Nudt1水解酶使嘌呤核苷三磷酸氧化以防止RNA掺入，而Tab2调控神经元中的信号转导途径(Sardi,S.P.等人,2006,Cell,127:185–197)。基因本体分析显示ACSS2峰近端的基因与神经元分化相联系(图7E)。因此，染色质-相关的神经元基因启动子-近端的ACSS2可以向HAT酶提供局部乙酰-CoA来源。
检验了相对于组蛋白乙酰化的ACSS2结合，并且发现最近的靶标基因上游的80％的ACSS2峰与乙酰化峰重叠或者具有靶标转录起始位点(TSS)下游的乙酰化峰(图7F，图7G)。存在大量(基因组范围内所有ACSS2峰的13-15％)直接重叠的H3和H4乙酰化峰(图7H)。另外，ACSS2峰高与交叉的组蛋白乙酰化峰整体相关(图7I，图7J，图7K)。这种峰高相关性表明H4乙酰化可能对ACSS2-来源的乙酰-CoA反应性最强，具体地，已与衰老期间的缺陷记忆形成相联系的标志物H4K12ac(Peleg,S.等人,2010,Science,328:753–756)。一般地，最富集的ACSS2峰显示出最强的组蛋白乙酰化富集(图7L，图7M，图7N)。
使用从头扫描基序发现，对于ACSS2 ChIP-seq峰研究了通过转录因子结合的ACSS2的推定招募，这表明了对于神经元转录因子所预测的结合序列。最富集的基序是YinYang1(YY1)(图7O；P＝1×10-599)，其招募了两种乙酰-CoA-依赖性HAT酶：CREB-结合蛋白(CBP)和E1A结合蛋白(p300)(17)，这与ACSS2为附近的HAT催化活性提供能量的想法一致。
初始峰分析未鉴别出所有的ACSS2或乙酰化峰(图8A，图8B)，因此分析了基因体富集并且存在其它显著的实例，如Camk2a(图2A)，其编码海马长期增强(LTP)和空间学***比所有基因的平均值高多达3倍(图9A，图9B，图9C，图9D)，并且在ACSS2差异结合中具有最大倍数变化的基因具有最高的组蛋白乙酰化水平(图2C；图9E，图9F，图9G，图9H)。基因本体功能类别富集显示排名靠前的ACSS2-结合和乙酰化基因是神经元-特异性的(图2B)。
在所有诱导的基因，ACSS2结合伴随着组蛋白乙酰化升高(图7P)，并且通过ACSS2i处理，显示出表达降低的299个基因是在组蛋白乙酰化中具有最大分化-相联系的升高的那些(图2D)。总的来说，在分化的CAD细胞中诱导了约9％的先前与神经元分化有关的基因(ND基因，1,315个基因的AmiGO注释集)，并且这些诱导的基因对ACSS2i处理特别敏感(图2E，“诱导的”)。此外，尽管在分化的CAD细胞中整个ND基因类的表达不改变，但是通过ACSS2i处理显著降低了它们的表达(图2E，“ND基因”)。使用多重线性回归分析显示了分化-相关基因的表达变化和ACSS2向染色质的招募之间的相互作用，并且在更高的ACSS2富集(红色)和基因表达升高之间发现了显著的关系(图9I)。整体上，CAD细胞基因组数据表明了分化神经元中的动态ACSS2富集与组蛋白乙酰化升高和神经元基因的转录上调的参与有关。
神经元组蛋白乙酰化中的ACSS2功能
在ACSS2敲低细胞中(图2F；平均Δ＝-0.19±0.03，P＝0.003)和用ACSS2i处理的细胞中(图2F；平均Δ＝-0.25±0.05，P＝0.006)中测量了核乙酰-CoA水平，并且发现乙酰-CoA的水平类似地降低。该发现支持ACSS2酶活力提供核乙酰-CoA的理论。在ACSS2敲低细胞中，转录-相关H3K27ac和H3K9ac的全局组蛋白乙酰化水平降低(图2G，图10A)，并且这些标志物是在海马LTP和长期记忆中具有作用的转录辅激活蛋白CBP和p300的重要底物(18)。ACSS2与乙酰化染色质，具体地H3K9ac、H3K27ac和H4K12ac(图10B)以及与CBP(图2H)免疫共沉淀，表明ACSS2在转录活性基因处结合染色质以提高体内记忆形成期间的组蛋白乙酰化(Wood,M.A.等人,2005,Learn.Mem.,12:111–119；Korzus,E.等人,2004,Neuron,42:961–972；Vecsey,C.G.等人,2007,J.Neurosci.,27:6128–6140)。
考虑到它们对于重要记忆-相关神经元基因的去极化和表达的能力，在原代小鼠海马神经元中检查了ACSS2。ACSS2定位至核(图2I)，并且ACSS2i处理降低了神经元标志物表达和组蛋白乙酰化，但不降低ACSS2水平(图2J，图10C)。ACL的表达未改变(图2J)，表明在海马神经元中的组蛋白乙酰化的调控中，ACL不如ACSS2重要。
使用ChIP-seq，在小鼠海马中体内评价了ACSS2和H3K9ac的染色质结合。海马H3K9ac定位与ENCODE小鼠前脑H3K9ac ChIP-seq强烈相关(Spearman多重相关系数R＝0.67)，其具有类似的峰分布(图11A)。海马ACSS2和H3K9ac对应于基因组-范围和参与记忆的三种典型神经元基因(Arc、Egr2和Nr2f2；图3A，图3B)。另外，ACSS2启动子结合和H3K9ac与海马中的RNA-seq相关(图3C)。发现少量基因是ACSS2-结合的，但不是H3K9ac富集的，它们是沉默的，类似于对于ACSS2或H3K9ac未富集的基因(图3D)。相反，对于H3K9ac富集的基因是活跃转录的，但是对于ACSS2和H3K9ac两者富集的基因大多数是高度表达的(图3D)。
