具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物及其制备方法和应用 (Triazole derivative capable of influencing calcium ion channel of tumor cell and preparation method and application thereof ) 是由 孙秀伟 刘晓斐 姚小军 王文君 王育伟 于 2021-03-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物化学合成技术领域,具体涉及一种具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物及其制备方法和应用。本发明以度鲁特韦为先导化合物,利用药物拼接原理,通过click反应,将度鲁特韦结构中的苄基变为1,2,3-三氮唑结构,得到一种新的化合物,能够通过影响肿瘤细胞中的钙离子通道来抑制肿瘤细胞的生长,具有显著的应用价值。(The invention relates to the technical field of pharmaceutical chemistry synthesis, in particular to a triazole derivative capable of influencing a tumor cell calcium ion channel, and a preparation method and application thereof. According to the invention, dolutegravir is taken as a lead compound, a benzyl group in a dolutegravir structure is changed into a 1,2, 3-triazole structure through a click reaction by utilizing a medicine splicing principle, so that a novel compound is obtained, the growth of tumor cells can be inhibited by influencing a calcium ion channel in the tumor cells, and the application value is obvious.)
技术领域
本发明涉及药物化学合成技术领域，具体涉及一种具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
度鲁特韦是一种安全高效且具有较高基因屏障和良好药代特性的HIV整合酶抑制剂，是由美国葛兰素史克旗下公司所研发，于2013年由食品药品监督管理局FDA批准上市。度鲁特韦通过与整合酶活性部位结合来阻断逆转录病毒脱氧核糖核酸(DNA)整合的链转移步骤。该药物每日仅服用一次，对于治疗首次感染HIV-1患者，疗效与每日服用两次的雷特格韦的作用相当，并且安全性高，具有强效的抗耐药属性，度鲁特韦作为FDA优先审评药物，预计2020年销售额将达26亿美元。临床前研究结果显示其毒性小，没有基因毒性和致癌毒性，在大于临床剂量27倍时没有出现明显的生育毒性和致畸毒性。临床研究显示度鲁特韦对初次治疗的HIV感染者、当前疗法治疗失败但未使用整合酶抑制药治疗的患者的治疗效果均优于对照药；对抗病毒治疗失败、且对雷特格韦和/或埃替格韦耐药的成人患者也显示出良好的疗效。
肿瘤是当今世界危及人类生命的一种常见的严重疾病，已成为导致人类死亡的“第二大杀手”。据统计，2035年全球癌症死亡人数将增加到1315万人，但是目前上市的绝大多数化疗药物不良反应较多，很多患者不能耐受以致死亡。因此，抗肿瘤药物的研究开发在当今生命科学领域中极富挑战性而且意义重大。因为HIV会降低人体免疫力，进而会导致病人容易患各种肿瘤，而且目前关于度鲁特韦的研究主要在抗HIV方面，还没有发现其能够应用到治疗别的疾病。
中国专利CN107759607A公开了一种具有抗肿瘤活性的三氮唑并二氮卓化合物及其制备方法，属于医药合成技术领域。该专利的技术要点为：
该专利对乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2均有抑制作用。
度鲁特韦是一类具有二酮酸结构的HIV整合酶抑制剂，通过羰基与HIV整合酶靶点中的Mg2+相互作用介导，进而抑制HIV整合酶的活性。度鲁特韦对肿瘤细胞没有抑制作用，对肺癌细胞H460和H1975的抑制率IC50都在100uM以上，可以认为无效；因此可以保留度鲁特韦结构中的二酮酸结构，并引入了1,2,3-三氮唑结构，使其具有抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物，以度鲁特韦为先导化合物，利用药物拼接原理，通过click反应，将度鲁特韦结构中的苄基变为1,2,3-三氮唑结构，得到一种新的化合物，能够通过影响肿瘤细胞中的钙离子通道来抑制肿瘤细胞的生长，具有显著的应用价值；本发明的同时提供其制备方法和应用。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
本发明所述的具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物，其结构式如下：
本发明所述的具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)4-甲氧基乙酰乙酸甲酯与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应，得到(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯；(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯与草酸二甲酯发生环合反应，经氧氮转化后水解，得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯；或者
4-甲氧基乙酰乙酸甲酯与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应后，直接与草酸二甲酯发生环合反应，经氧氮转化后水解，得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯；
(2)1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯与间氨基苯乙炔缩合得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺；
(3)D(+)α-甲基苄胺与乙酰乙酸乙酯反应得到1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯；在硼氢化钠和催化剂作用下，1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯手性催化加氢，得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐；
(4)在硼氢化钠和氯化锌作用下或在频那醇硼烷和醋酸镧作用下或在氢化铝锂作用下，(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇；
(5)(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇与S-扁桃酸反应，得到R-3-氨基丁醇-S-扁桃酸盐；或者(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇与乙酸反应，得到R-3-氨基丁醇-乙酸盐；
(6)1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺与R-3-氨基丁醇-S-扁桃酸盐或R-3-氨基丁醇-乙酸盐反应，得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺；
或者
1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯在催化剂作用下与3-氨基丁醇反应，得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-羧酸；之后再与间氨基苯乙炔经过酰化反应得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺；
(7)(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺与2-三氟甲基苯基叠氮发生click反应，得到具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物。
其中：
