阅读说明：本技术 一种阿拉伯木聚糖的制备方法及产品 (Preparation method of arabinoxylan and product ) 是由 牛猛 王朦 唐翠娥 张宾佳 贾才华 赵思明 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种阿拉伯木聚糖的制备方法,具体包括以下步骤：(1)对麦麸去淀粉；(2)采用碱提法得到多糖溶液；(3)对多糖溶液进行脱蛋白处理；(4)对脱蛋白的多糖溶液进行酶处理、透析；(5)对透析后的多糖溶液进行酶解；(6)对未经过酶解的多糖溶液和经过酶解的多糖溶液分别进行醇沉分级,得到不同分子量阿拉伯木聚糖；(7)将不同分子量阿拉伯木聚糖进行二次酶处理、二次透析。本发明制备取方法简单可行,能够提高原材料麦麸的利用率,可得到不同级分的阿拉伯木聚糖,结构各异,具有不同程度的降血糖、抗氧化等功能性作用,医药价值高。(The invention discloses a preparation method of arabinoxylan, which specifically comprises the following steps: (1) removing starch from the wheat bran; (2) obtaining polysaccharide solution by adopting an alkali extraction method; (3) deproteinizing the polysaccharide solution; (4) carrying out enzyme treatment and dialysis on the deproteinized polysaccharide solution; (5) performing enzymolysis on the dialyzed polysaccharide solution; (6) respectively carrying out alcohol precipitation grading on the polysaccharide solution which is not subjected to enzymolysis and the polysaccharide solution which is subjected to enzymolysis to obtain the arabinoxylan with different molecular weights; (7) and (3) carrying out secondary enzyme treatment and secondary dialysis on the arabinoxylan with different molecular weights. The preparation method is simple and feasible, can improve the utilization rate of the raw material wheat bran, can obtain different fractions of arabinoxylan, has different structures, has different degrees of functional effects of reducing blood sugar, resisting oxidation and the like, and has high medical value.)

一种阿拉伯木聚糖的制备方法及产品

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种阿拉伯木聚糖的制备方法及产品。

背景技术

阿拉伯木聚糖(arabinoxylans，AX)是一种很有研究价值的非淀粉多糖，主要存在于小麦、黑麦、大麦、稻米、玉米等谷物种皮中，是构成植物细胞壁的主要成分之一。AX结构复杂，分子量分布较广，基本结构包括以β-D-吡喃木糖残基经β-(1→4)糖苷键连接而成的木聚糖主链和α-L-呋喃阿拉伯糖基侧链，其中阿拉伯糖残基的相对数量和取代情况的不同是造成阿拉伯木聚糖性质(溶解性、溶液粘度、胶凝性、酶作用程度等)差异的主要原因。

根据AX在水中溶解性的不同通常将其分为两大类：水溶阿拉伯木聚糖(Water-extractable arabinoxylan，WEAX)和水不溶阿拉伯木聚糖(Water-unextractablearabinoxylan，WUAX)。WUAX虽然不能被水提取，但在碱性条件下，尤其是在热碱液(KOH、NaOH、Ba(OH)₂)中可被充分提取，因此WUAX有时又被称为碱可提取阿拉伯木聚糖。AX的提取方法也据此主要分为三大类：水/热水提取、碱法提取以及酶法提取。相比而言，水提取法的提取率一般较低；碱法提取的提取率虽然比较高，但是通常会破坏AX结构中的某些功能基团，如阿魏酰基团、蛋白质基团等，可能削弱其功能性质；酶法提取的条件较为温和，对AX的糖链结构会造成部分降解，但一般不会影响其中的功能基团。

国内外对阿拉伯木聚糖的研究表明，AX在食品领域被广泛利用，因为其具有高黏度、高持水性的特点，可作为食品的稳定剂、增稠剂。此外，AX还具有降低血清氧化物，维持血糖水平，抗氧化活性，降低餐后血糖反应，增强免疫力等生物活性。AX的功能特性取决于AX自身性质。例如，阿魏酸使AX具有独特的氧化胶凝性质，可作为自由基清除剂，具有抗氧化，抗菌消炎等功能特性；低相对分子质量AX影响面团持水力，高相对分子质量AX显著影响生面团的延展性。如何将AX分离获得不同分子量的AX是本领域需要探讨的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阿拉伯木聚糖的制备方法及产品，该方法综合了碱提醇沉法、酶解法和膜分离技术的长处，摒弃了单一方法的高品质和低成本难以融合的缺点，既能保持多糖结构破坏少、纯度高、达到多级分离的效果，又能减少能耗降低加工成本，同时又能得到分子量不同的阿拉伯木聚糖。

