阅读说明：本技术 硫酸化木聚糖及其制备方法和在制备抗氧化药物中的应用 (Sulfated xylan, preparation method thereof and application thereof in preparing antioxidant drugs ) 是由 李霞 胡楠 韦滢 关媛 李静 李培骏 单杨 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种硫酸化木聚糖的制备方法,包括以下步骤：将木聚糖与N,N-二甲基甲酰胺按质量体积比5:1-3混合溶解,并于搅拌条件下升温到一定温度后,缓慢加入氨基磺酸反应1-5h,终止反应,经后处理得到硫酸化木聚糖。还公开该制备方法制备的硫酸化木聚糖,其取代度为0.212-1.488；以及硫酸化木聚糖在制备抗氧化药物中的应用,硫酸化木聚糖的有效浓度为2mg/mL。本发明通过调整反应条件制备出不同取代度的硫酸化木聚糖,并验证了不同取代度对不同抗氧化活性的影响,以便于有针对性选择硫酸化木聚糖实现不同药物效果,这为硫酸化木聚糖替代化学药品提供了可能,并且也为硫酸化木聚糖在医药领域的应用提供参考依据。(The invention discloses a preparation method of sulfated xylan, which comprises the following steps: mixing and dissolving xylan and N, N-dimethylformamide according to the mass-volume ratio of 5:1-3, heating to a certain temperature under the condition of stirring, slowly adding sulfamic acid to react for 1-5h, stopping the reaction, and performing post-treatment to obtain sulfated xylan. Also disclosed are sulfated xylans prepared by the preparation method, having a degree of substitution of from 0.212 to 1.488; and the application of the sulfated xylan in preparing the antioxidant drugs, wherein the effective concentration of the sulfated xylan is 2 mg/mL. The invention prepares the sulfated xylan with different degrees of substitution by adjusting reaction conditions, and verifies the influence of different degrees of substitution on different antioxidant activities, so as to select the sulfated xylan with pertinence to realize different drug effects, thereby providing possibility for replacing chemical medicines by the sulfated xylan and providing reference basis for the application of the sulfated xylan in the field of medicine.)

硫酸化木聚糖及其制备方法和在制备抗氧化药物中的应用

技术领域

本发明属于木聚糖修饰技术领域，具体涉及一种硫酸化木聚糖及其制备方法和在制备抗氧化药物中的应用。

背景技术

木聚糖是植物细胞中半纤维素的主要成分，是一种复杂的多聚五碳糖，占植物细胞干重的三分之一到五分之二，是自然界中除纤维素之外含量最丰富的多糖。木聚糖来源广泛，是一种丰富的生物质资源，且木聚糖作为植物多糖，其生物学活性在抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等方面有着主要体现。基于木聚糖多种生物活性，用木聚糖可以作为新材料来代替传统的化学产品，从而达到降低污染的效果，一直是科研工作者研究的热点。但是木聚糖的结构复杂多样，其组成具有多种单糖和官能团。木聚糖的种类大致可分为线性均一木聚糖、***木聚糖、葡糖醛酸木聚糖以及葡糖醛酸***木聚糖。木聚糖特殊性决定了其独特的理化特性和生物功能。大多数木聚糖之间含有较强的氢键连接，故木聚糖在水中不易被溶解。

多糖为天然产物，来源广泛，具有毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点，因而备受研究者的重视。现代研究发现，多糖的生物活性与多糖的空间结构密切，通过物理、化学等手段对其分子结构进行修饰，从而赋予多糖更多生物活性。用适当方法向多糖支链进行羧甲基、硫酸化等修饰，可以增强多糖溶解性和电负性，但是由于多糖结构的复杂性，其现有技术中取代度低，并且由于取代位置不同会造成生物活性差别很大，很难真正应用到实际的生产或后期研究当中；另外，现有技术中，多是采用聚丙烯酰胺凝胶、活性炭等技术进行分离，得到低聚合度的木聚糖或其他多糖，以用于抗炎活性、抗病毒活性、抗癌活性、抗凝活性等方面进行的研究，一方面分离过程比较繁琐，需要进行精细掌握分离条件以获得低聚糖，另一方面由于低聚糖易于被吸收利用的特点，被应用到不同活性研究中，而对于直接经修饰改性的高聚合度多糖，没有相关在抗氧化活性方面应用的报道。

