阅读说明：本技术 黄瑞香中的异戊烯基黄酮类化合物及其用途 (Isopentene flavonoid compound in daphne giraldii nitsche and application thereof ) 是由 李玲芝 宋少江 刘莹 于 2020-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及异戊烯基黄酮类化合物及其用途,具体涉及从瑞香科瑞香属植物黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche.)根茎皮中提取分离的八个异戊烯基黄酮类化合物。将黄瑞香干燥根茎皮用乙醇提取,将粗提物依次经硅胶柱色谱,聚酰胺柱色谱,MCI柱色谱,ODS柱色谱,凝胶柱色谱及HPLC分离的色谱方法进行分离。通过核磁技术对化合物结构进行鉴定,利用手性HPLC对化合物4和5进行手性拆分,最终得到两对对映异构体(4a,4b和5a,5b)。本发明所述的化合物对Hep3B细胞系的具有细胞毒作用和促凋亡作用。本发明的化合物对成纤维生长因子受体1(FGFR1)具有抑制活性。<Image he="391" wi="700" file="DDA0002472491350000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the technical field of medicines, relates to isopentenyl flavonoid compounds and application thereof, and particularly relates to eight isopentenyl flavonoid compounds extracted and separated from root bark of Daphne giraldii Nitsche (Daphne giraldii) of Daphne of Thymelaeaceae. Extracting dried cortex Daphne Giraldii Nitsche with ethanol, and sequentially subjecting the crude extract to silica gel column chromatography, polyamide column chromatography, and MCThe compound has cytotoxic effect and apoptosis promoting effect on a Hep3B cell line, and has inhibitory activity on fibroblast growth factor receptor 1(FGFR 1).)

黄瑞香中的异戊烯基黄酮类化合物及其用途

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及异戊烯基黄酮类化合物及其用途，具体涉及从药用植物黄瑞香根茎皮中分离得到的8个具有异戊烯基黄酮类化合物(包括两对对映异构体)，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche.)，又名野蒙花、新蒙花，为瑞香科瑞香属植物，直立落叶灌木，主要分布于陕西、甘肃、四川、青海、宁夏等省区，河南、江西及山西等地亦有分布，多生长于海拔1600米左右山地的树林中及阔叶木下的阴湿地。其根皮和茎皮可作为祖师麻入药，性温，味辛、苦，有小毒，具有祛风除湿、止痛散瘀的功效，主要用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、关节炎等症，在我国西北地区及民间广泛使用，治疗类风湿性关节炎和腰腿疼痛效果颇佳。

我国卫生部颁布的国家重要保护品种中“祖师麻片”、“祖师麻关节止痛膏”、“黄瑞香注射液”等都是以黄瑞香作为主要原料。现代药理研究表明黄瑞香具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗疟等作用。近年来，已从黄瑞香中分离得到香豆素类、黄酮类、二萜类、木脂素类等多种活性成分，香豆素类化合物是黄瑞香的特征性成分和有效成分，普遍存在于瑞香属植物中，其中含量最高的为瑞香素(祖师麻甲素)和瑞香苷，瑞香素是一种蛋白激酶抑制剂，在有效浓度范围内对肝癌细胞SMMC-7721、肉瘤细胞S180和肾癌细胞RCC的生长有不同程度的抑制作用，能明显增强S180荷瘤小鼠的细胞免疫、非特异性免疫和红细胞免疫功能。黄酮类化合物是黄瑞香中另一类主要化学成分，多来自于植物的根茎皮，本发明中异戊烯基黄酮类成分对人肝癌细胞系HepG2、Hep3B具有较好的选择性细胞毒性，并对成纤维生长因子FGFR1有活性。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一系列异戊烯基黄酮类化合物或其盐，其结构如下：

所述的异戊烯基黄酮类化合物是从瑞香科瑞香属植物黄瑞香(Daphne giraldiiNitsche.)中同时分离得到的。

本发明提供了所述的异戊烯基黄酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)黄瑞香干燥根茎皮以乙醇冷浸提取，合并提取液，浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯和正丁醇依次进行萃取得到乙酸乙酯层、正丁醇层及水层浸膏；

