具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

应当理解，本发明并非仅限于特定的方法、试剂、化合物、成分、或生物系统，该方法、试剂、化合物、成分、或生物系统可发生变化。另外应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。

应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。

除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。

如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

抗体

本发明提供了结合到3pEβ肽的抗体或其抗原结合片段，尤其是优先于不包含3pE的Aβ肽的抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了制备结合至3pE Aβ肽的抗体或其抗原结合片段的方法，以及制备生成结合至3pE Aβ肽的抗体或其抗原结合片段的杂交瘤的方法。本发明还包括在个体中治疗阿尔茨海默病和其他β-淀粉样蛋白相关疾病的方法、清除与阿尔茨海默病或其他β-淀粉样蛋白相关疾病相关联的斑块的方法、以及预防3pE Aβ的斑块接种活性的方法。本发明还提供了包含用于本发明所述方法的抗体或其抗原结合片段的试剂盒和装置。

根据一个具体方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：

a.分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；

b.分别为SEQ ID NO:1、7、3、4、5和6；

c.分别为SEQ ID NO:1、7、3、8、5和6；

d.分别为SEQ ID NO:1、2、3、8、5和6；

e.分别为SEQ ID NO:56、57、3、8、5和6；

f.分别为SEQ ID NO:56、57、3、4、5和6；

g.分别为SEQ ID NO:56、58、3、4、5和6；

h.分别为SEQ ID NO:56、7、3、8、5和6；

i.分别为SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6；

j.分别为SEQ ID NO:56、7、3、4、5和6；

k.分别为SEQ ID NO:1、57、3、4、5和6；

l.分别为SEQ ID NO:1、58、3、4、5和6；或者

m.分别为SEQ ID NO:56、2、3、4、5和6；

其中抗体或其抗原结合片段特异性地结合3pE Aβ，优选人3pE Aβ。

根据另一个具体方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或抗原结合片段，包含具有与SEQ ID NO:9、11、13、15、16、17、19、20或21有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者与SEQ ID NO:10、12、14、18、22、53或55有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。

根据另一个具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含：

l.具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:22的多肽序列的轻链可变区；

m.具有SEQ ID NO:9的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:10的多肽序列的轻链可变区；

n.具有SEQ ID NO:11的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:12的多肽序列的轻链可变区；

o.具有SEQ ID NO:13的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区；

p.具有SEQ ID NO:15的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区；

q.具有SEQ ID NO:16的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区；

r.具有SEQ ID NO:20的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区；

s.具有SEQ ID NO:17的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:18的多肽序列的轻链可变区；

t.具有SEQ ID NO:19的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:18的多肽序列的轻链可变区；

u.具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:53的多肽序列的轻链可变区；或者

v.具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:55的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、58、3、4、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、2、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、58、3、4、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:21有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:22或53或55有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:22或53或55的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、58、3、4、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、2、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、58、3、4、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:20有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:14有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:20的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、57、3、4、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:19有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:18有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:19的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:18的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、57、3、4、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:17有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:18有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:17的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:18的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、57、3、4、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:16有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:14有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:16的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、57、3、4、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:15有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:14有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:15的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、57、3、4、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、7、3、4、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:13有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:14有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:13的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、7、3、8、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、57、3、8、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、7、3、8、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:11有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:12有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:11的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:12的多肽序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1、7、3、8、5和6或分别具有SEQ ID NO:56、57、3、8、5和6或分别具有SEQ IDNO:56、7、3、8、5和6或分别具有SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6的多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在另一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:9有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的重链可变区以及具有与SEQ ID NO:10有至少85％、优选90％、更优选95％或更高(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:9的多肽序列的重链可变区；以及具有SEQ ID NO:10的多肽序列的轻链可变区。

在另一个具体方面，分离的单克隆抗体包含：

a.包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列；

b.包含SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列；

c.包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列；或者

d.包含SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO:55的轻链氨基酸序列。

根据另一个具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

根据另一个具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是人或人源化的。

根据另一个具体方面，本发明涉及抗原结合片段，其中抗原结合片段选自由Fv、F(ab')、F(ab')2和scFv构成的片段。抗体或其抗原结合片段选择性地结合到3pE Aβ肽(例如，Aβ3pE-40和Aβ3pE-42)，与其他Aβ肽或β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)只有很少交叉反应性或没有交叉反应性。

在另一个总的方面，本发明涉及编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。本领域的技术人员将理解，可以改变(例如置换、缺失、插入等)蛋白质的编码序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员将理解，可变更编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。

在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。根据本公开，可使用本领域的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘端质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可为组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够向细胞递送核酸的多种表达载体在本领域中是已知的，并且在本文可用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。常规克隆技术或人工基因合成可用于根据本发明的实施方案生成重组表达载体。

在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的宿主细胞。鉴于本公开，本领域的技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据具体实施方案，通过常规方法诸如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其中将该重组表达载体稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸有效表达。

在另一个总的方面，本发明涉及产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码单克隆抗体或其抗原结合片段的苷酸的细胞，以及从该细胞或细胞培养物(例如，从上清液)回收该抗体或其抗原结合片段。可从细胞收获表达的抗体或其抗原结合片段并且根据本领域已知以及如本文所述的常规技术进行纯化。

本发明提供了结合到3pE Aβ的分离抗体或其抗原结合片段。术语“抗体”在本文中是指能够结合抗原或其部分的免疫球蛋白，尤其是能够特异性地结合到3pE Aβ的免疫球蛋白。结合到抗原的抗体可通过本领域技术人员已知的方法测量，示例为使用BIAcore^TM仪器。当解离常数小于或等于1μM、优选小于或等于100nM、最优选小于或等于10nM时，抗体或抗原结合抗体片段被认为特异性结合抗原。

抗体的抗原结合片段是指抗体的片段，其可与完整抗体结合于其上的抗原结合，并且与完整抗体竞争抗原结合。抗原结合片段包含允许抗原结合的完整抗体的一部分(即完整抗体的可变区)。抗原结合片段可包括但不限于Fab、Fab’、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、单链抗体分子(例如scFV)、双抗体、微型抗体、纳米抗体、线性抗体、单结构域抗体(sdab)、驼峰化单结构域抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、以及结合到抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。

抗体由两个重链和两个轻链组成。每个重链具有一个可变结构域或区(V_H)，之后是恒定结构域或区(C_H1)、铰链区、以及另外两个恒定结构域或区(C_H2和C_H3)。每个轻链具有一个可变结构域或区(V_L)和一个恒定结构域或区域(C_L)。重链和轻链的可变结构域或区形成抗体的互补位(与锁类似的结构)，其特异于特定表位(类似于键)，从而允许互补位和表位以精确的方式结合在一起。在可变结构域内，β链的可变环(在轻链和重链上各三个)负责与抗原结合。这些环被称为互补决定区(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)。

CDR被定义为抗体的互补决定区。这些是主要负责结合至抗原的抗体重链和轻链的高可变区。在重链和轻链可变区中的每一个中存在三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变互补决定区另选地被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且重链可变互补决定区另选地被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。抗体的CDR可以多种方式定义。例如，可变区内的CDR可根据Kabat、Chothia、IMGT的定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来鉴定。抗体CDR可被鉴定为最初由Kabat定义的高可变区(Kabat等人，1992，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，NIH，Washington D.C.)、最初由Chothia定义的结构环结构(Chothia等人，Nature 342:877-883(1989))或IMGT的独特编号系统(Lefranc，The Immunologist 7:132-136(1999)；Lefranc等人，Nucleic AcidsRes.27:209-212(1999)；Scaviner等人，Exp.Clin.Immunogenet.16:234-240(1999)；Lefranc等人，Nucleic Acids Res.43:D413-422(2015))。

当在抗体的上下文中使用时，“分离”意指“通过人工”自任何自然状态改变；即，如果其天然存在，则其已从原始环境改变或移除或者两者兼有。例如，以其天然状态天然存在于活动物中的天然存在的抗体不是“分离的”，但从其天然状态的共存材料中分离出的相同抗体是“分离的”，如本文所用的术语，例如，“分离的抗体”可指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(即，特异性地结合到3pE Aβ的分离的抗体基本上不含不结合到3pEAβ的抗体)。抗体可存在于组合物诸如免疫测定试剂中，其不是天然存在的组合物，并且其中仍然是该术语(如本文所用的)的含义内的分离的抗体。

产生抗体的方法包括用期望的免疫原接种宿主。合适的宿主包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、鸡、驴、马、猴、黑猩猩、猩猩、大猩猩、人以及能够建立成熟免疫应答的任何物种。免疫程序在本领域中良好建立，并且在许多论文和出版物中有所阐述，包括“TheImmunoassay Handbook”(第2版，David Wild编辑，Nature Publishing Group，2000)。