分化的CAD细胞中ACSS2和CBP的物理结合(图2H)与海马中ACSS2和CBP的基因共定位以及H3K27ac相关(来自公开的小鼠皮质CBP和H3K27ac ChIP-seq数据；通过超几何分布检验，ACSS2:CBP重叠P＝3.23×10-16)。整体上，通过H3K27ac共靶向57％的ACSS2-相关基因(图3E)，并且ACSS2和CBP共靶向的基因对于参与突触膜电位的基因本体功能类别富集(图11B，图11C)。海马ACSS2峰处的基序分析显示Nrf1—调控轴突生长的转录因子—预测在45％的ACSS2位点结合(图3F)，从而提出了ACSS2-CBP招募机制。此外，ACSS2i-敏感基因(50％：289个中的145个)在TSS的10kb内具有近端ACSS2(超几何分布分析，P＝7.6986×10-8)，这与转录中染色质-结合的ACSS2的直接作用一致。
ACSS2调节长期记忆储存
通过部分通过表观遗传修饰，具体地组蛋白乙酰化协调的活性-依赖性基因表达变化发生了海马-依赖性空间记忆(Barrett,R.M.等人,2011,Neuropsychopharmacology,36:1545–1556；
为了评价海马-依赖性空间记忆，使用了物体-位置记忆范例(Balderas,I.等人,2008,Learn.Mem.,15:618–624)。动物在训练期间探查了三种不同的物体，并且在一个物体移动至不同位置的情况下，通过24小时后的再暴露测试长期记忆(图4A，右图)。在训练中，对照和敲低小鼠在探查中显示无差异(图4C，左图)。在记忆提取期间，对照小鼠显示对已移动的物体的探查增加(图4C)。相反，ACSS2敲低小鼠的空间物体记忆受损(图4C和图12E，平均Δ＝-5.01±1.21；P＝8.3×10-5)并且显示出较低的区别度指数(图4D；％ΔDI＝-29.5±11.4；P＝0.02)。ACSS2敲低小鼠在测试期间显示出总物体探查减少(图4C)，表明与来自训练期的物体完整识别有关的新鲜性的降低(平均Δ＝-6.13±2.15；P＝0.02，n＝10每组)。
先前的研究已显示当背海马的操纵发生在训练之前时，则通过腹侧海马介导长期情景恐惧记忆(Rogers,J.L.等人,2006,Neurobiol.Learn.Mem.,86:72–81)。因此，作为对照实验，对在背海马注射ACSS2敲低shRNA或eGFP的小鼠进行条件化情景恐惧范例。在24-小时的测试期期间，ACSS2-敲低和eGFP小鼠之间的僵直行为的量不存在显著差异(图12F，图12G)，这表明腹侧海马成功介导了情景-电击联想(context-shock association)。整体上，结论如下：ACSS2在背海马-介导的长期空间记忆中具有重要作用。
ACSS2调控即早基因的上调
长期空间记忆需要组蛋白乙酰化快速升高并且在敏感时窗内发生即早基因转录以使得能够记忆巩固(Barrett,R.M.等人,2011,Neuropsychopharmacology,36:1545–1556；Peixoto,L.L.等人,2015,BMC Genomics,16:S5)；在记忆提取期间，也发生了基因转录以用于记忆再巩固，并且这可以在敏感提取后期期间通过抑制mRNA合成来防止(Mamiya,N.等人,2009,J.Neurosci.,29:402–413)。通过对背海马进行mRNA-seq，测试了ACSS2是否参与用于海马记忆固化和再巩固的动态基因上调。首先鉴别了通过空间物体训练诱导的全局基因表达变化，这先前尚未在基因组-范围进行研究。在空间物体训练之后的记忆巩固敏感期期间，从对照和shACSS2-敲低小鼠除去了背海马。为了控制昼夜节律振荡，包括了已处理但未训练的注射动物。
通过训练的对照-注射小鼠与未训练的昼夜节律对照-注射小鼠的转录组比较，使用Cuffdiff鉴别了训练后差异表达的基因。在训练后立即诱导了少量基因，包括即早基因，如Egr2、Fos、Nr2f2、Sgk1和Arc(图4E)。重要地，未训练的对照和ACSS2-敲低小鼠中的这些记忆-相关基因的基线表达是明显类似的(图12H)。相反，ACSS2敲低显著降低了通过训练的这些即早基因的动态上调(图4E)。
进一步测试了ACSS2是否还调控记忆再巩固期间即早基因在背海马中的表达。因此，海马mRNA-seq分析集中在先前鉴别和验证的在记忆提取后变得上调的基因(Peixoto,L.L.等人,2015,BMC Genomics,16:S5；Poplawski,S.G.等人,2014,Neurobiol.Learn.Mem.,116:90–95)。通过ACSS2敲低阻断了敏感再巩固期间即早基因的提取-相关的诱导，而在相同时期提取-相关的下调未被阻断(图13A，图13B，图13C，图13D，图13E，图13F)。
总结
代谢状态可以调节染色质结构，具体地通过诱导组蛋白修饰进行调节(Gut,P.等人,2013,Nature,502:489–498)。在本文中，在细胞代谢和神经元可塑性之间建立了联系，并且揭示了ACSS2作为染色质-结合的转录辅激活蛋白刺激组蛋白乙酰化和基因表达的神经元功能。