为实现上述目的，本发明提供一种阿拉伯木聚糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将麦麸从面粉中分离出来，并去除麦麸中的淀粉，得到去淀粉麦麸；

(2)对步骤(1)所得的去淀粉麦麸利用碱提法得到多糖溶液；

(3)对步骤(2)多糖溶液进行脱蛋白处理得到脱蛋白的多糖溶液；

(4)将步骤(3)所得的脱蛋白的多糖溶液进行酶处理、透析；

(5)对步骤(4)经过透析后的多糖溶液进行酶解；

(6)将步骤(4)未经过酶解的多糖溶液和步骤(5)经过酶解的多糖溶液分别进行醇沉分级，得到阿拉伯木聚糖；

(7)对步骤(6)所得的阿拉伯木聚糖进行二次酶处理、二次透析。

优选的，所述步骤(1)的去淀粉麦麸的制备方法包括以下步骤：麦麸在4℃水中浸泡60min，捞出后清洗，将清洗后的麦麸沥干，沥干后在50℃条件下加热12h，得到去淀粉麦麸。

优选的，所述步骤(2)的碱提法包括以下步骤：①将去淀粉麦麸与NaOH溶液混合后在80℃下反应90min，冷却至室温后离心，所述NaOH溶液摩尔浓度为0.15M，去淀粉麦麸与NaOH溶液质量体积比为1g:15ml，所述NaOH溶液中包含体积分数为0.5％的H₂O₂；②将步骤①得到的上清液用HCl调整pH至4.5，离心，得到上清液；③将步骤②离心后的上清液减压浓缩至原体积的1/4后醇沉，得到的沉淀物溶解在水中并离心，重复一次。

优选的，所述步骤(3)的脱蛋白采用的是Sevage法除蛋白，具体包括以下步骤：向多糖溶液中加入Sevage试剂，剧烈振荡1h，离心后收集水层，再次加入Sevage试剂，重复5-6次直至完全除去游离蛋白，上清液减压浓缩，冷冻干燥；每次加入Sevage试剂的体积与加入多糖溶液的体积比为1:4。

优选的，所述步骤(4)的酶处理包括以下步骤：①配制质量分数为4％的多糖溶液，在多糖溶液中加入耐高温α-淀粉酶，所述耐高温α-淀粉酶酶活为100u/g，在95℃条件下反应2h，煮沸后冷却至室温；②在步骤①得到的溶液中加入淀粉转葡萄糖苷酶，所述淀粉转葡萄糖苷酶酶活为200u/g，在55℃条件下反应4h，反应后煮沸30min后，离心，得到的上清液用去离子水透析。

优选的，所述步骤(5)酶解过程包括以下步骤：将多糖溶液分散在NaAc缓冲溶液中，配制质量分数为2％的悬浮液，加入戊聚糖酶在pH5.0、温度50℃条件下反应2h，离心得到上清液；戊聚糖酶的酶活为5000u/g。

优选的，所述步骤(6)的醇沉分级包括以下步骤：

A:对步骤(5)经过酶解的多糖溶液进行醇沉分级，得到多糖溶液：

B:对步骤(4)未酶解的多糖溶液进行醇沉分级，得到多糖溶液：

C:将步骤A、B醇沉分级得到的多糖溶液分别在4℃下放置过夜，离心，得沉淀物，将沉淀物溶解于水中，得到的粗多糖冻干储存。

优选的，所述步骤(7)的二次酶处理包括以下步骤：将步骤(6)冻干存储的粗多糖配制成质量分数为0.5％的多糖溶液，加入地衣聚糖酶在温度40℃条件下反应1h，冷却、离心，得到的上清液用去离子水透析后冷冻干燥并储存；所述地衣聚糖酶酶活为20u/g。

