阅读说明：本技术 大环内酯类抗生素发酵调控的方法 (Method for regulating fermentation of macrolide antibiotics ) 是由 王欣荣 张雪霞 褚以文 郑智慧 张新宜 路新华 赵克雷 高健 林家富 黄挺 任凤 于 2020-03-02 设计创作，主要内容包括：本发明为大环内酯类抗生素发酵调控的方法。解决传统方法发酵过程不容易控制,耗能高,目标产物产量低的问题。包括以下步骤：在大环内酯类抗生素产生菌初级代谢阶段,培养温度按正常要求控制在27.0-30.0℃,菌丝快速生长；在大环内酯抗生素产生菌完成对数生长期后降低发酵培养温度到18.0-27.0℃,促进目标产物大量合成,所述大环内酯抗生素为采用PKS生物合成途径发酵产生的抗生素及其同系物。本发明工艺简单易行,易于操作,非常适合商业化生产。(The invention relates to a method for regulating and controlling fermentation of macrolide antibiotics. Solves the problems of difficult control, high energy consumption and low yield of target products in the traditional method. The method comprises the following steps: in the primary metabolism stage of macrolide antibiotic producing bacteria, the culture temperature is controlled to be 27.0-30.0 ℃ according to normal requirements, and hyphae grow rapidly; reducing the fermentation culture temperature to 18.0-27.0 ℃ after the log growth period of macrolide antibiotic producing bacteria is completed, and promoting the mass synthesis of a target product, wherein the macrolide antibiotic is produced by fermentation by adopting a PKS biosynthesis pathway and a homologue thereof. The method has the advantages of simple and easy process, easy operation and suitability for commercial production.)

大环内酯类抗生素发酵调控的方法

技术领域

本发明涉及微生物药物技术领域，具体涉及基于培养温度调控的大环内酯类抗生素发酵调控的方法。

背景技术

大环内酯类抗生素如西罗莫司（Sirolimus）、他克莫司（Tacrolimus）、多拉菌素（Doramectin）、多杀菌素（Spinosyn）和柱晶白霉素（ Kitasamycin）等其结构上均属聚酮类物质, 这类聚酮结构的生物合成过程也呈现相似的规律。聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)是催化形成聚酮化合物的多酶复合体，催化合成大环内酯类抗生素的由低级脂肪酸聚合而成的具有长碳链结构的基本骨架。聚酮合成的起始单元和碳链延伸所需短链脂肪酸单元如乙酸和丙酸等在微生物初级代谢阶段已得到累积。在发酵中后期，继续维持较高的发酵温度，会使微生物快速消耗产生短链脂肪酸单元的原料如糖分、油脂或氨基酸等形成废物而损失，不能持续满足产物合成的需求。同时，较高的碳源消耗会产生大量有机酸使发酵液pH和溶氧快速下降，碳源消耗殆尽后pH值又会快速上升，这样又会使得发酵过程不容易控制。

发明内容

本发明人目的是提供一种工艺简单，易于控制，耗能少，提高设备利用率，降低营养成分的消耗，目标产物产量明显提高的大环内酯类抗生素发酵调控的方法。

本发明是这样实现的：

大环内酯类抗生素发酵调控的方法，包括以下步骤：

在大环内酯类抗生素产生菌初级代谢阶段, 培养温度按正常要求控制在27.0-30.0℃，菌丝快速生长；在大环内酯抗生素产生菌完成菌体生长期后通过降低发酵培养温度到18.0-27.0℃，促进目标产物大量合成，所述大环内酯抗生素为采用PKS生物合成途径发酵产生的抗生素及其同系物。

在大环内酯抗生素产生菌完成菌体生长期后降低发酵培养温度的时段至少为两个，其中的每个时段的发酵培养温度不同，先高后低。

所述大环内酯抗生素包含西罗莫司（Sirolimus）、他克莫司（Tacrolimus）、阿维菌素（Avermectin）、多杀菌素（Spinosyn）和柱晶白霉素（ Kitasamycin）。