乙酰-CoA代谢是细胞-和组织-特异的，并且经常在恶性转化中失调(misregulate)(Comerford,S.A.等人,2014,Cell,159:1591–1602；Mashimo,T.等人,2014,Cell,159:1603–1614)。在脂肪细胞中，ACSS2部分定位至核并且有助于低葡萄糖条件下的组蛋白乙酰化(Wellen,K.E.等人,2009,Science,324:1076–1080；Gao,X.等人,2016,Nat.Commun.,7:11960)，但是组蛋白乙酰化的主要代谢决定簇是ACL9。相反，在本文中显示有丝***后的神经元依赖于染色质-招募的ACSS2来提供用于组蛋白乙酰化的乙酰-CoA。值得注意地，禁食降低了大部分组织中的乙酰-CoA和蛋白乙酰化，但是乙酰-CoA水平在脑中保持不变(G.等人,2014,Mol.Cell,53:710–725)，这表明当通过柠檬酸酯-依赖性ACL的乙酰-CoA产生降低时，神经元ACSS2在禁食状态下具有重要作用。
最优的转乙酰酶活性需要高局部乙酰-CoA：CoA比，其决定了HAT酶的催化活性和底物特异性(Cai,L.,等人,2011,Mol.Cell,42:426–437；Wellen,K.E.等人,2009,Science,324:1076–1080；Takahashi,H.等人,2006,Mol.Cell,23:207–217)。该发现表明可以通过改变核乙酰-CoA的水平来控制组蛋白乙酰化。因此，染色质-结合的ACSS2可以提供乙酰-CoA，从而为HAT活性局部提供能量，即时再循环CoA，并且还可以从脱乙酰反应中再捕获乙酸酯。本文所提供的数据表明了通过神经元基因处的ACSS2的特异性染色质结合以及对组蛋白乙酰化上调的定位和空间记忆中的基因转录(图4F)(其需要提高的组蛋白乙酰化)之间的联系(
表观遗传机制持续显示为神经功能和行为的重要调控因子，并且已涉及神经精神病学疾病，包括焦虑症和抑郁症(Kandel,E.R.等人,2014,Cell,157:163–186；
实施例2：ACSS2和酒精
乙酸酯的生理学来源包括1)乙酰化蛋白；2)结肠中的细菌发酵；和3)摄入的酒精。然而，对于酒精是否运往神经元染色质尚未可知(图17)。
为了研究急性酒精施用的影响，用EtOH-13C2对小鼠进行腹膜内注射以模拟“酗酒”。将质谱用于确定肝和脑组蛋白的乙酰化。通过IP注射后1小时，将重C乙酸酯引入肝和脑组蛋白(图18)。
然后，确定重C乙酸酯向海马乙酰化组蛋白的引入是否需要ACSS2。背HPC中的ACSS2 KD导致A向背HPC中掺入的丧失(4h)。雷达图显示了重同位素(与轻同位素相比)的相对丰度。与野生型相比，在敲低细胞中，重同位素仅在海马腹侧和在肌肉中更高。在海马背侧，它保持与WT小鼠(注射了未标记的EtOH)中相同的低水平。(图19-20)。
实施例3：肝酒精代谢直接为脑中的组蛋白乙酰化提供能量
在成年的脑中，基因表达的表观遗传控制在神经活动的处理中具有重要作用。新的证据表明表观遗传调控取决于代谢状态，从而在驱动行为的神经功能中涉及特异性代谢因子。在神经元中，组蛋白乙酰化取决于通过染色质-结合的ACSS2从乙酸酯产生的代谢产物乙酰-CoA(Mews等人,Nature,2017,546:381-386)。在本文中，使用体内稳定同位素标记，已表明肝脏酒精代谢通过以ACSS2-依赖性方式将酒精-来源的乙酰基在组蛋白上直接沉积，为脑中的组蛋白乙酰化快速提供能量。通过重标记的乙酸酯体内注射也观察到了类似的诱导。另外，标记的酒精向妊娠小鼠的注射导致标记的乙酰基掺入到孕育胎儿的脑中。在体外分离的原代海马神经元中，胞外乙酸酯诱导了学习和记忆-相关转录程序，发现该程序对ACSS2抑制敏感。这些发现在肝脏酒精代谢和神经元组蛋白乙酰化之间建立了新型且直接的联系，从而为从肝代谢直接向神经元中的表观遗传调控的动态信号转导提供了第一证据。
现有对酒精成瘾的神经生物学的研究集中在边缘奖励回路(limbic rewardcircuitry)、神经传递的变化和胞内神经元信号转导级联。然而，对于酒精发挥其精神影响作用的确切机制仍未完全理解。尽管酒精直接与神经元通道蛋白相互作用，但是该途径不能解释酒精中毒对脑功能的多种影响(Ron等人,Nat.Publ.Gr.,2016,17:576-591)。的确，最近的研究集中于以下看法：失调基因表达是酒精对靶组织作用的关键分子机制(Ron等人,Nat.Publ.Gr.,2016,17:576-591；Zakhari,Alcohol Res.,2013,35:6-16)。在脑中，基因表达的表观遗传控制使得神经活动的整合能够持续适应回路连接并且对适当或—就酒精成瘾来说—不适当行为的表达至关重要(Ron,Nat.Publ.Gr.,2016,17:576-591；Mews等人,Prog.Brain Res.,2017,235:19-63；Robinson等人,Nat.Rev.Neurosci.,2011,12:623-637；Egervari等人,Neurosci.Biobehav.Rev.,2018,85:117-125)。新的证据表明这种表观遗传调控取决于代谢状态。的确，最近已表明控制海马记忆形成的组蛋白乙酰化依赖于通过染色质-结合的ACSS2从乙酸酯产生的代谢产物乙酰-CoA(Mews等人,Nature,2017,546:381-386)。值得注意地，乙酸酯的主要生理学来源是通过酒精在肝脏中的分解，从而导致血液乙酸酯快速升高(Sarkola等人,Alcohol.Clin.Exp.Res.,2002,26:239-245)。因此，神经元组蛋白乙酰化可能受胞外乙酸酯水平的影响(Soliman等人,Mol.Cell.Biochem.,2011,352:173-180)。然而，尚不知道肝脏酒精代谢是否直接影响脑中的组蛋白乙酰化。
现将讨论方法和材料。
组蛋白提取