(2)将乙酸乙酯层浸膏经硅胶色谱柱使用二氯甲烷-甲醇系统(100:1-8:1)进行快速梯度洗脱，经硅胶薄层检识分为四个馏分A、B、C、D；

(3)馏分B分别经快速聚酰胺柱色谱以乙醇-水系统(40％-100％)进行快速梯度洗脱，经硅胶薄层检识进行合并后共得五个馏分B₁、B₂、B₃、B₄、B₅；

(4)馏分B₂、B₃、B₄、分别经MCI柱色谱，以乙醇-水系统(20％-80％)进行梯度洗脱，经硅胶薄层检识进行合并后共收集到五个组分B_(2-4)-1、B_(2-4)-2、B_(2-4)-3、B_(2-4)-4、B_(2-4)-5；

(5)所得组分B_(2-4)-5经ODS柱色谱以甲醇-水(20％-80％)进行等度洗脱，得到六个组B_(2-4)-5-1～B_(2-4)-5-6。

(6)利用半制备HPLC分别对组分B_(2-4)-5-1～B_(2-4)-5-6以乙腈水系统进行洗脱，得到了化合物1-6。

其中，步骤(1)中所述的乙醇为70-95％工业乙醇，提取2-3次。乙酸乙酯和正丁醇与浸膏的体积比例为1:1，萃取3-4次；

步骤(6)中所述的乙腈水系统为50-70％。

进一步地，对化合物4和5进行手性拆分得到化合物4a,4b和5a,5b。其手性制备拆分方法为：利用Daicel Chiralpak AD-H手性色谱柱，流动相为正己烷-异丙醇混合溶剂，比例分别为3:1和5:1，流速分别为1.5mL/min，紫外检测器检测波长为210nm。

本发明中所述的手性拆分条件，适用于化合物4和5。

本发明所得化合物的结构鉴定结果如下：

利用高分辨质谱、一维和二维NMR技术对化合物的平面结构及相对构型进行确定。通过比较实测CD和文献经验，对拆分后的光学纯化合物4a-4b和5a-5b的绝对构型进行确定。

化合物1：黄色固体(甲醇)。HRESI-MS给出准分子离子峰543.2266[M+Na]⁺(calcdfor 543.2353)。结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₁H₃₆O₇，不饱和度为14。¹H-NMR(400MHz CD₃OD)显示：δ 6.72(1H,s),6.25(1H,s)为两个芳环质子信号，氢谱中还给出了三组异戊烯取代基的质子信号δ 5.10(1H,overlapped),5.07(1H,overlapped),4.93(1H,m),3.44(2H,d,J＝6.34Hz),3.33(2H,d,J＝4.76Hz),3.26(2H,d,J＝5.78Hz),1.74(3H,s),1.69(3H,s),1.58(3H,s),1.47(3H,s),1.45(3H,s),1.30(3H,s),此外，δ 3.57(3H,s)为一组甲氧基质子信号。¹³C-NMR(100MHz CD₃OD)谱中给出31个碳信号，其中δ 180.4,163.5,162.1,160.7,156.3,146.9,143.7,140.4,132.8,129.0,122.5,115.3,108.0,106.2,99.4提示为黄酮母核的15个碳信号，δ 132.3,131.9,131.8,125.1,124.6,123.4,29.4,26.3,26.0×2,25.7,22.4,18.1,17.8×2提示为三组异戊烯基碳信号，δ 61.0提示为一组甲氧基碳信号。结合二维谱HSQC和HMBC数据对该化合物结构进一步确定。