所述大环内酯抗生素产生菌完成菌体生长期为发酵开始15-96小时之后。

在大环内酯抗生素产生菌完成菌体生长期即15-96小时之后，发酵培养温度从27.0-30.0℃降低到22.0-26.0℃，促进目标产物大量合成。

在大环内酯抗生素产生菌完成对数生长期即15-96小时之后，发酵培养温度从27.0-30.0℃降低到23.0-25.0℃，促进目标产物大量合成。

整个发酵周期比传统发酵周期延长1-4天。

大环内酯类抗生素生物合成发酵调控的方法，包括以下步骤：

在大环内酯类抗生素产生菌初级代谢阶段,，培养温度按传统要求控制，菌丝快速生长；在大环内酯抗生素产生菌完成菌体生长期即15-96小时之后，通过降低发酵培养温度3-8℃，促进目标产物大量合成，所述大环内酯抗生素为采用PKS生物合成途径发酵产生的抗生素及其同系物。

所述大环内酯抗生素为红霉素（Erythromycin）。

本发明的优点如下：

本发明采用了两段温度控制策略, 大环内酯抗生素产生菌初级代谢阶段, 在大环内酯类抗生素产生菌初级代谢阶段，培养温度按正常要求控制，菌丝快速生长；在大环内酯抗生素产生菌完成菌体生长期后通过显著降低发酵培养温度，促进目标产物大量合成。

本发明通过在大环内酯抗生素产生菌完成对数生长期后通过显著降低发酵培养温度，意外发现发酵过程发酵液pH值和溶氧变化平稳，易于控制，目标产物产量明显提高。通过实施降温工艺，提高了设备利用率，降低了营养成分的消耗，实现了节能减排。本方法工艺简单易行，易于操作，非常适合商业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明涵盖了权利要求书范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。

实施例1：

菌种：阿维链霉菌Streptomyces avermitilis SIIA-1502

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称好淀粉投入发酵配料罐中（预先加入适量水），启动搅拌，加入淀粉酶（淀粉重量的0.5%）蒸汽加热，逐渐升温到85℃，保温搅拌60分钟，使淀粉充分液化。再按上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求6.9即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌30分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：10个茄子瓶；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.5-0.8vvm；

培养周期：315小时。

在阿维菌素产生菌发酵前期80小时内，通过基础培养基使得菌丝快速生长，培养温度控制在29.0℃；80小时-200小时，培养温度控制在25.0℃；200小时-315小时，培养温度控制在27.0℃。

本发明中，阿维菌素的含量通过HPLC高效液相检测方法进行测定，具体如下。

分析柱：C18柱，4.6mm×250mm×5um，柱温：30℃；采用等度洗脱，流动相为甲醇:水:乙腈（8:1:1）；流速为1.2mL/min；检测波长：245nm；进样量：10µL。根据面积归一化法计算阿维菌素的含量。

取发酵液2毫升，加入10毫升乙醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析阿维菌素的含量，发酵第315小时阿维菌素的效价为8.8克/L。

对比实施例1：

菌种：阿维链霉菌Streptomyces avermitilis SIIA-1502

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称好淀粉投入发酵配料罐中（预先加入适量水），启动搅拌，加入淀粉酶（淀粉重量的0.5%）蒸汽加热，逐渐升温到85℃，保温搅拌60分钟，使淀粉充分液化。再按上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求6.9即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌30分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：10个茄子瓶；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.5-0.8vvm；

培养周期：285小时。

在阿维菌素产生菌发酵过程中培养温度控制在29℃。

本发明中，阿维菌素的含量通过HPLC高效液相检测方法进行测定，具体如下。

分析柱：C18柱，4.6mm×250mm×5um，柱温：29℃；采用等度洗脱，流动相为甲醇:水:乙腈（8:1:1）；流速为1.2mL/min；检测波长：245nm；进样量：10µL。根据面积归一化法计算阿维菌素的含量。

取发酵液2毫升，加入10毫升乙醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析阿维菌素的含量，发酵第315小时阿维菌素的效价为5.1克/L。

实施例2：

菌种：游动放线菌SIIA-1602（Actinoplanes SIIA-1602）

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称好淀粉投入发酵配料罐中（预先加入适量水），启动搅拌，蒸汽加热，逐渐升温到70℃，保温搅拌10分钟，使淀粉充分糊化。再按上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求6.9即可，升温，当温度达到121℃时，开始灭菌30分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：8%；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.5-0.8vvm；

