具体实施方式

定义

为了更容易地理解本发明，以下首先定义某些术语。对于以下术语和其它术语的附加定义记载在整个说明书中。

施用：

如本文所用，术语“施用”是指将组合物递送或应用至受试者或系统。可通过任何适当的途径施用至动物受试者(例如，施用至人类)。例如，在一些实施方案中，施用可以是支气管内(包括由支气管滴注)、口腔内、肠内、真皮间、动脉内、真皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、粘膜、鼻腔、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括由气管内滴注)、经皮、阴道和玻璃体。

生物学活性：

如本文所用，短语“生物学活性”是指在生物系统中具有活性的任何物质(例如，细胞培养物、生物体等)的特征。例如，当施用至生物体时对该生物体具有生物作用的物质，被认为是具有生物学活性的。生物学活性也可通过体外检测(例如，体外酶检测)来确定。在特定实施方案中，当蛋白质或多肽为具有生物学活性时，共享该蛋白质或多肽的至少一种生物学活性的该蛋白质或多肽的一部分通常称为“生物学活性”部分。在一些实施方案中，蛋白质产生自和/或纯化自细胞培养系统，其在施用至受试者时表现生物学活性。

对照：

如本文所用，术语“对照”具有其领域理解的含义，作为针对所比较的结果的标准。通常，对照用于通过分离变量来得出关于此类变量的结论而增加实验的完整性。在一些实施方案中，对照是与试验反应或检测同时进行的反应或检测以提供比较者(comparator)。在一个实验中，应用“试验”(即，被试变量)。在第二个实验中，不应用作为被试变量的“对照”。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，先前进行的试验或检测的历史对照、或先前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照为或包括打印的或以其它方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。在一些实施方案中，对照可以是“参考对照”，其是用于与试验样品相比较来寻找差异或出于表征目的的样品。

基因治疗:

如本文所用，术语“基因治疗”是指包括将核酸直接或间接施用至受试者的任何治疗。在特定实例中，从施用的核酸表现出蛋白质的治疗价值。

同一性：

如本文所用，术语“同一性”是指聚合分子之间，例如核酸分子之间(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间的整体相关性。两条核酸序列的同一性百分比的计算，例如，可通过出于最佳比较目的比对两条序列来进行(例如，为了最佳比对可以在第一和第二核酸序列中的一条或两条中引入空位和为了比较目的可忽略非同一序列)。在某些实施方案中，用于比较目的而比对的序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或实质上100％。然后比较在相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置处为同一的。考虑到需要引入以实现两条序列的最佳比对的空位数、和各个空位的长度，两条序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数。可使用数学算法来完成序列的比较和两条序列之间的同一性百分比的确定。例如，可通过使用Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)来确定两条核苷酸序列之间的同一性百分比，其已被整合至使用PAM120权重残基表(weight residue table)、空位长度罚分为12和空位罚分为4的ALIGN程序(版本2.0)。可选地，两条核苷酸序列之间的同一性百分比可使用通过使用NWSgapdna.CMP矩阵的GCG软件包中的GAP程序来确定。各种其它的序列比对程序是可获得的并且可用于确定序列同一性，例如Clustal等。

改善、增加、或降低：

如本文所用，术语“改善”、“增加”或“降低”、或语法等同物，指示相对于基线测定，例如在本文所描述的治疗开始之前相同个体中的测定、或在不存在本文所描述的治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测定的值。“对照个体”是患有与正在治疗的个体所患有的相同种类或几乎相同严重程度的例如阿尔茨海默症的个体，所述个体与正在治疗的个体年龄大致相同(以确保治疗的个体和对照个体(一个或多个)的疾病的阶段是可比较的)。

神经退行性病变：

如本文所用，术语“神经退行性病变”是指其中一个或多个神经元受损、功能降低、变为功能障碍的、和/或因死亡而丧失的过程。神经退行性病变包括快速的、逐步的二者，以及中间形式。因此，神经退行性疾病、病况、或症状通常表征为与神经元损伤和/或死亡相关的疾病。

受试者：

如本文所用，术语“受试者”是指人类或任何非人类的动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长目动物)。人类包括产前和产后形式。在许多实施方案中，受试者为人类。受试者可以是患者，其是指为了诊断或治疗疾病而与医疗人员见面的人。术语“受试者”与“个体”或“患者”在本文中可交换地使用。受试者可患有或易患有疾病或病症，但可以表现或不表现该疾病或病症的症状。

遭受：

“遭受”疾病、病症、和/或病况(例如，阿尔茨海默症)的个体已被诊断具有或显示该疾病、病症、和/或病况的一个或多个症状。

易患有：

“易患有”疾病、病症、和/或病况的个体并未被诊断具有和/或可以不显示疾病、病症、和/或病况的症状。在一些实施方案中，易患有疾病、病症、和/或病况(例如，阿尔茨海默症)的个体可表征为以下的一个或多个：(1)与疾病、病症、和/或病况的发展相关的基因突变；(2)与疾病、病症、和/或病况的发展相关的基因多态性；(3)与疾病、病症、和/或病况相关的蛋白质的表达和/或活性的增加和/或降低；(4)与疾病、病症、和/或病况的发展相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症、和/或病况的家族史；(6)对某些细菌或病毒的反应；(7)暴露于某些化学物质。在一些实施方案中，易患有疾病、病症、和/或病况的个体将发展为疾病、病症、和/或病况。在一些实施方案中，易患有疾病、病症、和/或病况的个体将不发展为疾病、病症、和/或病况。

