具体实施方式

下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。

枸杞多糖(lyciumbar barum polysaccharide，LBP)是枸杞生物活性功能的主要有效成分，具有无耐药性、无残留、安全、制造工艺简单等特点。研究表明LBP具有抗氧化、抗炎、神经保护、降血糖血脂、免疫调节等功能。

枸杞糖肽(lycium barbarum glycopeptide，LbGp)是从LBP中进一步分离纯化后得到的具有更强免疫活性的糖缀合物。病原微生物、营养、饲养管理、应激和药物等因素极易诱发鸡群免疫抑制，因此本申请通过肌注环磷酰胺(CY)诱导雏鸡产生免疫抑制，再通过饮水口服高、中、低剂量的LbGp，以生长状况、脾脏指数、外周血液淋巴细胞增殖率为评价指标，再辅以脾脏组织学切片分析，提出LbGp对CY诱导产生免疫抑制鸡的免疫调节作用。

一方面，本申请提供一种免疫增强组合物，包括枸杞糖肽和辅料；所述枸杞糖肽和辅料质量比为5:1，所述枸杞糖肽的纯度≥90％。

第二方面，本申请提供上述的免疫增强组合物作为环磷酰胺拮抗剂的应用。

第三方面，本申请提供一种免疫增强组合物在制备提高雏鸡免疫方面药物中的应用，

所述免疫增强组合物包括药物学上有效量的枸杞糖肽LbGp。

可选的，上述的应用，所述药物学上有效量为重量比90-95％。

可选的，上述的应用，包括所述免疫增强组合物在制备增加雏鸡外周血淋巴细胞因子药物或饲料中的应用。

下面提供实施例来验证免疫增强组合物中的枸杞糖肽的免疫作用。

实施例

1、准备工作

1.1、实验所用的材料

试验动物及药品：1d龄海兰蛋鸡购自北京市华都峪口禽业有限公司。枸杞糖肽购自于宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司，将枸杞糖肽与辅料制备得到免疫增强组合物。

试剂及仪器：CY购自大连美仑生物技术有限公司(货号：A0505A)；鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司(货号：LTS1090C)；一次性试验动物静脉血样采集容器枸橼酸钠抗凝剂购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司(货号：TBDTM-0001)；中性福尔马林固定液(10％NBF)(货号：G2161)购自索莱宝公司；鸡外周血淋巴细胞完全培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司(货号：CM-C007)；0.9％氯化钠注射液购自陕西圣奥；电子秤购自上海第二天平仪器厂；CO₂培养箱购自上海力申科学有限公司；组织切片机购自德国Leica公司。

1.2、实验分组与预处理

将200羽1d龄海兰蛋鸡，适应性饲养至7d龄后随机分成5个组，每组40羽，即空白组(NC)、环磷酰胺组(CY)及LbGp4组高(LbGp4H组)、中(LbGp4M组)、低(LbGp4L组)3个剂量组，除NC组注射生理盐水外，其余4组连续3d肌注80mg/kg·d CY进行造模，造模后LbGp4各组连续7d分别给予10、5、2.5mg/kg·d LbGp4。在首次给药后的第7、14、21和28d，每组随机选取5只鸡称重，随后取下脾脏称重，记录数据计算脾脏指数，其公式为：脾脏指数＝脾重(g)/体重(g)×100。

在首次给药后第7、14、21和28d，每组随机选取5只鸡无菌心脏采血，随后离心分离淋巴细胞，培养后采用MTT法测定淋巴细胞OD490nm值。

在首次给药后第7、14、21和28d，每组随机选取5只鸡处死后取脾脏，将其完全放入10％NBF中，室温保存3d，按常规操作制备石蜡切片后HE染色，镜检。

数据使用SPSS25.0进行One-Way ANOVA检验分析各组间的差异显著性，结果用平均值±标准误表示。

2、实验结果

2.1、枸杞糖肽对CY免疫抑制鸡体重的影响

表1为枸杞糖肽对鸡体重的影响。由表1可知，在第7、14、21和28d时CY组免疫抑制雏鸡的体重均低于其余各组。其中第7d时，NC组体重显著高于LbGp4H、LbGp4L和CY组(P＜0.05)；14d时，LbGp4M组体重显著高于CY组和NC组(P＜0.05)；21d时，LbGp4M组显著高于LbGp4H，LbGp4H显著高于CY组(P＜0.05)，LbGp4M极显著高于LbGp4L、CY和NC组(P＜0.01)；27d时，LbGp4M组体重显著高于LbGp4H和LbGp4L组(P＜0.05)，LbGp4M极显著高于CY和NC组(P＜0.01)。