优选地，将包含本发明特征的免疫原与佐剂联合施用于宿主受试者，例如动物或人类。合适的佐剂包括但不限于弗氏佐剂、粉末氢氧化铝(alum)、氢氧化铝连同百日咳嗜血杆菌(Bordetella pertussis)、以及单磷酰类脂A-合成海藻糖二棒状霉菌酸酯(MPL-TDM)。

通常，通过一次或多次皮下注射或腹膜内注射将免疫原或免疫原与佐剂的组合注入哺乳动物宿主中。优选地，免疫方案在至少一周内进行，并且更优选在两个或更多个星期内进行。可利用本领域熟知的方法分离和纯化以这种方式产生的多克隆抗体。

单克隆抗体可通过Kohler和Milstein的良好建立的杂交瘤方法产生，例如，Nature 256：495-497(1975)。杂交瘤方法通常涉及使宿主或来自宿主的淋巴细胞面积，收获分泌或具有分泌淋巴细胞的潜力的单克隆抗体，将淋巴细胞融合至无限增殖化细胞，以及选择分泌期望的单克隆抗体的细胞。

宿主可经免疫诱导淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生对免疫具有特异性的抗体。另选地，可将淋巴细胞在体外免疫。如果需要人细胞，可使用外周血淋巴细胞，但优选脾脏细胞或来自其他哺乳动物来源的淋巴细胞。

淋巴细胞可与无限增殖化细胞系融合以形成杂交瘤细胞，这是可通过使用融合剂，例如聚乙二醇促进的过程。以示例的方式，可使用通过转化而无限增殖化的突变型啮齿动物、牛或人骨髓瘤细胞。相对于未融合的无限增殖化细胞，优选基本上纯的融合瘤细胞群。因此，在融合之后，细胞可在抑制未融合的无限增殖化细胞的生长或存活的合适培养基中生长，例如通过使用缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的突变型骨髓瘤细胞。在此类情况下，可将次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶核苷加入培养基(HAT培养基)中，以在允许杂交瘤生长的防止HGPRT-缺陷型细胞的生长。

优选地，有效融合的无限增殖化细胞可通过在诸如HAT的培养基中的选择从混合种群中分离，并且在融合之后支持抗体的稳定和高水平表达。优选的无限增殖化细胞系包括购自American Type Culture Collection(Manassas，VA)的骨髓瘤细胞系。

本发明的一个方面是产生能够产生结合至淀粉样蛋白β肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法。此类方法是本领域的技术人员通常已知的，并且一般包括：(i)选择用于抗体产生的宿主；(ii)用期望的免疫原接种该宿主；(iii)将该接种宿主的细胞系与连续分裂细胞融合以生成能够产生结合到免疫原的单克隆抗体的融合细胞；以及(iv)克隆该融合细胞以获得杂交瘤细胞系。

本发明的方法包括产生能够产生结合至3pE Aβ肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法。杂交瘤可通过以下方法制备：用期望的免疫原(诸如具有弗氏佐剂中的焦谷氨酸的Aβ肽)的初始腹膜内注射，之后进行例如每一周至两周的追加注射，将可由此产生杂交瘤的动物(诸如Balb/c小鼠)进行免疫。分离的脾脏的后续融合可使用本领域的普通技术人员通常已知的任何技术进行，优选地使用SP2/0细胞，通过Kohler和Milstein的修改程序进行(Eur.J.Immunol.，1976；6:292-295)。可筛选杂交瘤以确定哪些杂交瘤产生对3pE Aβ肽具有特异性的抗体。筛选可在标准测定诸如ELISA或RIA测定中进行。本发明的一个方面是一种产生杂交瘤细胞系的方法，该杂交瘤细胞系产生单克隆抗体BAMB31_1或其人源化形式。

单克隆抗体也可通过本领域已知的重组方法产生，例如，如美国专利号4,166,452所述。编码单克隆抗体的DNA可使用常规程序进行分离和测序，例如使用特异性地结合到鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针，优选地结合到从分泌具有焦谷氨酸盐的Aβ特异性抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞系分离的探针DNA。

还可产生包含淀粉样β肽的特异性结合位点的抗体片段。此类片段包括但不限于F(ab')₂片段，其可通过胃蛋白酶消化抗体分子来制造；及Fab片段，其可通过还原F(ab')₂片段的双硫键生成。另选地，可构建Fab表达文库以允许快速且容易地鉴定具有期望的特异性的单克隆Fab片段(Huse等人，Science 256:1270-1281(1989))。Fab、Fv和ScFv抗体片段全部均可在大肠杆菌中表达并分泌，从而允许产生大量的这些片段。另选地，Fab'-SH片段可从大肠杆菌直接回收并化学偶联以形成F(ab')₂片段(Carter等人，BioTechnology 10:163-167(1992))。用于产生抗体片段的其他技术是本领域的技术人员已知的。还设想了单链Fv片段(scFv)(参见例如美国专利号5,761,894和5,587,458)。Fv和sFv片段是唯一具有缺乏恒定区域的完整组合位点的物种；因此，它们可能示出减少的非特异性结合。该抗体片段也可以为“线性抗体”，例如，如美国专利号5,642,870中所述。

因此，本发明的目的是提供由上述杂交瘤细胞表达的分离的单克隆抗体，该抗体能够特异性识别3pE Aβ。分离的单克隆抗体可由杂交瘤细胞表达或重组表达。

优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段选择性地结合到3pE Aβ，与不具有3pE或β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的其他Aβ只有很少交叉反应性或没有交叉反应性。具体地，本发明的抗体或其抗原结合片段选择性地结合到Aβ3pE-40(SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:45)和Aβ3pE-42(SEQ ID NO:51)肽，与其他不含3pE的Aβ肽或APP只有很少交叉反应性或没有交叉反应性。

表1提供了本发明的抗体的氨基酸序列。如由Kabat、Chothia和IMGT限定的重链可变区和轻链可变区的CDR以单独的序列示出。

表1：3pE Aβ单克隆抗体序列

在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，抗3pE Aβ抗体和编码它们的多核苷酸、3pE Aβ多肽和编码它们的3pE Aβ多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比的两条或更多条序列或子序列，如使用以下序列比较算法中的一种序列比较算法或通过目视检查所测量的。

对于序列比对，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行对比。当使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法的程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算对于测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith&Waterman的局部同源性算法进行，《高等应用数学》第2卷：第482页(1981年)(Adv.Appl.Math.2:482(1981))，通过使用Needleman&Wunsch的同源比对算法进行，《分子生物学杂志》，第48卷：第443页(1970年)(JMol.Biol.48：443(1970))，通过搜索Pearson&Lipman的相似性方法进行，《美国国家科学院院刊》，第85卷：第2444页(1988年)(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988))，通过这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，在威斯康星州遗传学软件包，遗传学计算小组，威斯康辛州，麦迪逊，科学街区575号(575Science Dr.,Madison,WI)计算机化实施，或通过目测(大体参见，《分子生物学实验室指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等人编辑，《实验室指南》，格林尼出版协会和约翰威利父子公司的合资企业(1995年增补版)(Ausubel))。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人的(1990年)《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页(J.Mol.Biol.215:403-410)和Altschul等人的(1997年)核酸研究第25卷：第3389-3402页(Nucleic Acids Res.第25卷：第3389-3402页。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字词来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字词比对时，该短字词匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻近字词分数阈值(Altschul等人，出处同上)。这些初始邻近字词命中充当用于发起搜索以找到包含它们的较长HSP的种子。然后将字词命中沿每个序列在两个方向上延伸，只要可增加累积的比对分数。

对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)和N(错配残基的处罚分数；始终<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分数。字词命中在每个方向上的延伸在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量X；累积分数由于一个或多个负分数残基比对的累积而变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)3、期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，第90卷，第5873-5787页(1993年))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸类似于参考序列。

两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是通过第一核酸编码的多肽与通过第二核酸编码的多肽免疫地交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅通过保守置换而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交。

体外方法

应当理解，设想了采用抗体或其抗原结合片段的免疫测定法的所有方式根据目前优选的实施方案的用途，包括其中抗体或其抗原结合片段结合至固相的测定和抗体处于液体培养基中的测定法。可用于使用体现本发明特征的抗体来检测分析物的免疫测定方法包括但不限于竞争性(试剂受限的)测定，其中样品中的标记分析物(分析物类似物)和分析物竞争抗体，以及单位点免疫测定法，其中抗体被标记；等。

