五环化合物的盐及其晶体
阅读说明：本技术 五环化合物的盐及其晶体 (Salt of pentacyclic compound and crystal thereof ) 是由 吉田贤史 大桥芳章 星川环 佐藤信明 栉田郁雄 于 2020-03-03 设计创作，主要内容包括：由式(I)所表示的化合物的盐或其晶体具有用作药物的原料药的可能性。(The salt of the compound represented by the formula (I) or the crystal thereof has a possibility of being used as a drug substance of a medicament.)
技术领域
本发明涉及具有胆碱能神经元活化作用及/或神经保护作用的五环化合物的药学上可接受的盐以及五环化合物及其药学上可接受的盐的晶体。本发明还涉及包含上述盐或晶体作为有效成分的药物组合物。
背景技术
释放乙酰胆碱作为传递物质的胆碱能神经元在前脑中自基底前脑的梅纳特(Meynert)基底核和中隔核向海马、杏仁核、及大脑皮质广泛地投射，并且参与记忆、学习、认知、和注意力的调节(非专利文献1)。此外，认为脑干的脚桥核与背外侧被盖核的胆碱能神经元向纹状体、伏隔核、黑质或丘脑投射，并且参与动机或觉醒状态的调节(非专利文献2至4)。
特别地，已经通过使用许多动物模型(如损伤模型)进行分析，更加阐明了胆碱能神经元在基底前脑中的作用。特别地，胆碱能神经元的功能障碍与记忆和学习下降之间的相关性已经显示于动物模型中(非专利文献5至7)，并且已经显示通过使用胆碱酯酶抑制剂增加乙酰胆碱的量以及增强胆碱能神经元的功能，改善了认知表现(非专利文献8至12)。
据报道，神经生长因子(NGF)在表现出胆碱能神经元的缺失的动物模型中显示对胆碱能神经元的神经保护作用(非专利文献13至15)。
特别地，对于阿尔茨海默病(AD)中，从AD的早期发现胆碱能神经元的缺失，并且其是AD的病理学特征之一。由淀粉样蛋白β的沉积而造成的老年斑的积累和由τ蛋白聚集造成的神经原纤维缠结也是AD的病理特征，并且特别地已知神经原纤维缠结随着疾病状态的进展而增加并且引起神经元死亡。神经原纤维缠结在来自AD早期的梅纳特基底核和内嗅皮层中发现。其中，据报道，早期发现τ蛋白聚集导致梅纳特基底核中胆碱能神经元的缺失，并且认知功能评分的丧失与降低之间存在相关性(非专利文献16和17)。与AD类似，在具有P301S突变的经基因修饰的小鼠中发现τ蛋白的高度磷酸化和异常积累，该P301S突变已在家族性额颞叶痴呆(人τP301S转基因小鼠)中发现。因此，形成神经原纤维缠结(AD的病理特征)(非专利文献18)并且通过突触损伤、神经变性和神经元的缺失引起认知功能障碍。基于这些发现，人τP301S转基因小鼠被广泛用作AD样动物模型(非专利文献19-22)，并且通过抑制人τP301S转基因小鼠中的AD样病变可以预期阿尔茨海默病中认知衰退的改善和疾病状态进展的抑制。
此外，使用经基因修饰的小鼠和障碍的动物模型进行的多重分析表明轴突运输缺陷是胆碱能神经元缺失的原因之一(非专利文献23-25)。其中，从隔区向海马投射的胆碱能神经元的轴突在穹窿海马伞损伤模型中受损，并且涉及存活和功能的分子的逆向运输受损引起神经元缺失(非专利文献26-28)。在经基因修饰的小鼠中也发现了逆向运输的损伤(非专利文献23和24)，并且由穹窿海马伞损伤造成的胆碱能神经元的缺失反映了疾病状态的一个方面。因此，通过在该障碍模型中抑制或改善胆碱能神经元的缺失可以预期阿尔茨海默病中认知衰退的改善和疾病状态进展的抑制。
路易体痴呆(DLB)和帕金森病(PD)是进行性神经退行性障碍，其中主要由α突触核蛋白组成的异常包涵体(路易体)出现在神经元中并引起神经元的变性和缺失。如果路易体主要分布在大脑皮层中，则会导致认知功能障碍进展，并且如果路易体主要分布在脑干中，则会导致帕金森症进展。除此之外，还会导致精神症状，例如幻视、幻觉和妄想、睡眠障碍和自主症状进展。如果痴呆出现在帕金森症发作之前或之后一年内，则诊断为路易体痴呆，并且如果帕金森症在痴呆发作前一年或更长时间出现，则诊断为帕金森病痴呆(PDD)。路易体痴呆、帕金森病痴呆和帕金森病是病理相同的疾病，并且综合称为路易体病(LBD)，尽管这些在认知功能障碍以及帕金森症的出现顺序和程度上是不同的。在路易体痴呆和帕金森病痴呆中，与阿尔茨海默病类似，梅纳特基底核(胆碱能神经起源的核)的神经元退化并缺失，并且据报道，海马和皮层中出现严重的胆碱能神经元障碍(非专利文献29-31)。此外，胆碱能神经元障碍的进展与认知功能障碍之间存在相关性(非专利文献29)，并且已经证明胆碱酯酶抑制剂可改善认知功能。基于这些发现，认知功能通过改善胆碱能神经元的功能而得到改善，并且与阿尔茨海默病类似，通过抑制或改善若干种障碍模型中胆碱能神经元的缺失可以预期路易体痴呆和帕金森病痴呆中认知衰退的改善和疾病状态进展的抑制。
因此，基于这些发现，对由胆碱能神经元机能障碍引起的认知表现的下降的改善可以通过在临床实践中实现对胆碱能神经元的功能性活化和/或神经保护作用来预期。
引证文献清单
非专利文献
[非专利文献1]Everitt BJ et al.“Central cholinergic systems andcognition.”Annu.Rev.Psychol.48(1997)649-684.
[非专利文献2]Gulledge AT.et al.“Cholinergic inhibition of neocorticalpyramidal neurons.”J.Neurosci.25(2005)10308-20.
[非专利文献3]Daniel Dautan D.et al.“A major external source ofcholinergic innervation of the striatum and nucleus accumbens originates inthe brainstem.”J.Neurosci.34(2014)4509-18.
[非专利文献4]M Steriade M.et al.“Neuronal activities in brain-stemcholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocorticalsystems.”J.Neurosci.10(1990)2541-59.
[非专利文献5]Fischer W.et al.“Progressive decline in spatial learningand integrity of forebrain cholinergic neurons in rats during aging.”Neurobiol.Aging 13(1992)9-23.
[非专利文献6]Leanza G.et al.“Selective lesioning of the basalforebrain cholinergic system by intraventricular 192IgG-saporin:behavioural,biochemical and stereological studies in the rat.”Eur.J.Neurosci.7(1995)329-43.
[非专利文献7]Leanza G.et al.“Selective immunolesioning of the basalforebrain cholinergic system disrupts short-term memory in rats.”Eur.J.Neurosci.8(1996)1535-44.
[非专利文献8]Ogura H.et al.“Donepezil,a centrally actingacetylcholinesterase inhibitor,alleviates learning deficits inhypocholinergic models in rats.”Methods Find Exp.Clin.Pharmacol.22(2000)89-95.
[非专利文献9]Spowart-Manning L.et al.“Spatial discrimination deficitsby excitotoxic lesions in the Morris water escape task.”Behav.Brain Res.156(2005)269-76.
[非专利文献10]Bruce AP.et al.“Choline acetyltransferase activity andcognitive domain score of Alzheimer’s patients.”Neurobiol.Aging.21(2000)11-17.
[非专利文献11]Rogers SL.et al.“The efficacy and safety of donepezilin patients with Alzheimer’s disease:results of a US Multicentre,Randomized,Double-Blind,Placebo-Controlled Trial.The Donepezil Study Group.”Dementia 7(1996)293-303.
[非专利文献12]Mori E.et al.“Donepezil for dementia with Lewy bodies:arandomized,placebo-controlled trial.”Ann.Neurol.72(2012)41-52.