治疗有效量：

如本文所用，术语“治疗有效量”是指以合理的收益/风险比适用于任何医疗治疗的对所治疗的受试者赋予治疗效果的治疗性蛋白质。治疗效果可以是客观的(即，由一些试验或标记物可测定的)或主观的(即，受试者给出效果的迹象或感觉)。特别地，“治疗有效量”是指有效治疗、改善、或预防预期的疾病或病况，或例如通过改善与疾病相关的症状、预防或延迟疾病的发作、和/或还减轻疾病的症状的严重程度或频率而显示可检测的治疗或预防效果的治疗性蛋白或组合物的量。通常以可包括多个单位剂量的给药方案施用治疗有效量。对于任何特定的治疗性蛋白质，治疗有效量(和/或在有效给药方案内的合适的单位剂量)可例如依施用途径、与其它药物制剂组合而变化。并且，用于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于包括以下的各种因素：待治疗的病症和病症的严重程度；采用的特定药物制剂的活性；采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间、施用途径、和/或采用的特定融合蛋白的分泌或代谢的速率；治疗持续时间；和在医疗领域众所周知的其他因素。

治疗：

如本文所用，术语“治疗”(名词、动词或动名词形式)，在其最广义的含义中，是指对一种或多种症状、特征、和/或特定疾病、病状、和/或病况的病因的部分或完全缓解、改善、再生、抑制、延迟其发作、降低其严重程度、和/或降低其发生率。在一些实施方案中，这样的治疗可施用至不显示相关疾病、病症和/或病况的征兆的受试者和/或仅显示疾病、病症、和/或病况的早期征兆的受试者。可选地或另外地，在一些实施方案中，治疗可施用至显示相关疾病、病症和/或病况的一个或多个确定的征兆的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已被诊断遭受相关疾病、病症和/或病况的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已知具有与相关疾病、病症和/或病况的发展的增加的风险在统计学上相关的一个或多个敏感因子(susceptibility factor)的受试者。

尽管，一般而言“PS1”是指早老素-1蛋白，且“PS2”是指早老素-2蛋白，在一些情况中，PS1或PS2用于指mRNA或基因。

详细说明

除了其它方面，本公开提供基于递送功能性早老素-1(PS1)和/或早老素-2(PS2)的用于治疗患有阿尔茨海默症和其它神经退行性疾病、病症和病况的受试者的组合物和方法。特别地，本公开考虑通过向有治疗需要的受试者提供编码早老素-1(PSEN1)和/或早老素-2(PSEN2)基因的多核苷酸的基因治疗。然而，在一些实施方案中，还可使用早老素-1(PS1)和/或早老素-2(PS2)。

在以下部分中详细描述本发明的各个方面。这些部分的使用不意在限制本发明。每个部分可应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。

治疗方法

作为非限制性实例，本方法包括在患有或易患有，例如与PSEN1或PSEN2中的突变(例如，显性阴性突变)相关的神经退行性疾病，例如阿尔茨海默症(例如，携带PSEN1或PSEN2突变的家族性AD患者或散发性AD患者)的受试者中表达野生型人早老素-1或早老素-2的基因治疗。除了其它方面，这样的基因治疗的目的在于在家族性或散发性AD患者的脑中增强PS1或PS2表达以校正或克服PS1或PS2表达和/或活性中的不足。在FAD患者中，预期本文所描述的基因治疗方法引起脑中野生型PS1或PS2的表达的增加，挽救与PS1或PS2突变相关的γ-分泌酶活性的损害。

早老素基因–PSEN1和PSEN2–中的突变为高度外显的且占家族性AD(FAD)中识别的全部突变的约90％，突出了其在AD的发病机理中的重要性。已报告超过260种的PSEN1中的明显的突变，并且它们为显性遗传的且多数为错义突变。致病性PSEN1突变以顺式起作用损害突变的PS1功能和以反式起作用抑制野生型PS1功能(Heilig等人.J Neurosci 33:11606-717(2013)；Zhou等人.Proc Natl Acad Sci USA114:12731–12736(2017)。典型地，由于其自身性质，显性阴性突变不可通过野生型蛋白质的表达来挽救(Herskowitz,I.Nature,329:219-222(1987))。然而，令人惊讶地，如本文所示，hPSEN1 cDNA转染至携带杂合和纯合PSEN1突变的永生化MEF挽救了这些细胞中的受损的γ-分泌酶活性(参见实施例，下文)，令人惊讶地表明野生型PS1蛋白的过度表达可克服突变早老素蛋白的显性阴性效果。早老素是γ-分泌酶复合物的催化亚单元，其也包括Nicastrin、APH-1(前咽缺陷蛋白1)和PEN-2(早老素增强子2)，其全部是γ-分泌酶复合物的组装、稳定性和活性所需的。令人惊讶地，并且不期望被理论所束缚，认为基于目前的数据，野生型早老素蛋白可取代γ-分泌酶复合物中的突变早老素蛋白。因此，野生型PS1或PS2蛋白的表达可用于挽救AD患者中γ-分泌酶表达和/或活性的损害。

本文所描述的方法和组合物可同等地用于治疗其它神经退行性疾病、病症或病况。

阿尔茨海默症

本文所描述的方法可用于治疗具有包括但不限于家族性和散发性阿尔茨海默症、早发性或晚发性阿尔茨海默症的全部种类的阿尔茨海默症的受试者或降低其发展的风险。在一些实施方案中，本方法可用于治疗与早老素-1(PS1)和/或早老素-2(PS2)中的突变相关的阿尔茨海默症(AD)的早发型家族型或降低其发展的风险(Sherrington,等人.,Nature375:754-760(1995)；Rogaev,等人,Nature 376:775-778(1995)；Levy-Lahad,等人,Science 269:970-973(1995)；Hiltunen,等人,Eur.J.Hum.Genet.8:259-266(2000)；Jonghe,等人,Hum.Mol.Genet.8:1529-1540(1999)；Tysoe,等人,Am.J.Hum.Genet.62:70-76(1998)；Crook,等人,Nat.Med.4:452-455(1998)，其全部内容通过引用结合在此)。