培养周期：220小时。

在西罗莫司产生菌发酵前期0-60小时,通过基础培养基使得菌丝快速生长，培养温度控制在28..0℃；80小时-220小时，培养温度控制在23.0℃。

本发明中，西罗莫司的含量通过HPLC高效液相检测方法进行测定，具体如下：

取发酵液3ml，加入丙酮7ml混匀，超声处理30分钟，12000rpm离心，取上清液进行HPLC分析。色谱条件：C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇：乙腈：水=60:25:30（v:v:v），柱温50℃，流速1.0 mL/min，检测波长277 nm,进样量10µl。发酵第220小时西罗莫司的效价为1.98克/L。

对比实施例2：

菌种：游动放线菌SIIA-1602（Actinoplanes SIIA-1602）

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称好淀粉投入发酵配料罐中（预先加入适量水），启动搅拌，蒸汽加热，逐渐升温到75℃，保温搅拌20分钟，使淀粉充分糊化。再按上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求6.9即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌30分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：8%；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.5-0.8vvm；

培养周期：192小时。

在西罗莫司产生菌发酵过程中培养温度控制在28.0℃。

本发明中，西罗莫司的含量通过HPLC高效液相检测方法进行测定，具体如下：

取发酵液3ml，加入丙酮7ml混匀，超声处理30分钟，12000rpm离心，取上清液进行HPLC分析。色谱条件：C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱,流动相为甲醇：乙腈：水=60:25:30（v:v:v），柱温50℃,流速1.0 mL/min,检测波长277 nm,进样量10µl。发酵第192小时的西罗莫司的效价为1.25克/L。

实施例3：

菌种：千佛链霉菌新种SIIA-9818（Streptomyces qianfoensis sp.nov. SIIA-9818）

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称好淀粉投入发酵配料罐中（预先加入适量水），启动搅拌，蒸汽加热，逐渐升温到70℃，保温搅拌10分钟，使淀粉充分糊化。再按上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求6.9即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌30分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：8%；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.8-1.0vvm；

培养周期：220小时。

在他克莫司产生菌发酵前期0-48小时,通过基础培养基使得菌丝快速生长，培养温度控制在28.5℃；80小时-220小时，培养温度控制在22.0℃。

本发明中，他克莫司的含量通过HPLC高效液相检测方法进行测定，具体如下：

取发酵液3ml，加入乙醇7ml混匀，超声处理30分钟，12000rpm离心，取上清液进行HPLC分析。色谱条件：C8(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱，流动相为V(异丙醇)∶V(水)=35∶65，柱温50℃，流速1.0 mL/min，检测波长220 nm，进样量10µl。发酵第220小时的他克莫司的效价为1.13克/L。

对比实施例3：

菌种：游动放线菌SIIA-1602（Actinoplanes SIIA-1602）

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称好淀粉投入发酵配料罐中（预先加入适量水），启动搅拌，蒸汽加热，逐渐升温到75℃，保温搅拌20分钟，使淀粉充分糊化。再按上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求6.9即可，升温，当温度达到121℃时，开始灭菌30分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：8%；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.8-1.0vvm；

培养周期：192小时。

在他克莫司产生菌发酵过程中培养温度控制在28.5℃。

本发明中，他克莫司的含量通过HPLC高效液相检测方法进行测定，具体如下：

取发酵液3ml，加入乙醇7ml混匀，超声处理30分钟，12000rpm离心，取上清液进行HPLC分析。色谱条件：C8(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为V(异丙醇)∶V(水)=35∶65，柱温50℃，流速1.0 mL/min，检测波长220 nm，进样量10µl。发酵第192小时的他克莫司的效价为0.65克/L。

实施例4：

菌种：刺糖多孢菌SIIA 1802（S. spinosa SIIA 1802）

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求7.2即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌35分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：10%；