[非专利文献13]Mufson EJ.et al.“Human cholinergic basal forebrain:chemoanatomy and neurologic dysfunction.”J.Chem.Neuroanat.26(2003)233-242
[非专利文献14]Mufson EJ.et al.“Cholinergic system duringtheprogression of Alzheimer’s disease:therapeutic implication.”Expert.Rev.Neurother.8(2008)1703-1718.
[非专利文献15]Schliebs R.et al.“The significance of the cholinergicsystem in the brain during aging and in Alzheimer’s disease.”J.Neural.Transm113(2006)1625-1644.
[非专利文献16]Vana L et al.“Progression of tau pathology incholinergic Basal forebrain neurons in mild cognitive impairment andAlzheimer’s disease.”Am.J.Pathol.179(2011)2533-2550.
[非专利文献17]Gomez-Isla T et al.“Neuronal loss correlates with butexceeds neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease.”Ann.Neurol.41(1997)17-24.
[非专利文献18]Lee VM et al.“Neurodegenerative tauopathies.”Annu.Rev.Neurosci.24(2001)1121-1159.
[非专利文献19]Allen B et al.“Abundant tau filaments and nonapoptoticneurodegeneration in transgenic mice expressing human P301S tau protein.”J.Neurosci.22(2002)9340-9351.
[非专利文献20]Xu H et al.“Memory deficits correlate with tau andspine pathology in P301S MAPT transgenic mice.”Neuropathol.Appl.Neurobiol.40(2014)833-43.
[非专利文献21]Yoshiyama Y et al.“Synapse loss and microglialactivation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.”Neuron 53(2007)337-351.
[非专利文献22]Hoffmann NA et al.“Impaired plasticity of corticaldendritic spines in P301S tau transgenic mice.”Acta Neuropathol Commun.1(2013)82.
[非专利文献23]Salehi A et al.“Increased App Expression in a MouseModel of Down’s Syndrome Disrupts NGF Transport and Causes Cholinergic NeuronDegeneration”Neuron 51(2006)29-42.
[非专利文献24]Onishi T et al.“Early-onset cognitive deficits andaxonal transport dysfunction inP301S mutant tau transgenic mice”NeuroscienceResearch 80(2014)76-85.
[非专利文献25]Xu W et al.“Amyloid precursor protein-mediatedendocytic pathway disruption induces axonal dysfunction andneurodegeneration”J.Clin.Invest.126(2016)1815-33.
[非专利文献26]Lapchak PA et al.“Effect of recombinant human nervegrowth factor on presynaptic cholinergic function in rat hippocampal slicesfollowing partial septohippocampal lesions:measures of[3H]acetylcholinesynthesis,[3H]acetylcholine release and choline acetyltransferase activity”Neuroscience 42(1991)639-49.
[非专利文献27]Gilmor ML et al.“Coordinate expression of the vesicularacetylcholine transporter and choline acetyltransferase followingseptohippocampal pathway lesions”J.Neurochem.71(1998)2411-20.
[非专利文献28]Gu H et al.“Recombinant human NGF-loaded microspherespromote survival of basal forebrain cholinergic neurons and improve memoryimpairments of spatial learning in the rat model of Alzheimer’s disease withfimbria-fornix lesion”Neurosci.Lett.453(2009)204-9.
[非专利文献29]Shimada,H.et al.,“Mapping of brain acetylcholinesterasealterations in Lewy body disease by PET”Neurology,vol.73,pp.273-278,2009.
[非专利文献30]Tiraboschi,P.et al.,“Cholinergic dysfunction indiseases with Lewy bodies”Neurology 54(2000)407-411.
[非专利文献31]Perry,E.K.et.al.,“Neocortical cholinergic activitiesdifferentiate Lewy body dementia from classical Alzheimer’s disease”,NeuroReport,vol.5,pp.747-749(1994).
发明内容
技术问题
诸位发明人已经发现由下式(I)所表示的化合物(5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮，以下也称为“化合物(I)”)具有胆碱能神经元活化作用及/或神经保护作用。因此，化合物(I)具有作为改善由胆碱能神经元的功能障碍引起的认知功能低下的药剂的潜在用途。
一般而言，用作药物的化合物及其盐及其晶体的物理性质会对药物的生物利用度、原料药的纯度、药物制剂的配方等造成较大影响。因此，本发明的目的是提供具有用作药物的原料药的可能性的化合物(I)的药学上可接受的盐及其晶体。
问题的解决方案
鉴于上述情况，诸位发明人对化合物(I)反复进行深入研究，结果发现了化合物(I)的盐及其晶体，从而完成本发明。
即，本发明涉及以下<1>至<35>。
<1>一种由式(I)所表示的5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的单盐酸盐或单氢溴酸盐：
<2>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮或5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的单盐酸盐或单氢溴酸盐的晶体。
<3>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为9.0°、11.1°及23.6°处具有衍射峰。
<3.1>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为9.0°、11.1°、14.5°、18.1°、20.0°、21.9°、23.6°、24.4°、24.9°及28.5°处具有衍射峰。
<3.2>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，具有图1的粉末X射线衍射图。
<4>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的A型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为11.6°、20.8°及25.7°处具有衍射峰。
<4.1>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的A型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.1°、7.8°、11.6°、16.2°、19.9°、20.8°、25.2°、25.7°、26.9°及29.9°处具有衍射峰。
<4.2>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的A型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，具有图2的粉末X射线衍射图。