一、步骤(1)如下：在氮气保护、温度15-25℃条件下，将4-甲氧基乙酰乙酸甲酯加入四氢呋喃中，滴加N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛，滴加完后，搅拌反应；然后升温至25-35℃，反应结束后浓缩得到(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯；
将(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯加入甲醇中，在室温和氮气保护条件下搅拌至完全溶解，加入草酸二甲酯，然后降温至10-12℃，加入金属醇盐，回流；原料反应完全后降温至0℃，调节pH值为5-6，真空浓缩；向浓缩物中加入乙酸乙酯，分出有机相后浓缩；然后加入甲醇和氨基乙醛缩二甲醇，搅拌后降温至5℃，加入无水氢氧化锂反应；反应结束后，保持反应温度0-5℃，调节反应液pH值为1-2，有机相萃取，饱和食盐水洗涤，有机相浓缩得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯；
或步骤(1)如下：
在氮气保护、温度15-25℃条件下，将4-甲氧基乙酰乙酸甲酯加入四氢呋喃中，滴加N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛，滴加完后，搅拌反应；然后升温至25-35℃，反应结束后浓缩得到(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯；
在0℃和氮气保护条件下，将金属盐的甲醇溶液加入1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中，加入草酸二甲酯，搅拌；再加入(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯，升至室温，加入金属盐的甲醇溶液，加入完毕继续搅拌；再加入氨基乙醛缩二甲醇和二异丙基乙胺，室温反应；然后浓缩反应液，浓缩后加入乙酸乙酯中，调节反应液pH值为中性，分离有机相后，浓缩，加入甲醇中；氮气保护下加入无水氢氧化锂，0-5℃下反应，然后调节反应液pH值为2-3，有机相萃取，饱和食盐水洗涤，有机相浓缩得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯；
或步骤(1)如下：
氮气保护和室温条件下，将N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛滴加到4-甲氧基乙酰乙酸甲酯中，反应，然后加入无水甲醇，搅拌至完全溶解；加入草酸二甲酯，然后降温至10-12℃，加入金属醇盐，回流；TLC监控原料反应完全后降温至0℃，调节pH值为5-6，浓缩，向浓缩物中加入乙酸乙酯，溶解浓缩物；然后加入甲醇和氨基乙醛缩二甲醇，搅拌后降温至5℃，加入无水氢氧化锂反应；反应结束后，保持反应温度0-5℃下，调节反应液pH值为1-2，有机相萃取，饱和食盐水洗涤，有机相浓缩得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯；
其中，所述的4-甲氧基乙酰乙酸甲酯与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛的摩尔比为1:1-1.1；所述的(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯、草酸二甲酯、金属盐的摩尔比为1:2-4:2-3；所述的(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯、氨基乙醛缩二甲醇、氢氧化锂的摩尔比为1:1:1-4；所述的金属醇盐为甲醇钠，乙醇钠或叔丁醇钾。
二、步骤(2)如下：将1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯、HATU、DIPEA、间氨基苯乙炔和N,N-二甲基甲酰胺，氩气保护下，室温反应；将反应液加入水中，析出固体，抽滤，烘干得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺；
其中，所述的1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯，HATU、DIPEA、间氨基苯乙炔的摩尔比为1:1:2:2。
三、步骤(3)如下：
将D(+)α-甲基苄胺和乙酰乙酸乙酯加入四氢呋喃中，氮气保护下回流反应，原料反应完全，真空浓缩，得到1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯；
将硼氢化钠和无水氯化金属盐加入甲基叔丁基醚中，室温搅拌，得到含有甲基叔丁基醚的溶液；将L-脯氨酸和1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯加入四氢呋喃中，室温搅拌得到含有四氢呋喃的溶液；然后在0-10℃，氮气保护下，将含有四氢呋喃的溶液滴加到含有甲基叔丁基醚的溶液中，氮气保护下分批加入枸橼酸，加入完毕后保温搅拌；原料反应完全后，降温至-10℃以下，滴加水，然后再调节反应液pH值至中性，分离有机相，洗涤，干燥，抽滤，蒸除甲基叔丁基醚；然后加入丙酮和正己烷中，滴加甲酸溶液，析出固体，降温到0℃，抽滤，得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐；
其中，所述的D(+)α-甲基苄胺与乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1:1-1.1；所述的无水氯化金属盐为三氯化铈、氯化钙或氯化锂；所述的1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯、硼氢化钠、氯化金属盐与L-脯氨酸的摩尔比为1:1.5-2.5:0.5-1:1；所述的1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯与枸橼酸的摩尔比为1:1；
或步骤(3)如下：
将D(+)α-甲基苄胺和乙酰乙酸乙酯加入甲苯中，氮气保护下回流反应，原料反应完全，蒸除甲苯和未反应完的乙酰乙酸乙酯，得到1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯；
将硼氢化钠、氯化铜、(R,R)-QuinoxP*加入四氢呋喃和乙腈的混合溶液中，温度保持在-5℃至0℃，搅拌；氮气保护下，滴加1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯，分批加入枸橼酸，反应；TLC监控原料反应完全，然后降温至-10℃以下，滴加水，然后再调节反应液pH值至中性，蒸除有机溶剂；加入乙酸乙酯，分离有机相，洗涤，干燥，抽滤，蒸除乙酸乙酯；然后加入丙酮和正己烷中，滴加甲酸溶液，析出固体，降温至0℃，抽滤，得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐；
其中，所述的D(+)α-甲基苄胺与乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1:1-1.1；所述的1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯、硼氢化钠、氯化铜与(R,R)-QuinoxP*的摩尔比为1:1.5-2.5:0.1-0.5:0.1；所述的1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯与枸橼酸的摩尔比为1:1。
四、步骤(4)如下：
在0-10℃和氮气保护条件下，向四氢呋喃中加入NaBH4和氯化锌，然后再滴加溶有(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐的四氢呋喃溶液，控制温度5-10℃，滴加完毕后升至室温；原料反应完全后，将反应液倾入冰水中，加入甲基叔丁基醚，分出上层有机相，再洗涤，干燥，抽滤，滤液浓缩得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇；
其中，所述的(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐、硼氢化钠、氯化锌的摩尔比为1:4:2；
或步骤(4)如下：
将(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐和频那醇硼烷加入溶剂中，室温和氮气保护条件下，加入含有醋酸镧的溶剂，升温至40-60℃反应；TLC监控原料反应完全，过滤反应液，浓缩后加入二氯甲烷，洗涤，分出有机相，浓缩得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇；
其中，所述的(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐和频那醇硼烷的摩尔比为1:2-3；所述的溶剂为正戊烷或甲苯；