根据本发明的抗体或其抗原结合片段可用于常规免疫技术中以用于检测Aβ3pE，无论其可出现在何处，包括用于监测β淀粉样蛋白相关疾病的生物样品和用于监测APP的细胞内处理的来自细胞培养的条件培养基。合适的免疫学技术是本领域的技术人员熟知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹分析、竞争性或夹心免疫测定等，并且如另外熟知的，它们都依赖于抗原-抗体免疫复合物的形成，其中出于测定目的，可用例如放射性、酶、发光或荧光标记可检测地标记抗体或其抗原结合片段，或者可将抗体或其抗原结合片段固定在不溶性载体上。因此，本发明的目的是提供用于测定或检测样品中的Aβ3pE或其片段的免疫测定法，该方法包括使样品与根据本发明的针对Aβ3pE或其片段的抗体或其抗原结合片段接触，以及确定该抗体或其抗原结合片段与Aβ3pE或其片段之间是否形成免疫复合物。这些方法可在组织样品或体液样品上进行，并且一般包括从受试者的身体获得样品；使所述样品与成像有效量的经可检测地标记的根据本发明的抗体或其抗原结合片段接触；并且检测该标记以确定该样品中Aβ3pE或其片段的存在。使用本发明的抗体或其抗原结合片段的测量方法没有特别限制。可使用任何测量方法，只要待测溶液中抗体、抗原或对应于抗原量的抗原-抗体复合物的量(特别是Aβ3pE或其片段的量)是通过化学或物理方式检测的，并且由通过使用含有已知量的抗原的标准溶液得到的标准曲线计算得出。例如，适合使用比浊法、竞争法、免疫测定法和夹心法。就灵敏度和特异性而言，特别优选使用夹心法。

在夹心法中，使测试溶液与不溶性抗体(诸如不溶性抗-Aβ3pE抗体)反应(第一反应)，另外，使标记的第二抗体反应(第二反应)；然后测定标记剂对不溶性载体的活性，由此可确定测试溶液中Aβ3pE或其片段的量。第一反应和第二反应可同时或顺序进行。

在测量方法中，标签物质、放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等被用作标记试剂。放射性同位素的示例包括¹²⁵1、¹³¹I、³H和¹⁴C。酶通常通过共轭适当的继而催化可检测反应的基质而制成可检测的。其示例包括例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化物酶。所述发光物质包括，例如，发光氨(luminol)、发光胺衍生物、虫荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶此外，抗生物素蛋白-生物素体系也可用于标记本发明的抗体和免疫原。当免疫原或抗体不溶解时，可采用通常用于蛋白质或酶的不溶解化或固定的物理吸附或化学结合。载体的示例包括不溶性多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素、合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅氧烷聚合物、以及玻璃。

在用于检测或诊断β-淀粉样蛋白相关疾病的另一个实施方案中，包含包括组织、体液诸如脑脊液(CSF)、血液、血浆、血清、尿液等在内的生物样品，并使其与适当量的第一抗体接触以产生免疫复合物。该接触通常涉及将样品添加到涂覆有第一抗体的固体基质中。通过洗脱将由样品与第抗体接触产生的氟化物与样品分离。然而，可采用其他回收方法。将回收的复合物与至少一种第二抗体接触，所述第二抗体针对抗原上的抗原决定簇并且能够结合复合物上的抗原。第二抗体所针对的抗原决定簇可以为第一抗体所针对的相同抗原决定簇，这是由于抗原实体的多表位特性。可使用上述标签中的任一个使第一抗体或第二抗体可检测。在一个优选的实施方案中，使第二抗体可检测。结合到复合物的可检测抗体的存在可以容易地使用本领域已知的技术进行检测，该复合物由结合到第一抗体和第二抗体的抗原组成。通过将生物样品中获得的结果与对照样品上获得的那些结果进行比较，可确定改变的Aβ3pE或其片段的存在或水平。

体内方法

本发明的方面涉及用于预防、改善、治疗和/或减少淀粉样蛋白-β相关病症中淀粉样蛋白-β沉积的方法，其包括以治疗有效量向本发明的受试者施用本文所公开的抗体或其抗原结合片段。本发明的附加方面包括用于预防、改善、治疗和/或减少淀粉样蛋白-β相关病症中淀粉样蛋白沉积的药物组合物，其包含如本文所公开的抗体或其抗原结合片段。本发明的方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，本发明涉及预防、改善、治疗和/或减少特征在于在人体内形成含有β-淀粉样蛋白的斑块的病症中淀粉样蛋白-β沉积的方法，该方法包括向需要此类治疗的人优选地外周施用治疗有效量或预防有效量的根据本发明的抗体或其免疫学反应性片段，该抗体特异性地结合到人Aβ3pE。在另一方面，本发明涉及抑制形成淀粉样蛋白斑块的方法和/或清除人类中的淀粉样蛋白斑块的方法，该方法包括向需要此类抑制或清除的人受试者施用有效量的根据本发明的抗体，其中该抗体螯合脑中的Aβ3pE肽并诱导脑中改变的Aβ3pE的清除。在附加的方面，本发明涉及此类人源化抗体，包括其免疫有效部分，以及它们的制备方法。

对其有需要的受试者是患有或易患有特征在于形成包含β淀粉样蛋白的斑块的病症的人。在一个实施方案中，所述病症是阿尔茨海默病。在其他实施方案中，病症是与三体型21(唐氏综合征)相关的痴呆、弥漫性路易体疾病、包涵体肌炎、脑淀粉样血管病或遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性(HCHWA-D)。

人源化抗体是来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加它们与人中天然产生的抗体变体的相似性。一般来讲，人源化抗体的蛋白质序列与人类变体的蛋白质序列基本上相同，除了其互补决定区(CDR)片段负责抗体结合到其靶抗原的能力的一些或全部的非人源之外。将可变区的构架区替代为相应的人构架区，保留非人CDR基本上完整。在一些情况下，人源化抗体在非人CDR区中的一个或多个中确实具有少量取代，以保留非人抗体的结合亲和力和/或解离常数。

人源化抗体还指包含人构架、至少一个来自非人抗体的CDR的抗体，并且其中存在的任何恒定区基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，即至少约85％、90％、优选至少95％相同或98％相同。因此，除了CDR中的一个或多个之外，人源化抗体的所有部分均与人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。例如，人源化免疫球蛋白将通常不涵盖嵌合小鼠可变区/人恒定区抗体。

人源化抗体相对于用于人治疗的非人和嵌合抗体具有至少三个潜在优点：1)因为效应器部分是人的，所以它可更好地与人免疫系统的其他部分相互作用(例如，激活小胶质细胞以清除斑块)；2)人免疫系统应当不将人源化抗体的构架区或C区识别为外源的，因此针对此类施用的抗体的抗体应答应当小于针对完全外源的非人抗体或部分外源的嵌合抗体的抗体应答；以及3)已经报道施用的非人抗体在人体循环中的半衰期地短于人抗体的半衰期。

在治疗和预防特征在于形成包含β淀粉样蛋白的斑块的方法中，使用标准的施用技术，将本发明的抗体或其抗原结合片段(包括免疫活性片段)施用于处于以下情况的风险或表现出以下情况的受试者：淀粉样蛋白β相关症状或病理学，诸如临床或临床前阿尔茨海默病、与唐氏综合征相关的痴呆、或临床或临床前淀粉样蛋白血管病变。优选地，通过静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌肉内、鼻内、口腔、舌下或栓剂给药来外周给药(即不通过施用于中枢神经系统中)。虽然抗体或其结合片段可直接施用到心室系统、脊髓液或脑实质中，并且用于访问这些位置的技术在本领域中是熟知的，但不一定必须使用这些更加困难的程序。在通过依赖于外周循环系统的更简单技术进行施用时，本发明的抗体或其结合片段是有效的。本发明的优点包括抗体或其抗原结合片段即使不直接提供至中枢神经系统本身也能发挥其有益效果的能力。

用于施用的药物组合物被设计成适于所选的施用模式，并且适当地使用药学上可接受的赋形剂，诸如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。Remington's Pharmaceutical Science，Mack Publishing Co.，Easton Pa.，最新版，以引用方式并入本文，提供了从业者通常已知的制剂技术概要。

可能尤其有用的是改变本发明抗体的溶解度特性，从而使其更具亲脂性，例如通过将其包封在脂质体中或通过阻断极性基团。

优选通过静脉注射、腹膜内注射或皮下注射的外周全身性递送。用于此类注射的合适载体很简单。然而，此外，施用也可借助于鼻用气溶胶或栓剂通过粘膜执行。适用于此类施用模式的制剂是熟知的，并且通常包括有利于跨膜转移的表面活性剂。此类表面活性剂通常衍生自类固醇或阳离子脂质，诸如N-[1-(2,3-二油酰基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)或各种化合物，诸如胆固醇半琥珀酸酯、磷脂酰甘油等。