<4.3>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的A型晶体在使用以甘氨酸作为外部基准(176.03ppm)的13C固态NMR光谱中，在化学位移(δ±0.5ppm)为164.0ppm、129.6ppm及36.5ppm处具有峰。
<5>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的B型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为9.7°、10.1°及17.9°处具有衍射峰。
<5.1>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的B型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.3°、9.7°、10.1°、17.9°、19.0°、19.4°、23.4°、26.3°、27.3°及32.0°处具有衍射峰。
<5.2>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的B型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，具有图3的粉末X射线衍射图。
<5.3>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的B型晶体在使用以甘氨酸作为外部基准(176.03ppm)的13C固态NMR光谱中，在化学位移(δ±0.5ppm)为160.1ppm、133.4ppm及130.7ppm处具有峰。
<6>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的C型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.0°、7.7°及16.9°处具有衍射峰。
<6.1>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的C型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.0°、7.7°、9.7°、11.4°、15.8°、16.9°、18.1°、23.2°、25.4°及27.6°处具有衍射峰。
<6.2>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的C型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，具有图4的粉末X射线衍射图。
<6.3>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的C型晶体在使用以甘氨酸作为外部基准(176.03ppm)的13C固态NMR光谱中，在化学位移(δ±0.5ppm)为159.6ppm、127.6ppm及38.9ppm处具有峰。
<7>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的D型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.6°、14.6°及26.4°处具有衍射峰。
<7.1>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的D型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.6°、14.6°、16.1°、20.5°、21.0°、23.0°、24.5°、26.4°、28.0°及32.5°处具有衍射峰。
<7.2>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的D型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，具有图5的粉末X射线衍射图。
<8>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的E型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.4°、11.3°及27.3°处具有衍射峰。
<8.1>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的E型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.4°、11.3°、15.7°、18.0°、19.2°、22.8°、24.6°、25.4°、26.0°及27.3°处具有衍射峰。
<8.2>一种化合物(I)单盐酸盐的E型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，具有图6的粉末X射线衍射图。
<9>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的F型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为7.3°、9.3°及10.7°处具有衍射峰。
<9.1>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的F型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为5.9°、7.3°、9.3°、10.7°、13.8°、15.6°、16.4°、18.7°、25.1°及26.8°处具有衍射峰。
<9.2>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单盐酸盐的F型晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，具有图7的粉末X射线衍射图。
<10>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单氢溴酸盐的晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为7.8°、24.5°及25.2°处具有衍射峰。
<10.1>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单氢溴酸盐的晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.0°、7.8°、10.0°、11.7°、17.8°、20.8°、23.5°、24.5°、25.2°及27.3°处具有衍射峰。
<10.2>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮单氢溴酸盐的晶体在使用以CuKα作为X射线源的粉末X射线衍射中，具有图8的粉末X射线衍射图。
<11>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的单盐酸盐的A型晶体，其在拉曼光谱测量中，在587cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)。
<12>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的单盐酸盐的A型晶体，其在拉曼光谱测量中，在587cm-1、1428cm-1及1493cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)。
<13>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的单盐酸盐的A型晶体，其在拉曼光谱测量中，在587cm-1、763cm-1、1428cm-1、1493cm-1及1688cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)。
<14>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的单盐酸盐的A型晶体，其在拉曼光谱测量中，在409cm-1、587cm-1、763cm-1、976cm-1、1428cm-1、1493cm-1及1688cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)。
<15>一种5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂-4,13-二酮的单盐酸盐的A型晶体，其在拉曼光谱测量中，具有图19的光谱。
<16>一种药物组合物，其包含根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<17>根据<16>所述的药物组合物，其是胆碱能神经元活化剂。
<18>根据<16>所述的药物组合物，其是胆碱能神经元保护剂。
<19>根据<16>所述的药物组合物用于治疗认知功能障碍。
<20>一种用于认知功能障碍的治疗剂，该治疗剂包含根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<21>一种治疗认知功能障碍的方法，该方法包括向患者施用根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<22>根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体用于在治疗认知功能障碍中使用。
<23>根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体用于制造用于认知功能障碍的治疗剂的用途。