或步骤(4)如下：
在-30℃至0℃和氩气保护条件下，向四氢呋喃中加入氢化铝锂，然后再滴加溶有(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐的四氢呋喃溶液，反应至原料消失；将反应液倾入冰水中，加入甲基叔丁基醚，分出上层有机相，再洗涤，干燥，抽滤，滤液浓缩得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇；
其中，所述的(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐、氢化铝锂的摩尔比为1:2-5。
五、步骤(5)如下：向(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇和无水乙醇中，加入25wt.％甲酸铵水溶液，氮气保护下加入10wt.％的Pd/C，升温至55-65℃；原料反应完全，降温抽滤除去Pd/C，蒸除乙醇得到游离态的R-3-氨基丁醇；反应温度冷却到8-12℃，加入异丙醇，分批加入S-扁桃酸或乙酸，加完后继续搅拌，有固体析出；蒸除异丙醇，带走反应体系中残留的水分，再加入异丙醇加热到回流溶解，溶清后降温至室温，固体析出，抽滤后，洗涤滤饼，烘干得到R-3-氨基丁醇-S-扁桃酸盐或R-3-氨基丁醇-S-乙酸盐；
其中，所述的(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇与25wt.％甲酸铵水溶液的质量比为1:4-5，所述的(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇与10wt.％的Pd/C的质量比为5:1-2，所述的(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇与S-扁桃酸或乙酸的摩尔比为1:1-1.2。
六、步骤(6)如下：
将1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺加入到无水甲酸中，氩气保护下，加热至60-70℃，反应后，浓缩，蒸除甲酸，加入乙腈，搅拌使其溶解，加入R-3-氨基丁醇-S-扁桃酸盐或R-3-氨基丁醇-乙酸盐，加热至回流，反应结束后浓缩蒸除溶剂，加入二氯甲烷和水，分出有机相，洗涤，浓缩得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺；
其中，所述的1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺、R-3-氨基丁醇-S-扁桃酸盐或R-3-氨基丁醇-乙酸盐的摩尔比为1:1-2。
或步骤(6)如下：
将1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯加入无水甲酸中，氮气保护下，加热至回流，反应结束，浓缩除去甲酸，加入乙腈，氮气保护下搅拌溶解得到乙腈溶液；将3-氨基丁醇和(R,R)-QuinoxP*和双(三苯基膦)硝酸铜(I)，加入四氢呋喃中得到含有四氢呋喃的溶液；氮气保护下，向含有四氢呋喃的溶液中滴加含有乙腈的溶液，滴加完毕，回流反应；TLC检测原料反应完全，过滤反应液，浓缩蒸除溶剂，加入二氯甲烷和水,再调节反应液pH值为1-2，加入二氯甲烷和水，分出下层有机相，洗涤，浓缩得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-羧酸；
将(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-羧酸加入N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下室温搅拌完全溶解；加入HATU，控制温度不超过25℃，滴加DIPEA；将间氨基苯乙炔溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，并将其加入反应体系中，于25-35℃反应；TLC显示反应完成，加水，打浆，抽滤，滤饼烘干后得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺；
其中，所述的1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯、3-氨基丁醇、(R,R)-QuinoxP*、双(三苯基膦)硝酸铜(I)的摩尔比为1:1-1.4:0.1:0.1；
(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-羧酸、HATU、DIPEA、间氨基苯乙炔的摩尔比为1:1-1.1:1-1.1:2。
七、步骤(7)如下：
将2-三氟甲基苯基叠氮、(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺、叔丁醇、水、四氢呋喃、五水硫酸铜和抗坏血酸钠混合后，在60-80℃下反应；原料反应完全，加入二氯甲烷，过滤反应液，得到黄色液体；分出有机相，干燥，蒸除溶剂得到黄色固体，用乙醇重结晶得到具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物。
本发明所述的(R,R)-QuinoxP*的结构式为
所述的具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物的应用，是将具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物制备抗癌药物。
本发明的有益效果如下：
1、本发明通过“一锅法”反应得到关键中间体1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯，缩短了反应路线，提高了反应收率，具有良好的工业化前景。
2、本发明设计一条合成R-3-氨基丁醇-盐的路线，采用了金属盐催化剂，提高了各个步骤中手性中间体的收率。
3、本发明在催化剂作用下可以直接得到手性纯度较高的(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-羧酸，具有很高的工业化生产价值。
4、本发明以度鲁特韦为先导化合物，利用药物拼接原理，通过click反应，将度鲁特韦结构中的苄基变为1,2,3-三氮唑结构，得到一种新的化合物，能够通过影响肿瘤细胞中的钙离子通道来抑制肿瘤细胞的生长，具有显著的应用价值。
附图说明
图1是本发明具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物的氢谱图；
图2是本发明实施例16中(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇的氢谱图；
图3是本发明实施例19中R-3-氨基丁醇-乙酸盐的氢谱图；
图4是本发明实施例20中(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺的氢谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
在氮气保护、反应温度在15-25℃条件下，把4-甲氧基乙酰乙酸甲酯30g加入到四氢呋喃100mL中，滴加N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛24g，滴加完后保持温度在室温，搅拌反应1h，然后升温至35℃，反应结束后浓缩得到(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯37g，LC-MS：202[M+H]+。
实施例2
把(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯20g，加入无水甲醇250mL，在室温条件和氮气保护下搅拌至完全溶解；加入草酸二甲酯48g，然后降温至10℃，加入甲醇钠12g，升温至回流，原料反应完全后降温至0℃，滴加2N盐酸调节反应液pH值为5-6，然后真空浓缩，然后向浓缩物中加入乙酸乙酯150mL，分出有机相后浓缩再加入无水甲醇200mL中，再加入氨基乙醛缩二甲醇11g，搅拌2.5h后降温至5℃，加入无水氢氧化锂7.2g，控制反应在0-5℃之间；反应30min后，TLC显示原料反应完全，保持反应温度0-5℃下，滴加稀硫酸溶液调节反应液pH值为1-2，加入二氯甲烷100mL，分出有机相，水相再用二氯甲烷萃取多次，合并有机相，用饱和食盐水20mL洗涤一次，有机相浓缩得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯19.4g；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.42(s,1H),4.54(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),4.14(d,J＝8.0Hz,2H),4.03(s,6H),3.42(s,6H).