根据所选的具体施用模式，主要基于流体体积、粘度等，选择低至约0.1重量％至多达约15重量％或20重量％的制剂中的人源化抗体的浓度。因此，用于注射的典型药物组合物可被制成包含1mL磷酸盐缓冲盐水的无菌缓冲水和1mg至100mg本发明的人源化抗体。制剂可在制备制剂后无菌过滤，或换句话讲制成微生物学上可接受的。用于静脉输注的典型组合物可具有多达250mL流体诸如无菌林格氏溶液的体积以及1mg/mL至100mg/mL或更高的抗体浓度。

对于抗体施用，剂量范围为宿主体重的约0.0001mg/kg至100mg/kg，优选0.01mg/kg至75mg/kg。例如，剂量可以为宿主体重的0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、20mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、或75mg/kg。在实施方案中，剂量在0.01mg/kg至10mg/kg的范围内，或在0.1mg/kg至15mg/kg的范围内，或在0.1mg/kg至20mg/kg的范围内，或在0.1mg/kg至30mg/kg的范围内，或在0.1mg/kg至40mg/kg的范围内，或在0.1mg/kg至50mg/kg的范围内，或在0.1mg/kg至60mg/kg的范围内，优选至少1mg/kg、至少5mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg、至少50mg/kg或至少60mg/kg。在一个优选的示例中，剂量可为约10kg/mg、约20kg/mg、约30kg/mg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg或约70mg/kg。在一个特别优选的示例中，抗体以约0.3mg/kg至约60mg/kg的剂量范围腹膜内施用。在示例性治疗方案中，抗体以约10kg/mg、约20kg/mg、约30kg/mg、约40mg/kg、约50mg/kg或约60mg/kg的剂量腹膜内施用。

如本文所用，术语“约”在涉及可测量值诸如量时，其意指涵盖与指定值之间的以下变型：±20％和±0.1％，优选±15％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，并且还更优选±0.5％、±0.1％、0.05％或0.01％，因为此类变型是适合的。

示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，所施用的每种抗体的剂量落在所指示的范围内。抗体通常在多个场合施用。单次剂量之间的时间间隔可以为每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量受试者体内针对Aβ的抗体的血液水平所指示。另选地，抗体可作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较不频繁的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。一般来讲，人抗体示出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。

施用的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在较长时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些受试者在其余生中继续接受治疗。在治疗应用中，可能要求相对较短间隔的相对较高剂量，直到疾病的进展减慢或终止，并且优选地直到受试者表现出疾病症状的部分或完全改善。然后，可施用预防性机制。

在一些方法中，施用剂量以实现1μg/ml至1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中为25μg/ml至300μg/ml。另选地，抗体可作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较不频繁的施用。剂量和频率根据抗体在受试者中的半衰期而变化。

用本发明的抗体进行的治疗可以是独立治疗。另选地，用本发明的抗体进行的治疗可以是联合治疗方案的一个组分或阶段，其中一种或多种附加治疗剂也用于治疗个体。

当用于体内疗法时，本发明的抗体或其抗原结合片段以治疗有效量施用于个体，例如减少、清除或预防β-淀粉样蛋白斑块或改善患有AD或其他β-淀粉样蛋白相关疾病的受试者的认知功能的量。抗体或其抗原结合片段根据已知的方法，诸如静脉注射给药，例如，推注或通过一段时间连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用于个体。本发明的药剂可任选地与对治疗淀粉样变性疾病至少部分有效的其他药剂组合施用。在阿尔茨海默病和其中淀粉样蛋白沉积发生在脑中的相关病症的情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段可与增强本发明的药剂穿过血脑屏障的其他药剂联合施用。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与斑块沉积物中的3pE Aβ结合。通过与牙斑沉积物中的3pE Aβ结合，抗体或其抗原结合片段可诱导斑块去除。斑块去除的诱导可通过激活斑块周围的小胶质细胞和通过去除稳定的Aβ形式使斑块去稳定化来进行。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段可抑制3pE Aβ的斑块接种活性。与血管淀粉样蛋白相比，斑块中3pE Aβ的可能富集可增大免疫疗法的治疗安全窗口。

试剂盒和装置

本发明提供可用于上述方法的试剂盒和装置。优选地，试剂盒和装置包含结合到3pE Aβ的抗体或其抗原结合片段。此外，试剂盒可包含试剂和说明材料。说明书可例如印刷在纸上和/或以电子可读介质提供。另选地，说明书可通过将用户引导至互联网网站，例如由试剂盒的制造商或经销商指定的互联网网站来提供。

包含在本发明的试剂盒中的试剂可以以各种方式的容器形式提供，使得不同组分的活性基本上被保持，同时组分本身基本上不被容器的材料吸附或改变。

在一个实施方案中，试剂盒或装置包含本发明的抗体或其抗原结合片段，优选纯化的抗体，更优选单克隆抗体，甚至更优选结合到3pE Aβ肽的分离的单克隆抗体。在实施方案中，抗体由杂交瘤细胞表达。

实施方案

实施方案1是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3：

a.分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；

b.分别为SEQ ID NO:1、7、3、4、5和6；

c.分别为SEQ ID NO:1、7、3、8、5和6；

d.分别为SEQ ID NO:1、2、3、8、5和6；

e.分别为SEQ ID NO:56、57、3、8、5和6；

f.分别为SEQ ID NO:56、57、3、4、5和6；

g.分别为SEQ ID NO:56、58、3、4、5和6；

h.分别为SEQ ID NO:56、7、3、8、5和6；

i.分别为SEQ ID NO:1、57、3、8、5和6；

j.分别为SEQ ID NO:56、7、3、4、5和6；

k.分别为SEQ ID NO:1、57、3、4、5和6；

l.分别为SEQ ID NO:1、58、3、4、5和6；或者

m.分别为SEQ ID NO:56、2、3、4、5和6；

其中抗体或其抗原结合片段特异性地结合3pE Aβ，优选人3pE Aβ。

实施方案2是根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含具有与SEQ ID NO:9、11、13、15、16、17、19、20或21有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区或者与SEQ ID NO:10、12、14、18、22、53或55有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。

实施方案3是根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含：

a.具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:22的多肽序列的轻链可变区；

b.具有SEQ ID NO:9的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:10的多肽序列的轻链可变区；

c.具有SEQ ID NO:11的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:12的多肽序列的轻链可变区；

d.具有SEQ ID NO:13的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区；

e.具有SEQ ID NO:15的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区；

f.具有SEQ ID NO:16的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区；

g.具有SEQ ID NO:20的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变区；

h.具有SEQ ID NO:17的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:18的多肽序列的轻链可变区；

i.具有SEQ ID NO:19的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:18的多肽序列的轻链可变区；

j.具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:53的多肽序列的轻链可变区；或者

k.具有SEQ ID NO:21的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:55的多肽序列的轻链可变区。

实施方案4是根据实施方案1至3中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

实施方案5是根据实施方案1至4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段是人或人源化的。

实施方案6是一种分离的单克隆抗体，包含：

a.包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列；

b.包含SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO:38的轻链氨基酸序列；

c.包含SEQ ID NO:37的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列；或者

d.包含SEQ ID NO:39的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO:54的轻链氨基酸序列。

实施方案7是一种分离的核酸，该分离的核酸编码根据实施方案1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

实施方案8是一种载体，该载体包含根据实施方案7所述的分离的核酸。

实施方案9是一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施方案8所述的载体。

实施方案10是一种药物组合物，该药物组合物包含根据实施方案1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。

实施方案11是一种在有需要的受试者中治疗与含有β-淀粉样蛋白的斑块形成相关联的病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或根据实施方案10所述的药物组合物。

实施方案12是根据实施方案11所述的方法，其中病症是阿尔茨海默病。

实施方案13是根据实施方案11所述的方法，其中病症选自：与三体型21(唐氏综合征)相关的痴呆、弥漫性路易体疾病、包涵体肌炎、脑淀粉样血管病和遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变性(HCHWA-D)。

实施方案14是一种在有需要的受试者中减少与阿尔茨海默病相关联的斑块的方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或根据实施方案10所述的药物组合物。

实施方案15是一种在有需要的受试者中预防3pE Aβ的接种活性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或根据实施方案10所述的药物组合物。

实施方案16是一种产生根据实施方案1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生该单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码该单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及回收该抗体或其抗原结合片段。

实施方案17是一种生产包含实施方案1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，该方法包括将该单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得该药物组合物。

实施例

鉴于以下非限制性实施例，可另外理解本发明。

实施例1：单克隆抗体的生成和人源化过程

三只Balb/c小鼠(Janvier Labs)用H2N-pEFRHDSGC-COOH(Eurogentec)(SEQ IDNO:47)的完全弗氏佐剂(Sigma；St.Louis,MO)接种。使用市售的试剂盒，诸如ImjectMaleimide Activated BSA试剂盒(Pierce；Rockford,IL)，根据制造商的说明书，通过将肽经由COOH-末端半胱氨酸残基与用马来酰亚胺活化的牛血清白蛋白(Life Technologies；Carlsbad,CA)偶联来制备肽。每两周用100μg或200μg BSA-偶联肽对小鼠进行加强免疫，该肽首先处于完全弗氏佐剂中，随后处于不完全弗氏佐剂中。