<24>一种用于阿尔茨海默病的治疗剂，该治疗剂包含根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<25>一种治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括向患者施用根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<26>根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体用于在治疗阿尔茨海默病中使用。
<27>根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体用于制造用于阿尔茨海默病的治疗剂的用途。
<28>一种用于路易体痴呆症的治疗剂，该治疗剂包含根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<29>一种治疗路易体痴呆症的方法，该方法包括向患者施用根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<30>根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体用于在治疗路易体痴呆症中使用。
<31>根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体用于制造用于路易体痴呆症的治疗剂的用途。
<32>一种用于帕金森病痴呆的治疗剂，该治疗剂包含根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<33>一种治疗帕金森病痴呆的方法，该方法包括向患者施用根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体。
<34>根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体用于在治疗帕金森病痴呆中使用。
<35>根据<1>所述的盐或根据<2>至<15>中任一项所述的晶体用于制造帕金森病痴呆的治疗剂的用途。
发明的有利效果
根据本发明，可以提供期待用作药物的原料药的可能性的具有良好的物理性质的化合物(I)的盐及其晶体。
附图说明
图1是实例1中所获得的化合物(I)的晶体的粉末X射线衍射图。横坐标表示衍射角(2θ)，并且纵坐标表示峰强度。
图2是实例2中所获得的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体的粉末X射线衍射图。横坐标表示衍射角(2θ)，并且纵坐标表示峰强度。
图3是实例4中所获得的化合物(I)单盐酸盐的B型晶体的粉末X射线衍射图。横坐标表示衍射角(2θ)，并且纵坐标表示峰强度。
图4是实例3中所获得的化合物(I)单盐酸盐的C型晶体的粉末X射线衍射图。横坐标表示衍射角(2θ)，并且纵坐标表示峰强度。
图5是实例5中所获得的化合物(I)单盐酸盐的D型晶体的粉末X射线衍射图。横坐标表示衍射角(2θ)，并且纵坐标表示峰强度。
图6是实例6中所获得的化合物(I)单盐酸盐的E型晶体的粉末X射线衍射图。横坐标表示衍射角(2θ)，并且纵坐标表示峰强度。
图7是实例7中所获得的化合物(I)单盐酸盐的F型晶体的粉末X射线衍射图。横坐标表示衍射角(2θ)，并且纵坐标表示峰强度。
图8是实例8中所获得的化合物(I)单氢溴酸盐的晶体的粉末X射线衍射图。横坐标表示衍射角(2θ)，并且纵坐标表示峰强度。
图9是实例2中所获得的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体的13C固态NMR光谱。横坐标表示化学位移(δ)，并且纵坐标表示峰强度。
图10是实例4中所获得的化合物(I)单盐酸盐的B型晶体的13C固态NMR光谱。横坐标表示化学位移(δ)，并且纵坐标表示峰强度。
图11是实例3中所获得的化合物(I)单盐酸盐的C型晶体的13C固态NMR光谱。横坐标表示化学位移(δ)，并且纵坐标表示峰强度。
图12是实例2中所获得的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体的热分析TG-DTA图。横坐标表示温度，左纵坐标表示TG的重量变化，并且右纵坐标表示DTA的热流。
图13是实例4中所获得的化合物(I)单盐酸盐的B型晶体的热分析TG-DTA图。横坐标表示温度，左纵坐标表示TG的重量变化，并且右纵坐标表示DTA的热流。
图14是实例3中所获得的化合物(I)单盐酸盐的C型晶体的热分析TG-DTA图。横坐标表示温度，左纵坐标表示TG的重量变化，并且右纵坐标表示DTA的热流。
图15是实例5中所获得的化合物(I)单盐酸盐的D型晶体的热分析TG-DTA图。横坐标表示温度，左纵坐标表示TG的重量变化，并且右纵坐标表示DTA的热流。
图16是实例6中所获得的化合物(I)单盐酸盐的E型晶体的热分析TG-DTA图。横坐标表示温度，左纵坐标表示TG的重量变化，并且右纵坐标表示DTA的热流。
图17是实例7中所获得的化合物(I)单盐酸盐的F型晶体的热分析TG-DTA图。横坐标表示温度，左纵坐标表示TG的重量变化，并且右纵坐标表示DTA的热流。
图18是实例8中所获得的化合物(I)单氢溴酸盐的晶体的热分析TG-DTA图。横坐标表示温度，左纵坐标表示TG的重量变化，并且右纵坐标表示DTA的热流。
图19表示实例2中所获得的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体的拉曼光谱。
具体实施方式
以下，对本发明的化合物(I)的盐及其晶体及其生产方法进行详细说明。
如本文所用，“盐”是指由作为碱性成分的化合物(I)、及相对于化合物(I)的某些当量数的酸组成的化学物质。
如本文所用，“盐”的实例包括无机酸的盐、有机酸的盐、以及酸性氨基酸的盐等，其中优选地为药学上可接受的盐。
无机酸的盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐；并且有机酸的盐的适当实例包括有机羧酸(例如乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、硬脂酸和苯甲酸)的盐和有机磺酸(例如甲基磺酸(甲磺酸)、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸)的盐；其中优选地为盐酸、氢溴酸、和磷酸。
酸性氨基酸的盐的实例包括天冬氨酸盐和谷氨酸盐。
本发明的盐也可以是无水物或者水合物或溶剂化物。如本文所用，水合物或溶剂化物是指化合物(I)或其盐与水分子或溶剂分子一起形成的固体，并且该固体也可以是晶体：并且溶剂化物的溶剂的实例可以包括基于酮的溶剂，如丙酮、2-丁酮、环己酮；基于酯的溶剂，如乙酸甲酯和乙酸乙酯；基于醚的溶剂，如1,2-二甲氧基乙烷、叔丁基甲基醚；基于醇的溶剂，如甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇；极性溶剂，如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜。化合物(I)或其盐的水分子或溶剂分子的量没有特别限定，例如可以是1分子或2分子。
如本文所用，“晶体”是指化合物(I)或其盐的无水物或水合物的晶体。
如本文所用，化合物(I)以及化合物(I)的盐酸盐及氢溴酸盐的晶体的优选的实例包括：
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为9.0°、11.1°及23.6°处具有衍射峰的化合物(I)的晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为9.0°、11.1°、14.5°、18.1°、20.0°、21.9°、23.6°、24.4°、24.9°及28.5°处具有衍射峰的化合物(I)的晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为11.6°、20.8°及25.7°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.1°、7.8°、11.6°、16.2°、19.9°、20.8°、25.2°、25.7°、26.9°及29.9°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体；
在13C固态NMR光谱中，在化学位移(δ±0.5ppm)为164.0ppm、129.6ppm及36.5ppm处具有峰的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体；
在拉曼光谱测量中，在587cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体；
在拉曼光谱测量中，在587cm-1、1428cm-1及1493cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体；
在拉曼光谱测量中，在587cm-1、763cm-1、1428cm-1、1493cm-1及1688cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体；
在拉曼光谱测量中，在409cm-1、587cm-1、763cm-1、976cm-1、1428cm-1、1493cm-1及1688cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体；
在拉曼光谱测量中，实质上具有如图19所示的光谱的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为9.7°、10.1°及17.9°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的B型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.3°、9.7°、10.1°、17.9°、19.0°、19.4°、23.4°、26.3°、27.3°及32.0°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的B型晶体；