培养温度：28.0-30.0℃；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.5-0.8vvm；

培养周期：360小时。

在多杀菌素产生菌发酵前期0-96小时,通过基础培养基使得菌丝快速生长，培养温度控制在30.0℃；96小时-360小时，培养温度控制在26.0℃。

取发酵液1.0毫升，加入10毫升乙醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析多杀菌素的含量。色谱柱规格为ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；柱温：室温；流动相：甲醇/乙腈/2%乙酸铵溶液（体积比45/45/10）；流速：1.5 mL/min；上样体积：10 μL；检测波长：250 nm。通过检测系统自带分析软件计算多杀菌素A、D 的响应峰面积，与标准品比对便可得出样品中多杀菌素的含量。

取发酵液1.0毫升，加入10毫升乙醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析多杀菌素的含量，发酵第360小时的多杀菌素的效价为1.82克/L。

比较实施例4：

菌种：刺糖多孢菌SIIA 1802（S. spinosa SIIA 1802）

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求7.2即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌35分钟。

发酵体积：6000L

接种量：10%

培养温度：28.0-30.0℃

搅拌转速：80-220rpm

空气流量：1:0.7-1.1vvm

培养周期：320小时

在他克莫司产生菌发酵过程中培养温度控制在30.0℃。

取发酵液1.0毫升，加入10毫升乙醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析多杀菌素的含量。色谱柱规格为ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；柱温：室温；流动相：甲醇/乙腈/2%乙酸铵溶液（体积比45/45/10）；流速：1.5 mL/min；上样体积：10 μL；检测波长：250 nm。通过检测系统自带分析软件计算多杀菌素A、D 的响应峰面积，与标准品比对便可得出样品中多杀菌素的含量。取发酵液1.0毫升，加入10毫升乙醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析多杀菌素的含量，发酵第320小时的多杀菌素的效价为1.05克/L。

实施例5：

菌种：北里链霉菌菌NBRC 13686

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求7.2即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌35分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：10%；

培养温度：28.0-30.0℃；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.8-1.0vvm；

培养周期：116小时。

10-20小时补加正丙醇0.4%（菌浓大于20%时补加）。

在柱晶白霉素产生菌发酵前期0-15小时，通过基础培养基使得菌丝快速生长，培养温度控制在28.0℃；15小时-116小时，培养温度控制在24.0℃。

采用HPLC分析柱晶白霉素的含量。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L醋酸铵溶液（磷酸调节pH4.5）-甲醇-乙腈（40:55:5）为流动相；柱温60℃；检测波长为231nm。取对照品溶液（1）10μl注入液相色谱仪。记录的色谱图应与标准图谱一致。柱晶白霉素主组分出峰顺序依次为A9、A8、A7、A6、A5、A4、A1、A3、A13。按外标法以柱晶白霉素A5的峰面积计算，吉他霉素A5应为35%～70%，A4应为5%～25%，A1、A13均应为3%～15%；主组分A9、A8、A7、A6、A5、A4、A1、A3、A13之和不得少于85%。通过检测系统自带分析软件计算各组分的响应峰面积，与标准品比对便可得出样品中柱晶白霉素的含量。

取发酵液1.0毫升，加入10毫升乙醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析柱晶白霉素的含量，发酵第116小时的的效价为11.22克/L。

比较实施例5：

菌种：北里链霉菌菌NBRC 13686

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求7.2即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌35分钟。

发酵体积：6000L；

接种量：10%；

培养温度：28.0℃；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.8-1.0vvm；

培养周期：92小时。

15-20小时补加正丙醇0.4%（菌浓大于20%时补加）。

培养温度控制在28℃。

采用HPLC分析柱晶白霉素的含量。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L醋酸铵溶液（磷酸调节pH4.5）-甲醇-乙腈（40:55:5）为流动相；柱温60℃；检测波长为231nm。取对照品溶液（1）10μl注入液相色谱仪。记录的色谱图应与标准图谱一致。柱晶白霉素主组分出峰顺序依次为A9、A8、A7、A6、A5、A4、A1、A3、A13。按外标法以柱晶白霉素A5的峰面积计算，吉他霉素A5应为35%～70%，A4应为5%～25%，A1、A13均应为3%～15%；主组分A9、A8、A7、A6、A5、A4、A1、A3、A13之和不得少于85%。通过检测系统自带分析软件计算各组分的响应峰面积，与标准品比对便可得出样品中柱晶白霉素的含量。