溶于一定溶剂系统中的多糖与相应的硫酸化试剂在一定的条件下反应，使得多糖残基上的某些羟基接上硫酸基团，以氯磺酸试剂为例，多糖的硫酸酯化反应是在路易碱溶液中由SO₃H⁺取代多糖羟基中的H⁺，经过中和得到硫酸酯盐。本发明通过对木聚糖进行硫酸化修饰，并研究了不同取代度硫酸化多糖的抗氧化活性。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种硫酸化木聚糖的制备方法，通过改变反应条件制备不同取代度的硫酸化木聚糖，以便研究不同取代度的木聚糖对于生物活性的影响。

本发明还有一个目的是提供一种由硫酸化木聚糖的制备方法制备的硫酸化木聚糖。

本发明还有一个目的是提供一种硫酸化木聚糖在制备抗氧化药物中的应用，不同取代度的硫酸化木聚糖表现出不同强度的抗氧化作用，以便于选择合适硫酸化木聚糖进行抗氧化药物的制备。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种硫酸化木聚糖的制备方法，包括以下步骤：

将木聚糖与N，N-二甲基甲酰胺按质量体积比5:1-3混合溶解，并于搅拌条件下升温到一定温度后，缓慢加入氨基磺酸反应1-5h，终止反应，经后处理后，得到硫酸化木聚糖。

优选的是，所述氨基磺酸按所述木聚糖质量的0.5％-2.5％添加。

优选的是，反应温度为50-90℃。

优选的是，用冰水终止反应后，将反应后的溶液pH值调至中性，流水透析2d，冷冻干燥后，得到所述硫酸化木聚糖。

优选的是，用质量分数为20％的氢氧化钠调节pH值至中性。

本发明还提供一种由所述的硫酸化木聚糖的制备方法制备的硫酸化木聚糖，所述硫酸化木聚糖的硫酸化取代度为0.212-1.488。

本发明还提供一种所述的硫酸化木聚糖在制备抗氧化药物中的应用，其特征在于，所述硫酸化木聚糖的有效浓度为2mg/mL。

优选的是所述抗氧化药物包含清除DPPH自由基的药物、清除羟基自由基的药物、清除超氧阴离子自由基的药物以及清除还原能力的药物。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明根据溶于一定溶剂系统中的多糖与相应的硫酸化试剂在一定的条件下反应，使得多糖残基上的某些羟基接上硫酸基团，制备成硫酸化取代物，本发明具体以氯磺酸为试剂，根据多糖的硫酸酯化反应是在路易碱溶液中由SO₃H⁺取代多糖羟基中的H⁺，经过中和得到硫酸酯盐，在制备过程中，通过改变制备硫酸化木聚糖反应条件，比如原料用量、反应温度、反应时间等，可以获得不同取代度的硫酸化木聚糖。再将所得的不同取代度的硫酸化木聚糖用于抗氧化活性研究中，发现不同取代度的硫酸化木聚糖表现出不同强度的抗氧化活性，并且发现不同硫酸化的木聚糖具有清除DPPH自由基、清除羟基自由基、清除超氧阴离子自由基、清除还原能力等，根据不同抗氧化活性方面的清除能力，选择适宜的浓度应用到不同的抗氧化药物中，以有针对性的实现不同药物效果，这为硫酸化木聚糖替代化学药品提供了可能，并且也为硫酸化木聚糖在医药领域的应用提供参考依据。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明不同氨基磺酸用量对木聚糖硫酸化取代度的影响；

图2为本发明不同硫酸化温度对木聚糖硫酸化取代度的影响；

图3为本发明不同硫酸化时间对木聚糖硫酸化取代度的影响；

图4为本发明不同DMF用量对木聚糖硫酸化取代度的影响；

图5为本发明硫酸化木聚糖红外谱图；

图6为本发明不同取代度硫酸化木聚糖的DPPH自由基清除率；

图7为本发明不同取代度硫酸化木聚糖的羟基自由基除率；

图8为本发明不同取代度硫酸化木聚糖的超氧阴离子清除率；

图9为本发明不同取代度硫酸化木聚糖的还原能力。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

硫酸化木聚糖的制备方法。

称量100mg的木聚糖，溶于50mL N,N-二甲基甲酰胺于三角瓶中，用磁力搅拌器搅拌升温到80℃后，加入2.5g氨基磺酸，搅拌反应1h，冰浴终止反应，用质量分数20％的氢氧化钠溶液调pH至中性，流水透析2d，冷冻干燥后得到硫酸化木聚糖样品。