杂交瘤和抗体产生：选择显示出最高血清滴度的小鼠进行融合，同时分离其他小鼠的脾脏并将其冷冻在液氮中。在第4天，在融合或脾脏提取之前，用在盐水中偶联到BSA(Merck；Kenilworth,NJ)的100μg H2N-pEFRHDSGC-COOH(SEQ ID NO:47)对所有小鼠进行腹膜内加强。通过Kohler和Milstein的修改程序(Euro.J.Immunol.,1976；292-295)将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞(ATCC；Manassas,VA)融合。将杂交瘤接种在30×96孔板中，10天后在直接ELISA中对0.5μg/孔非偶联Aβ3pE-40肽(AnaSpec；Fremont,CA)进行筛选。检测阳性细胞对0.5μg/ml涂布的Aβ1-40肽(AnaSpec)的(缺乏)交叉反应性，并立即进行亚克隆。

在融合后，在直接涂布ELISA筛选中，17个克隆体与人Aβ3pE-40合成肽(SEQ IDNO:40)反应成阳性并冷冻在液氮中。

所有杂交瘤在补充有10％胎牛血清(Hyclone，欧洲)、杂交瘤融合克隆补充剂(2％)(Roche；Brussels,Belgium)、2％HT(Sigma)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺和青霉素(100U/ml)和链霉素(50mg/ml)的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。所有产品均可商购获得并且购自Life Technologies。将细胞在加湿的8％CO₂空气培养箱中温育。

用于抗体选择的直接ELISA：用于检测上述Aβ3pE-40抗体的筛选ELISA是在NUNCMaxisorp(Life Technologies)平底高结合96孔微量滴定板中在50μl/孔涂布缓冲液(10mMTris、10mM NaCl和10mM NaN₃，pH 8.5)中用0.5μg/ml游离人Aβ3pE-40肽(SEQ ID NO:40)在4℃下过夜涂布的直接ELISA。

第二天，在室温下用75μl/孔的在PBS中的0.1％酪蛋白(Merck)封闭板60分钟以减少非特异性结合。接下来，加入50μl杂交瘤上清液，并且在37℃下温育1小时。在洗涤后，用50μl/孔的与辣根过氧化物酶缀合的绵羊抗小鼠IgG(Amersham-Pharmacia Biotech；Little Chalfont,United Kingdom)在37℃下检测结合的单克隆抗体1小时。两种试剂均在0.1％酪蛋白/PBS中稀释。将板洗涤，并且加入50μl的0.42mM 3,5,3',5'-四甲基联苯胺(Biorad)、0.003％(体积/体积)H₂O₂(Biorad)的100mM柠檬酸(Biorad；Hercules,CA)、100mM磷酸氢二钠(pH 4.3)(Biorad)作为底物。允许反应在室温下在平板振荡器上进行最多15分钟，此后用50μl/孔的2N H₂SO₄停止显色，并且在微量滴定读板器(Thermomax,MolecularDevices)上在450nm处读取板。利用与筛选测定相同的直接ELISA测试所选单克隆抗体与全尺寸人游离Aβ1-40的交叉反应性。

从17个Aβ3pE-40反应性克隆体中，基于亲和力和选择性选择BAMB31_1以用于进一步表征(参见实施例2和实施例3)。确定此抗体具有鼠IgG1同种型重链和鼠k轻链。虽然鼠IgG1 Fc与鼠IgG2a Fc仅具有70％的序列同一性和76％的序列相似性，但这些同种型具有不同的活性和蛋白质谱。与鼠IgG2a相比，由于与鼠FcγRI、FcγRIII和FcγRIV受体和鼠C1q的较弱结合，鼠IgG1具有较少鼠Fc效应和互补功能。鼠IgG2a被认为是最接近人IgG1活性的同种型，其结合到鼠FcγRI、FcγRIII和FcγRIV受体以及鼠C1q，从而具有可有助于Aβ斑块清除的补体、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。

BAMB31重链的序列从鼠IgG1改变成鼠IgG2a以形成BAMB31_2a。如下所述用SPR方法证实V区克隆后反应性的保留。

人源化过程：使用类似于Singh等人的程序(MAbs 2015；7(4):778-91)人源化亲本抗体BAMB31_2a(mIgG2a)，不同之处在于CDR-H2，其根据用于这项工作的AbM定义(Martin,A.C.,PNAS 86:9268-9277,1989)描绘。简言之，在小鼠亲本序列中鉴定互补决定区(CDR)。将这些序列与人种系进行比较，并且选择其中移植了鼠CDR的4种人种系重链和2种人种系轻链构架。通过比较鼠和人J区段序列来选择每种亲本抗体的VL和VH的人J区段，以最大化序列同一性。使用默认参数在MOE(CCG；Montreal,Canada)中生成亲本mAb的Fv区的分子模型。以图形方式检查所得模型以鉴定对结合和/或抗体稳定性可能重要的构架位置。得到抗体文库，其中这些位置除了移植的CDR之外还具有人/小鼠二元组合。在文库中，具有移植的鼠CDR的每条链与相对的鼠亲本链配对。这样，只有一条链适于人构架，并且基于抗原结合决定回复突变。然后将人源化VH和VL组合以得到最终候选抗体。

文库克隆体在大肠杆菌中表达为Fab并通过ELISA测试与肽的结合，并且将信号与完全鼠亲本分子进行比较。选择显示结合大于80％鼠亲本的分子信号进行测序。分析序列，选择人适应的重链和人适应的轻链以组合并表达为单克隆人IgG1抗体。对于每种抗体的所有VH/VL人源化对，进行表达、纯化并评估抗原结合、Epivax计算机模拟免疫原性风险、恢复为小鼠序列的残基数量和生物物理特性。

结果：一些残基需要恢复为小鼠序列以保持亲本的结合。结合的保留、Epivax计算机模拟免疫原性风险和生物物理特性不依赖于恢复为小鼠序列的数目，而是依赖于恢复为小鼠序列的位置。来自该分析的代表性HFA mAb表征结果示于表2和表3中。

表2：BAMB31HFA表征结果的示例

BAMB246亲本人IgG1嵌合体

超出预期范围的值用粗体表示：恢复为小鼠序列的残基总数>5；Hc和Lc Epivax风险得分>-10；V区组合Epivax风险得分>-20；SEC％单体值<95％kd(1/s)值>1.00E-04；KD(M)值>2.50E-11；T起始(℃)<60；Tm1(℃)<65；Tagg(℃)<65。

翻译后修饰风险的降低：亲本抗体和人构架适应的变体在HCDR2中包含NG翻译后脱酰胺修饰基序。为了解决这个潜在问题，使用简并寡核苷酸为N残基和G残基创建单独的文库。这些产生的新序列为每个位置随机引入了全部20个氨基酸。筛选每个文库的保留结合。选择与鼠亲本表现出相似结合的变体抗体进行测序。

结果：测序后，N到S和N到G突变体均与亲本具有相当的结合。将前导HFA变体克隆并表达为野生型IgG1(BAMAB674)，并且将在Fc区中具有M37Y、S39T和T41E点突变的IgG1(基于Hc恒定区Fc IgG1重链恒定区序列基因库登录号AEV43323编号)命名为+YTE IgG1(BAMB675)。已知这些突变增加了对FcRn的亲和力并延长了循环半衰期(Properties ofHuman IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor(FcRn),Dall’Acqua WF.,JBC,2006)。BAMB674和BAMB675的表征示于表3中。

表3：BAMB674和BAMB675的表征

表3a：热稳定性

*N＝1

实施例2：热稳定性测试

对于BAMB31人构架适应的变体，使用纳米差示扫描荧光测定法(NanoDSF)评估它们的热稳定性，以测量熔融起始温度(T起始)、第一熔融转变温度(Tm1)和初始聚集检测温度(Tagg)。一些变体的数据示于表2(列6至列8)和表3(行10至行12)和表3a中。

材料和方法：使用自动Prometheus仪器测定样品的热稳定性。通过将样品从384孔样品板装载到24孔毛细管中来进行测量。对每个样品进行重复运行。Prometheus NanoDSF用户界面(熔融扫描选项卡)用于设置运行的实验参数。典型IgG样品的热扫描范围为20℃至95℃，速率为1.0℃/分钟。样品的典型浓度为0.3mg/mL至1mg/mL。分子在330nm和350nm处的固有荧光用于监测温度斜坡期间的展开并被记录为荧光强度随时间的变化。这被称为热扫描结果(Tm)。并行地使用背向反射技术，该仪器计算热斜坡期间的起始聚集温度(Tagg)。因此，NanoDSF法能够同时测量先导候选物的构象和胶体稳定性，先导候选物通常作为在变化的条件下长期样品稳定性的指标进行监测。