在一些实施方案中，本方法可用于治疗具有PSEN1或PSEN2等位基因中的突变，例如对野生型PS1/PS2蛋白具有显性阴性效果的突变的受试者。示例性突变包括C410Y、Δex9、G548、D257A、L166P、R278I、L435F、G384A、Y115H、和L392V、以及N141I、G206A、H163R、A79V、S290C、A260P、A426P、A431E、R269H、L271V、C1410Y、E280G、P264L、E185D、L235V、和M146V突变(参见，例如，Heilig等人,J.Neurosci.,33(28):11606-11617(2013)；Watanabe等人,J.Neurosci.32(15):5085–5096(2012)；Brouwers等人,2008Ann Med 40(8):562–83)；Watanabe和Shen,PNAS 2017年11月28日114(48)12635-12637；Zhou等人,PNAS 2017年11月28日114(48)12731-12736；Hsu等人,Alzheimers Res Ther.2018年7月18日；10(1):67)。可对野生型PS蛋白具有显性阴性效果的另外的示例性突变可包括但不限于，在PSEN-1中：N32N；R35Q；D40del(delGAC)；D40del(delACG)；E69D；A79V；V82L；I83_M84del(DelIM,ΔI83/M84,ΔI83/ΔM84)；I83T；M84V；L85P；P88L；V89L(G>T)；V89L(G>C)；C92S；V94M；V96F；V97L；T99A；F105C；F105I；F105L；F105V；R108Q；L113_I114insT(内含子4,InsTAC,p.113+1delG,剪接子5)；L113P；L113Q；Y115C；Y115D；Y115H；T116I；T116N；T116R；P117A；P117L；P117R；P117S；E120D(A>C)；E120D(A>T)；E120G；E120K；E123K；Q127_R128del(CAGA)；InsG(G)(c.379_382delXXXXinsG)；H131R；S132A；L134R；N135D；N135S；N135Y；A136G；M139I(G>C)；M139I(G>A)；M139K；M139L；M139T；M139V；V142F；I143F；I143M；I143N；I143T；I143V；M146I(G>C)；M146I(G>T)；M146I(G>A)；M146L(A>C)；M146L(A>T)；M146V；T147I；T147P；L150P；L153V；Y154C；Y154N；Y156F；Y156_R157insIY；R157S；H163P；H163R；H163Y；A164V；W165C(G>C)；W165C(G>T)；W165G；L166H；L166P；L166R；L166V；L166del；I167del(TTAdel)；I167del(TATdel)；I168T；S169del(ΔS169,Ser169del,ΔS170)；S169L；S169P；S170F；S170P；L171P；L173F(G>C)；L173F(G>T)；L173W；L174del；L174M；L174R；F175S；F176L；F177L；F177S；S178P；G183V；E184D；E184G；V191A；I202F；G206A；G206D；G206S；G206V；G209A；G209E；G209R；G209V；S212Y；I213F；I213L；I213T；H214D；H214N；H214Y；G217D；G217R；L219F；L219P；L219R；R220P；Q222H；Q222P；Q222R；Q223R；L226F；L226R；I229F；S230I；S230N；S230R；A231P；A231T；A231V；L232P；M233I(G>A)；M233I(G>C)；M233L(A>T)；M233L(A>C)；M233T；M233V；L235P；L235R；L235V；F237I；F237L；I238M；K239N；T245P；A246E；A246P；L248P；L248R；L250F；L250S；L250V；Y256S；A260V；V261F；V261L；L262F；L262V；C263F；C263R；P264L；G266S；P267A；P267L；P267S；R269G；R269H；L271V；V272A；E273A；E273G；T274R；A275V；R278I；R278K；R278S；R278T；E280A；(Paisa)；E280G；E280K；L282F；L282R；L282V；F283L；P284L；P284S；A285V；L286P；L286V；T291A；T291P；K311R；E318G；D333G；R352C；R352_S353insR；T354I；R358Q；S365A；S365Y；R377M；R377W；G378E；G378V；G378fs；L381F；L381V；G384A；F386I；F386S；F388L；S390I；S390N；V391F；V391G；L392P；L392V；G394V；A396T；N405S；I408T；A409T；C410Y；V412I；I416T；G417S；L418F；L420R；L424F；L424H；L424R；L424V；A426P；A431E；(Jalisco)；A431V；A434C；A434T；L435F；P436Q；P436S；I437V；I439S；I439V；T440del；869-2A>G；869-22_869-23ins18(ΔE9,Δ9,ΔE9)；I238_K239insI；S290C；T291_S319del(ΔE9Finn,Δ9Finn,Δ9)；S290C；T291_S319del(ΔE9,Δ9)；S290C；T291_S319del A>G(ΔE9,Δ9)；S290C；T291_S319del G>A(ΔE9,Δ9)；S290C；T291_S319del G>T(ΔE9,Δ9)；或S290W；S291_R377del(Δ9-10,Δ9-10,p.Ser290_Arg377delinsTrp,g.73671948_73682054del)(相对于Uniprot P49768.1/GenBankRef.No.NM_000021.4命名突变)，和在PSEN-2中：T18M；R29H；G34S；R62C；R62H；P69A；R71W；K82R；A85V；V101M；K115Efs*；T122P；T122R；P123L；E126fs；E126K；S130L；V139M；N141I(Volga German)；N141Y；L143H；V148I；K161R；R163H；H169N；M174V；S175C；G212V；V214L；Q228L；Y231C；I235F；A237V；L238F；L238P；M239I；M239V；A252T；A258T；T301M；K306fs；P334A；P334R；P348L；A377V；V393M；T430M；或D439A，相对于UniprotP49810.1/GenBank Ref.No.NP_000438.2命名突变)。参见，例如，Sun等人,Proc Natl AcadSci USA.2017；114:E476–E485；Heilig等人,J Neurosci.2013年7月10日；33(28):11606-17；Zhou等人,PNAS 2017年11月28日114(48)12731-12736。在一些实施方案中，方法可包括例如使用本领域已知的方法来确定受试者具有这样的突变。