实施例3
把(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯20g，加入无水甲醇250mL，在室温条件和氮气保护下搅拌至完全溶解；加入草酸二甲酯48g，然后降温至10℃，加入乙醇钠15g，升温至回流，原料反应完全后降温至0℃，滴加2N盐酸调节pH值为5-6，然后真空浓缩，然后向浓缩物中加入乙酸乙酯150mL，分出有机相后浓缩，加入无水甲醇200mL中，再加入氨基乙醛缩二甲醇11g，搅拌2.5h后降温至5℃，加入无水氢氧化锂7.2g，控制反应在0-5℃之间；反应30min后，保持反应温度0-5℃滴加2N盐酸溶液调节pH值为1-2，加入二氯甲烷100mL，分出有机相，水相再用二氯甲烷萃取多次，合并有机相，用饱和食盐水20mL洗涤一次，有机相浓缩得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯16.6g。
实施例4
把(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯20g，加入无水甲醇250mL，在室温条件和氮气保护下搅拌至完全溶解；保持室温搅拌，加入草酸二甲酯48g，然后降温至10℃，加入叔丁醇钾25g，升温至回流，原料反应完全后降温至0℃，滴加2N盐酸调节反应液pH值为5-6，然后真空浓缩之后向浓缩物中加入乙酸乙酯150mL，分出有机相后浓缩；然后加入无水甲醇300mL中，再加入氨基乙醛缩二甲醇11g，搅拌2.5h后降温至5℃，加入无水氢氧化锂9.6g，控制反应在0-5℃之间；反应40min后保持反应温度0-5℃下，滴加2N盐酸溶液调节反应液pH值为1-2，浓缩反应液，加入二氯甲烷100mL，分出有机相，水相再用二氯甲烷萃取多次，合并有机相，用饱和食盐水15mL洗涤一次，有机相浓缩得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯25.6g。
实施例5
在反应瓶中，在0℃条件和氮气保护下，把溶有甲醇钠11g的甲醇溶液100mL加入1,3-二甲基-2-咪唑啉酮300mL中，然后加入草酸二甲酯48g，加入完后搅拌10min，再加入(Z)-2-((2,2-甲基氨基)亚甲基)-4-甲氧基-3-氧代丁酸甲酯20g，升温至室温，搅拌1h后加入溶有甲醇钠5.5g的甲醇溶液50mL，滴加完后继续搅拌1.5h，再加入氨基乙醛缩二甲醇11g和二异丙基乙胺13g，室温搅拌反应3.2h，然后浓缩反应液，浓缩后加入乙酸乙酯200mL中，用稀盐酸调节反应液pH为中性，然后分离有机相，有机层用5％碳酸氢钠水溶液洗涤后浓缩，然后加入甲醇350mL中，在氮气保护下加入无水氢氧化锂9.6g，控制反应在0-5℃之间；反应30min后，保持反应温度0-5℃下，滴加冰乙酸调节反应液pH值为2-3，浓缩反应液，加入二氯甲烷100mL，分出有机相，水相再用二氯甲烷萃取多次，合并有机相，用饱和食盐水20mL洗涤一次，有机相浓缩得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯27.9g。
实施例6
在氮气保护和室温条件下，把N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛12g缓慢滴加到4-甲氧基乙酰乙酸甲酯15g中，滴加完后搅拌反应1h，然后加入无水甲醇250mL，在室温条件和氮气保护下加入草酸二甲酯48g，然后降温至10℃，分批加入甲醇钠12g，缓慢升温至回流，原料反应完全后降温至0℃，滴加2N盐酸调节反应液pH值为5-6，然后真空浓缩，之后向浓缩物中加入乙酸乙酯150mL，搅拌条件下使浓缩物溶解；然后加入无水甲醇300mL中，再加入氨基乙醛缩二甲醇11g，搅拌2h，然后降温至5℃，加入无水氢氧化锂7.2g，控制反应在0-5℃之间；反应40min后保持反应温度0-5℃下，滴加2N盐酸溶液调节反应液pH值为1-2，浓缩反应液，加入二氯甲烷100mL，分出有机相，水相再用二氯甲烷萃取多次，合并有机相，用饱和食盐水20mL洗涤一次，有机相浓缩得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯29.1g。
实施例7
在室温条件下，在反应瓶中加入1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯5g，HATU 6g，DIPEA 4.1g，间氨基苯乙炔3.7g和N,N-二甲基甲酰胺50mL，在氩气保护下，室温搅拌反应12h；把反应液加入水100mL中，有大量固体析出，抽滤，烘干得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺5.73g，LC-MS(ESI)：415[M+H]+。
实施例8
在反应瓶中把D(+)α-甲基苄胺12g和乙酰乙酸乙酯15g加入甲苯100mL，在氮气保护下升温至回流，原料反应完全；真空浓缩后得到1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯17g；1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ8.97(s,1H),7.33(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,2H),7.24(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,2H),4.66-4.61(m,1H),4.47(s,1H),4.17-4.09(m,2H),1.76(s,3H),1.52(d,J＝4.0Hz,3H),1.27(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,5H).