实施例3：Epivax计算机模拟免疫原性风险评估

用于预测MHC II类结合的EpiMatrix软件(EpiVax Inc.)被用来执行抗Aβ3pE mabV区的计算机模拟分析。该软件检查连续氨基酸9聚体以鉴定潜在的HLA II类结合序列。数据库包括覆盖约95％人群的最常见HLA类型。如果抗原呈递细胞的HLA受体结合肽抗原限制位，则该肽的另一面(表位)可结合T效应器或T调节细胞，这继而可刺激或抑制针对带有该表位的蛋白质的免疫反应。该软件产生可针对预测的T调节细胞结合调整的抗原限制位结合得分。相对于蛋白质的大小和导致指示蛋白质的预测免疫原性的输出的结合事件的数目将得分归一化。

实施例4：经纯化的mAb的分析表征

每个经纯化的mAb的蛋白质浓度通过在NanoDrop1000分光光度计或TrineanDropSense96多通道分光光度计上测量280nm处的吸光度进行测定，并使用基于氨基酸序列的消光系数进行计算。

经纯化的抗体的SE HPLC通过以下方式执行：在TOSOH TSKgel BioAssist G3SWxl柱上，在pH为6.8的0.2M磷酸钠中以1mL/分钟的速率在Waters Alliance HPLC上运行样品20分钟。用280nm处的吸光度监测柱流出物。结果示于表2和表3中。

实施例5：结合动力学和亲和力测量

表面等离子体共振(SPR)是用于研究生物分子相互作用的无标记检测方法。监测传感器表面上的质量的微小变化，该直接实时结合测定提供了关于生物分子之间相互作用的定性和定量数据；即确定平衡结合常数(亲和力，K_D)和动力学速率常数(k_a/k_d；复合体缔合速率k_a、以及复合体解离速率k_d)。该方法可用于研究蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸相互作用，以及蛋白质与小分子之间的相互作用。在此，研究了3pE特异性抗体与人Aβ3pE-40(SEQ ID NO:40)或Aβ3pE-28(SEQ ID NO:42)、人Aβ1-40(SEQ ID NO:41)或Aβ1-28(SEQ IDNO:43)和啮齿动物Aβ3pE-28肽(SEQ ID No:45和46)之间的相互作用。

材料和方法

SPR：使用得自GE Healthcare的小鼠抗体捕获试剂盒进行BAMB31_2a(mIgG2a)对Aβ-3pE-40肽(SEQ ID NO:40)的亲和力研究。包括J&JPRD/Aβ/pE3/1mIgG2a(描述于美国专利公开号2018/0142011中)和mE8c mIgG2a(描述于US9944696和US8679498中)作为对照抗体。按照制造商的方案，在CM5传感器芯片上经由胺偶联执行抗小鼠抗体的固定化。随后，感兴趣抗体(1μg/ml)被抗小鼠抗体捕获至300RU的水平，之后将经稀释的各种浓度(3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM和50nM)的人Aβ3pE-40肽(SEQ ID NO:40)注射到运行缓冲液(含有2.7mM KCl、137mM NaCl和0.05％表面活性剂P20(Tween^TM20)的20mM磷酸盐缓冲液)中。用pH1.7的10mM甘胺酸HCl盐使表面再生并持续至少180秒和另外的60秒。将人Aβ(1-40)肽(SEQID NO:41)用作阴性对照。

使用光学生物传感器T200进行亲和力测量。根据1:1结合拟合模型，用Biacore T200评估软件(第2.0版)，执行动力学分析。

在一些情况下，通过使用不同仪器(Biacore T200、Biacore 8K或MASS-2(Biacore,Inc.))和抗人或抗小鼠免疫球蛋白生物传感器表面进行的SPR测量抗Aβ3pE mAb的结合亲和力和特异性。使用针对胺偶联化学的制造商说明书将抗人或抗小鼠免疫球蛋白抗体共价偶联到CM4或CM5传感器芯片(GE Healthcare)的表面。感兴趣抗体在抗人或小鼠免疫球蛋白传感器芯片上被捕获到300RU至400RU的水平，之后将各种浓度的Aβ肽或蛋白质(示例：人Aβ3pE-40(SEQ ID NO:40)、Aβ3pE-28(SEQ ID NO:42)、加扰的Aβ3pE-28(SEQ IDNO:44)、Aβ1-28(SEQ ID NO:43)、小鼠Aβ3pE-28(SEQ ID NO:46)或纤粘蛋白)注射到含有0.005％表面活性剂P20(Tween^TM20)的HEPES缓冲盐溶液中。以100μL/分钟的速率两次脉冲注射30μL的10mM Gly pH 1.5，使表面再生。所报告的数据是含有所捕获抗体的流动池与不含捕获抗体的参考池之间的SPR信号的差异。通过从扣除参考的信号中减去空白注射的数据来去除对信号的额外仪器贡献。当适用时，通过使用Biaevaluation软件(Biacore,Inc.)，用1:1结合模型拟合所有浓度下的缔合相和解离相(全局拟合)来分析数据。否则，将数据定性评估为是/否结合。

对福尔马林固定石蜡包埋的脑的免疫组织化学：对于免疫组织化学分析，在对切片进行脱蜡和再水化之后，通过在甲酸(70％蒸馏水溶液)中温育转基因小鼠脑玻片10分钟进行抗原修复，并且用3％过氧化氢(DAKO；Glostrup,Denmark,S2023)封闭内源性过氧化物酶活性。将切片与不同浓度(工作浓度：在含有背景降低组分的抗体稀释剂(DAKO,S3022)中为2μg/ml、0.1μg/ml至0.05μg/ml至0.025μg/ml)的BAMB674、BAMB675、hE8L、R17L、R17、CI-C7、B12L、抗体I或抗体II(后七种抗体先前描述于US9944696B2和US8679498B2中)一起温育1小时。在充分洗涤后，将HRP-标记的抗人二抗(PI-3000,Vector labs；Burlingame,CA，在抗体稀释剂(DAKO,S0809)中为1/500)施加于玻片1小时，之后用3,3-二氨基联苯胺(DAB)(DAKO,K3468)显色标记。将玻片用苏木精复染，脱水并用Vectamount(H-5000,VectorLabs)永久固定。

结果：单克隆抗体BAMB31_2a(mIgG2a)的动力学分析证实了与Aβ3pE-40肽(SEQ IDNO:40)的亲和结合。当以高达50nM的浓度施用人Aβ1-40肽(SEQ ID NO:41)时未检测到结合。证实BAMB31_2a(mIgG2a)与人Aβ3pE-40肽(SEQ ID NO:40)的结合相互作用的传感图(单循环动力学)示于图1中。作为比较分子，在相同测定中评估J&JPRD/Aβ/pE3/1mIgG2a和mE8cmIgG2a(图2)，并且证实了与mE8c和J&JPRD/Aβ/pE3/1相比，BAMB31具有更高亲和力。平衡结合常数(亲和力，K_D)和动力学速率常数(k_a/k_d)示于表4中。

表4：J&JPRD/Aβ/pE3/1、BAMB31和mE8cmIgGa的动力学

具有减小的Hc CDR2 NG脱酰胺风险的BAMB31 HFA mAb(BAMB674和BAMB675)的动力学分析显示出相对于BAMB31_2a(mIgG2a)亲本和BAMB246(人IgG1嵌合体)亲本保留了对Aβ3pE-28肽(SEQ ID NO:42)的结合亲和力。平衡结合常数(亲和力，K_D)和动力学速率常数(k_a/k_d)示于表5中。

与先前描述的人源化3pE特异性抗体hE8L、R17L、R17、CI-C7、B12L、抗体I和抗体II(先前在US9944696B2和US8679498B2中描述)相比，当前BAMB31 HFA分子的亲和力更高，如表5中所示。

表5：BAMB31 HFA和mE8c HFA分子的3pE Aβ结合动力学

人嵌合抗体在人IgG1恒定区具有小鼠可变区。

表5a：结合亲和力比较

HU-3pE-β-淀粉样蛋白浓度范围0.6nM至4.5nM

通过SPR测量的更高亲和力也转化为改善的斑块结合。通过免疫组织化学对转基因小鼠脑的脑切片进行一抗的稀释系列。在2μg/mL的浓度下，所有抗体均得到可见斑块标记，但程度不同。在0.1μg/mL的浓度下，根据通过SPR测量的低亲和力，抗体C1至C7和R17L未产生可见的斑块标记。在0.05μg/mL的浓度下，BAMB674和BAMB675显示斑块标记，而对于比较分子，在该浓度下视觉上不存在斑块标记(图3)。在0.025μg/mL的浓度下，所有测试分子均(几乎完全)不存在可见斑块标记。