典型地，增加的健忘或轻微的混淆是阿尔茨海默症的早期症状。逐渐地，与阿尔茨海默症相关的认知损害导致记忆特别是近期的记忆丧失，迷失方向和对空间关系的曲解，说话、书写、思考、推理困难，性格和行为中的改变导致抑郁、焦虑、社交退缩、情绪波动、对他人的不信任、易怒和攻击性，睡眠习惯的改变，神志恍惚，失去自制力，妄想，并最终死亡。

其它神经退行性疾病、病症或病况

除了阿尔茨海默症以外，本方法可用于治疗其它神经退行性疾病、病症或病况，包括颞额叶痴呆，各种类型的记忆丧失，包括但不限于轻度认知损害(MCI)的认知损害，或与PS1丧失例如由于产生显性阴性同种型的突变相关的其它病况。

早老素-1(PSEN1)和/或早老素-2(PSEN2)

适用于本文所描述的组合物和方法的编码早老素-1(PS1)或早老素-2(PS2)的多核苷酸可包括全长基因或其编码保留野生型蛋白质的实质性γ分泌酶活性如γ分泌酶活性的至少50％、或由(例如，在包括实施例部分中描述的那些的体外γ分泌酶检测，也参见Watanabe等人,J.Neurosci.32(15):5085–5096(2012))确定的野生型蛋白质的活性的至少60、70、80、90、或95％的蛋白质的部分或片段。在一些实施方案中，合适的编码PS1或PS2的多核苷酸分别与全长野生型基因组或cDNA PSEN1或PSEN2序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。在一些实施方案中，合适的PSEN1或PSEN2基因分别编码与全长野生型PS1或PS2蛋白序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的蛋白序列。人PSEN1/PS1或PSEN2/PS2的示例性野生型基因组、cDNA、和蛋白序列在表1和下文中示出。用于其它物种的序列为本领域已知的。PS1和PS2通常裂解为作为活性形式的N-和C-末端片段。PS-1被加工为两个片段：N末端28kDa片段，和C末端18kDa片段；主要内切蛋白酶解(endoproteolytic)裂解在大亲水性环的近端部分中的Met298处或其附近发生(Podlisny等人,Neurobiol Dis.1997；3(4):325-37；Marambaud等人,EMBO J.2002年4月15日；21(8):1948-56)。包括或编码这些裂解的形式的序列还可用于本文所描述的方法和组合物，例如编码SEQ ID NO:5的氨基酸1-291、1-292、1-293、1-294、1-295、1-296、1-297、1-298、或1-299或SEQ ID NO:6-8的相应片段。

表1：GenBank登录号。

>NM_000021.3 智人早老素1(PSEN1)，转录本1，

mRNA(SEQ ID NO：1)

>NH_007318.2 智人早老素1(PSEN1)，转录本2，

mRNA(SEQ ID NO：2)

>NH_000447.2 智人早老素2(PSEN2)，转录本1，

mRNA(SEQ ID NO：3)

>NM_012486.2 智人早老素2(PSEN2)，转录本2，

mRNA(SEQ ID NO：4)

>NP_000012.1 早老素-1同种型I-467[智人](SEQ ID NO：5)

>NP_015557.2 早老素-1同种型I-463[智人](SEQ ID NO：6)

>NP_000438.2 早老素-2同种型1[智人](SEQ ID NO：7)

>NP_036618.2 早老素-2同种型2[智人](SEQ ID NO：8)

为了确定两条氨基酸序列、或两条核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的而比对序列(例如，为了最佳比对可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一条或两条中引入空位和为了比较目的可忽略非同源序列)。用于比较目的而比对的参考序列的长度是参考序列的长度的至少80％，并且在一些实施方案中为至少90％或100％。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处为同一的。考虑到需要引入以实现两条序列的最佳比对的空位数、和各个空位的长度，两条序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数。在其它实施方案中，两条氨基酸序列的同一性百分比可作为两条氨基酸序列中相应位置处相同的氨基酸家族(例如，带正电、带负电、极性和不带电的、疏水的)内的氨基酸残基的保守性的函数(例如，在两条序列中特定位置处存在的丙氨酸残基替换缬氨酸残基显示高度保守性，但在两条序列中特定位置处存在的精氨酸残基替换天冬氨酸残基则显示低度保守性)。

例如，两条氨基酸序列之间的同一性百分比可使用已被整合至GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法、使用例如具有默认值的空位罚分、空位延伸罚分为4、和移码空位罚分的Blossum得分矩阵来确定。

突变的早老素1

在一些实施方案中，PS1蛋白包含突变。在一些实施方案中，突变为保守替换。这样的改变包括任意的异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、和亮氨酸(L)对这些疏水性氨基酸的任何其它氨基酸的替换；天冬氨酸(D)对谷氨酸(E)的替换，反之亦然；谷氨酰胺(Q)对天冬酰胺(N)的替换，反之亦然；和丝氨酸(S)对苏氨酸(T)的替换，反之亦然。其它替换也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境和其在蛋白质的三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可经常互换，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也可经常互换。相对疏水的甲硫氨酸(M)可经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，且有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)可经常在其中氨基酸残基的重要特征为其电荷且这两种氨基酸残基的pK的差异不显著的位置处互换。在特定环境下，其它改变仍可被认为是“保守的”(参见，例如，US20110201052的表III；13-15页“Biochemistry”第2版.Stryer编辑(Stanford University)；Henikoff等人,PNAS 1992第89卷10915-10919；Lei等人,J Biol Chem 1995年5月19日；270(20):11882-6)。