优选的，所述步骤(4)、步骤(7)的透析过程中膜管为3500Da，透析时长为36h。

阿拉伯木聚糖的制备方法制备的阿拉伯木聚糖。

与现有技术相比本发明的有益效果：

1.本发明制备方法简单可行，能够提高原材料麦麸的利用率，提高了粮食加工产品的附加值，增加了经济效益，同时得到的多糖的纯度较高，具有良好的应用价值和市场潜力；

2.本发明使用的酶简单易得，而且麸皮中的AX由于其自身的结构，以及AX分子之间、AX与其他细胞壁物质如木质素、纤维素分子之间存在着物理性或化学性的结合，在碱性条件下这种结合会被打断，使原来不溶性的AX变为可溶性AX；同时，单一的NaOH溶液作为提取剂时，只能无选择性地对多糖和细胞壁物质进行粗略水解，而无法高选择性专一水解阿拉伯木聚糖，因此得率虽高但纯度较低，而过氧化氢的加入会加剧多糖的释放，提高多糖的溶出程度，所得样品的提取率和得率都会相应提高；

3.通过碱提获得的AX中具有一定量的阿魏酸，且提取条件的变化对阿魏酸含量产生一定影响，为了降低碱提方法的不足，需要严格控制反应条件，如碱液浓度、H₂O₂含量、反应温度及时间等；

4.从麦麸提取得到的多糖组分大多是粗多糖，还需要经过去淀粉、除蛋白、去葡聚糖等杂质才能获得比较纯的AX，而蛋白可用sevage法除去，淀粉和葡聚糖可以通过加入相关特异性酶进行酶解反应，进行分离，以防止多糖结构被破坏；同时酶处理也是对碱提多糖进行一个纯化的过程，一次酶解是除去多糖中小分子量可溶性淀粉，二次酶解所用的地衣聚糖酶对β-葡聚糖具有专一性，反应后可透析除去多糖中β-葡聚糖，通过两次酶解后才能获得较高纯度的AX；

5.分级沉淀法是在多糖水溶液中加入另一种溶剂(如乙醇、丙酮等)改变混合溶剂的极性，使部分物质沉淀析出，从而实现分离，通过逐步提高乙醇的体积浓度即可以达到初步纯化多糖的目的，维持较高得率，且针对不同乙醇浓度沉淀下来的多糖有不同的分子量及生物活性，一般来说，多糖分子量越大，极性越低，较低浓度的乙醇即可使其沉淀下来；

6.本发明能够有效的脱除多糖液中的蛋白质和淀粉，即能保证多糖存在，通过透析还可以除去多糖溶液中有机物的残留。

附图说明

图1为水溶性阿拉伯木聚糖酶解样品的GPC图；

图2水溶性阿拉伯木聚糖未酶解样品的GPC图；

图3为水溶性阿拉伯木聚糖紫外扫描图谱；

图4为阿拉伯木聚糖的制备方法示意图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

不同分子量水溶性阿拉伯木聚糖的制备：

(1)将所购的全麦面粉100目过筛，得到麦麸；

(2)取麦麸500g，与去离子水混合，在4℃条件下浸泡60min，之后将湿润的麦麸用质量浓度为5％的水洗涤，以除去淀粉，将洗后的麦麸沥干，在50℃的烘箱中加热12小时，得到去淀粉麦麸并储存在4℃的环境中；

(3)①取150g烘干好的去淀粉麦麸与2.25L 0.15M NaOH溶液混合，其中NaOH溶液中含有体积分数为0.5％的H₂O₂，在80℃下反应90min，然后将混合物冷却至室温后离心30min，得到上清液a；②将上清液a用4MHCl调整pH至4.5，再离心30min，得到上清液b；③将上清液b减压浓缩至原体积的1/4后使用乙醇沉淀，离心5min，将该沉淀物溶解在水中并再次离心30min，重复一次，得上清液c，即多糖溶液；

(4)取800ml步骤(3)所得的多糖溶液，加入60ml氯仿与40ml正丁醇的混合溶液，剧烈振荡1h，离心15min，溶液分为三层，收集水层，再次加入Sevage试剂，振荡后离心，如此重复5次后，上清液减压浓缩，冷冻干燥，得到脱蛋白的多糖；

(5)将脱蛋白的多糖均匀分散于水中，配制成质量分数为4％的悬浮液，用4MHCl调整pH至6.5，加入耐高温α-淀粉酶，耐高温α-淀粉酶酶活为100u/g，在95℃条件下反应2h，煮沸15min后冷却至室温；再将冷却后的溶液用HCl调整pH至4.6，加入淀粉转葡萄糖苷酶，淀粉转葡萄糖苷酶酶活为200u/g，在55℃条件下反应4h，反应结束后再将溶液煮沸30min，使酶失活后，离心10min，得到上清液；