通过HSQC谱相关信号对直接相连的氢碳信号进行了归属。在HMBC谱中，可观察到δ6.25与δ 163.5(C-7),160.7(C-5),108.0(C-8),106.2(C-10),δ 3.33与δ 163.5(C-7),156.3(C-9),108.0(C-8)存在远程相关，说明6.25为黄酮A环6位质子信号，且8位被异戊烯基取代。δ 6.72与δ 162.1(C-2),146.9(C-4′),143.7(C-3′)存在远程相关，说明6.72为黄酮B环2′位质子信号。δ 3.44与δ 146.9(C-4′),129.0(C-5′),δ 3.26与δ 129.0(C-5′),122.5(C-1′)存在远程相关，说明B环5′,6′位被异戊烯基取代。δ 3.57与δ 140.4(C-3)存在远程相关，说明C环3位被甲氧基取代。结合HMBC相关信号和质谱信息，判断C-5,7,3′,4′被-OH取代。因此确定了该化合物的平面结构。

化合物2：黄色固体(甲醇)。¹H-NMR(400MHz DMSO)显示：δ 6.63(1H,s),6.29(1H,s)为两个芳环质子信号，氢谱中还给出了三组异戊烯取代基的质子信号δ 5.28(1H,t,J＝7.35Hz),5.02(1H,t,J＝7.11Hz),4.96(1H,t,J＝6.88Hz),3.26(4H,overlapped),3.21(2H,d,J＝7.01Hz),1.67(3H,s),1.65(3H,s),1.54(3H,s),1.44(3H,s),1.41(3H,s),1.25(3H,s),此外，δ 3.56(3H,s)为一组甲氧基质子信号，12.60(1H,brs)为5位羟基质子信号。¹³C-NMR(150MHz DMSO)谱中给出31个碳信号，其中δ 178.2,161.8,159.5,158.9,154.2,145.3,143.2,138.5,126.1,125.9,121.4,121.1,105.8,104.4,98.3,提示为黄酮母核的15个碳信号，δ 131.7,130.8,130.0,123.0,122.4,122.0,27.9,25.6,25.5,25.4,25.2,21.0,17.6,17.4,17.3提示为三组异戊烯基碳信号，δ 59.8提示为一组甲氧基碳信号。结合二维谱HSQC和HMBC数据对该化合物结构进一步确定。

通过HSQC谱相关信号对直接相连的氢碳信号进行了归属。在HMBC谱中，可观察到δ6.29与δ 158.9(C-5),105.8(C-8),104.4(C-10),δ 3.21与δ 161.8(C-7),154.2(C-9)存在远程相关，说明6.29为黄酮A环6位质子信号，且8位被异戊烯基取代。δ 6.63与δ 159.5(C-2),145.3(C-4′),126.1(C-5′)存在远程相关，说明6.72为黄酮B环6′位质子信号。δ 3.27与δ 143.2(C-3′),δ 3.26与δ 145.3(C-4′),δ 6.63与δ 25.6(C-1″″)存在远程相关，说明B环2′,5′位被异戊烯基取代。δ 3.56与δ 138.5(C-3)存在远程相关，说明C环3位被甲氧基取代。结合HMBC相关信号和质谱信息，判断C-5,7,3′,4′被-OH取代。因此确定了该化合物的平面结构。

化合物3：黄色固体(甲醇)。HRESI-MS给出准分子离子峰541.2175[M+Na]⁺(calcdfor 541.2197)。结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₁H₃₄O₇，不饱和度为15。¹H-NMR(600MHz DMSO)显示：δ 6.63(1H,s),6.26(1H,s)为两个芳环质子信号，氢谱中还给出了二组异戊烯取代基的质子信号δ 5.08(1H,t,J＝7.25Hz),5.00(1H,t,J＝6.97Hz),3.39(2H,d,J＝6.85Hz),3.32(2H,overlapped),1.57(3H,s),1.46(3H,s),1.42(3H,s),1.30(3H,s),一组2””,2””-二甲基吡喃取代基的质子信号δ 6.34(1H,d,J＝9.81Hz),5.08(1H,d,J＝9.78Hz),1.49(6H,s),此外，δ 3.59(3H,s)为一组甲氧基质子信号。¹³C-NMR(150MHz DMSO)谱中给出31个碳信号，其中δ 180.4,164.0,161.2,160.8,156.5,144.7,143.0,140.5,129.9,124.3,120.6,119.7,108.1,106.2,99.6提示为黄酮母核的15个碳信号，δ 132.3×2,124.0,123.5,26.8,26.1,25.8,22.5,17.8×2提示为二组异戊烯基碳信号，δ 132.1,122.8,78.6,28.2×2提示为一组2””,2””-二甲基吡喃取代基的质子信号，δ 61.1提示为一组甲氧基碳信号。结合二维谱HSQC和HMBC数据对该化合物结构进一步确定。