将细胞在具有0.2％NP-40的核分离缓冲液(NIB)(15mM Tris-HCl、15mM NaCl、60mM KCl、5mM MgCl2、1mM CaCl2、250mM蔗糖，pH 7.5和0.5mM AEBSF、10mM丁酸钠、5nM微囊藻素(microcystein)、1mM新鲜添加的DTT)中在冰上培育5min。通过在4℃，以700×g离心5min收集核。用相同体积的无NP-40的核分离缓冲液清洗所得核颗粒2次。然后，在4℃，边旋转边用0.2M H2SO4对组蛋白酸-提取3小时。在4℃，以3400×g使不溶性核碎片离心沉淀成粒5min，并保留上清液。然后，在4℃，通过以1:3(v/v)的比例添加100％三氯乙酸(TCA)，使组蛋白蛋白沉淀1小时。用丙酮清洗沉淀颗粒以除去残余的酸。将组蛋白在30μl50mM NH4HCO3(pH 8.0)中再悬浮。
组蛋白丙酰化和消化
将样品与15μl衍生化混合物(包含1:3(v/v)的比例的丙酸酐和乙腈)混合，然后立即与7.5μl氢氧化铵混合以维持pH 8.0。将样品在37℃培育15min，干燥并再次重复该衍生化程序。然后，将样品在50mM NH4HCO3中再悬浮并在室温下与胰蛋白酶(酶：样品比例1:20)培育过夜。消化后，再进行两次衍生化反应以使肽的N-末端衍生化。在LC-MS分析之前，使用C18 Stage-移液器头(Stage-tip)使样品脱盐。
NanoLC-MS/MS
通过使用nanoLC-MS/MS装置分析样品。NanoLC配置有使用EASY-nLC nano-HPLC(Thermo Scientific,San Jose,CA,USA)，内部装填的75μm ID×25cm Reprosil-Pur C18-AQ(3μm；Dr.Maisch GmbH,Germany)纳米柱。HPLC梯度如下所示：在45min内，5％至32％溶剂B(A＝0.1％甲酸；B＝80％乙腈，0.1％甲酸)，在5min内，32％至90％溶剂B，90％B保持10min，流速300nL/min。nanoLC偶联至Orbitrap Elite质谱仪(Thermo Scientific,SanJose,CA,USA)。采集方法为如所述的数据独立采集(DIA)。简要地，在DIA工作循环内，在离子阱中采集两种全扫描MS光谱(m/z 300-1100)，并且以50Da的分离窗进行16ms/ms。归一化的碰撞能量(CE)设置为35％。
数据分析
手动分析原始MS数据。选择了含有乙酰化的组蛋白H3和H4的7个最强烈的肽，并且提取了第四同位素的相对丰度(与单同位素信号相比)。由于它们的低丰度，无法可信地定量所有同位素的相对丰度，因此未考虑其它肽。
RNA-测序
如下所示，准备了用于分析的所有RNA-seq数据：使用BaseSpace上的原有apps(native apps)对NextSeq序列数据多路分解。通过RNA-STAR 2.5.2比对多路分解的FASTQ以组装mm10(GRCm38)。使用HTSeq 0.6.1，将比对的读序定位至基因组特征。使用DESeq2和Wald检验进行定量、文库大小调整和基因差异表达分析(抑制剂-处理或未处理的细胞中乙酸酯和DMSO-处理之间的成对对比，然后是差异表达的基因的集重叠)。使用超几何分布检验，检验了基因列表重叠的显著性。
功能分析
使用DAVID，以10％的FDR截止值并且过滤掉具有少于10个基因或者相对于背景小于2.5×倍富集的类别来进行基因本体分析。使用300bp的固定窗(Mews等人,Nature,2017,546:381-386)，使用HOMER v4.6对来自(通过最近的TSS)靶向在启动子处具有H3K9ac的对乙酸酯敏感的基因的公开的体内数据(Mews等人,Nature,2017,546:381-386)的所有ACSS2峰进行基序分析。
小鼠实验
使用8-周大的成年雄性小鼠或E18.5妊娠雌性小鼠。通过腹膜内(i.p.)注射并且以2g/kg剂量(20％的盐水溶液，通过Stericup GV过滤器过滤)施用乙醇、乙醇-d6和乙酸钠-d3(Sigma-Aldrich)。根据Cunningham等人进行条件性位置偏爱实验(CPP)。简要地，使用了外形尺寸为35×18×29cm的Ugo Basile(Italy)小鼠CPP箱(型号：42553)。将装置分为墙壁和地板图案不同的两个室(16×15×25cm)。条纹墙壁配合圆形挖剪图画(1cm)，纯灰色墙壁配合正方形挖剪图画(0.5cm)。在环境温度，在暗室中进行测试期。在动物之间，用70％的乙醇清洗箱。范例包括1个适应日(在中性环境中探查5min)、1个训练前期(20min)、8个训练日(偏差受试者分配，5min期之前立即i.p.盐水或乙醇的交替期)和1个训练后测试期(20min)。测量在条件室内所花费的时间百分比。使用Shapiro-Wilks检验来评价正态分布，使用曼-惠特尼检验确定学习。
病毒载体的颅内注射
用异氟烷气体(1-5％以维持外科平面)使成年小鼠(8+周龄)麻醉并置于立体固定装置内的无菌区。在用必妥碘溶液对皮肤消毒并使用无菌手术设备通过短切口暴露颅骨之前，动物接受布比卡因注射(2.5mg kg-1)用于局部麻醉。将人工眼泪应用于眼部以确保充分润滑。使用立体定位和立体定向的钻在颅骨中的目标区域上钻出小孔(约0.5mm)。将充满病毒载体的微型注射器***背海马并在注射后缓慢除去(距前囟AP，-2.0mm；DV，-1.4mm；14ML，±1.5mm)。ACSS2敲低载体，AAV2/9； U6.shACSS2.CMV.EGFP。所有动物在诱导时作为止痛法接受单一剂量的皮下美洛昔康(5mg kg)并根据需要，在术后每天接受一个剂量并进行两天。