实施例9
在反应瓶中把D(+)α-甲基苄胺12g和乙酰乙酸乙酯15g加入四氢呋喃100mL，在氮气保护下升温至回流，原料反应完全；真空浓缩后得到1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯21g；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.97(s,1H),7.33(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,2H),7.24(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,2H),4.66-4.61(m,1H),4.47(s,1H),4.17-4.09(m,2H),1.76(s,3H),1.52(d,J＝4.0Hz,3H),1.27(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,5H).
实施例10
在反应瓶中，把硼氢化钠7.6g和无水三氯化铈13g加入甲基叔丁基醚100mL中，室温条件下搅拌30min，得到含有甲基叔丁基醚的溶液；在室温条件下，把L-脯氨酸11g和1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯24g加入四氢呋喃200mL中，在室温条件下搅拌20min，得到含有四氢呋喃的溶液；然后在0℃、氮气保护下，把得到含有四氢呋喃的溶液慢滴加到含有甲基叔丁基醚的溶液中，保持温度在0-10℃，在氮气保护下分批加入枸橼酸20g，滴完后保温搅拌1.5h，原料反应完全后降温至-10℃以下，缓慢地滴加水100mL，保持温度不超过0℃，滴加饱和氢氧化钠溶液调节反应液pH值达到中性，过滤反应液，然后分出有机相；用水20mL洗涤有机相两次，再用饱和NaCl溶液10mL洗涤一次，最后经无水MgSO4干燥，抽滤后浓缩得到油状的液体[(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯含量81％，(1R,2S)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯含量19％]，把得到的油状液体加入到丙酮70mL和正己烷140mL的混合液中，搅拌均匀后缓慢滴加甲酸溶液，有大量固体析出，降温到0℃搅拌1h，抽滤得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐19.1g，手性纯度达到96.4％；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.31(s,4H),7.23-7.22(m,1H),4.13(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,2H),3.88(dd,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),3.01-2.95(m,1H),2.43(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),2.41-2.34(m,1H),1.58(s,1H),1.32(s,3H),1.31-1.25(m,3H),1.05(d,J＝4.0Hz,3H).
实施例11
在反应瓶中，把硼氢化钠7.6g和无水氯化钙6g加入甲基叔丁基醚100mL中，室温条件下搅拌30min，得到含有甲基叔丁基醚的溶液；在室温条件下，把L-脯氨酸11g和1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯24g加入四氢呋喃200mL中，在室温条件下搅拌20min，得到含有四氢呋喃的溶液；然后在0℃、氮气保护下，把含有四氢呋喃的溶液缓慢滴加到含有甲基叔丁基醚的溶液中，保持温度在0-10℃，在氮气保护下分批加入枸橼酸20g，滴完后保温搅拌1.5h，原料反应完全后降温至-10℃以下，缓慢地滴加水100mL，保持温度不超过0℃，滴加饱和氢氧化钠溶液调节反应液pH值达到中性，过滤反应液，然后分出有机相；用水20mL洗涤有机相两次，再用饱和NaCl溶液10mL洗涤一次，最后经无水MgSO4干燥，抽滤后浓缩得到油状液体[(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯含量78％，(1R,2S)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯含量22％]，把得到的油状液体加入到丙酮70mL和正己烷140mL的混合液中，搅拌均匀后缓慢滴加甲酸溶液，有大量固体析出，降温到0℃搅拌1h，抽滤得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐16.7g，手性纯度达到96.9％；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.31(s,4H),7.23～7.22(m,1H),4.13(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,2H),3.88(dd,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),3.01-2.95(m,1H),2.43(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),2.41-2.34(m,1H),1.58(s,1H),1.32(s,3H),1.31-1.25(m,3H),1.05(d,J＝4.0Hz,3H).
实施例12
在反应瓶中，把硼氢化钠7.6g和无水氯化锂4g加入甲基叔丁基醚100mL中，室温条件下搅拌30min，得到含有甲基叔丁基醚的溶液；在室温条件下，把L-脯氨酸11g和1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯24g加入四氢呋喃200mL中，在室温条件下搅拌20min，得到含有四氢呋喃的溶液；然后在0℃、氮气保护下，把含有四氢呋喃的溶液缓慢滴加到含有甲基叔丁基醚的溶液中，滴加过程中保持温度在0-10℃，在氮气保护下分批加入枸橼酸20g，滴完后保温搅拌1.5h，原料反应完全后降温至-10℃以下，缓慢地滴加水100mL，保持温度不超过0℃，滴加饱和氢氧化钠溶液调节反应液pH值达到中性，过滤反应液，然后分出有机相；用水20mL洗涤有机相两次，再用饱和NaCl溶液10mL洗涤一次，最后经无水MgSO4干燥，抽滤后浓缩得到油状液体[(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯含量73％，(1R,2S)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯含量27％]，把得到的油状液体加入到丙酮70mL和正己烷140mL的混合液中，搅拌均匀后缓慢滴加甲酸溶液，有大量固体析出，降温到0℃搅拌1h，抽滤得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐14.4g，手性纯度达到91.5％；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.31(s,4H),7.23-7.22(m,1H),4.13(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,2H),3.88(dd,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),3.01-2.95(m,1H),2.43(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),2.41-2.34(m,1H),1.58(s,1H),1.32(s,3H),1.31-1.25(m,3H),1.05(d,J＝4.0Hz,3H).