在13C固态NMR光谱中，在化学位移(δ±0.5ppm)为160.1ppm、133.4ppm及130.7ppm处具有峰的化合物(I)单盐酸盐的B型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.0°、7.7°及16.9°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的C型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.0°、7.7°、9.7°、11.4°、15.8°、16.9°、18.1°、23.2°、25.4°及27.6°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的C型晶体；
在13C固态NMR光谱中，在化学位移(δ±0.5ppm)为159.6ppm、127.6ppm及38.9ppm处具有峰的化合物(I)单盐酸盐的C型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.6°、14.6°及26.4°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的D型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.6°、14.6°、16.1°、20.5°、21.0°、23.0°、24.5°、26.4°、28.0°及32.5°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的D型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.4°、11.3°及27.3°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的E型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.4°、11.3°、15.7°、18.0°、19.2°、22.8°、24.6°、25.4°、26.0°及27.3°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的E型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为7.3°、9.3°及10.7°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的F型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为5.9°、7.3°、9.3°、10.7°、13.8°、15.6°、16.4°、18.7°、25.1°及26.8°处具有衍射峰的化合物(I)单盐酸盐的F型晶体；
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为7.8°、24.5°及25.2°处具有衍射峰的化合物(I)单氢溴酸盐的晶体；以及
在粉末X射线衍射中，在衍射角(2θ±0.2°)为6.0°、7.8°、10.0°、11.7°、17.8°、20.8°、23.5°、24.5°、25.2°及27.3°处具有衍射峰的化合物(I)单氢溴酸盐的晶体等。
上述粉末X射线衍射中的衍射峰、13C固态NMR光谱中的化学位移及拉曼光谱测量中的拉曼位移峰对于化合物(I)的晶体、化合物(I)单盐酸盐的A-F型晶体及化合物(I)单氢溴酸盐的晶体的每个是独特的，并且他们是晶体的特征峰。
一般而言，粉末X射线衍射中的衍射角(2θ)可能在±0.2°的范围内含有误差，因此需理解为上述衍射角的值也包括约±0.2°范围内的数值。因此，在某些化合物或其盐中，不仅粉末X射线衍射中的峰的衍射角完全一致的晶体，而且峰的衍射角在约±0.2°的误差中一致的晶体也相同，并包含于本发明中。
如本文所用，例如“在衍射角(2θ±0.2°)为9.0°处具有衍射峰”意指“在衍射角(2θ)为8.8°-9.2°处具有衍射峰”，并且同样适用于其他衍射角的情形。
一般而言，即使晶型相同，对于每次测量粉末X射线衍射中的衍射角(2θ)的峰强度或半峰宽都不同，这取决于不同的测量条件以及用作测量样品的粉末晶体颗粒的尺寸和形式的变化，并且并不总是显示恒定的峰强度或半峰宽。因此，在粉末X射线衍射图的比较中，即使在相同的衍射角(2θ)处其峰强度或半值宽存在差异，这并不意味着差异来自晶型的不同。因此，这意味着相对于本发明的特定晶体的衍射峰特征具有这种差异的晶体(具有粉末X射线衍射图)具有与本发明的晶体相同的晶型。另外，如本文所用，“具有图1的粉末X射线衍射图”意指所有显示图1所示的粉末X射线衍射图的晶体与本发明的晶体是相同的晶体，不仅在具有特征衍射峰的粉末X射线衍射图与图1所示粉末X射线衍射图在±0.2°的误差范围内匹配的情况下，而且还在具有不同的峰强度或半峰宽的粉末X射线衍射图的情况下(在误差范围为±0.2°，具有与图1所示的粉末X射线衍射图相匹配的特征衍射角)。
如本文所用，“化学位移(δ±0.5ppm)为164.0ppm、129.6ppm及36.5ppm”意指“在通常的测量条件或与本说明书实质上相同的条件下进行13C固态NMR光谱测量，分别具有与化学位移(δ±0.5ppm)为164.0ppm、129.6ppm及36.5ppm实质上同等的峰”。
一般而言，在判断是否“具有实质上同等的峰”时，13C固态NMR光谱中的化学位移δ可能在±0.5ppm的范围内含有误差，因此需理解上述化学位移的值也包括±0.5ppm左右的范围内的数值。因此，不仅13C固态NMR光谱中的化学位移完全一致的晶体包含于本发明中，而且化学位移在约±0.5ppm的误差中一致的晶体亦包含于本发明中。因此，如本文所用，例如“在化学位移(δ±0.5ppm)为164.0ppm处具有峰”意指在化学位移(δ)163.5ppm至164.5ppm的范围内具有峰，并且同样适用于13C固态NMR光谱中的化学位移的情形。
一般而言，拉曼光谱测量中的拉曼位移峰(cm-1)可能在±2cm-1的范围内含有误差，因此需理解上述峰的值也包括在约±2cm-1的范围内的数值。因此，在某些化合物或其盐中，不仅拉曼光谱测量中的拉曼位移峰完全一致的晶体，而且拉曼位移峰在约±2cm-1的误差中一致的晶体也相同，包括在本发明中。
如本文所用，例如“在拉曼光谱测量中，在587cm-1处具有拉曼位移峰(±2cm-1)”意指“在拉曼光谱测量中，在585cm-1～589cm-1处具有拉曼位移峰”，其他拉曼位移的情形也相同。
一般而言，即使晶型相同，拉曼光谱测量中的拉曼位移的峰强度或半峰宽对于每次测量都不同，这取决于不同的测量条件以及用作测量样品的粉末晶体颗粒的尺寸和形式的变化，并且并不总是显示恒定的峰强度或半峰宽。因此，在拉曼光谱测量的比较中，即使在相同的拉曼位移峰(cm-1)处其峰强度或半值宽存在差异，这并不意味着差异来自晶型的不同。因此，这意味着相对于本发明的某些晶体的拉曼位移峰特征具有这种差异的晶体(具有拉曼光谱)具有与本发明的晶体相同的晶型。另外，如本文所用，“在拉曼光谱测量中，具有图19的光谱”意指所有显示图19所示的拉曼光谱的晶体与本发明的晶体相同的晶体，不仅在具有特征性的拉曼位移峰(cm-1)的拉曼光谱与图19所示的拉曼光谱中在±2cm-1的误差范围内匹配的情况下，而且还在具有不同的峰强度或半值宽的拉曼光谱的情况下(尽管具有在±2cm-1的误差范围内匹配的特征性的拉曼位移峰)。
以下，对作为本发明的一个实施例的化合物(I)的盐、晶体等的生产方法进行说明。
用于生产化合物(I)的方法
化合物(I)也可以是通过本领域技术人员熟知的方法生产的化合物。例如，化合物(I)可通过下文所述的参考实例中所记载的方法合成。
用于生产化合物(I)的盐的方法
根据本发明的化合物(I)的盐可通过通常生产盐的方法获得。特别地，可以通过例如将化合物(I)悬浮或溶解在溶剂中，同时根据需要加热，然后向所得悬浮液或溶液中添加酸，然后将混合物在室温下搅拌或使其静置来生产盐，或冷却几分钟到几天。通过使用这些生产方法，能够以晶体或无定形的形式获得化合物(I)的盐。此外，根据需要，除了这些生产方法以外，还可以通过进行冷冻干燥等操作来获得无定形体。本文所使用的溶剂的实例包括基于醇的试剂，如乙醇、1-丙醇、异丙醇；乙腈；基于酮的溶剂，如丙酮和2-丁酮；基于酯的溶剂，如乙酸乙酯；基于饱和烃的溶剂，如己烷和庚烷；基于醚的溶剂，如叔丁基甲基醚和水。这些溶剂可以单独使用或与两种或更多种组合使用。
用于生产化合物(I)或其盐的晶体的方法
化合物(I)或其盐的晶体可通过上述用于生产化合物(I)的方法、或用于制备其盐的方法进行制备，或者也可通过将化合物(I)或其盐加热溶解于溶剂中，并在搅拌下冷却进行结晶而制备。
用于结晶的化合物(I)或其盐可以是任意形态，即可以是溶剂化物或水合物或无水物，可以是无定形或晶型(包括由多种多晶型组成的那种)、或其混合物。
在结晶中使用的溶剂的实例包括基于醇的溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇和1-丙醇；乙腈；基于酰胺的溶剂，例如N,N-二甲基甲酰胺；基于酯的溶剂，如乙酸乙酯；基于饱和烃的溶剂，如己烷和庚烷；基于酮的溶剂，如丙酮和2-丁酮；基于醚的溶剂，如叔丁基甲基醚和水。这些溶剂可以单独使用或与两种或更多种组合使用。
所用溶剂的量可以适当地选择，条件是能够通过加热溶解化合物(I)或其盐的量或能够搅拌悬浮液的量是下限，并且晶体的收率不显着降低是上限。
在结晶中，可添加或不添加晶种(例如，所需的化合物(I)或其盐的晶体)。添加晶种的温度不受具体限制，并优选是0℃至80℃。
可以根据溶剂适当地选择加热和溶解化合物(I)或其盐的温度，使得化合物(I)或其盐可以在该温度下溶解，但温度优选地在50℃至晶体溶剂开始回流的温度的范围内，更优选地为55℃至80℃。
由于急冷会产生不同形态的结晶(多晶型)，结晶时的冷却考虑到对晶体质量和品级的影响，应通过适当控制冷却速度来进行，优选冷却速度为例如5到40℃/小时。更优选地，按例如5至25℃/小时的冷却率进行冷却。
可以根据晶体的产率、质量等适当地选择最终结晶温度，并且其优选为-25℃至30℃。