在一些实施方案中，方法包括将一个或多个另外的突变引入至人PS1序列(SEQ IDNO:5或6)。因此，在一些实施方案中，序列可与人PS1的至少60％、70％、80％、90％、或100％具有至少80％、85％、90％、95％、或99％的同一性。在一些实施方案中，方法包括将一个或多个另外的突变引入至人PS2序列(SEQ ID NO:7或8)。因此，在一些实施方案中，序列可与人PS2的至少60％、70％、80％、90％、或100％具有至少80％、85％、90％、95％、或99％的同一性。

为了确定两条氨基酸序列、或两条核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的而比对序列(例如，为了最佳比对可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一条或两条中引入空位和为了比较目的可忽略非同源序列)。用于比较目的而对比的参考序列的长度通常为参考序列的长度的至少80％，和在一些实施方案中为至少90％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处为同一的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一”等同于氨基酸或核酸“同源”)。考虑到需要引入以实现两条序列的最佳比对的空位数、和各个空位的长度，两条序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数。在其它实施方案中，两条氨基酸序列的同一性百分比可作为两条氨基酸序列中相应位置处的相同的氨基酸家族(例如，带正电、带负电、极性和不带电的、疏水的)内的氨基酸残基的保守性的函数(例如，在两条序列中特定位置处存在的丙氨酸残基替换缬氨酸残基显示高度保守性，但在两条序列中特定位置处存在的精氨酸残基替换天冬氨酸残基则显示低度保守性)。

对于本方法的目的，序列的比较和两条序列之间的同一性百分比的确定可使用空位罚分为12、空位延伸罚分为4、和移码空位罚分为5的Blossum 62得分矩阵来完成。

递送载体

编码PS1或PS2多肽或其治疗活性片段的核酸可整合至基因构建体中用作基因治疗方案的一部分。例如，本文描述用于体内递送和表达在特定细胞类型、特别是脑皮质神经元细胞中编码PS1或PS2多肽或其活性片段的多核苷酸的靶向表达载体。这样的组分的表达构建体可在任何有效载体中施用，例如能够有效体内递送组分基因至细胞的任何制剂或组合物。方法包括将基因插入至病毒载体，优选腺相关病毒中。病毒载体通常直接转导细胞。

可以采用能够高效转导CNS神经元的病毒载体，包括rAAV(例如，AAV1-AAV12)载体的任何血清型、重组或嵌合AAV载体、以及慢病毒或其它合适的病毒载体。在一些实施方案中，编码PS1或PS2的多核苷酸可操作地连接至适于在CNS中表达的启动子。例如神经元亚型特异性特定启动子如α-钙/钙调蛋白激酶2A启动子可用于靶向刺激性神经元。可选地，泛神经元启动子，例如突触蛋白I启动子，可用于驱动PS1或PS2表达。其它示例性启动子包括但不限于，巨细胞病毒(CMV)早期增强子/启动子；杂合CMV增强/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子；包括CMV早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白的第一外显子和第一内含子、和兔β-珠蛋白基因的剪接受体的启动子(通常称为“CAG启动子”)；或由CMV即刻早期增强子和CBA内含子1/外显子1构成的1.6kb杂合启动子(通常称为CAGGS启动子；Niwa等人.Gene,108:193-199(1991))。CAGGS启动子(Niwa等人,1991)已显示在脑中提供普遍且长期的表达(Klein等人,Exp.Neurol.176:66-74(2002))。用于体内导入核酸至细胞中的典型方法是通过使用含有核酸如编码PS1或PS2的cDNA的病毒载体。除了其它方面以外，用病毒载体感染细胞具有大部分的靶细胞可接收核酸的优点。另外，在病毒载体内编码的分子，例如通过包含在病毒载体内的cDNA，在已摄取病毒载体核酸的细胞中有效表达。

对于核酸的递送特别有用的病毒载体系统是腺相关病毒(AAV)。腺相关病毒是天然存在的缺陷性病毒，其需要例如腺病毒或疱疹病毒等其它病毒作为有效复制和生产性生命周期的辅助病毒。(关于综述参见Muzyczka等人,Curr.Topics in Micro andImmunol.158:97-129(1992))。AAV载体有效转导各种细胞类型并且可在体内产生转基因的长期表达。尽管AAV载体基因组可作为附加体保持在细胞内，已观察到载体整合(参见例如Deyle和Russell,Curr Opin Mol Ther.2009年8月；11(4):442–447；Asokan等人,MolTher.2012年4月；20(4):699–708；Flotte等人,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356(1992)；Samulski等人,J.Virol.63:3822-3828(1989)；和McLaughlin等人,J.Virol.62:1963-1973(1989))。例如AAV2等AAV载体已广泛用于基因扩增或替换并且已在动物模型以及临床的范围内显示治疗功效；参见，例如，Mingozzi和High,Nature Reviews Genetics12,341-355(2011)；Deyle和Russell,Curr Opin Mol Ther.2009年8月；11(4):442–447；Asokan等人,Mol Ther.2012年4月；20(4):699–708。含有AAV的少至300个碱基对的AAV载体可被包装并可产生重组蛋白表达。用于产生重组逆转录病毒的方案和用于用这样的病毒体外或体内感染细胞的方案是本领域已知的，例如，可见于Ausubel,等人,编辑,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989),Sections9.10-9.14，和其它标准实验室手册。已描述使用AAV载体递送构建体以在脑中表达，例如在Iwata等人,Sci Rep.2013；3:1472；Hester等人,Curr Gene Ther.2009年10月；9(5):428-33；Doll等人,Gene Therapy 1996,3(5):437-447；和Foley等人,J Control Release.2014年12月28日；196:71-8。