实施例13
在反应瓶中，把硼氢化钠7.6g和氯化铜6.7g和(R,R)-QuinoxP*3.3g加入四氢呋喃和乙腈的混合溶液300mL中，搅拌并降温到-5-0℃，搅拌2h，然后在氮气保护下，缓慢滴加1R-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁烯酸乙酯24g，保持温度不变，在氮气保护下分批加入枸橼酸20g，滴完后保温搅拌2h，TLC监控原料反应完全；然后降温至-10℃以下，缓慢地滴加水120mL，保持温度不超过-10℃，滴加饱和氢氧化钠溶液调节反应液pH值达到中性，过滤反应液，然后真空蒸出有机溶剂，加入乙酸乙酯200mL，然后分出有机相；用水20mL洗涤有机相两次，再用饱和氯化钠溶液10mL洗涤一次，最后经无水MgSO4干燥，抽滤后浓缩，得到油状液体[(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯含量91％，(1R,2S)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯含量9％]，把得到的油状液体加入到丙酮70mL和正己烷140mL的混合液中，搅拌均匀后缓慢滴加甲酸溶液，有大量固体析出，降温到0℃搅拌1h，抽滤得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐19.4g，手性纯度达到97.3％；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.31(s,4H),7.23-7.22(m,1H),4.13(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,2H),3.88(dd,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),3.01-2.95(m,1H),2.43(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),2.41-2.34(m,1H),1.58(s,1H),1.32(s,3H),1.31-1.25(m,3H),1.05(d,J＝4.0Hz,3H).
实施例14
在反应瓶中，先加入四氢呋喃100mL，在0-10℃条件和氮气保护下，加入硼氢化钠14g和氯化锌26g，然后再缓慢滴加溶有(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐28g的四氢呋喃溶液200mL，控制内温5-10℃，滴完后缓慢升温至室温，原料反应完全后，把反应液缓慢倾入冰水120mL中，加入甲基叔丁基醚100mL，搅拌后分出上层有机相后，再用水20mL洗涤两次，最后用饱和氯化钠溶液20mL洗涤一次，无水硫酸镁20g干燥后抽滤，滤液浓缩得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇17.5g(收率为95％，手性纯度>99％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.33(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,3H),3.95-3.89(m,2H),3.84-3.81(m,1H),2.96(s,1H),1.80(d,J＝12.0Hz,1H),1.46-1.41(m,1H),1.36(d,J＝4.0Hz,3H),1.10(d,J＝4.0Hz,3H),1.31-1.25(m,3H),1.05(d,J＝4.0Hz,3H).
实施例15
在反应瓶中，把(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐28g和频那醇硼烷35g先加入正戊烷250mL中，在氮气保护下，室温条件下把含有醋酸镧6.3g的正戊烷30mL加进反应液中，缓慢升温至40℃，反应7h，TLC监控原料反应完全，过滤反应液，真空浓缩后加入二氯甲烷，然后用水洗涤多次，分出有机相，浓缩有机相得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇18.1g(手性纯度>99％)；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.33(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,3H),3.95-3.89(m,2H),3.84-3.81(m,1H),2.96(s,1H),1.80(d,J＝12.0Hz,1H),1.46-1.41(m,1H),1.36(d,J＝4.0Hz,3H),1.10(d,J＝4.0Hz,3H),1.31-1.25(m,3H),1.05(d,J＝4.0Hz,3H).
实施例16
在反应瓶中，把(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐28g和频那醇硼烷35g先加入甲苯250mL中，在氮气保护下，室温条件下把含有醋酸镧6.3g的甲苯溶液30mL加进反应液中，缓慢升温至60℃，反应4h，TLC监控原料反应完全，过滤反应液，真空浓缩后加入二氯甲烷，然后用水洗涤多次，分出有机相，浓缩有机相得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇17.4g(手性纯度>99％)；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.33(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,3H),3.95-3.89(m,2H),3.84-3.81(m,1H),2.96(s,1H),1.80(d,J＝12.0Hz,1H),1.46-1.41(m,1H),1.36(d,J＝4.0Hz,3H),1.10(d,J＝4.0Hz,3H),1.31-1.25(m,3H),1.05(d,J＝4.0Hz,3H).
实施例17
在反应瓶中，先加入四氢呋喃200mL，通入氩气进行惰性气体保护，温度降至-30℃，加入氢化铝锂20g，然后再缓慢滴加溶有(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁酸乙酯甲酸盐28g的四氢呋喃溶液100mL，控制内温不超过0℃，滴加完后反应至原料消失，把反应液缓慢倾入冰水100mL中，加入甲基叔丁基醚100mL，搅拌均匀后分出上层有机相后再用水25mL洗涤两次，最后用饱和氯化钠溶液25mL洗涤一次，无水硫酸镁20g干燥后抽滤，滤液浓缩得到(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇12.8g(手性纯度>99％)；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.33(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,3H),3.95-3.89(m,2H),3.84-3.81(m,1H),2.96(s,1H),1.80(d,J＝12.0Hz,1H),1.46-1.41(m,1H),1.36(d,J＝4.0Hz,3H),1.10(d,J＝4.0Hz,3H),1.31-1.25(m,3H),1.05(d,J＝4.0Hz,3H).