(6)使用3500Da的膜管将步骤(5)得到的上清液用去离子水透析36h，得到多糖溶液；

(7)获得酶解样品：将步骤(6)获得的多糖溶液冻干后，将其均匀分散于pH5.0、0.1mol/LNaAc缓冲溶液中，配制成质量分数为2％的悬浮液，加入戊聚糖酶，戊聚糖酶酶活性为5000u/g，于50℃水浴振荡反应2h，反应结束后再将溶液沸水浴灭酶30min，离心10min，收集上清液，上清液在搅拌下缓缓加入乙醇，至乙醇体积浓度达60％，静置过夜，离心，沉淀物用蒸馏水溶解，冷冻干燥得到的粗多糖组分命名为M60％-1；上清液中继续加入乙醇，至乙醇体积浓度达70％，静置过夜，离心，沉淀的处理步骤同上述步骤，得到的粗多糖组分命名为M70％-1；上清液中继续加入乙醇至乙醇体积浓度达80％，得到的粗多糖组分命名为M80％-1；

(8)获得未酶解样品：向步骤(6)获得的多糖溶液中，缓缓加入乙醇，至乙醇体积浓度达40％，静置过夜，离心，沉淀物用蒸馏水溶解，冷冻干燥得到的粗多糖组分命名为N40％-1；上清液中继续加入乙醇，至乙醇体积浓度达70％，静置过夜，离心，沉淀的处理步骤同上述步骤，得到组分命名为N70％-1；

(9)二次酶处理：将步骤(7)、步骤(8)得到的粗多糖M60％-1、M70％-1、M80％-1、N40％-1和N70％-1分别配制成1L质量分数为0.5％的多糖溶液，分别加入100u地衣聚糖酶，在40℃摇床中反应1h，反应结束后再分别将多糖溶液在100℃条件下加热10min使酶失活，冷却后，离心20min，得到上清液；

(10)二次透析：使用截留分子量为3500Da的膜管将步骤(9)得到的上清液分别用去离子水透析36h，得到的多糖M60％-2、M70％-2、M80％-2、N40％-2、N70％-2冷冻干燥并储存。

以上制备过程离心转速均为4000r/min。

实施例2

采用高效凝胶渗透色谱法(GPC)对实施例1制备的多糖M60％-2、M70％-2、M80％-2、N40％-2、N70％-2分子量进行测定。色谱条件为：采用TSK gel G3000PWxL(300*7.8mm,7um)色谱柱；所用的流动相为0.05M mol/L硫酸钠水溶液；流动相流速为1.0ml/min；柱温35℃；检测器为RID示差检测器。右旋糖酐对照品的相对分子质量为3000,10000,40000,70000,500000，将其与多糖样品配成1.0mg/ml溶液，过滤后，待仪器色谱柱平衡、基线平稳后，进样20μl，如图1-2以及表1。

分子量是多糖重要的参数，与多糖的理化性质和生物活性密切相关。由于多糖的结构复杂，即使是纯多糖，其纯度也只代表某种多糖相似链长的平均分布，即一定分子量范围内的多糖均一组分。从图1和图2中可以看出，所获得阿拉伯木聚糖的色谱峰的峰形基本相同，每个样品都只有1个主要的色谱峰，说明五种多糖为均一的多糖。

表1水溶性阿拉伯木聚糖的分子结构特征参数

用GPC软件分析五中多糖之后可得到表1，从多分散性指数(Mw/Mn)中看出，分子量分布较宽，表明五种多糖为宽分布多糖，此外，在酶解样品(M60％-2、M70％-2、M80％-2)和未酶解样品(N40％-2、N70％-2)中，随着醇沉浓度的增加，重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)和平均分子量(Mz)都呈现逐渐减小的趋势，多分散性指数呈现逐渐增大的趋势。也就是表明，木聚糖酶的添加，能促进高相对分子质量的水溶性阿拉伯木聚糖的降解；醇沉体积分数能影响多糖分子的质量分布，分子量较小的多糖具有更好的水溶解性，需要高体积分数的乙醇才能将其沉淀出来；而分散系数逐渐增大，说明相对分子质量分布不均匀，获得的低相对分子质量阿拉伯木聚糖的种类在逐渐增加。