表1枸杞糖肽对鸡体重的影响

Table 1Effect of Lycium Barbarum Glycopeptide on body weight ofchickens

2.2、枸杞糖肽对CY免疫抑制鸡脾脏指数的影响

表2为枸杞糖肽对鸡脾脏指数的影响。由表2可知，在第7、14、21和28d时CY组免疫抑制雏鸡的脾脏指数均低于其余各组。其中7d时，NC组显著高于CY组(P＜0.05)；在14的、21d和278d，LbGp4M组均显著高于CY组(P＜0.05)。

表2枸杞糖肽对鸡脾脏指数的影响

Table 2Effect of Lycium Barbarum Glycopeptide on spleen index ofchickens

2.3、枸杞糖肽对免疫抑制鸡外周血淋巴细胞转化的影响

表3为枸杞糖肽对鸡外周血淋巴细胞转化的影响。由表3可知，在第7、14、21和28d时CY组免疫抑制雏鸡的外周血淋巴细胞A490nm值均低于其余各组。其中7d时LbGp4M组外周血淋巴细胞A490nm值显著高于CY组(P<0.05)；在14d时LbGp4H、LbGp4M和LbGp4L组外周血淋巴细胞A490 nm值均极显著高于CY组(P<0.01),NC组显著高于CY组(P<0.05)；在21d时LbGp4H、LbGp4M组外周血淋巴细胞A490nm值极显著高于NC与CY组(P<0.01)；在28d时LbGp4H、LbGp4M组外周血淋巴细胞A490nm值极显著高于LbGp4L、NC与CY组(P<0.01)。

表3枸杞糖肽对鸡外周血淋巴细胞转化的影响(A 490nm)

Table 3Effect of lycium Barbarum Glycopeptide on lymphocytetransformation in chicken peripheral blood(A490nm)

2.4、枸杞糖肽对免疫抑制鸡脾脏组织切片的影响

图1为7d枸杞糖肽对鸡脾脏组织结构的影响，首次给药后的第7d各组淋巴细胞分布均匀，分组之间无明显差异(P>0.05)。图2为14d枸杞糖肽对鸡脾脏组织结构的影响，第14d时NC组生发中心个数约为25-30个，CY组生发中心个数约为20个，且生发中心缩小，边缘区模糊，脾窦增宽，LbGp4各组生发中心个数约40-50为个，显著高于NC和CY组(P＜0.05)。图3为21d枸杞糖肽对鸡脾脏组织结构的影响，第21d时NC、LbGp4各组生发中心个数约为30-40个，CY组生发中心个数约25-30个，显著低于NC和LbGp4各组(P＜0.05)，且生发中心缩小、脾窦增宽。图4为28d枸杞糖肽对鸡脾脏组织结构的影响，第28d时各组生发中心个数约为30-40个，分组之间无明显差异(P>0.05)。

上述结果显示CY组出现生长性能抑制、脾脏指数降低和外周血淋巴细胞转化减弱，并且脾脏组织学切片可见生发中心缩小，边缘区模糊，脾窦增宽，说明本试验雏鸡免疫抑制构建成功。本申请结果也提出LbGp4具有能提高CY诱导免疫抑制产蛋雏鸡的生长性能和脾脏指数的作用，其中LbGp4中剂量浓度效果最好(5mg/kg·d)。本申请结果证明LbGp4可以提高产蛋雏鸡外周血淋巴细胞转化作用。本申请通过对鸡脾脏的组织学变化的观察，发现CY能够损伤鸡脾脏，减少生发中心数量和淋巴细胞数量，而LbGp4能够在一定程度上促进脾脏损伤恢复。

本申请提供的免疫增强组合物中枸杞糖肽(LbGp4)对环磷酰胺(CY)诱导雏鸡产生免疫抑制的调节作用。将200羽7日龄海兰蛋鸡随机分成5个组，每组40羽，即空白组(NC)、环磷酰胺组(CY)及LbGp4高(LbGp4H)、中(LbGp4M)、低(LbGp4L)3个剂量组，NC组肌注生理盐水，其余4组连续3d肌注80mg/kg·d CY进行造模，造模后LbGp4H、LbGp4M和LbGp4L组连续7d分别给予10、5、2.5mg/kg·d LbGp4。在首次给药后第7、14、21和28d各随机选取5只鸡测定体重，脾脏指数，外周血淋巴细胞转化作用，并进行脾脏组织学分析。结果表明，LbGp4H显著提高了CY诱导免疫抑制雏鸡体重(P＜0.05)，LbGp4M组能极显著提高CY诱导免疫抑制雏鸡体重(P＜0.01)；LbGp4M组显著提高了CY诱导免疫抑制雏鸡脾脏指数(P＜0.05)；LbGp4H和LbGp4M组极显著提高了CY诱导免疫抑制雏鸡外周血淋巴细胞转化率(P<0.01)；脾脏组织学结果显示，在首次给药后第14、21d LbGp4各组生发中心个数显著高于CY组(P＜0.05)。综上可知，枸杞糖肽对环磷酰胺诱导的雏鸡免疫抑制有显著的拮抗作用，以中剂量组效果最佳。

本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。