可以通过普通过滤程序来分离通过结晶获得的晶体，如果需要用溶剂洗涤过滤的晶体，然后干燥，得到目标晶体。作为用于洗涤晶体的溶剂，可以使用与用于结晶的溶剂类似的那些。优选地，其实例包括乙醇、丙酮、2-丁酮、乙酸乙酯、二乙醚、叔丁基甲基醚和己烷。这些溶剂可以单独使用或与两种或更多种组合使用。
通过过滤程序分离的晶体可通过适当地放置在大气下或氮气流下、或者通过加热而干燥。
根据生产量、干燥装置、干燥温度等可以适当地选择干燥时间，直到残留溶剂的量低于特定量为止。干燥还可以在通风下或在减压下进行。减压的程度可以根据生产量、干燥装置、干燥温度等适当地选择。干燥后，也可以讲所获得的晶体视需要放置于大气中。
通过以上所述的生产方法获得的化合物(I)及化合物(I)的盐的晶体具有胆碱能神经元活化作用及/或神经保护作用(如下文所述的药理试验例中的活性数据所示)，且具有用作由胆碱能神经元的功能障碍引起的认知功能低下的改善剂的可能性。
[药物组合物]
本发明的另一个实施例是药物组合物，其包含化合物(I)的晶体和药学上可接受的添加剂。可通过将药学上可接受的添加物与化合物(I)的晶体混合来生产药物组合物。根据本发明的药物组合物可以通过已知方法来生产，例如，在Japanese PharmacopoeiaSeventeenth Edition[日本药典，第十七版]的General Rules for Preparations[制剂的通用规则]中所描述的方法。
根据本实施例的药物组合物可以取决于其剂型适当地施用至患者。
根据本发明的化合物(I)的剂量取决于症状的严重程度、年龄、性别、体重、剂型、盐的类型、疾病的具体类型和其他条件而变化；然而，一般而言，成人每天口服的剂量为约30μg至10g，优选100μg至5g，并且更优选100μg至1g；成人每天注射给药的剂量为约30μg至1g，优选100μg至500mg，并且更优选100μg至300mg；并且上述剂量给药一次或多次。
实例
本发明的化合物(I)的晶体可通过，例如以下实例所述的方法来生产，且该化合物的作用可通过以下测试实例中所述的方法来确认。然而，这些仅是实例，并且本发明无论如何不限于以下具体实例并且可以在不偏离本发明范围的范围内被修改。
以下实例中所生产的晶体的粉末X射线晶体衍射是将所获得的晶体装载在粉末X射线衍射装置的样品台，并且在下述任一条件下进行测量。
(透射条件)
X射線源：CuKα
电压：45kV
电流：40mA
光学系统：聚焦镜
索勒狭缝：0.02°
检测器：X’Celerator(半导体检测器)
扫描范围：5°至35°
步长：0.017°
扫描步进时间：600sec
样品保持器：Kapton膜
(反射条件)
X射線源：CuKα
电压：50kV
电流：300mA
狭缝：发散狭缝0.5mm、散射狭缝开口、接收狭缝开口
检测器：闪烁计数器
扫描速度：5°/min
取样间隔：0.02°
扫描范围：5°至35°
样品保持器：铝保持器
在铝样品盘中精密称取样品，并在以下的条件下进行热分析。
(测量条件)
大气：在氮气流下(100mL/min)
对照：空铝样品盘
升温速率：10℃/min
取样间隔：1sec
测量温度范围：室温至320℃
通过在以下的条件下将约300mg的固态样品封入样品管中来测量晶体的13C固态NMR光谱。
(测量条件)
使用的装置：Avance 400MHz(由布鲁克公司(BRUKER)制造)7mm-CPMAS探头(由布鲁克公司制造)
核测量：13C(共振频率100.6248425MHz)
测量温度：室温
脉冲模式：CPTOSS测量
转速：5000Hz
脉冲重复时间：3sec
接触时间：1msec
累计次数：5120次
参考材料：甘氨酸(外部基准：176.03ppm)
在以下的测量条件下，通过将样品置于拉曼显微光谱仪的样品台，测量晶体的拉曼光谱。
(测量条件)
使用的装置：RENISHAW拉曼显微镜inVia Reflex
激光波长：785nm
衍射光栅：1200线/mm
物镜：50倍
扫描模式：连续的
暴露时间5sec
累计次数：5次
测量范围：400-1800cm-1(拉曼位移)
误差：±2cm-1
用文献名等描述的化合物表示这些化合物是根据这些文献等生产的。
此外，本说明书中使用的缩写是本领域技术人员熟知且常见的。在本说明书中，使用以下缩写。
DMSO：二甲亚砜
IPA：异丙醇
n-：正
TEA：三乙胺
THF：四氢呋喃
1H-NMR：质子核磁共振光谱法
MS：质谱法
以下实例和生产实例中的术语“室温”通常是指约10℃至约35℃。除非另外说明，％是指重量百分数。
质子核磁共振光谱中的化学位移以相对于四甲基硅烷的δ单位(ppm)表示，并且偶联常数以赫兹(Hz)记录。裂分形式的縮寫如下：
s：单峰，d：二重峰，t：三重峰，q：四重峰，m：多重逢，br.s：宽单峰。
在使用参考实例的微波反应器的反应中，使用由拜泰齐公司生产的Initiator(TM)或Initiator+(TM)。
对于色谱法，作为硅胶，使用由默克公司(Merck)生产的硅胶60(70-230目ASTM)或由富士硅化学有限公司(Fuji Silysia Chemical Ltd.)生产的PSQ60B，或使用预填充柱{柱：由山善株式会社(YAMAZEN)生产的Hi-Flash(TM)柱(硅胶)，尺寸：S(16x60mm)、M(20x75mm)、L(26x100mm)、2L(26x150mm)、和3L(46x130mm)中的一个；或使用由拜泰齐公司生产的Biotage(TM)SNAP Ultra Silica柱体，尺寸：10g、25g、和50g中的一个}。
作为NH硅胶，使用由富士硅化学有限公司(Fuji Silysia Chemical Ltd.)生产的CHROMATOREX NH-DM2035，或使用预填充柱{柱：山善株式会社(YAMAZEN)生产的Hi-Flash(TM)柱(Amino)，尺寸：S(16x60mm)、M(20x75mm)、L(26x100mm)、2L(26x150mm)、和3L(46x130mm)中的一个；或使用由和光纯药工业株式会社(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)生产的Presep(TM)(Luer Lock)NH2(HC)，尺寸：M型(14g/25mL)、L型(34g/70mL)、2L型(50g/100mL)、和3L型(110g/200mL)中的一个}。
作为中性氧化铝，使用氧化铝90中性活性，70-230目，默克公司，E6NXX。
作为以下所示化合物的名称，除了通常使用的试剂之外，使用“E-Notebook[E-手册]”第12版(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中所示的那些。
参考实例1
5,10-二甲基-5,6,9,10,11,12-六氢吡啶并[4",3":4',5']噻吩并[2',3':4,5]嘧 啶并[1,2-a]噻吩并[3,2-f][1,4]二氮杂 -4,13-二酮(以下称为化合物(I))的合成
(1)乙基2-氨基-6-甲基-4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶-3-甲酸酯的合成
在室温下，将TEA(61.6mL，442mmol)添加到1-甲基-4-哌啶酮(CAS号1445-73-4)(51.5mL，442mmol)、氰乙酸乙酯(CAS号105-56-6)(47.2mL，442mmol)、硫(CAS No.7704-34-9)(14.2g，442mmol)和乙醇(800mL)的混合物中。将反应混合物在40℃搅拌15小时，并且然后在减压下浓缩。将残余物通过柱色谱法(NH硅胶，乙酸乙酯)进行纯化。将获得的浓缩残余物用乙酸乙酯进行研磨。通过过滤收集沉淀物，用乙酸乙酯洗涤，并且在减压下干燥，以产生标题化合物(58.4g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.33(t,J＝7.0Hz,3H),2.44(s,3H),2.62-2.70(m,2H),2.79-2.88(m,2H),3.37(t,J＝2.0Hz,2H),4.26(q,J＝7.3Hz,2H),5.97(br.s,2H)。
MS(ESI)m/z：241[M+H]+
(2)4-甲基-3,4-二氢-1H-噻吩并[2,3-e][1,4]二氮杂 -2,5-二酮的合成
将1H,2H,4H-噻吩并[2,3-d][1,3]噁嗪-2,4-二酮(CAS号103979-54-0)(600mg，3.55mmol)添加到肌氨酸(790mg，8.87mmol)在水(12mL)中的溶液中。将该反应混合物在回流下加热1.5小时。将该反应混合物冷却至室温。将氯仿添加到该反应混合物中，并且将有机层分离。将水层用氯仿(两次)和乙酸乙酯(3次)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，并且过滤，并且将滤液在减压下浓缩。将获得的固体进行干燥，以产生标题化合物(430mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)：3.23(s,3H),3.99(s,2H),6.90(d,J＝5.9Hz,1H),7.29(d,J＝5.7Hz,1H),8.39(br.s,1H)。
MS(ESI)m/z：197[M+H]+
(3)化合物(I)的合成
在室温下，将三氯氧磷(1.43mL，15.3mmol)添加到在步骤(2)中获得的4-甲基-3,4-二氢-1H-噻吩并[2,3-e][1,4]二氮杂-2,5-二酮(1.00g，5.10mmol)、在步骤(1)中获得的乙基2-氨基-6-甲基-4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶-3-甲酸酯(1.84g，7.64mmol)、和1,4-二噁烷(30mL)的混合物中。将该反应混合物在室温下搅拌5分钟，并且在90℃搅拌2小时。经5分钟，将乙醇钠(在乙醇中的20％溶液，21.7mL，56.1mmol)添加到冷却至室温的该反应混合物中。在室温下将该反应混合物搅拌1.5小时。将乙酸乙酯、饱和碳酸氢钠水性溶液、和水顺序地添加到该反应混合物中，并且将有机层分离。将水层用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层经无水硫酸镁干燥，并且过滤，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，20％-50％甲醇/乙酸乙酯)进行纯化。将获得的固体用乙醇研磨，并且通过过滤收集沉淀物。将获得的固体用乙醇洗涤并且在减压下干燥以产生标题化合物(712mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)：2.52(s,3H),2.71-2.87(m,2H),3.05-3.30(m,5H),3.59-3.75(m,2H),4.23(d,J＝14.8Hz,1H),4.57(d,J＝14.8Hz,1H),7.35(d,J＝6.2Hz,1H),7.39(d,J＝5.9Hz,1H)。