总之，免疫组织化学数据证实了SPR数据证实了BAMB674和BAMB675与比较分子相比具有更高的亲和力。

BAMB246(人IgG1嵌合体)和当前BAMB31 HFA mAb(BAMB674和BAMB675)对高度同源的小鼠Aβ3pE-28肽(SEQ ID NO:46)具有>3个对数级的选择性，并且对纤粘蛋白、Aβ1-28肽(SEQID NO:43)和氨基酸3-9加扰Aβ3pE-28肽(加扰3pE-28)(SEQ ID NO:44)具有>5个对数级的选择性。相关肽和蛋白质的选择性结果和平衡结合常数(亲和力，K_D)和动力学速率常数(k_a和k_a)示于表6中。

表6：BAMB246(人IgG1嵌合体)和HFA mAb与相关靶标的选择性结合动力学

加扰3pE-28是氨基酸3-9被加扰的人Aβ3pE-28肽。

通过将表4中的KD除以表3中的KD确定倍数选择性。

>1.20E-06K_D(M)在最高1.2μM测试浓度下没有检测到抗原结合。

BAMB31 HFA抗体对野生型IgG1(BAMB674)和+YTE IgG1同种型(BAMB675)的FcRn结合亲和力示于表7中。与wt IgG1(BAMB674)相比，+YTE mAb(BAMB675)对人和食蟹猴FcRn的亲和力高约3倍，其在食蟹猴药代动力学研究中转化为+YTE抗体的更长循环半衰期(图11)。

表7：比较作为野生型的HFA mAb与+YTE IgG1的FcRn结合亲和力

KD(M)值是5至6个独立重复的平均值。

实施例6：用于交叉反应性测试的夹心ELISA

对于所选的Aβ3pE单克隆抗体BAMB31，使用合成肽评估与啮齿动物Aβ3pE-40(SEQID NO:45)和人Aβ1-40(SEQ ID NO:41)、Aβ1-42(SEQ ID NO:48)、Aβ11pE-40(SEQ ID NO:49)和Aβ11pE-42(SEQ ID NO:50)的交叉反应性。组合BAMB31+JRF/cAβ40/28-HRPO用于研究与Aβ1-40(SEQ ID NO:41)、Aβ11pE-40(SEQID NO:49)和啮齿动物Aβ3pE-40(SEQ ID NO:45)的交叉反应性，并且组合BAMB31+JRF/cAβ42/26-HRPO用于研究与Aβ1-42(SEQ ID NO:48)和Aβ11pE-42(SEQ ID NO:50)的交叉反应性。测试最高至10,000pg/mL的浓度。

材料和方法：以0.1mg/mL将标准物溶于二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)中并储存于-80℃下。对于用于ELISA中而言，将肽在0.1％酪蛋白的PBS溶液中进一步稀释至1pg/mL。将九十六孔板(Maxisorb ELISA板，NUNC)在4℃下用来自BAMB31_1的单克隆抗体以在涂布缓冲液中1.5μg/mL的浓度涂布过夜。第二天，洗涤板，并在室温下用0.1％酪蛋白的PBS溶液阻断1-4小时。将标准物与HRPO标记的第二抗体(JRF/cAβ40/28-HRPO或JRF/cAβ42/26-HRPO)在4℃下一起温育过夜。在过夜温育之后，洗涤板，并根据制造商的建议，用TMB过氧化物EIA底物试剂盒(Biorad)使测定显色。

结果：BAMB31显示与Aβ3pE-40(SEQ ID NO:40)和Aβ3pE-42(SEQ ID NO:51)具有选择性结合，并且在最高10ng/mL的浓度下未检测到与人Aβ1-40(SEQ ID NO:41)、人Aβ1-42(SEQ ID NO:48)和啮齿动物Aβ3pE-40(SEQ ID NO:45)以及人AβpE11-40(SEQ ID NO:49)和AβpE11-42(SEQ ID NO:50)的交叉反应性(图4)。

图7：用于检测抗体对转基因小鼠和人AD脑组织中的斑块的反应性的免疫组织化 学

在福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)以及冷冻保存的脑组织中，研究抗体对斑块的反应性。

材料和方法

福尔马林固定石蜡包埋的脑：对于免疫组织化学分析，在对切片进行脱蜡和再水化之后，通过在甲酸(70％蒸馏水溶液)中温育转基因小鼠脑玻片10分钟进行抗原修复，并且用3％过氧化氢(DAKO；Glostrup,Denmark,S2023)封闭内源性过氧化物酶活性。将切片与BAMB246(huIgG1嵌合体)、BAMB674或BAMB675(工作浓度：在含有背景降低组分的抗体稀释剂(DAKO,S3022)中为4μg/ml)一起温育1小时。在充分洗涤后，将HRP-标记的抗人二抗(PI-3000,Vector labs，在抗体稀释剂(DAKO,S0809)中为1/500)施加于玻片1小时，之后用3,3-二氨基联苯胺(DAB)(DAKO,K3468)显色标记。将玻片用苏木精复染，脱水并用Vectamount(H-5000,Vector Labs)永久固定。

冷冻保存的脑：将人脑样品速冻，用低温恒温器切片(20μm厚度)并在使用前保存在-80℃下。将切片在室温下干燥，之后进行福尔马林固定，用含3％过氧化氢的内源性过氧化物酶(DAKO,Glostrup,Denmark,S2023)封闭，并用PBS1x+0.3％Triton X-100和10％正常山羊血清(DAKO,X0907)封闭1小时。将一抗pE3/16(在含有背景降低组分的抗体稀释液(DAKO,S3022)中为2μg/ml)施加于切片1小时。在彻底洗涤之后，将玻片与HRP缀合的抗小鼠二抗(Envision,DAKO,K4000)一起温育，之后进行显色DAB标记(DAKO,K3468)。将玻片用苏木精复染，脱水并用有机封片剂(Vectamount,Vector labs)固定。用HamamatsuNanozoomer(Hamamatsu Photonics；Shizuoka,Japan)来执行成像。

结果：在转基因小鼠的FFPE组织上证实了BAMB264(人IgG1嵌合体)以及BAMB674和BAMB675的反应性(图5A至图5F)。此外，BAMB31_2a(mIgG2a)在冷冻保存的AD脑组织中证实了显著的斑块标记(图6)。在人脑的冷冻切片中，被抗体4G8检测到的大部分斑块也用BAMB31标记(图5A至图5F)。++

实施例8：对转基因小鼠给药后的血清抗体水平

研究用BAMB31和比较分子mE8c治疗后的血清抗体水平。

材料和方法：表达升高水平的人Aβ42和Aβ40肽的老年转基因小鼠(22至23月龄)接受单次腹膜内(i.p.)注射20mg/kg的mE8c mIgG2a、BAMB31_2a(mIgG2a)或同种型对照抗体mIgG2a(n＝5/治疗组)。在抗体给药之后，在中间时间点(注射后24小时和48小时)经由大隐静脉和在处死时(注射后第4天)经由眼眶穿刺将全血分别收集在采集管(分别为100Z和300Z；Sarstedt；Numbrecht,Germany)。将收集的全血在室温下温育1至2小时，随后在4℃下以10,000rpm离心10分钟以从血凝块中分离血清。使用同种异型特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定血清抗体水平。为此，在室温下用1.5μg/ml小鼠单克隆抗IgG2a(a)(BD Biosciences；San Jose,CA)涂布Nunc MaxiSorp^TM平底板(ThermoScientific；Waltham,MA)并过夜。mE8cmIgG2a、BAMB31_2a(mIgG2a)和同种型对照mIgG2a的抗体标准品以1μg/ml的浓度在封闭缓冲液(1％BSA的PBS缓冲液+0.05％Tween-20)中单独制备，并在封闭缓冲液中进一步稀释至0.1ng/ml。洗涤(PBS缓冲液+0.05％Tween-20)后，在室温下用封闭缓冲液封闭样品1小时。接下来，将标准品和预稀释的血清样品在经涂布的MAXISORP^TM板中在室温下温育1小时。样品温育后，洗涤板，并将板在室温下与过氧化物酶-AffiniPure山羊抗小鼠IgG(Fcy亚类2a特异性)抗体一起温育1小时。洗涤板，并通过向孔中加入TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒(1步，Pierce)进行显色。2分钟后通过向孔中加入2NH₂SO₄停止显色，并使用EnVision多模式读板器(Perkin Elmer)在450nm处读取板。