现将讨论结果。
为了确定来自肝脏酒精分解的乙酸酯是否为脑中的动态组蛋白乙酰化提供能量，使用并通过质谱(MS)监测蛋白乙酰化的体内稳定同位素标记(Mews等人,MethodsEnzymol.,2016,574:311-329)。具体地，对小鼠腹膜内注射2g/kg氘化乙醇(d6-EtOH)或对照盐水，并在基线以及腹膜内注射后1和4小时评价氘向乙酰化组蛋白的掺入(图21A，底部)。使用先进的定量液相色谱-MS技术，定量脑中和外周组织中同位素标记的组蛋白乙酰化的相对丰度(图21A，顶部)。EtOH-来源的乙酰基-基团快速掺入到脑中的海马和前额皮质中的组蛋白乙酰化(图21B和21C，图22A-22D)。向组蛋白乙酰化的标记掺入是动态的，并且在腹膜内(i.p.)注射后8小时，重标记降低至基线水平。类似的反应也发生在肝脏中(图21D)，它是酒精代谢的主要位点并且先前已表明表达高水平的ACSS2(Zakhari,AlcoholRes.,2013,35:6-16；Comerford等人,Cell,2014,159:1591-1602)。相反，在表达相对低水平的ACSS2的骨骼肌(腓肠肌，图21E)中未观察到组蛋白乙酰化的这种快速标记(Bonthuis等人,Cell Rep.,2015,12:979-991)。
为了研究ACSS2在脑中酒精-依赖性乙酰化中的直接作用，使用先前验证的病毒载体，通过shRNA敲低降低了背海马(dHPC)中的ACSS2表达(Mews等人,Nature,2017,546:381-386)。在这些ACSS2敲低(KD)动物中，分别在其中ACSS2减少(ACSS2 KD)的dHPC中和在其中正常表达ACSS2的腹侧海马(vHPC)中比较了重-酒精-来源的组蛋白乙酰化。明显地，ACSS2KD防止酒精-来源的重乙酰基向组蛋白乙酰化的掺入(图23A)。相反，在相同动物中，重标记的vHPC掺入不受影响(图23B)。这些体内数据表明来源于肝脏酒精代谢的乙酸酯输送至脑中并容易地掺入组蛋白乙酰化。值得注意地，尽管大部分酒精代谢发生在肝脏中，但是酒精部分还可以在脑中通过酶催化酶和CYP2E1转化为乙酸酯(Zimatkin等人,Alcohol.Clin.Exp.Res.,2006,30:1500-1505)。因此，评价了脑中胞外乙酸酯-来源的乙酰基对组蛋白乙酰化的贡献。在腹膜内注射2g/kg氘化乙酸酯(d3-乙酸酯)的小鼠中，在海马和皮质两者中以类似的水平检测到了向脑组蛋白乙酰化中的快速标记掺入(图23C和23D)。明显地，30分钟时的相对标记是最高的并在注射后4小时回到背景水平，这表明了乙酸酯-来源的乙酰基的快速掺入以及脑组蛋白乙酰化的快速转化(图23C和23D)。总的来说，这些数据表明来自肝脏酒精代谢的血液乙酸酯的升高(图23E，左图)为脑中ACSS2-介导的动态组蛋白乙酰化(图23E，右图)提供能量。
然后，检验了酒精-来源的乙酸酯对于调控海马基因表达中的ACSS2-依赖性组蛋白乙酰化的功能相关性(图23E，右图)。发现野生型(WT)小鼠中的酒精施用导致了基因组范围的H3K9ac和H3K27ac峰的显著富集。明显地，在通过dHPC中的EtOH处理不能诱导显著水平的H3K9ac峰和显著量的H3K27ac峰的ACSS2 KD动物中，消除了这种反应。然后，实施RNA-seq以鉴别转录反应并且发现H3K9ac和H3K27ac驱动了EtOH-处理的WT动物基因组范围的基因表达。然而，与ChIP-seq数据一致，在ACSS2 KD小鼠中，这种反应显著削弱。总的来说，体内发现强烈表明酒精施用导致dHPC中的组蛋白乙酰化和转录活性以ACSS2-依赖性的方式升高。由于酒精和乙酸酯对脑回路和代谢具有多效性，因此随后开展了体外测定来更接近地对外源乙酸酯对基因表达的直接影响建模。使用分离的小鼠原代海马神经元来研究对于模拟酒精中毒期间外源乙酸酯流入的超生理水平的乙酸酯的转录反应(分离后，将细胞培养1周，随后用10mM乙酸酯处理24小时)。此外，为了确定ACSS2在对乙酸酯的转录反应中的具体作用，使用了高特异性的ACSS2的小分子抑制剂(ACSS2i)(Mews等人,Nature,2017,546:381-386；Comerford等人,Cell,2014,159:1591-1602)。
在原代海马神经元中，乙酸酯的添加诱导了3613个基因(图24A，图25A)，通过基因本体(GO)功能类别分析(term analysis)，这些基因参与神经系统过程，包括信号转导以及学习和记忆(图25B，红色)。相反，乙酸酯处理导致参与免疫系统过程的基因下调(图25B，下图，蓝色)。在存在ACSS2i的情况下，2107个乙酸酯-诱导的基因不会变为上调(图24A和24C)，表明乙酸酯-诱导的转录强烈依赖于ACSS2的催化活性。重要地，在不存在乙酸酯的情况下，乙酸酯-诱导的基因不受ACSS2i处理的调控(图24B)。ACSS2i-敏感的上调基因的GO分析显示出对于神经系统过程、行为以及学习和记忆的富集(图24C，下图)。值得注意地，这些乙酸酯-诱导的基因显示与体内海马中急性酒精上调的基因明显重叠(Mulligan等人,Alcohol.Clin.Exp.Res.,2011,35:659-670)(214个酒精-反应性海马基因中的38％，图25C)，这强烈支持了体外模型的翻译正确性。