MS(ESI)m/z：373[M+H]+
实例1
制备化合物(I)的晶体
向1.5L的0.3M盐酸中添加152.08g的化合物(I)，并且向该溶液中添加450ml乙酸乙酯，随后搅拌5分钟。将水层分离并用450ml的乙酸乙酯清洗，并将不溶物通过过滤去除。在20℃水浴中向滤液中添加100ml的1N氢氧化钠水溶液并将混合物搅拌15分钟。向该混合物中添加350ml的1N氢氧化钠水溶液，并将所得悬浮液搅拌2小时30分钟。过滤收集所得结晶，依序用300ml、450ml、300ml的水，300ml、350ml及300ml的乙醇进行洗净，并在减压下加以干燥以获得141.7g标题晶体。
粉末X射线衍射峰(反射法，2θ±0.2°)：9.0°、11.1°、14.5°、18.1°、20.0°、21.9°、23.6°、24.4°、24.9°、28.5°
将通过上述方法所获得的化合物(I)晶体的粉末X射线衍射图示于图1。
实例2
制备化合物(I)单盐酸盐的A型晶体
向螺口试管中添加101mg的化合物(I)。向其中添加0.2mL的1.5M盐酸并溶解。添加IPA 1.8mL，用超声波照射后，用搅拌器在40℃下搅拌一天。在室温下进一步搅拌1小时后，通过使用过滤器(0.2μm)过滤来收集样品，用0.5mL的IPA/水(9/1，v/v)进行冲洗，在氮气流下风干。将残余物在70℃下干燥约1小时以产生标题晶体(103mg)。
粉末X射线衍射峰(透射法，2θ±0.2°)：6.1°、7.8°、11.6°、16.2°、19.9°、20.8°、25.2°、25.7°、26.9°、29.9°
13C-NMR(100MHz，固态)δ(ppm):164.0,162.5,160.5,153.9,151.6,150.7,133.6,131.1,129.6,128.4,126.9,125.2,123.7,121.3,120.3,119.5,53.7,52.0,50.9,44.7,36.5,22.6
拉曼位移峰(cm-1)：409、587、763、976、1428、1493、1688将通过上述方法所获得的化合物(I)单盐酸盐的A型晶体的粉末X射线衍射图示于图2，将13C-固态NMR光谱示于图9，将热分析TG-DTA图示于图12，并且将拉曼光谱示于图19。
实例3
制备化合物(I)单盐酸盐的C型晶体
向螺口试管中添加1020mg的化合物(I)。将1.5当量的盐酸(353μL)溶解于20mL的甲醇中，并将其添加至样品中。将样品用搅拌器在室温下搅拌2天。通过用过滤器(0.2μm)过滤来收集样品。将所获得的固体减压干燥约2小时后，然后在70℃下干燥1小时以产生标题晶体(1048mg)。
粉末X射线衍射峰(透射法，2θ±0.2°)：6.0°、7.7°、9.7°、11.4°、15.8°、16.9°、18.1°、23.2°、25.4°、27.6°
13C-NMR(100MHz，固态)δ(ppm):162.5,160.5,159.6,153.8,151.1,134.1,131.6,128.4,127.6,125.6,120.0,54.0,52.6,50.9,44.3,43.5,38.9,32.3,22.4
将通过上述方法所获得的化合物(I)单盐酸盐的C型晶体的粉末X射线衍射图示于图4，将13C-固态NMR光谱示于图11，并且将热分析TG-DTA图示于图14。
实例4
制备化合物(I)单盐酸盐的B型晶体
将实例3中所获得的盐酸盐晶体303mg添加至铂制坩埚中，在160℃下加热15分钟以产生标题晶体(293mg)。
粉末X射线衍射峰(透射法，2θ±0.2°)：6.3°、9.7°、10.1°、17.9°、19.0°、19.4°、23.4°、26.3°、27.3°、32.0°
13C-NMR(100MHz，固态)δ(ppm):162.0,160.1,153.8,151.1,133.4,130.7,128.3,126.9,125.6,120.3,51.2,43.6,32.3,22.3
将通过上述方法所获得的化合物(I)单盐酸盐的B型晶体的粉末X射线衍射图示于图3，将13C-固态NMR光谱示于图10，并且将热分析TG-DTA图示于图13。
实例5
制备化合物(I)单盐酸盐的D型晶体
将实例2和3中分别获得的227mg盐酸盐晶体的混合物及8mL乙醇添加至螺口试管中。将混合物用搅拌器在65℃下搅拌。约1小时后，将混合物用超声波照射，在相同温度下搅拌一天。通过用过滤器(0.2μm)过滤来收集样品以产生标题晶体(203mg)。
粉末X射线衍射峰(透射法，2θ±0.2°)：6.6°、14.6°、16.1°、20.5°、21.0°、23.0°、24.5°、26.4°、28.0°、32.5°
将通过上述方法所获得的化合物(I)单盐酸盐的D型晶体的粉末X射线衍射图示于图5，并且将热分析TG-DTA图示于图15。
实例6
制备化合物(I)单盐酸盐的E型晶体
将实例2中所获得的108mg盐酸盐晶体及5mL乙腈添加至螺口试管中。将混合物用搅拌器在60℃下搅拌一天，并将样品通过过滤器(0.2μm)过滤来收集。再次将所获得的固体及5mL乙腈添加至螺口试管中，并用搅拌器在60℃下搅拌一天。在氮气流下通过用过滤器(0.2μm)过滤来收集样品以产生标题晶体(89.7mg)。
粉末X射线衍射峰(透射法，2θ±0.2°)：6.4°、11.3°、15.7°、18.0°、19.2°、22.8°、24.6°、25.4°、26.0°、27.3°
将通过上述方法所获得的化合物(I)单盐酸盐的E型晶体的粉末X射线衍射图示于图6，并且将热分析TG-DTA图示于图16。
实例7
制备化合物(I)单盐酸盐的F型晶体
将实例2中所获得的101mg盐酸盐晶体及5mL乙醇添加至螺口试管中。将混合物用搅拌器在60℃下搅拌一天。通过用过滤器(0.2μm)过滤来收集样品。再次将所获得的固体及5mL乙醇添加至螺口试管中，并用搅拌器在60℃下搅拌4小时。通过用过滤器(0.2μm)过滤来收集样品以产生标题晶体(75.0mg)。
粉末X射线衍射峰(透射法，2θ±0.2°)：5.9°、7.3°、9.3°、10.7°、13.8°、15.6°、16.4°、18.7°、25.1°、26.8°
将通过上述方法所获得的化合物(I)单盐酸盐的F型晶体的粉末X射线衍射图示于图7，并且将热分析TG-DTA图示于图17。
实例8
制备化合物(I)单氢溴酸盐的晶体
向螺口试管中添加933mg的化合物(I)。在20mL的甲醇中溶解1.5当量(434μL)的氢溴酸，将其添加至样品中。将混合物用搅拌器在室温下搅拌3天。通过用过滤器(0.2μm)过滤来收集样品，在60℃下干燥1小时以产生标题晶体(1111mg)。
粉末X射线衍射峰(透射法，2θ±0.2°)：6.0°、7.8°、10.0°、11.7°、17.8°、20.8°、23.5°、24.5°、25.2°、27.3°
将通过上述方法所获得的化合物(I)单氢溴酸盐的粉末X射线衍射图示于图8，并且将热分析TG-DTA图示于图18。
<药理学测试实例>
在NGF存在下测量大鼠原代隔区神经元培养系统中乙酰胆碱(ACh)的释放
(1)大鼠原代隔区神经元培养
从胎龄18天的斯普拉格-道利(Sprague-Dawley，SD)大鼠(查尔斯河实验室日本公司(Charles River Laboratories Japan,Inc.))中分离隔区，并且培养。特别地，在异氟烷麻醉下，将胎儿无菌地从妊娠大鼠中取出。从每个胎儿中提取大脑，并且浸入冰冷却的L-15培养基(11415-064，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中。在立体显微镜下，从提取的大脑解剖出隔区。在37℃下，使解剖的隔区在含有0.25％胰蛋白酶(15050-065，赛默飞世尔科技公司)和0.01％DNA酶(D5025-150KU，西格玛公司)的酶溶液中经受酶处理持续30分钟，从而使细胞分散。在这种情况下，通过添加灭活的马血清(26050-088，赛默飞世尔科技公司)来终止该酶反应。将酶处理的溶液以1000rpm离心3分钟，并且去除上清液。将10mL的量的培养基添加到获得的细胞团块中。所使用的培养基为补充有N2补充剂(17502-048，赛默飞世尔科技公司)、1mM丙酮酸钠(11360-070，赛默飞世尔科技公司)和青霉素-链霉素(15140-1221，赛默飞世尔科技公司)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(044-29765，和光公司(WAKO))。通过轻柔移液使添加该培养基的细胞团块的细胞再分散，并且然后以1000rpm再离心3分钟，并且去除上清液。将10mL的量的培养基添加到获得的细胞团块中，并且通过40-μm尼龙网(细胞过滤网)过滤细胞分散液以去除细胞团块，从而获得神经元细胞悬浮液。用培养基稀释神经元细胞悬浮液，并且添加10％灭活牛血清(26140-079，赛默飞世尔科技公司)和10％灭活马血清。此后，将100μL/孔的悬浮液接种在预涂有聚-D-赖氨酸的96孔板(354461，康宁公司(CORNING))中，使得初始培养密度为1.4x105个细胞/cm2。在将接种的细胞在37℃培养箱中在5％CO2-95％空气下培养2天之后，用120μL新鲜培养基代替整个培养基，并且随后培养细胞持续5天。
(2)化合物添加
在培养的第7天，以下列方式添加化合物。用培养基稀释测试化合物在DMSO中的溶液，使得浓度比最终浓度高10倍。以0.3ng/mL制备NGF(450-01，派普泰克公司(PEPRO TECH,INC.))。将这两种溶液各自以15μL/孔的量添加，并且将混合物充分混合。最终的DMSO浓度为0.1％或更低。此外，仅将DMSO和NGF添加到对照组中。