结果：在腹膜内注射20mg/kg抗体后24小时、48小时和4天时测量血清抗体水平。对于所有研究的抗体，24小时后血清中的平均抗体浓度是相当的。对于BAMB31_2a和同种型对照抗体，抗体浓度随时间逐渐降低(在第4天降低高达约30％)，而对于mE8c可观察到随时间明显更高的降低，在第4天降低约97％(图7)。

总之，显示了在斑块沉积小鼠模型中腹膜内注射BAMB31_2a和mE8c后的药代动力学曲线的差异，表明用BAMB31_2a抗体治疗后的清除比mE8c更慢。

实施例9：转基因小鼠模型中的慢性功效研究

在转基因小鼠模型中研究在用BAMB31_2a mIgG2a长期治疗后减少淀粉样蛋白负荷的功效以及对微出血的作用。

材料和方法：PDAPP(V717F)转基因小鼠(研究开始时平均年龄为18.3月龄)用剂量30mg/kg的BAMB31_2a抗体(mIgG2a)进行每周腹膜内治疗，持续12周。在实验中包括接受mIgG2a同种型对照抗体注射的对照组。在最后一次腹膜内注射后第7天对动物实施安乐死(研究结束时平均年龄21.1月龄)。在收集组织之前，小鼠接受PBS灌注。将左半球(部分1：海马体，部分2：没有海马体/小脑/脑干的剩余脑)冷冻保存用于进一步的生化分析，而将右半球在基于福尔马林的固定剂中固定过夜，之后石蜡包埋并用切片机切片(5μm)。

为了评估长期治疗后对淀粉样蛋白负荷的作用，进行生物化学和免疫组织化学两种分析。对于生物化学分析，使用Tallprep D裂解基质管(MP Bio)将脑在冰冷的5M盐酸胍和50mM Tris/HCl提取缓冲液(100mg组织/ml提取缓冲液)中均质化。均质化后，将样品在室温下置于颠倒的旋转轮中3小时。在用MSD夹心免疫测定法分析之前，将所得匀浆保存在-80℃下。

将合成的Aβ肽标准品以0.1mg/mL溶解于二甲亚砜(DMSO)(Sigma)中并保存在-80℃下。为了用于MSD免疫测定，将肽进一步稀释在0.5M GuHCl+5mM Tris-HCl-pH 8.0中(提取缓冲液在0.1％酪蛋白的PBS中10倍稀释)。将GuHCl提取物解冻并在冰冷的0.1％酪蛋白的PBS溶液中以1:10稀释，并在4℃下以20,000g离心20分钟。回收上清液用于夹心MSD测定，将样品进一步稀释在0.5M GuHCl+5mM Tris-HCl-pH 8.0中(提取缓冲液在0.1％酪蛋白的PBS中10倍稀释)。

将96孔扇形板标准品(Meso Scale Discovery；Rockville,MD)在4℃下用PBS中浓度为1.5μg/mL的单克隆抗体涂布过夜。第二天，洗涤板，并在室温下用0.1％酪蛋白的PBS溶液封闭2小时。将标准品和样品与生物素标记的二抗一起在4℃下温育过夜。温育过夜后，洗涤板，并与二级检测试剂(用链霉亲和素-SULFO-TAG^TM标记)一起在室温下温育2小时。洗涤板并加入2倍的读取缓冲液T，之后根据制造商的建议读取板。使用具有1/Y²加权函数的四参数逻辑模型的标准曲线测定Aβ浓度。

组合JRF/AβN/25+4G8-生物素抗体用于研究脑匀浆中的Aβ1-x浓度。

对于免疫组织化学分析，在对切片进行脱蜡和再水化后，通过在甲酸(70％蒸馏水溶液)中温育玻片10分钟进行抗原修复，并用3％过氧化氢(DAKO,Glostrup,Denmark,S2023)封闭内源性过氧化物酶活性。将切片与生物素酰化的4G8抗体(Biolegend；SanDiego,CA)一起温育过夜，在含有背景降低组分的抗体稀释剂(DAKO,S3022)中1/2000稀释。充分洗涤后，将链霉亲和素-HRP(PK6100 Elite,Vector labs)施加于玻片上30分钟，之后用3,3-二氨基联苯胺(DAB)(DAKO,K3468)显色标记。将玻片用苏木精复染，脱水并用Vectamount(H-5000,Vector Labs)永久固定。用NanoZoomer玻片扫描仪(HamamatsuPhotonics)产生图像(20x)并用Matlab/Phaedra进行分析。根据Franklin和Paxinos图集(Franklin KB,Paxinos G.Mouse brain in stereotaxic coordinates.Waltham:Academic Press；1997)手动描绘感兴趣区域(ROI)，并计算每个ROI的DAB标记区域占总面积的百分比。

为了评估对微出血的作用，进行Perls染色。简言之，根据下述方案，用酸性亚铁氰化物溶液处理石蜡包埋的组织切片。微出血中存在的铁离子(Fe3+)将与亚铁氰化物结合，导致形成被称为普鲁士蓝的蓝色颜料。在脱蜡和再水化后，将切片在2％亚铁氰化钾(Sigma-Aldrich)和2％冰盐酸(Sigma-Aldrich)的1/1混合物中温育30分钟。在蒸馏水中冲洗玻片三次后，用核固红(Sigma-Aldrich)进行复染，之后在蒸馏水中冲洗，脱水和封片(Vectamount,Vector Labs)。用NanoZoomer玻片扫描仪(Hamamatsu Photonics)进行成像。人工计数脑膜附近的Perl阳性细胞数量。

结果：概括地讲，在基线、同种型对照和BAMB31治疗组中观察到少量微出血(图8)。生化分析证实了对于海马体中的Aβ1-x浓度，BAMB31_2a相对于同种型对照抗体减少34％(p<0.0001)(图9)。此外，使用抗体4G8的免疫组织化学显示海马体和皮质分别比同种型对照抗体减少23％(p<0.0001)和37％(p<0.001)。

总之，证实了在斑块沉积小鼠模型中长期腹膜内注射BAMB31后淀粉样蛋白负荷减少的功效，而不导致微出血的发生率增加，这表明用BAMB31抗体治疗后功效与毒性的有利比率。

实施例10：BAMB31 HFA mAb的药代动力学

在食蟹猴中评估作为野生型IgG1的BAMB31 HFA mAb(BAMB674)与+YTE IgG1(BAMB675)同种型的药代动力学，以直接比较外周循环和脑中的特性。

材料和方法：每组三只动物静脉内(i.v.)推注施用25mg/kg的每种mAb，并在5周期间收集血清样品。在第6周给另外三只猴子静脉内推注施用25mg/kg的每种mAb，并在施用后第7天和第42天从每组收集脑组织。总共，对于每种分子，在第7天和第42天从三只食蟹猴收集脑样品。

来自体内食蟹猴血清和脑组织样品的BAMB674和BAMB675的药物暴露分析通过使用个体适合目的的电化学发光免疫测定(ECLIA)方法进行，其中终点测定在Meso ScaleDiscovery(MSD)Sector Imager S600上进行。对每种化合物和基质应用一种测定形式，从而得到四种独立的方法来测量暴露。形式描述如下：用抗人Fc特异性(CH2结构域)小鼠mAb捕获和检测mAb化合物。对于脑组织制备，通过冷冻粉碎速冻组织并在缓冲液中稀释来制备匀浆。使用BCA测定验证并归一化组织的蛋白质浓度以产生用于该方法的最终蛋白质浓度。在Watson LIMS软件中使用5参数逻辑(自动估计)拟合和1/Y2标准曲线加权执行原始数据回归。

使用具有静脉内(i.v.)施用(给药)至中央隔室、隔室间清除率(Q)和线性清除率(CL)的双隔室(中枢(V_C)和组织(V_T)隔室)药代动力学(PK)模型来表征食蟹猴中BAMB674和BAMB675的PK。图10示出了模型示意图。

结果：计算每种抗体的终末半衰期，并与食蟹猴数据和2隔室模型拟合一起示于图11中。与野生型IgG1同种型(BAMB674)相比，+YTE IgG1同种型(BAMB675)的半衰期延长约1.6倍。与野生型IgG1 mAb(BAMB674)相比，+YTE同种型(BAMB675)的FcRn亲和力增大约3倍，如表5所示。

跨区域和mAb之间的脑裂解物水平在第7天是相似的，但在第42天仅在脑区和动物中持续检测到YTE mAb。其结果示于图12中。这与在稍后的时间点+YTE mAb的暴露增加一致。

在描述本发明及其各种实施方案中，为了清楚起见，采用特定术语。然而，本发明不旨在被限制于如此选择的特定术语。相关领域的技术人员将会认识到，在不脱离本发明广泛构思的情况下，可采用其他等同部件，并且可开发出其他方法。在本说明书中任何地方引用的所有参考文献均引入作为参考，如同每个参考文献已单独结合。