1、不同氨基磺酸用量对木聚糖硫酸化取代度的影响

设置氨基磺酸用量0.5g、1g、1.5g、2.0g、2.5g，研究不同氨基磺酸用量对木聚糖硫酸化取代度的影响。

如图1所示，结果显示：氨基磺酸加量在0.5-1.5g时，取代度变化平缓，在2.5g时有最高峰，即取代度为1.53，超过2.5g时取代度有所降低，因此，制备硫酸化木聚糖时的氨基磺酸最佳用量为2.5g。

2、不同反应温度对木聚糖硫酸化取代度的影响

设置温度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，研究不同温度对木聚糖硫酸化取代度的影响。

如图2所示，结果显示：随着温度的升高，取代度先升高之后又逐渐降低，在80℃时木聚糖的取代度最高，即取代度为0.51。因此，制备硫酸化木聚糖时的最佳硫酸化温度为80℃。

3、不同反应时间对木聚糖硫酸化取代度的影响

设置反应时间为1h、2h、3h、4h、5h，研究不同反应时间对木聚糖硫酸化取代度的影响。

如图3所示，结果显示，在反应4h内，随着时间的增长逐渐升高，而4h之后开始缓慢下降，反应4h时取代度最高，即取代度为0.89。因此，制备硫酸化木聚糖时的最佳反应时间温度为4h。

4、不同N,N-二甲基甲酰胺(DMF)用量对木聚糖硫酸化取代度的影响

设置DMF用量20mL、30mL、40mL、50mL、60mL，研究不同DMF用量对木聚糖硫酸化取代度的影响。

如图4所示，结果显示：取代度随DMF用量增大而减小，因此，制备硫酸化木聚糖时的DMF的最佳用量为20mL，取代度最高为1.14。

实施例2

通过实施例1得到的最佳反应条件制备硫酸化木聚糖，用红外光谱分析。

具体为：分别称取2mg的木聚糖和最佳条件下制备的硫酸化木聚糖，加入100mg干燥KBr于玛瑙研钵中，研磨均匀，压片。进行红外光谱扫描，扫描范围为4000～400^cm-1。

如图5所示，结果显示：在1197.63cm^-1处，吸收峰明显增大，说明硫酸根增加，831.20cm^-1处是硫酸酯键的特征吸收峰，表明已有硫酸基团连接在多糖链上，木聚糖成功制备硫酸化木聚糖。

实施例3

硫酸化木聚糖取代度的测定

称取3mg样品于试管中，加入3mL 1mol/L HCl，加塞，在100℃恒温水浴锅中水解6h，用蒸发皿将内容物60℃挥干，再用2mL去离子水复溶，得到样品水解液。取水解液0.4mL，去离子水补至1.6mL，依次加入8％三氯乙酸溶液、BaCl₂-明胶溶液各1.4mL，混匀后静置15min，360nm波长测定吸光值A1。

对照组：对照组操作同上，用1.4mL的明胶溶液代替BaCl₂-明胶溶液。360nm波长测定吸光度值A2。

所求吸光度A0＝A1-A2，A1-A2目的是消除水解液中所含自外吸收物质的影响。由所测得的吸光度值根据硫酸根标准曲线可计算出硫酸钾的质量。

硫酸化取代度的计算：

取代度计算公式：DS＝(1.62×S)/(32-1.02×S)。其中，S—样品中硫的质量分数(％)。

实施例4

分别取取代度为0.212、0.403、0.515、0.672、0.875、0.973、1.182、1.488的硫酸化木聚糖测定抗氧化活性。

不同取代度硫酸化木聚糖对DPPH自由基清除作用：

取不同取代度的待测样品液2.0mL 2mg/mL，加入2.0mL 0.04mg/mL DPPH溶液(无水乙醇作为溶剂)，充分混匀后室温下避光反应30min，在波长517nm处测定其吸光度Ai，同时测定无水乙醇(2.0ml)与DPPH(2.0mL)混合液的吸光度AC，无水乙醇(2.0mL)和样品液(2.0mL，具体浓度见图6)混合液的吸光度Aj。