其它分析显示40％ACSS2i-敏感的上调基因体内乙酰化(Mews等人,Nature,2017,546:381-386)(H3K9ac ChIP-seq，2107个ACSS2i-敏感的基因中的908)并且海马ACSS2的直接结合(ChIP-seq)在无任何直接体内行为刺激的基线处是启动子近侧的(promotor-proximal)(Mews等人,Nature,2017,546:381-386)(图23D)。GO分析将这些基因与包括轴突生成和电压-门控离子通道活性的复杂的可塑性-相关机制相联系(图24D)。相应地，ACSS2-靶向的，乙酸酯-诱导的和ACSS2i-敏感的基因的基序分析表明与神经分化以及通过药物滥用的行为调控相联系的神经元转录因子—包括E2F3和NR5A2(图24E)—的参与(Cates等人,Biol.Psychiatry,2018,84:167-179；Stergiopoulos等人,Nat.Commun.,2016,7:1-16)。
总的来说，这些发现强烈表明ACSS2通过协调酒精-诱导的组蛋白乙酰化和基因表达在酒精-相关学习中起重要作用(图23C)。为了通过行为对其进行测试，在WT和ACSS2 KD小鼠中进行了乙醇条件性位置偏爱测试(CPP)。在该范例中，将动物暴露于差别在于环境线索的不同隔室中的中性和奖赏刺激。在条件反射后，通过使动物接近两种环境并测量在酒精-相关室中所花费的时间来测量CPP。在WT小鼠中，奖赏刺激，如乙醇导致在药物-相关环境中所花的时间增加(曼-惠特尼，p＝0.022)。重要地，CPP的发展基于背HPC空间记忆的形成，并因此，背HPC病变破坏了位置条件反射。明显地，发现在ACSS2 KD(dHPC)小鼠中乙醇CPP完全消除(曼-惠特尼，p＝0.184)，表明酒精-相关联想记忆的形成基于ACSS2。总的来说，体外、体内和行为发现显示在背HPC中重标记乙酸酯向乙酰化组蛋白中的掺入需要ACSS2，其驱动了记忆-相关的基因表达和酒精-相关的联想学习。这些结果将ACSS2作为酒精使用障碍中的治疗性干预的有希望的候选，其中酒精-相关的环境线索记忆是主要的渴求驱动并且即使在延长的戒酒期后仍会复发。
重要地，酒精暴露不仅会破坏成年人脑中的表观遗传和转录过程，而且还与发育胎儿中的表观遗传调控异常有关(Veazey等人,Epigenetics Chromatin,2015,8:39；Starkman等人,Alcohol Research:Current Reviews,2011,34:293-305)。在子宫内，酒精是影响神经发育的基因表达的环境致畸因子并且可以引起分类为胎儿酒精谱系障碍(FASD)的多种酒精-相关的产后疾病表型(Mead等人,Front.Genet.,2014,5:1-10)。最近对子宫内酒精-介导的表观遗传变化的研究显示了FASD中改变的组蛋白乙酰化，但是潜在机制仍未可知(Kim等人,Alcohol Alcohol.,2006,41:126-132；Mandal等人,Int.J.Biol.Sci.,2017,13:1100-1108)。
通过酒精-来源的乙酰基在组蛋白上的直接沉积，研究了妊娠期酒精暴露是否可能影响发育胎儿脑中的组蛋白乙酰化。使用所建立的重-标记酒精注射(2mg/kg i.p.)以及随后通过质谱对分离的组蛋白蛋白分析的范式，确认了妊娠雌性小鼠(图26A)中酒精代谢产物(注射后4h)向神经元组蛋白乙酰化的掺入，这与先前在雄性小鼠中所获得的结果一致(图21B和21C)。然后，研究了酒精是否类似地影响子宫内发育的中脑和前脑中的动态组蛋白乙酰化(E18.5)(图26B)。
胎儿脑MS数据显示—与神经元组蛋白乙酰化的母体标记并行—“酗酒样”酒精暴露导致在早期神经发育期间，酒精-来源的乙酰基-基团在胎儿前脑和中脑中的组蛋白上沉积(图26B)。总的来说，结果表明酒精-来源的乙酰基的直接掺入驱使胎儿脑中的组蛋白乙酰化，这表明了对于FASD病原学意料之外的潜在机制。
在成年的脑中，控制基因表达的表观遗传机制在神经活动的处理中具有重要作用。以上数据提供了对于经由通过神经元ACSS2的代谢产物激活，从肝脏酒精代谢直接向神经元体内表观遗传调控的动态信号转导的第一证据。在海马中，酒精-来源的乙酰基掺入对于酒精-相关的联想学习可以是至关重要的，其编码了甚至在延长的戒酒期之后，仍驱使渴望、寻求和消费的与酒精有关的环境线索。重要地，这些发现表明生理学乙酸酯的其它外周来源—主要是肠微生物组学(gut microbiome)—可以类似地影响神经元组蛋白乙酰化和脑功能，这可能控制或滋养其它代谢综合征。针对外周代谢活性和神经表观遗传调控之间的这种关系的转化治疗(translational treatment)策略可以为酒精使用及其它神经精神病症的新型治疗性干预提供方向。
实施例4：H3K3乙酰化的小分子抑制
使用ADG-204、ADG-205或ADG-206，用抑制剂处理未分化的Ntera2细胞24小时(图27)。使用免疫印迹确定用ADG-204(图28)、ADG-205(图29)或者ADG-206(图30)处理后的H3K3ac的水平。