因此，在一些实施方案中，编码PS1或PS2的核酸存在于用于基因治疗的载体例如AAV载体中。在一些情况下，AAV载体选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV11、和AAV12组成的组。

本文所描述的载体可以是假型载体(pseudotyped vector)。假型化提供用于调节载体的靶细胞群的机制。例如，假型AAV载体可用于本文所描述的各种方法。假型载体为在第二载体例如第二AAV血清型的衣壳中含有一种载体的基因组例如一种AAV血清型的基因组的那些。假型化的方法是本领域公知的。例如，载体可由源自以下的包膜糖蛋白假型化：弹状病毒水泡性口炎病毒(VSV)血清型(印第安纳和章地埔拉株)、狂犬病病毒(例如，各种Evelyn–Rokitnicki–Abelseth ERA株和攻击病毒标准株(CVS))、狂犬病毒属莫科拉病毒、狂犬病相关病毒、水泡型口炎病毒(VSV)、莫科拉病毒(MV)、淋巴细胞型脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、狂犬病病毒糖蛋白(RV-G)、糖蛋白B型(FuG-B)、FuG-B的变体(FuG-B2)或莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)。病毒可以是假型，以用于一种或多种神经元或细胞群的转导。

在没有限制的情况下，假型载体的说明性实例包括重组AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV9、AAVrh10、AAV11、和AAV12血清型载体。本领域已知这样的载体可被工程化以包括编码人蛋白质或其它蛋白质的转基因。在特定实例中，本公开可包括含有如本文所公开的核酸的假型AAV9或AAVrh10病毒载体。参见Viral Vectors for GeneTherapy:Methods and Protocols,编辑.Machida,Humana Press,2003。

在一些情况下，可基于预期的用途，例如基于预期的施用途径，来选择特定的AAV血清型载体。

用于在基因治疗中应用AAV载体构建体的各种方法是本领域已知的，包括用于施用至人受试者的修饰、纯化、和制备的方法(参见，例如Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols,编辑.Machida,Humana Press,2003)。另外，已描述靶向CNS的细胞的基于AAV的基因治疗(参见，例如，美国专利6,180,613和6,503,888)。可使用本领域已知的技术来生产高滴度AAV制剂，例如如美国专利号5,658,776中所述。

载体构建体是指包括病毒基因组和转基因的全部或部分的多核苷酸分子。在一些情况中，基因转移可通过例如腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)等DNA病毒载体介导。用于基因治疗的方法的其它载体为本领域已知的。例如，本文所公开的构建体可包括甲病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、或痘苗病毒。

腺病毒是相对充分表征的病毒组，包括超过50种血清型(参见，例如WO95/27071，其通过引用结合在此)。腺病毒通过应用分子生物学技术而是易处理的并且可不需要整合至宿主细胞基因组中。已构建重组Ad来源的载体，其包括降低野生型病毒的重组或产生的潜力的载体(参见，例如，国际专利公布WO 95/00655和WO 95/11984，其通过引用结合在此)。野生型AAV具有高传染性且能够高度特异性地整合至宿主基因组中(参见，例如Hermonat和Muzyczka 1984Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 81:6466-6470和Lebkowski等人.1988Mol.Cell.Biol.8:3988-3996)。

非天然调控序列、基因控制序列、启动子、非编码序列、内含子、或编码序列可被包含在如本文所公开的核酸中。本文进一步预期包含核酸标签或信号序列、或编码蛋白质标签或蛋白质信号序列的核酸。典型地，编码区与一种或多种调控核酸组分可操作地连接。

包含在如本文所公开的核酸中的启动子可以是组织或细胞型特异性启动子、对多个组织或细胞类型具有特异性的启动子、器官特异性启动子、对多种器官具有特异性的启动子、全身型或遍在型启动子、或几乎全身型或遍在型启动子。具有随机型表达、诱导型表达、条件型表达、或以其它方式间断的、多变的、或不可预知的表达的启动子也包含在本公开的范围内。启动子可包含任何上述特征或本领域已知的其它启动子特征。

在临床环境中，可通过多种方法中的任何一种将用于治疗基因的基因递送系统引入至受试者中，各个方法为本领域中所熟悉的。例如，基因递送系统的药物制剂可全身地引入，例如通过静脉内注射，并且将主要由基因递送运载体所提供的转染特异性、由于控制受体基因表达的转录调控序列所引起的细胞型或组织型表达、或其组合而发生靶细胞中的蛋白质的特异性转导。在其它实施方案中，重组基因的初始递送更加受限，同时向受试者中的引入相当局部。例如，基因递送运载体可通过导管(参见美国专利5,328,470)或通过立体定向注射例如任选地注射至小脑延髓池、脑室、腰椎鞘内间隙、直接注射至海马体(例如，Chen等人,PNAS USA 91:3054-3057(1994))而引入。在一些实施方案中，早老素表达病毒的递送方法包括静脉内、鞘内、脑室内、脑池内、和立体定向实质内施用。

方法可进一步通过临床前试验而最佳化来实现神经退行性病变、痴呆、突触功能障碍和早老素条件型双敲除(knockout)小鼠和表达FAD突变的早老素-1基因敲入(knockin)小鼠中的分子改变的最佳挽救。

基因治疗构建体的药物制剂可基本上由可接受的稀释剂中的基因递送系统组成，或可包括其中嵌入有基因递送运载体的缓释基质。可选地，完全基因递送系统(completegene delivery system)可自例如逆转录病毒载体等重组细胞中完整产生，药物制剂可包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。