结果如图6所示：当硫酸化修饰取代度为0.875，DPPH自由基的清除率最大，此时样品液浓度为2mg/mL。随着取代度的不断增大，硫酸化木聚糖对DPPH自由基的清除作用呈下降趋势。总体上取代度和清除率之间并呈较明显线性规律。说明适当的硫酸化修饰，有助于提高DPPH自由基清除率。

实施例5

分别取取代度为0.212、0.403、0.515、0.672、0.875、0.973、1.182、1.488的硫酸化木聚糖测定对羟基自由基清除作用。

不同取代度硫酸化木聚糖对羟基自由基清除作用：

取0.2mL摩尔浓度为10mmol/L的FeSO₄-EDTA混合液于带塞试管中，加入0.2mL摩尔浓度为20mmol/L的α-脱氧核糖溶液，然后再加入0.2mL样品(具体浓度见图7)，并用磷酸缓冲液(0.2mol/L，pH＝7.4)定容至1.8mL，然后加入0.2mL的H₂O₂(10mmol/L)，40℃恒温水浴1h，加入1mL质量分数为2.8％的三氯乙酸终止反应，再加入1mL质量分数为1％硫代巴比妥酸，混匀之后于沸水浴中加热10min，冷却后，于532nm处测光吸收值AS。

结果如图7所示：随着取代度的不断增大，硫酸化木聚糖对羟自由基的清除作用呈上升趋势，但是取代度和清除率之间并没有呈明显线性规律。当取代度大于0.973时，硫酸化木聚糖对羟基自由基的清除率较高，样品浓度为2mg/mL最高。取代度继续增高，清除率有所下降。硫酸化修饰的取代度越大，木聚糖的清除羟自由基的能力越强，表明硫酸化修饰有利于木聚糖清除羟自由基。

实施例6

分别取取代度为0.212、0.403、0.515、0.672、0.875、0.973、1.182、1.488的硫酸化木聚糖测定对超氧阴离子自由基清除作用。

不同取代度硫酸化木聚糖对超氧阴离子自由基清除作用：

取4.5mL Tris-HCl溶液(50mmol/L，pH＝8.2)于试管，在25℃温水中预热20min，之后依次加入同样预热条件下预热的摩尔浓度为25mmoL/L邻苯三酚溶液0.3mL和样品0.2mL(具体浓度见图8)，并迅速混匀倒入比色皿，波长319nm处测定吸光度At，每30s测一次，测定8次。以去离子水作为空白对照，同样操作条件下测定并计算邻苯三酚自氧化速率V0。以At为纵坐标，时间为横坐标作图，计算斜率Vt。超氧阴离子自由基清除率计算公式：Y(％)＝(1-Vt)/V0×100％

式中：Vt为以At为纵坐标，时间为横坐标的斜率，V0为邻苯三酚的自氧化速率。

结果如图8显示：硫酸化木聚糖对超氧阴离子自由基的清除能力，总体上是随着取代度的变大而增加，但是并不呈现清晰的线性规律，与其羟基自由基的清除率有些类似，但是与之相比，硫酸化木聚糖对超氧阴离子自由基的清除能力呈现更复杂的趋势。随着硫酸化木聚糖取代度值的增大，对超氧阴离子自由基的清除作用增强。样品液浓度为2mg/mL时，清除能力最强。

实施例7

分别取取代度为0.212、0.403、0.515、0.672、0.875、0.973、1.182、1.488的硫酸化木聚糖测定对Fe³⁺还原能力。

不同取代度硫酸化木聚糖对Fe³⁺还原能力作用

取0.5mL不同浓度(详见图9)的硫酸化多糖溶液于试管中，并加入0.5mL摩尔浓度为0.2mol/L PBS缓冲液(pH＝6.7)和0.5mL质量分数为1％铁***溶液，50℃水浴锅恒温20min后冷却，加入0.5mL质量分数为10％三氯乙酸溶液，依次加入2mL蒸馏水，0.5mL质量分数为0.1％的FeCl₃溶液充分混匀，静置10min后，在紫外-可见分光光度计700nm波长处测定溶液吸光值。

结果如图9显示：随着取代度的不断增大，硫酸化木聚糖的还原性作用呈下降的趋势，浓度为2mg/mL的样品液的还原作用是最强的。但是取代度和清除率之间呈一定程度的负相关系，硫酸化修饰的取代度越大，木聚糖的还原性能力越弱，表明硫酸化修饰不利于木聚糖还原性的发挥。

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。