通过HSQC谱相关信号对直接相连的氢碳信号进行了归属。在HMBC谱中，可观察到δ6.26与δ 160.8(C-5),108.1(C-8),δ 3.32与δ 164.0(C-7),156.5(C-9),108.1(C-8)存在远程相关，说明6.26为黄酮A环6位质子信号，且8位被异戊烯基取代。δ 6.63与δ 161.2(C-2)存在远程相关，说明6.63为黄酮B环6′位质子信号。δ 3.39与δ 144.7(C-3′),129.9(C-2′)存在远程相关，说明B环2′位被异戊烯基取代。2””,2””-二甲基吡喃取代基中4””位的质子信号δ 6.34与δ 126.6(C-5'),119.7(C-6')存在远程相关，说明2””,2””-二甲基吡喃取代基连接在B环的4',5'位。δ 3.59与δ 140.5(C-3)存在远程相关，说明C环3位被甲氧基取代。结合HMBC相关信号和质谱信息，判断C-5,7,3′,4′被-OH取代。因此确定了该化合物的平面结构。

表1 1-3¹H与¹³C NMR数据

化合物4：黄色固体(甲醇)。HRESI-MS给出准分子离子峰515.2339[M+Na]⁺(calcd.515.2404)。结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₃₀H₃₆O₆，不饱和度为13。¹H-NMR(600MHz CD₃OD)显示：δ 4.88(1H,d,J＝11.27Hz),4.44(1H,d,J＝11.19Hz)为二氢黄酮醇类2,3位特征质子信号，δ 5.94(1H,s)为二氢黄酮醇A环6位质子信号，δ 7.07(2H,s)为B环2′,6′位质子信号，此外，氢谱中还给出了三组异戊烯取代基的质子信号δ 5.34(2H,m),5.12(1H,m),3.35(4H,d,J＝7.27Hz),3.12(2H,d,J＝7.27Hz),1.74(6H,s),1.72(6H,s),1.59(3H,s),1.49(3H,s)。¹³C-NMR(150MHz CD₃OD)谱中给出30个碳信号，其中δ 197.9,169.0,163.2,161.2,153.9,130.1×2,129.8,127.8×2,109.8,101.4,97.4,85.2,73.8提示为二氢黄酮醇母核的15个碳信号，δ 133.6×2,131.5,123.8×2,124.1,29.8×2,26.1×3,22.5,18.0×3提示为三组异戊烯基碳信号。结合二维谱HSQC和HMBC数据对该化合物结构进一步确定。

通过HSQC谱相关信号对直接相连的氢碳信号进行了归属。在HMBC谱中，可观察到δ4.88与δ 161.2(C-10),δ 3.12与δ 169.0(C-7),161.2(C-9),109.8(C-8)存在远程相关，说明A环8位被异戊烯基取代，δ 5.94与δ 169.0(C-7),163.2(C-5),109.8(C-8),101.4(C-10)存在远程相关，说明5.94为A环6位质子信号。δ 7.07(2H,s)与δ 153.9(C-5′),130.1(C-3′,4′),85.2(C-2),29.8(C-1″′,1″″)存在远程相关，说明7.07为B环2′,6′位质子信号，且3′,4′位分别被异戊烯基取代。结合HMBC相关信号和质谱信息，判断C-5,7,4′被-OH取代。因此确定了该化合物的平面结构。