ADG-I-206：1-(2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6-基)-3-甲脲(R＝Me)。向2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6-胺(333mg，1.08mmol，1当量)在无水CH2Cl2(5.4mL)中的搅拌溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(0.375mL，2.15mmol，2当量)，随后添加三光气(105mg，0.36mmol，0.33当量)在无水CH2Cl2(5.4mL)中的溶液以提供红-橙色溶液。使反应混合物在室温下搅拌4h，然后滴加甲胺(2M，THF中的溶液，0.67mL，1.35mmol，1.25当量)。然后，使反应混合物在室温下搅拌16h。在反应混合物上吹入氩气流以除去溶剂和任何过量的光气，并通过快速色谱法(80％EtOAc/己烷)纯化所得残余物以提供黄色固体状的标题化合物(196mg，50％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.17(s,1H),8.24(d,J＝2.4Hz,1H),7.90(d,J＝9.0Hz,1H),7.84–7.54(m,3H),7.16(dd,J＝13.9,3.7Hz,2H),7.12–7.06(m,2H),6.29(q,J＝4.6Hz,1H),2.71(d,J＝4.6Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ155.51,146.08,143.15,142.62,141.39,141.19,141.10,135.76,129.65,129.00,128.91,128.72,128.66,127.77,127.65,123.80,111.56,26.29.HRMS(ESI)m/z C18H15N4OS2[M+H]+的理论值：367.0687，实验值：367.0689。
ADG-I-205：1-(2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6-基)-3-(2-甲氧基乙基)脲(R＝MeOCH2CH2)。向2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6-胺(337mg，1.09mmol，1当量)在无水CH2Cl2(5.5mL)中的搅拌溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(0.38mL，2.18mmol，2当量)，随后添加三光气(107mg，0.36mmol，0.33当量)在无水CH2Cl2(5.5mL)中的溶液以提供红-橙色溶液。使反应混合物在室温下搅拌4h，然后滴加2-甲氧基乙胺(0.12mL，1.36mmol，1.25当量)。然后，使反应混合物在室温下搅拌16h。在反应混合物上吹入氩气流以除去溶剂和任何过量的光气，并通过快速色谱法(70％EtOAc/己烷)纯化所得残余物以提供黄色固体状的标题化合物(196mg，50％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.19(s,1H),8.23(d,J＝2.4Hz,1H),7.91(d,J＝9.1Hz,1H),7.76(ddd,J＝9.7,5.1,1.1Hz,2H),7.68(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),7.18(dd,J＝3.7,1.2Hz,1H),7.15(dd,J＝3.7,1.1Hz,1H),7.10(ddd,J＝6.9,5.1,3.7Hz,2H),6.47(t,J＝5.6Hz,1H),3.43(t,J＝5.4Hz,2H),3.33(t,J＝5.5Hz,2H),3.30(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ154.83,146.12,143.21,142.42,141.37,141.17,141.07,135.79,129.68,129.02,128.94,128.80,128.68,127.77,127.65,123.70,111.55,71.06,57.90,38.87.HRMS(ESI)m/z C20H19N4O2S2[M+H]+的理论值：411.0949，实验值：411.0926。
ADG-I-204：1-(2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6-基)-3-戊基脲(R＝n-C5H11)。向2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6-胺(1.04g，3.36mmol，1当量)在无水CH2Cl2(34mL)中的搅拌溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(1.17mL，6.72mmol，2当量)，随后添加三光气(329mg，1.11mmol，0.33当量)在无水CH2Cl2(1mL，最终浓度0.1M)中的溶液以提供红-橙色溶液。使反应混合物在室温下搅拌4h，然后滴加戊胺(0.49mL，4.20mmol，1.25当量)。然后，使反应混合物在室温下搅拌16h。