递送制剂和药物组合物

在一些实施方案中，用于体内递送至靶组织的如本文所公开的多核苷酸包封在纳米颗粒中或与纳米颗粒缔合。用于纳米颗粒包装的方法在本领域中是已知的，并且在以下中描述：例如，Bose S,等人(Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type3Infection of Human Lung Epithelial Cells.J.Virol.78:8146.2004)；Dong Y等人.Poly(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite nanoparticles for oraldelivery of anticancer drugs.Biomaterials 26:6068.2005)；Lobenberg R.等人(Improved body distribution of 14C-labelled AZT bound to nanoparticles inrats determined by radioluminography.J Drug Target5:171.1998)；Sakuma S R等人(Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilicpolymeric chains in the gastrointestinal tract.Int J Pharm 177:161.1999)；Virovic L等人.Novel delivery methods for treatment of viral hepatitis:anupdate.Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005)；和Zimmermann E等人,Electrolyte-andpH-stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle(SLN)dispersions inartificial gastrointestinal media.Eur J Pharm Biopharm 52:203.2001)。在一些实施方案中，在体内将囊泡例如脂质体中的一种或多种多核苷酸递送至靶组织(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat等人,in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；通常参见如上所述)。在一些实施方案中，使用基于脂质的纳米颗粒(LNP)；参见，例如，Robinson等人,Mol Ther.2018年8月1日；26(8):2034-2046；US9956271B2。

本方法和组合物可包括含有一种以上的如本文所述的治疗性分子–例如多核苷酸或RNA–的微泡(microvesicle)或其制剂。如本文所用的术语，“微泡”是指源自膜的微泡，其包括一系列细胞外囊泡，包括在正常生理和病理条件下由许多细胞类型分泌的外泌体、微粒和脱落微泡(shed microvesicle)。参见，例如EP2010663B1。本文所描述的方法和组合物可应用至所有尺寸的微泡；在一个实施方案中，30至200nm，在一个实施方案中，30至800nm，在一个实施方案中，至多2um。本文所描述的方法和组合物也可更广泛地应用于所有细胞外囊泡，其为包括外泌体、脱落微泡、肿瘤泌体(oncosome)、核外颗粒体(ectosome)、和逆转录病毒样颗粒的术语。这样的微泡或制剂由本文所述的方法产生。如本文所用的术语，微泡制剂是指从同一细胞来源获得/制备的微泡群。这样的制剂例如在体外通过培养表达本发明的核酸分子的细胞并分离由所述细胞产生的微泡来生产。这样的微泡的分离方法是本领域已知的(Thery等人,Isolation and characterization of exosomes from cell culturesupernatants and biological fluids,in Current Protocols Cell Biology,第3章,322,(John Wiley,2006)；Palmisano等人,(Mol Cell Proteomics.2012August；11(8):230-43)和等人,((2012)PLoS ONE 7(4):e34653.doi:10.1371/journal.pone.0034653))，本文描述了它们的一些实例。用于从培养中的细胞分离微泡的这样的技术包括但不限于蔗糖梯度纯化/分离和差速离心，并且可被改动以用于本文所描述的方法或组合物。参见，例如EP2010663B1。

在一些实施方案中，通过以足以从培养基中分离细胞的时间(例如，约15分钟)缓慢离心(例如，以约300g)供体细胞的培养基来分离微泡。这将微泡留在上清液中，从而产生微泡制剂。在一个实施方案中，以足以沉淀细胞碎片的时间(例如，约30分钟)更强力地离心(例如，以约16,000g)来自缓慢离心的培养基或上清液。这将微泡留在上清液中，从而产生微泡制剂。在一个实施方案中，对培养基、缓慢离心制剂、或强力离心制剂进行过滤(例如，通过0.22μm过滤器或0.8μm过滤器，借此使微泡穿过过滤器。在一个实施方案中，以将充分沉淀微泡的时间(例如，约80分钟)对滤液进行最终超速离心(例如，以约110,000g)。所得的沉淀(pellet)含有微泡且可重悬于体积为产生对进一步使用有用的浓度的缓冲液中，从而产生微泡制剂。在一个实施方案中，微泡制剂通过蔗糖浓度梯度纯化来制备。在一个实施方案中，用DNAse(例如，DNAse I)和/或RNAse和/或蛋白酶进一步处理微泡来分别消除来自外部的污染DNA、RNA、或蛋白质。在一个实施方案中，微泡制剂含有一种以上的RNAse抑制剂。

包含在微泡制剂中的分子将包括治疗性分子。典型地，制剂中的微泡将为异源性群体，并且各个微泡将含有与制剂中的其它微泡的分子可以相同或可以不同的分子的补体。微泡制剂中的治疗性分子的含量可以定量地或定性地表达。一种这样的方法是将含量表示为微泡制剂内的总分子的百分比。举例来说，如果治疗性分子为mRNA，含量可以表示为微泡制剂的总RNA含量的百分比，或可选地表示为微泡制剂的总mRNA含量的百分比。类似地，如果治疗性分子是蛋白质，则含量可表示为微泡内总蛋白质的百分比。在一个实施方案中，由本文所描述的方法产生的治疗性微泡或其制剂，与获得自对照细胞(获得自未进行科学操作来增加治疗性分子的表达的相同来源的细胞)的微泡相比，含有可检测的、统计学上显著增加的量的治疗性分子。在一个实施方案中，治疗性分子以比获得自对照细胞的微泡中的多至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的量存在。还可以实现更高水平的富集。在一个实施方案中，治疗性分子以比对照细胞微泡多至少2倍存在于微泡或其制剂中。还可获得更高倍的富集(例如，3、4、5、6、7、8、9或10倍)。

在一个实施方案中，相对高百分比的微泡内容物为治疗性分子(例如，通过过表达或将分子特异性靶向微泡来实现)。在一个实施方案中，治疗性分子的微泡含量为总(类似)分子含量的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，治疗性分子为mRNA且为微泡的总mRNA含量的约10％)。还可实现更高水平的富集。在一个实施方案中，治疗性分子以比所有其它这样(类似)分子多至少2倍存在于微泡或其制剂中。还可获得更高倍数的富集(例如，3、4、5、6、7、8、9或10倍)。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，其不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1：散发性阿尔茨海默症(AD)患者的锥体神经元表现降低的PSEN1和PSEN2mRNA水平