在¹H-NMR谱中，由δ 4.88(1H,d,J＝11.27Hz),4.44(1H,d,J＝11.19Hz)可确定C-2,C-3位的相对构型，即H-2,-3处于反式二直立键。然而，由于该化合物缺乏圆二色性(CD)的光学活性，这表明了它的外消旋性质。随后，通过手性HPLC导致了两种对映体4a和4b的分离。通过4a的CD谱，在291nm处显示负Cotten效应，表明C-2被指定为S构型.通过H-2和H-3之间的反式双键，进一步确定了4a的C-3(S)的构型。而4b与4a的CD曲线相反，故将4b的构型指定为C-2(R)和C-3(R)。

化合物5：棕色固体(甲醇)。HRESI-MS给出准分子离子峰401.2092[M+Na]⁺(calcd.401.2087)。结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₂₅H₃₀O₃，不饱和度为11。¹H-NMR(600MHz CD₃OD)显示：δ 4.80(1H,dd,J＝9.69,2.32Hz),2.74(1H,m),2.56(1H,m),2.00(1H,m),1.90(1H,m)为黄烷类2,3,4位特征质子信号，δ 6.80(1H,d,J＝8.24Hz),6.29(1H,dd,J＝8.22,2.46Hz),6.23(1H,d,J＝2.44Hz)为黄烷A环ABX偶合系统质子信号，δ 6.91(2H,s)为B环2′,6′位质子信号，此外，氢谱中还给出了两组异戊烯取代基的质子信号δ5.28(2H,m),3.29(4H,overlapped),1.70(6H,s),1.66(6H,s)。¹³C-NMR(150MHz CD₃OD)谱中给出25个碳信号，其中δ 157.6,157.2,153.0,134.6,131.0,129.8×2,126.0×2,114.4,109.1,104.1,79.2,31.2,25.3提示为黄烷母核的15个碳信号，δ 133.5×2,123.9×2,29.8×2,26.0×2,18.0×2提示为两组异戊烯基碳信号。结合二维谱HSQC和HMBC数据对该化合物结构进一步确定。

通过HSQC谱相关信号对直接相连的氢碳信号进行了归属。在HMBC谱中，可观察到δ6.80与δ 25.5,δ 6.29与δ 157.6,131.0,104.1存在远程相关，结合A环质子偶合常数，说明6.80,6.29,6.23分别为A环5,6,8位质子信号。δ 6.91(2H,s)与δ 153.0(C-5′),79.2(C-2),δ 3.29(4H,overlapped)与δ 153.0,129.8,126.1存在远程相关，说明6.90为B环2′,6′位质子信号，且3′,4′位分别被异戊烯基取代。结合HMBC相关信号和质谱信息，判断C-7,4′被-OH取代。因此确定了该化合物的平面结构。

该化合物在C-2处具有不对称的碳中心，由于手性HPLC中存在两个相等的峰，5a和5b被认为是等量的外消旋体，并在手性HPLC中成功地获得。5a的CD谱在290nm处显示正Cotten效应，故在的C-2处的绝对构型由指定为R。而5b与5a相比呈相反的CD曲线，将5b的绝对构型指定为C-2(S)。

化合物6：棕色固体(甲醇)。HRESI-MS给出准分子离子峰417.1980[M+Na]⁺(calcd.417.2036)。结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₂₅H₃₀O₄，不饱和度为11。¹H-NMR(600MHz CD₃OD)显示：δ 4.70(1H,d,J＝6.59Hz),3.99(1H,dd,J＝11.73,7.07,2.16Hz),2.79(1H,dd,J＝15.81,4.83Hz),2.64(1H,dd,J＝15.68,7.43Hz)为黄烷-3-醇类2,3,4位特征质子信号，δ 6.83(1H,d,J＝8.26Hz),6.33(1H,dd,J＝8.22,2.45Hz),6.27(1H,d,J＝2.41Hz)为黄烷-3-醇A环ABX偶合系统质子信号，δ 6.90(2H,s)为B环2′,6′位质子信号，此外，氢谱中还给出了两组异戊烯取代基的质子信号δ 5.28(2H,m),3.28(4H,overlapped),1.70(6H,s),1.65(6H,s)。¹³C-NMR(150MHz CD₃OD)谱中给出25个碳信号，其中δ 158.1,156.3,153.2,132.1,131.4,129.8×2,126.6×2,112.6,109.5,103.7,83.0,68.9,32.6提示为黄烷-3-醇母核的15个碳信号，δ 133.7×2,123.7×2,29.7×2,26.0×2,17.9×2提示为两组异戊烯基碳信号。结合二维谱HSQC和HMBC数据对该化合物结构进一步确定。