在反应混合物上吹入氩气流以除去溶剂和任何过量的光气，并通过快速色谱法(50-60％EtOAc/己烷)纯化所得残余物以提供黄色固体状的标题化合物(872mg，61％)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.07(s,1H),8.23(d,J＝2.3Hz,1H),7.90(d,J＝9.0Hz,1H),7.76(dd,J＝9.7,5.0Hz,2H),7.69(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),7.16(dd,J＝16.6,3.6Hz,2H),7.13–7.05(m,2H),6.41(t,J＝5.7Hz,1H),3.14(q,J＝6.5Hz,2H),1.48(p,J＝7.1Hz,2H),1.40–1.11(m,4H,与油脂重叠),0.90(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ154.87,146.09,143.13,142.59,141.40,141.19,141.08,135.75,129.67,129.00,128.91,128.74,128.66,127.77,127.65,123.77,111.49,29.26,28.55,21.83,13.91.HRMS(ESI)m/z C22H23N4OS2[M+H]+的理论值：423.1313，实验值：423.1336。
实施例5：乙酰-CoA的抑制影响组蛋白乙酰化和海马记忆
为了研究ACSS2在成年海马中的作用，通过用小分子ACSS2抑制剂ADG-204、ADG-205、ADG-206或ADG-207处理降低了背海马中的ACSS2表达。
与对照处理的小鼠相比，在开场(open field)研究期间，用ACSS2抑制剂处理的小鼠显示出类似的运动、协调、体重和焦虑-相关的趋触性水平；因此，ACSS2抑制不导致严重的行为变化。
为了评价海马-依赖性空间记忆，使用了物体-位置记忆范例。动物在训练期间探查了三种不同的物体，并且在一个物体移动至不同位置的情况下，通过24小时后的再暴露测试长期记忆。在训练中，对照和抑制剂处理的小鼠在探查中显示无差异。在记忆提取期间，对照小鼠显示对已移动的物体的探查增加。作为对比，用ACSS2抑制剂处理的小鼠的空间物体记忆受损并且显示出较低的区别度指数。用ACSS2处理的小鼠显示在测试期间，总物体探查减少，表明与来自训练期的完整物体识别有关的新鲜性的降低。
作为对照实验，对对照小鼠或用ACSS2抑制剂处理的小鼠进行条件化情景恐惧范例。在24-小时的测试期期间，在对照小鼠或者用ACSS2抑制剂处理的小鼠之间，僵直行为的量不存在显著差异，这表明腹侧海马成功介导了情景-电击联想(context-shockassociation)。整体上，ACSS2在背海马-介导的长期空间记忆中具有重要作用。
实施例6：乙酰-CoA合成酶的抑制防止酒精-来源的重乙酰基向组蛋白乙酰化的掺 入
为了研究ACSS2在脑中在酒精-依赖性乙酰化中的直接作用，用ACSS2抑制剂ADG-204、ADG-205、ADG-206或ADG-207处理小鼠。ACSS2抑制剂的处理防止酒精-来源的重乙酰基向组蛋白乙酰化的掺入。相反，在对照小鼠中，重标记的vHPC掺入不受影响。因此，来源于肝脏酒精代谢的乙酸酯输送至脑中并容易地掺入组蛋白乙酰化。
实施例7：ADG-207：1-((1S,3s)-金刚烷-1-基)-3-(2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6- 基)脲的合成(R＝1-金刚烷基)
向2,3-二(噻吩-2-基)喹喔啉-6-胺(32mg，0.1mmol，1当量)在无水CH2Cl2(0.6mL)中的搅拌溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(0.04mL，0.2mmol，2当量)，随后添加三光气(10mg，0.034mmol，0.33当量)在无水CH2Cl2(0.6mL，最终浓度0.08M)中的溶液以提供红-橙色溶液。使反应混合物在室温下搅拌4h，然后滴加1-金刚烷胺(0.49mL，4.20mmol，1.25当量)。然后，使反应混合物在室温下搅拌16h。在反应混合物上吹入氩气流以除去溶剂和任何过量的光气，并通过快速色谱法(40％EtOAc/己烷)纯化所得残余物以提供1,1-二-金刚烷基脲污染的标题化合物。将产物通过快速色谱法再纯化两次以提供黄色固体状的分析纯的标题化合物(4mg，8％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.91(s,1H),8.20(d,J＝2.4Hz,1H),7.89(d,J＝9.1Hz,1H),7.76(ddd,J＝9.2,5.1,1.2Hz,2H),7.61(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),7.19(dd,J＝3.7,1.2Hz,1H),7.14(dd,J＝3.7,1.2Hz,1H),7.10(ddd,J＝11.0,5.0,3.6Hz,2H),6.15(s,1H),2.06(s,3H),1.99(d,J＝2.9Hz,6H),1.66(t,J＝3.1Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ153.55,146.09,143.03,142.57,141.48,141.25,141.06,135.67,129.73,128.98,128.87,128.76,128.65,127.77,127.64,123.66,111.24,50.15,41.50,36.00,28.88.HRMS(ESI)m/z C27H27N4OS2[M+H]+理论值：487.1626，实验值：487.1625。
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