早老素(PS)蛋白是γ-分泌酶的催化亚单元，其是Aβ肽的产生所需的。早老素-1(PSEN1)和早老素-2(PSEN2)基因中的突变与90％的家族性阿尔茨海默症(FAD)的病例相关。与FAD和颞额叶痴呆相关的PSEN突变造成早老素表达和早老素功能的丧失，导致降低的γ-分泌酶活性(Xia等人,Neuron.2015年3月4日；85(5):967-81；Watanabe等人,JNeurosci.20124月11日；32(15):5085-96；Brouwers等人,2008Ann Med 40(8):562–83)。

使用激光捕获显微切割收集个体锥体神经元，将每人脑300个神经元合并在一起(pooled together)用于RNA制备(PicoPure RNA分离试剂盒,Life TechnologiesKIT0204)。使用SuperScript III一步法RT-PCR体系(SuperScript III One-Step RT-PCRSystem)使用Platinum Taq DNA聚合酶(Life Technologies)进行qRT-PCR。使用的引物的序列在表2中列出。

表2：引物列表。

PSEN1和PSEN2 mRNA水平在来自散发性AD患者的海马体CA1锥体神经元的激光切割的锥体神经元中降低(图1A-B)。

实施例2：γ-分泌酶活性在携带杂合和纯合PSEN1突变的MEF中的剂量依赖性降低

方法

永生化Psen突变MEF的产生

将携带各种Psen1基因型的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)维持在补充有10％FBS和1％青霉素和链霉素的培养基中。在6孔板中，通过用1μg的CMV-SV40转染来永生化300,000个MEF。将由CMV-SV40转染的MEF与在约第7代停止分裂的由CMV-GFP(1μg)转染的MEF相比较。

NdE和hPS1转染

为了确定γ-分泌酶活性是否在各种永生化的Psen突变MEF中受损，使用Lipofectamine LTX(ThermoFisher Scientific 15338030)按照制造商的说明将CMV-NotchΔE(5ng)瞬时转染至6孔板中的MEF中。

转染后约24小时，将细胞在RIPA缓冲液：50mM Tris-C1(pH 7.6)、150mM NaCl、1％NP40、0.5％脱氧胆酸钠、蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)、1mM DTT中裂解。将蛋白质(40μg)在NuPAGE凝胶(Invitrogen)中分离并转移至硝酸纤维素膜。一抗为兔抗切割的Notch1Val1744(Cell Signaling)、兔抗PS1 NTF(Calbiochem)，其识别小鼠和人PS1两者，小鼠抗cMyc(Sigma)或兔抗微管蛋白(Cell Signaling)。然后用染料耦合的二抗(来自Licor的山羊抗兔IRdye800、山羊抗小鼠IRdye800、或山羊抗兔IRdye680)孵育膜。用Odyssey红外成像系统(Odyssey Infrared Imaging System)(LI-COR Bioscience)定量信号。由NICD生产测定的γ-分泌酶活性在L435F KI/+MEF中降低且在KI/KI和PS1-/-MEF中进一步降低(图3A)。

实施例3：γ-分泌酶活性在具有各种PS基因型的MEF中的剂量依赖性挽救：PS1^+/+、PS1^L435F/+、PS1^+/-、PS1^L435F/L435F、PS1^-/-和PS1^-/-；PS2^-/-

为了确定降低的与PSEN1突变相关的γ-分泌酶活性是否可通过引入野生型(WT)hPS来校正，衍生来自携带各种PS基因型的胚胎的原代MEF：PS1^+/+、PS1^L435F/+、PS1^+/-、PS1^L435F/L435F、PS1^-/-和PS1^-/-；PS2^-/-(DKO)。由CMV-NdelE瞬时转染永生化MEF，且通过测定NICD和PS1 NTF/CTF的水平来评价γ-分泌酶活性。NICD水平以PS1剂量敏感性方式降低，且在DKO细胞中不可检测(图3A)。NICD水平在PS1^L435F/L435F MEF(“L435F KI/KI”MEF)和PS1^-/-MEF中降低但可检测(图3A)，然而通过使用L435F KI/KI和PS1^-/-胚胎脑的体外γ-分泌酶检测不可检测从头NICD产生(Xia等人,Neuron.2015年3月4日；85(5):967-81)。不希望被特定理论束缚，申请人主张这可能是由于PS2相对于MEF在胚胎脑中通常表达的较低水平，导致相对于MEF在L435F KI/KI和PS1^-/-脑中较低的整体PS活性。为了试验该假设，在PS1^L435F/+；PS2^-/-MEF中测定γ-分泌酶活性并与PS1^L435F/+MEF相比较。与PS1^L435F/+MEF相比，γ-分泌酶活性在PS1^L435F/+；PS2^-/-MEF中为较低的(图3B)。

为了确定在各种PS突变MEF中的受损的γ-分泌酶活性是否可以通过引入WT hPS1而被挽救，将各种量(0、20、40、80ng)的野生型hPS1cDNA(pCI-hPS1)同CMV-NdelE一起转染至MEF。应注意地，将增加量的pC1-hPS1转染至MEF导致突变(PS1^L435F/+、PS1^L435F/+；PS2^-/-和DKO)MEF中的PS1蛋白的累积和PS1 NTF和NICD的恢复水平(图3B)。这些结果表明外源WThPS1可挽救在各种PS突变MEF中受损的γ-分泌酶活性。

其它实施方案

应理解，即使已结合本发明的详细的说明来描述本发明，前述说明旨在为示例性的且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围来界定。其它方面、优点、和修改在所附权利要求的范围内。