实施例18
在反应瓶中，加入(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇20g和无水乙醇200mL，再加入浓度为25wt.％甲酸铵水溶液100g，氮气保护下加入含量为10wt.％的Pd/C 4g，加完室温搅拌1h，缓慢升温至60℃保持3h，原料反应完全，降温抽滤除去Pd/C，减压蒸除乙醇得到游离态的R-3-氨基丁醇；反应温度冷却到10℃左右，加入异丙醇50mL，分批加入S-扁桃酸16.5g，加完后继续搅拌，逐渐有固体析出；减压蒸除反应液中的异丙醇，以便带走反应体系中残留的水分，再重新加入异丙醇50mL加热到回流溶解，溶清后降温至室温，有大量固体析出，抽滤后用少量异丙醇洗涤滤饼，烘干滤饼得到R-3-氨基丁醇-S-扁桃酸盐22g(e.e值为100％)。
实施例19
在反应瓶中，加入(1R,2R)-3-(1’-甲基苄胺)-2-丁醇20g和无水乙醇200mL，再加入浓度为25wt.％甲酸铵水溶液100g，氮气保护下加入含量为10wt.％的Pd/C 4g，加完室温搅拌2h，缓慢升温至60℃保持3h，原料反应完全，降温抽滤除去Pd/C，减压蒸除乙醇得到游离态的R-3-氨基丁醇；反应温度冷却到10℃左右，加入异丙醇50mL，分批加入乙酸7.2g，加完后继续搅拌，检测反应液pH值在3-4，反应液中逐渐有固体析出；减压蒸除反应液中的异丙醇，以便带走反应体系中残留的水分，再重新加入异丙醇50mL加热到回流溶解，溶清后降温至室温，有大量固体析出，抽滤后用少量异丙醇洗涤滤饼，烘干滤饼得到R-3-氨基丁醇-乙酸盐12.2g(手性纯度100％)。
实施例20
把1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺4g加入到无水甲酸20mL中，在氩气保护下，搅拌条件下加热至65℃；反应约4.5h后真空浓缩旋蒸除去甲酸，加入乙腈40mL，搅拌使溶解，加入R-3-氨基丁醇-S-扁桃酸盐2.4g，加热至回流，反应至原料反应完全；浓缩后加入二氯甲烷20mL，搅拌下加入水10mL，分出下层有机相，上层水相用二氯甲烷10mL萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水10mL洗涤3次；然后在真空条件下浓缩得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺3.2g，手性纯度为98％。
实施例21
把1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺4g加入到无水甲酸20mL中，在氩气保护下，搅拌条件下加热至65℃；反应约4.5h后真空浓缩除去甲酸，加入乙腈40mL，搅拌使溶解，加入R-3-氨基丁醇-乙酸盐3g，加热至回流，反应至原料反应完全；浓缩后加入二氯甲烷20mL，搅拌下加入水10mL，分出下层有机相，上层水相用二氯甲烷10mL萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水10mL洗涤3次；然后在真空条件下浓缩得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺3.4g，手性纯度为99.5％。
实施例22
把1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-二甲酸吡啶-2-甲酸甲酯-5-(3-炔基苯氨基)甲酰胺4g加入到无水甲酸20mL中，在氩气保护下，搅拌条件下加热至65℃；反应约4.5h后真空浓缩除去甲酸，加入乙腈40mL，搅拌使溶解，加入R-3-氨基丁醇-S-扁桃酸盐3.6g和氯化铜0.4g，加热至回流，反应至原料反应完全；浓缩后加入二氯甲烷20mL，搅拌下加入水10mL，分出下层有机相，上层水相用二氯甲烷10mL萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水10mL洗涤3次；然后在真空条件下浓缩得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺3.6g，手性纯度为99.5％。
实施例23
在反应瓶中，把1-(2,2-二甲氧基乙基)-1,4-二氢-3-甲氧基-4-氧代-2,5-吡啶二甲酸-2-甲酯3g加入无水甲酸20mL中，在氮气保护下，搅拌条件下加热至回流；反应结束后真空浓缩除去甲酸，加入乙腈20mL，氮气保护下搅拌溶解；把3-氨基丁醇1.25g(0.014mol)和(R,R)-QuinoxP*0.33g和双(三苯基膦)硝酸铜(I)0.65g加入四氢呋喃20mL后搅拌15min；然后在氮气保护下，把乙腈溶液滴加入溶液四氢呋喃中，滴加完后体系升温至回流搅拌反应2h，TLC检测原料反应完全；过滤反应液，浓缩后加入二氯甲烷20mL，搅拌下加入水10mL,再加入2N盐酸调节反应液pH值为1-2，搅拌10min后分出下层有机相，上层水相用二氯甲烷10mL萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水10mL洗涤3次；然后在真空条件下浓缩得到(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-羧酸2.62g，手性纯度为99％；1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ8.43(s,1H),5.30(t,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),5.02(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),4.41(dd,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),4.27(dd,J1＝8.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),4.08(s,3H),4.03-3.99(m,2H),2.25-2.16(m,1H),1.56(d,J＝12.0Hz,1H),1.39(d,J＝8.0Hz,3H).
实施例24
在反应瓶中加入(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-羧酸7.0g和N,N-二甲基甲酰胺70mL，氮气保护下室温搅拌完全溶解；加入HATU 8.61g，严格控制体系温度不超过25℃，逐滴加入DIPEA 5.9g，将间氨基苯乙炔5.4g溶到N,N-二甲基甲酰胺10.0mL中,体系温度不超过25℃，加入反应体系后，在25-35℃反应12h；TLC显示反应完成，加水500mL，充分地打浆后抽滤，滤饼烘干后得到棕色粉状固体(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺8.35g。
实施例25
在反应瓶中，依次加入2-三氟甲基苯基叠氮1g、(4R,12AS)-3,4,6,8,12,12A-六氢-7-甲氧基-4-甲基-6,8-二氧代-2H-吡啶并[1',2':4,5]吡嗪并[2,1-B][1,3]恶嗪-9-(3-炔基苯氨基)甲酰胺1g，叔丁醇20mL，水20mL，四氢呋喃20mL，五水硫酸铜0.5g和抗坏血酸钠1g，在70℃条件下反应6h，原料反应完全，加入二氯甲烷50mL，过滤反应液，得到黄色液体，分出有机相，水相用二氯甲烷20mL萃取两次，合并有机相经无水硫酸镁干燥后，蒸除溶剂得到黄色固体，用乙醇重结晶，得到淡黄色的具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物产品1.3g。(其中在河南师范大学进行了实施例25的实施及化合物核磁表征测试)1HNMR(400MHz,DMSO-d6):12.62(s,1H),9.09(s,1H),8.72(s,1H),8.23(s,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.98(t,J1＝8.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),7.90(t,J1＝8.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),7.84(t,J1＝8.0Hz,J2＝12.0Hz,2H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.49(t,J1＝8.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),5.39(s,1H),4.79(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),4.62(d,J＝12.0Hz,1H),4.42(dd,J1＝8.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),3.98(t,J1＝12.0Hz,J2＝12.0Hz,1H),3.89(s,1H),3.85(s,3H),2.01-1.94(m,1H),1.52(d,J＝12.0Hz,1H),1.29(d,J＝8.0Hz,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6):173.77,161.71,155.15,152.75,146.22,143.09,139.01,134.23,134.06,131.24,130.81,130.35,129.82,129.28,127.52,124.39,120.87,119.54,117.62,116.41,75.80,61.72,60.20,52.36,44.34,29.17,15.67.