通过HSQC谱相关信号对直接相连的氢碳信号进行了归属。在HMBC谱中，可观察到δ6.83,6.27,4.70与δ 156.3,δ 6.33与δ 158.1,112.6,103.7存在远程相关，结合A环质子偶合常数，说明6.83,6.33,6.27分别为A环5,6,8位质子信号。δ 6.90(2H,s)与δ 153.2(C-5′),129.8(C-3′,4′),83.0(C-2),29.8(C-1″,1″′)存在远程相关，说明6.90为B环2′,6′位质子信号，且3′,4′位分别被异戊烯基取代。结合HMBC相关信号和质谱信息，判断C-7,4′被-OH取代。因此确定了该化合物的平面结构。

通过对其¹H NMR数据的检验，确定了6的相对构型。H-2的偶合常数(J＝6.59Hz)表明H-2，H-3具有相同的取向。在CD谱中，Cotten效应在280～290nm处为负最小值，表明6是单构型手性化合物，C-2的绝对立体化学称R。在此基础上，因为H-2，H-3位于C环的同一侧，C-3的绝对构型被指定R。因此，确定了化合物6的结构。

表2 4-5¹H与¹³C NMR数据

附图说明

图1化合物1的HRESIMS谱；

图2化合物1的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图3化合物1的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图4化合物2的HMBC谱(600MHz,DMSO)；

图5化合物2的HSQC谱(600MHz,DMSO)；

图6化合物3的HRESIMS谱；

图7化合物3的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图8化合物3的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图9化合物4的HRESIMS谱；

图10化合物4的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图11化合物4的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图12化合物4a和4b的手性拆分色谱图；

图13化合物4a和4b实测CD；

图14化合物5的HRESIMS谱；

图15化合物4的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图16化合物5的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图17化合物5a和5b的手性拆分色谱图；

图18化合物5a和5b实测CD；

图19化合物6的HRESIMS谱；

图20化合物6的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图21化合物6的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图22化合物6实测CD。

具体实施方式

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：化合物1-6的制备。

选用黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche.)干燥根茎皮(30.0kg)以70％乙醇冷浸提取2次，再以95％乙醇冷浸提取1次，合并提取液，浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯和正丁醇依次进行萃取得到乙酸乙酯层(1.35kg)、正丁醇层及水层浸膏；将乙酸乙酯层浸膏经硅胶色谱柱使用二氯甲烷-甲醇系统(100:1-8:1)进行快速梯度洗脱，经硅胶薄层检识分为四个馏分A、B、C、D；馏分B分别经快速聚酰胺柱色谱以乙醇-水系统(40％-100％)进行快速梯度洗脱，经硅胶薄层检识进行合并后共得五个馏分B₁、B₂、B₃、B₄、B₅；馏分B₂、B₃、B₄、分别经MCI柱色谱，以乙醇-水系统(20％-80％)进行梯度洗脱，经硅胶薄层检识进行合并后共收集到五个组分B_(2-4)-1、B_(2-4)-2、B_(2-4)-3、B_(2-4)-4、B_(2-4)-5；所得组分B_(2-4)-5经ODS柱色谱以甲醇-水(20％-80％)进行等度洗脱，得到六个组B_(2-4)-5-1～B_(2-4)-5-6；利用半制备HPLC分别对组分B_(2-4)-5-1～B_(2-4)-5-6以乙腈水系统进行洗脱，得到了化合物1(10.0mg,62％)、2(15.5mg,63％)、3(12.0mg,64％)、4(5.0mg,63％)、5(10.0mg,68％)、6(4.5mg,55％)。利用DaicelChiralpak AD-H手性色谱柱对化合物4和5进行手性拆分，流动相为正己烷-异丙醇混合溶剂，比例分别为3:1和5:1，流速分别为1.5mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，得到化合物4a(3.3mg),4b(1.6mg)和5a(4.8mg),5b(5.1mg)。