(3)ACh释放测量
在化合物添加后一天，通过HPLC以下列方式测量ACh释放量。在消除培养基之后，将温热的缓冲液以100μL/孔添加到孔中，并且立即去除缓冲液。此后，以120μL/孔添加缓冲液，该缓冲液添加有10μM胆碱、10μM毒扁豆碱、和6mM KCl。该缓冲液通过添加125mM NaCl、25mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、2.2mM CaCl2(2H2O)和10mM葡萄糖至灭菌水来制备，并且该溶液的最终pH设定为7.4。在将添加了缓冲液的96孔板在37℃培养箱中在5％CO2-95％空气下孵育40分钟之后，收集80μL的缓冲液。将内标溶液IPHC(5x10-7M)以6μL的量添加到收集的缓冲液中，并将缓冲液转移到用于HPLC测量的管中并且进行HPLC测量。结果通过各化合物的效果表示为对照组缓冲液中ACh浓度的百分比(对照的％)，并且显示比对照组缓冲液中ACh浓度增加20％的参考实例1的化合物浓度为0.1μM。
大鼠隔区中胆碱乙酰基转移酶(ChAT)mRNA表达水平的测量
(1)化合物施用
在该研究中，使用体重为约250g至350g的SD雄性大鼠(查尔斯河实验室日本公司(Charles River Laboratories Japan,Inc.))。将化合物溶解在0.01mol/L盐酸中，并且口服施用。
(2)取样
在施用化合物后24小时，在戊巴比妥麻醉下收集全脑组织。在冰上从全脑分离内侧隔核并用液氮冷冻，并且然后在-80℃储存。
(3)ChAT mRNA表达水平的测量
对于RNA纯化，在该研究中使用RNeasy Plus迷你试剂盒(#74136：凯杰公司(QIAGEN))。通过该试剂盒中描述的方法进行RNA纯化。RNA纯化之后，通过使用QIAxpert仪器(凯杰公司)测量总RNA浓度。使用SuperScript(R)VILO(TM)cDNA合成试剂盒(#11754：赛默飞世尔科技公司)合成cDNA。通过该试剂盒中描述的方法进行cDNA的合成。将合成的cDNA用无RNA酶的水稀释4倍，并且将稀释的cDNA溶液用作样品。将Taqman通用PCR预混合液(#4304437：赛默飞世尔科技公司)、Taqman(R)基因表达测定,INVENTORIED(#4331182：赛默飞世尔科技公司)、无RNA酶的水、以及该cDNA溶液各自以10μl、1μl、4μl、和5μl的量混合，并且将所得混合物用作测量样品溶液。通过荧光探针法，使用ABI PRISM(R)7900HT(赛默飞世尔科技公司)进行定量聚合酶链式反应(qPCR)。通过SDS 2.4(赛默飞世尔科技公司)进行分析。通过相比运载体施用组中ChAT mRNA表达水平的量增加的参考实例1的化合物施用组中ChAT mRNA表达水平的量的百分比来计算结果为在10mg/kg为56.4％。
测量大鼠脑脊液(CSF)中的乙酰胆碱(ACh)
(1)背景
通过对啮齿动物的研究揭示了脑内神经递质的增加和减少与脑脊液(CSF)中神经递质的增加和减少之间的相关性，并且在人类中也观察到该相关性(Lowe S等人Psychopharmacology[精神药理学]219(2012)959-970)。因此，测量CSF中乙酰胆碱的变化以确定由测试化合物引起的脑内乙酰胆碱的变化。
(2)化合物施用
在该研究中，使用体重为约150g至250g的Fischer344雄性大鼠(查尔斯河实验室日本公司(Charles River Laboratories Japan,Inc.))。将测试化合物以10mg/kg每天一次口服施用大鼠，持续三天。所使用的运载体是0.01mol/L的盐酸。
(3)取样
在施用运载体和测试化合物后24小时，在戊巴比妥麻醉下，在含有AchE抑制剂的试管中从小脑延髓池收集CSF。在3500x g下在4℃将收集的CSF离心10分钟，并收集上清液。将收集的上清液用液氮冷冻，然后在-80℃储存。
(4)通过LC-MS测量Ach
向10μL的CSF中添加50μL的终浓度为0.34nmol/L的乙酰胆碱-d9氯化物(ACh-d9)作为内标。对混合物进行移液并在1500x g下在4℃离心10分钟。收集上清液并进行LC/MS(NexeraX2(MS)，TSQ Altis(HPLC))，并且Ach在m/z 146.050处被检测为前体离子且在m/z87.071处被检测为产物离子，并且ACh-d9作为内标在m/z155.088处被检测为前体离子且在m/z 87.000处被检测为产物离子。通过相比运载体给药组中CSF中ACh浓度增加的参考实例1的化合物施用组中CSF中ACh浓度的百分比(对照％)计算来计算结果为156.8％。
评估人τP301S转基因小鼠
(1)化合物施用
在该研究中，每天一次将测试化合物口服施用人τP301S转基因小鼠，从四月龄至七月龄，持续三个月。所使用的运载体是0.01mol/L的盐酸。
(2)取样
在施用的最初一天(四月龄)和最后一次施用的第二天，将运载体施用组和测试化合物施用组的小鼠在戊巴比妥(50mg/kg，腹膜内施用)下麻醉并用PBS灌注。灌注后，收集包含内侧隔区的前脑并用4％多聚甲醛固定。
(3)制备脑冠状冷冻切片
将收集的包含内侧隔区的前脑浸入4％多聚甲醛中并振荡过夜。用7.5％蔗糖溶液替换该浸渍溶液。将其浸入7.5％蔗糖溶液中并振荡过夜，并用15％蔗糖溶液替换该浸渍溶液，并且将其浸入并振荡过夜。用30％蔗糖溶液替换该浸渍溶液，并将其浸入并振荡过夜。通过使用切片机(莱卡公司(Leica)，SM2000R)从包含内侧隔区的前脑制备具有30μm厚度的脑冠状冷冻切片。
(4)胆碱乙酰基转移酶(ChAT)阳性细胞的免疫组织化学
使用ChAT抗体(圣克鲁斯公司(Santa Cruz)，SC-20672)作为第一抗体，用DAB(DAB过氧化物酶底物试剂盒(维克多公司(Vector)，SK-4100))对制备的脑冠状冷冻切片进行染色。通过一体化荧光显微镜(基恩士公司(KEYENCE)，BZ-X710)拍摄包含内侧隔区的切片图像，如“The mouse Brain in stereotaxic coordinates[立体定位坐标中的小鼠的脑]”(COMPACT THIRD EDITION[合同第三版],Keith B.J.Franklin&George Paxinos)中所示，并且通过BZ分析软件(基恩士公司)对内侧隔区长轴周围的ChAT阳性细胞进行计数。结果显示为运载体施用组和测试化合物施用组中ChAT阳性细胞数相对于初次施用时(四月龄)的ChAT阳性细胞数的百分比。数据表示为平均值±SEM。通过非配对t检验来分析初次施用时的组与运载体处理组之间的差异(显著性：*)，并且还通过非配对t检验来分析载体处理组和化合物处理组之间的差异(显著性：#)。P<0.05的值被认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism版本7.02进行统计学分析。将结果示于表1。
[表1]
使用穹窿海马伞损伤的大鼠模型，胆碱能神经元的神经保护和恢复作用
(1)制备穹窿海马伞损伤的大鼠模型
在该研究中，使用体重为约250g至350g的斯普拉格-道利雄性大鼠(查尔斯河实验室日本公司(Charles River Laboratories Japan,Inc.))。在三种药物：咪达唑仑(2mg/kg，皮下)、盐酸美托咪定(0.15mg/kg，皮下)和酒石酸布托啡诺(2.5mg/kg，皮下)的组合下将大鼠进行麻醉，并用脑立体定向装置(成重有限公司(Narishige Co.,Ltd.))固定。暴露颅骨，并从前囟后侧2mm处的中线在头骨中钻出一个5mm宽的孔。将宽度为4mm的剃刀以5.5mm深度刺入前囟中以切割穹窿海马伞。止血后，将头皮缝合。手术后，将大鼠带回笼中并使其从麻醉中恢复。在假手术组中，从前囟后侧2mm处的中线在头骨中钻出一个5mm宽的洞，但没有刺入剃刀。
(2)化合物施用
在手术后五天至九天(实例1：10mg/kg)或手术后七天至十四天(实例3：3mg/kg)，将测试化合物每天一次口服施用大鼠。所使用的运载体是0.01mol/L的盐酸。在假手术组中，与测试化合物施用组类似地每天一次口服施用运载体。
(3)取样
将大鼠在戊巴比妥下进行麻醉并用冰冷的PBS经心脏灌注。灌注后，收集包含内侧隔区的前脑并用4％多聚甲醛浸没并振荡过夜。用7.5％蔗糖溶液替换该浸渍溶液。将其浸入7.5％蔗糖溶液中并振荡过夜，并用15％蔗糖溶液替换该浸渍溶液，并且将其浸入并振荡过夜。用30％蔗糖溶液替换该浸渍溶液，并将其浸入并振荡过夜。通过使用切片机(莱卡公司(Leica)，SM2000R)从包含内侧隔区的前脑制备具有30μm厚度的脑冠状冷冻切片。
(4)胆碱乙酰基转移酶(ChAT)阳性细胞和囊泡乙酰胆碱转运蛋白(VAChT)的免疫 组织化学
使用ChAT抗体(圣克鲁斯公司，SC-20672)或VAChT抗体(默克密理博公司(MerckMillipore)，ABN100)作为第一抗体，用DAB(DAB过氧化物酶底物试剂盒(维克多公司，SK-4100))对制备的脑冠状冷冻切片进行染色。通过一体化荧光显微镜(基恩士公司，BZ-X710)拍摄包含内侧隔区或海马体的切片图像，如“The mouse Brain in stereotaxiccoordinates[立体定位坐标中的小鼠的脑]”(COMPACT THIRD EDITION[合同第三版],Keith B.J.Franklin&George Paxinos)中所示，并且通过BZ分析软件(基恩士公司)测量内侧隔区中的ChAT阳性细胞或海马体VAChT中的光密度(OD)。结果显示为运载体施用组和测试化合物施用组中的内侧隔区中ChAT阳性细胞数或海马体VAChT中的OD相对于假手术组中的内侧隔区中ChAT阳性细胞数或海马体VAChT中的OD的百分比。数据表示为平均值±SEM。通过非配对t检验来分析运载体处理组和化合物处理组之间的差异(显著性：#)。P<0.05的值被认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism版本7.02进行统计学分析。将结果示于表2和3。
[表2]
[表3]
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