实施例3

对实施例1储存的多糖M60％-2、M70％-2、M80％-2、N40％-2、N70％-2进行紫外可见扫描光谱分析。

由于蛋白质和核酸在特定波长下具有紫外吸收功能，因此对多糖的紫外全波长扫描分析可用于鉴别多糖溶液中是否含有蛋白和核酸。将多糖M60％-2、M70％-2、M80％-2、N40％-2、N70％-2分别配制成5mg/ml的多糖溶液，以紫外分光光度计在200～400nm的范围内进行扫描，扫描结果如图3所示。

根据图3可以看出，多糖溶液M60％-2、M70％-2、M80％-2、N40％-2、N70％-2在260nm和280nm附近均无核酸和蛋白质的特征吸收峰，说明五种多糖溶液中蛋白和核酸的脱除效果较好，图中200nm处的吸光度较大，且随着波长的增加，吸光度呈现明显下降的趋势，因此可推测200nm存在多糖特征吸收峰。

实施例4

采用液相色谱法(HPLC)对实施例1储存的多糖M60％-2、M70％-2、M80％-2、N40％-2、N70％-2中的单糖组成进行分析。

阿拉伯木聚糖主要由单糖甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖组成。

单糖标品的衍生化，具体操作如下：

1)精密称取甘露糖对照品，用蒸馏水溶解，配置成浓度为10mg/ml的甘露糖溶液，摇匀；

2)取400μL步骤1)配制好的甘露糖溶液与250μL 0.3mol/L NaOH溶液混匀，再加250μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液，涡旋混匀，在70℃烘箱中反应120min，冷却；

3)向步骤2)冷却后的溶液中加500μL 0.3mol/L的HCl溶液，涡旋2min后，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿层，氯仿萃取3次，得到的水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖操作方法同甘露糖。

多糖M60％-2、M70％-2、M80％-2、N40％-2、N70％-2的衍生化，具体操作如下：

1)将实施例1储存的多糖M60％配制成10mg/ml的多糖溶液M60％，取1mL多糖溶液M60％于安瓿瓶中，加入1mL 4mol/L的三氟乙酸，充N₂封管，在110℃烘箱中水解3h，冷却；

2)冷却后打开盖，取600μL步骤1)的水解多糖溶液M60％，加入600μL甲醇后用N₂吹干，如此重复加甲醇并用N₂吹3次，去除三氟乙酸；

3)在步骤2)去除三氟乙酸的多糖溶液M60％中加入400μL蒸馏水，以充分溶解残渣，再加入250μL 0.3mol/L的NaOH溶液，混匀，得到混合溶液；

4)在步骤3)混合溶液中加入250μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液，涡旋混匀，同样在70℃的烘箱中反应100min，冷却后按单糖标品操作方法中和、萃取，并用微孔膜过滤。

多糖M70％-2、M80％-2、N40％-2、N70％-2的操作方法同多糖M60％-2。

色谱条件：色谱柱：InertSustainAQ-C18(250×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；流动相：溶剂A，50mmol/L磷酸缓冲液(KH₂PO₄-NaOH，pH6.9)，溶剂B，乙腈；等度梯度，检测波长250nm；进样体积20μL。结果见表2

表2阿拉伯木聚糖的单糖组成及其侧链取代度

多糖是由单糖作为结构单元通过糖苷键连接而成的，因此，分析多糖分子中单糖残基种类、相对含量(摩尔比)是研究多糖的结构及构效关系的重要步骤。AX含量计算公式为：AX含量(％)＝(Ara含量+Xyl含量)*0.88，侧链取代度的值表示AX的支链化程度，比值越大表明支链化程度越高。根据单糖混合标准品的液相色谱图和软件分析得到的结果如表1所示，对五种多糖进行组成分析，发现均不含甘露糖、鼠李糖和葡萄糖，均由阿拉伯糖、半乳糖和木糖组成，纯度都较高，但各组分单糖含量不尽相同。对于酶解样品(M60％-2、M70％-2、M80％-2)和未酶解样品(N40％-2、N70％-2)，不同点在于有无加入戊聚糖酶和醇沉浓度，实验结果说明AX可以被戊聚糖酶水解成不同链长和不同取代度的AX水解产物，不同浓度的乙醇可沉淀出不同的多糖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。