实施例2：对化合物1-6对人肝癌细胞系HepG2、Hep3B的细胞毒活性的考察。

1、细胞毒活性实验步骤：

(1)仪器与试剂

仪器：二氧化碳培养箱(Thermo,USA)；96孔培养板(Nest Biotech,USA)；倒置相差显微镜(Motic,China)；Varioskan Flash多功能酶标仪(Thermo,USA)等。

试剂：胰蛋白酶(Biological Industries,USA)；胎牛血清(BiologicalIndustries,USA)；DMEM培养基(HyClon,USA)；MTT(Sigma,USA)；DMSO(Sigma,USA)；5-氟尿嘧啶(5-Fu,Sigma,USA)；其余试剂均为国产分析纯。

(2)实验细胞株

人肝癌细胞系HepG2、Hep3B。细胞接种在含10％胎牛血清、10μg/mL链霉素和100U/mL青霉素的DMEM培养液中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(3)采用MTT法。

取对数生长期的肿瘤细胞，经胰酶消化后以每孔5000个细胞密度接种于96孔培养板，培养箱中培养12h后，每孔加入不同浓度药物100μL，对照组加等体积的空白培养基，每组设3个复孔，无细胞孔为背景。置于37℃、5％CO₂条件下培养48h后加MTT 20μL/孔，继续培养4h，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150μL，室温振荡，使结晶充分溶解。用酶标仪检测492nm处吸光度值，实验重复3次，生长抑制率(％)＝[A 492(阴性对照)-A 492(加药组)]/A 492(阴性对照)×100％，再利用SPSS数据分析软件求出化合物的半数抑制浓度(IC₅₀值)。

2、细胞毒活性实验结果：

实验结果显示，化合物2,5a,5b在均表现出显著的细胞毒活性，尤其是Hep3B细胞显示出良好的细胞毒活性和选择性，对映异构体5a,5b间并且表现出一定的立体选择性的活性差异。

表3 细胞毒活性IC₅₀值

实施例3：异戊烯基黄酮类化合物对成纤维生长因子受体1(FGFR1)的抑制作用的考察。

1、FGFR1的抑制作用实验步骤：

(1)仪器与试剂

仪器：酶标板、酶标仪

试剂：酶反应底物Poly(Glu-Tyr)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、成纤维生长因子受体1(FGFR1)、含0.1％吐温20的磷酸盐缓冲盐水(TPBS)、牛血清白蛋白(BSA)、抗磷酸酪氨酸抗体(PY99)V、HRP标记的羊抗鼠IgG、TMB显色液

(2)酶联免疫吸附(ELISA)测定FGFR1抑制活性

首先用酶反应底物Poly(Glu-Tyr)4：l包被酶标板，37℃孵育过夜后，用PBS洗3遍，将酶标板烘干。每孔加入不同浓度的抑制剂样品溶液，2.5μL FGFR1，于37℃反应lh，反应结束后用TPBS洗5遍，用BSA室温封闭lh，每孔加入(PY99 V)室温孵育2h，TPBS洗5遍，每孔再加100pl HRP标记的羊抗鼠IgG室温孵育lh，TPBS洗5遍，TMB显色检测底物磷酸化程度，用酶标仪读取OD490nm值，计算化合物对酪氨酸激酶蛋白的相对抑制率。

2、FGFR1的抑制作用实验结果：

实验结果显示，化合物2在10μM浓度表现出较好的FGFR1的抑制活性，其抑制率为78.4％，化合物5a,5b在10μM浓度时无FGFR1抑制作用。

表4 成纤维生长因子受体1抑制率