本发明对度鲁特韦进行结构改造，以度鲁特韦为母核，根据生物活性亚结构拼接原理，通过click反应设计合成了一种具有影响肿瘤细胞钙离子通道的三氮唑衍生物，并且利用MTT法评价了目标化合物对多种肿瘤细胞增殖抑制活性。具体步骤见实施例26与实施例27。
实施例26
抗肿瘤活性测试：从CO2培养箱中取出肺癌细胞A549，H358，H460，H1975，H1650，PC-9细胞培养皿，分别进行如下操作：在酒精灯旁进行无菌操作，打开皿盖，吸出培养液于废液缸中，用2mL的PBS洗培养皿中的培养液两次，用0.25wt.％的胰蛋白酶进行消化，待观察发现出现细胞间隙增大、细胞变成小圆圈形状时终止消化，使用移液枪吹打培养皿底部使细胞脱落，将所得的细胞悬浮液转移至无菌离心管中，设置离心机为800r/min，3min，进行离心，然后缓慢倾倒离心管中的上清液，加入2-5mL的培养液，于倒置显微镜下进行细胞计数。根据计数结果，将细胞接种于96孔板中，每孔细胞数目为3000个。将96孔板放入37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
将本发明药物分子配制至所需浓度：20μmol/L，10μmol/L，5μmol/L，2.5μmol/L。从5％CO2培养箱中取出96孔板，每孔加入100μL的含药培养基，每种浓度的药物同时设3个复孔。作为空白实验的孔，加入等体积的相应培养液。将其置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h。每一种药物都用同一批次不同代数的细胞进行三次实验。72小时后，在避光条件下，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，继续放入5％CO2培养箱中培养4h，用移液枪吸取上清液，每孔加入100μL DMSO，放置摇床10min使其混合均匀，用酶标仪在490nm波长处测定其吸光度OD值，其细胞增殖抑制率计算方法如下：细胞增殖抑制率＝[OD对照-OD实验]/OD对照×100％；经检测目标化合物对多种肺癌细胞抑制率IC50分别为A549(7.46umol/L)，H358(3.53umol/L)，H460(5.84umol/L)，H1975(1.71umol/L)，H1650(2.92umol/L)，PC-9(2.97umol/L)。由此发现本发明该类药物分子对突变型和野生型肺癌细胞都具有良好的抑制作用。
实施例27
为了验证本发明该药物分子的抗肿瘤活性机理，进行钙离子通道实验：从5％CO2培养箱中取出肺癌细胞H1975细胞培养皿，分别进行如下操作：在酒精灯旁进行无菌操作，打开皿盖，吸出培养液于废液缸中，用2mL的PBS洗培养瓶中的培养液两次，用0.25wt.％的胰蛋白酶进行消化，待观察发现出现细胞间隙增大、细胞变成小圆圈形状时终止消化，使用移液枪吹打培养瓶底部使细胞脱落，将所得的细胞悬浮液转移至无菌离心管中，设置离心机为800r/min，3min，进行离心，然后缓慢倾倒离心管中的上清液，加入2-5mL的培养液，于倒置显微镜下进行细胞计数。根据计数结果，用相应的培养液将其配制成1×105cells/mL的单细胞悬液，然后接种于6孔板中，且每孔2mL。将6孔板放入37℃，5％CO2培养箱中培养24h。翌日加入10mmol/L的药物分子，同时设置3个孔，作为空白实验的孔，加入等体积的相应培养液，继续培养24小时，每一种药物都用同一批次不同代数的细胞进行三次实验。24小时后，同细胞凋亡处理方法一致，制造成细胞沉淀于无菌离心管。向离心管中加入浓度为5μM的钙离子荧光探针Fluo-3 100μL，轻轻摇匀，于37℃，5％CO2培养箱中孵育30分钟，染色后，用PBS清洗两次后，使用流式细胞仪进行分析。结果显示，细胞经过目标化合物处理之后，分泌的钙离子水平明显增高，其增加的百分比在58.5％。由此说明，本发明该药物分子对细胞内的钙离子分泌水平有较大的影响，经过处理之后，其会增加钙离子的分泌水平。
实施例28
对C8166细胞的毒性实验：4×105/mL C8166细胞悬液100μL与不同的待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，37℃，5％CO2培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC50值(50％Cytotoxic Concentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。
对HIV-1IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验：将8×105/mL C8166细胞50μL/孔接种到含有100μL/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μL的HIV-1IIIB稀释上清，1300TCID50/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。3TC为阳性药物对照。37℃,5％CO2培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC50(50％EffectiveConcentration)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。
计算公式：根据实验结果，采用Origin7.5绘制折线图，按Reed&Muench法计算出样品抑制病毒的50％有效浓度(EC50)，50％抑制细胞生长浓度(CC50)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeutic index)为：TI＝CC50/EC50。1、细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100；2、HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100。
实施例25得到的化合物的CC50和EC50分别为6.21和2.61μmol/L；TI分别为2.38。
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