取发酵液1.0毫升，加入10毫升乙醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析柱晶白霉素的含量，发酵第92小时的效价为8.02克/L。

实施例6：

菌种：红霉素链霉菌SIIA1201（Streptomyces erythreus SIIA 1201）

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求6.2即可，升温,当温度达到121℃时，开始灭菌35分钟。

发酵体积：600L；

接种量：10%；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.8-1.0vvm；

培养周期：230小时。

20小时补加正丙醇0.4%，25小时补豆油，PH高于6.9开始补糖。

在红霉素产生菌发酵前期0-20小时，通过基础培养基使得菌丝快速生长，培养温度控制在34.0℃；20小时-230小时，培养温度控制在28.0℃。

采用HPLC分析红霉素的含量。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾8. 7g，加水1000ml，用磷酸调节p H 值至8 .2）-乙腈（40 ： 60）为流动相；流速为每分钟0.8〜1.0ml;柱温35℃；波长为215nm。取对照品溶液（1）10μl注入液相色谱仪。记录的色谱图应与标准图谱一致。按红霉索C、红霉素A、杂质1、红霉素B、红霉素烯醇醚峰的顺序出峰。按外标法以峰面积计算供试品中红霉素A的含量。通过检测系统自带分析软件计算各组分的响应峰面积，与标准品比对便可得出样品中红霉素的含量。

取发酵液1.0毫升，加入10毫升甲醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析红霉素的含量，发酵第230小时的效价为11.05克/L。

比较实施例6：

菌种：红霉素链霉菌SIIA1201（Streptomyces erythreus SIIA 1201）

发酵培养基配比：

按照规定配比精确称上述配料投入配料罐中并加水至定容体积，搅拌15分钟后测pH，pH要求6.2即可，升温，当温度达到121℃时，开始灭菌35分钟。

发酵体积：600L；

接种量：10%；

培养温度：34.0℃；

搅拌转速：80-220rpm；

空气流量：1:0.8-1.0vvm；

培养周期：200小时。

20小时补加正丙醇0.4%，25小时补豆油，PH高于6.9开始补糖。

采用HPLC分析红霉素的含量。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾8. 7g，加水1000ml，用磷酸调节p H 值至8.2）-乙腈（40 ︰60）为流动相；流速为每分钟0.8〜1.0ml;柱温35℃;波长为215nm。取对照品溶液（1）10μl注入液相色谱仪。记录的色谱图应与标准图谱一致。按红霉索C、红霉素A、杂质1、红霉素B、红霉素烯醇醚峰的顺序出峰。按外标法以峰面积计算供试品中红霉素A的含量。通过检测系统自带分析软件计算各组分的响应峰面积，与标准品比对便可得出样品中红霉素的含量。

取发酵液1.0毫升，加入10毫升甲醇，震摇15分钟，高速离心得上清液，HPLC分析红霉素的含量，发酵第200小时的效价为7.82克/L。

根据本发明的实施例1-6中，采用了两段温度控制策略, 大环内酯抗生素产生菌初级代谢阶段,，在大环内酯类抗生素产生菌初级代谢阶段,培养温度按正常要求控制，菌丝快速生长；在大环内酯抗生素产生菌完成对数生长期后通过显著降低发酵培养温度，促进目标产物大量合成。根据本发明的方法能够促进大环内酯类抗生素产量的显著提高,发酵过程易于控制，并维持更长时间的生物合成，提高了设备利用率，降低了营养成分的消耗，实现了节能减排。在比较实施例1-6中，发酵阶段维持发酵温度在较小范围内波动，发酵中后期，pH值不稳定，表现为中期pH值偏低，效价增长缓慢，后期pH值快速上升，效价增长停滞，比进行降温控制的实施例的发酵单位偏低30%以上。

由此可见，根据本发明的方法能够使大环内酯类抗生素发酵过程的促进抗生素合成，并维持长时间的快速合成速率。本方法工艺简单易行，易于操作，非常适合商业化生产。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。