用于生产重组肽的方法及所得到的肽
阅读说明：本技术 用于生产重组肽的方法及所得到的肽 (Method for producing recombinant peptides and resulting peptides ) 是由 N·F·麦索多夫 L·A·安德烈耶娃 D·V·格里科夫 于 2013-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于生产重组肽的方法及所得到的肽。本发明涉及生物化学及生物技术并且涉及生产具有性功能及生殖功能刺激活性的肽,所述肽具有下述通式：A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X,其中A为0、Met、Met(O)、Thr、Ala、His、Phe、Lys、Gly,B为0、Gly、Asp、Trp、Gln、Asn、Tyr、Pro、Arg,C为0、Arg、Phe、Tyr、Gly、His、Pro、Lys,D为0、Val、Gly、Tyr、Trp、Phe、His,X为OH、OCH-3、NH-2,其中0是没有氨基酸残基,条件是如果A≠0,则B和/或C和/或D≠0,且如果B≠0,则C和/或D≠0,不包括肽Phe-Thr-Lys-Pro-Gly、Thr-Lys-Pro-Pro-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg-Gly。本发明还涉及通过基因工程方法生产所述肽的方法。(The present invention relates to a method for producing recombinant peptides and the resulting peptides. The present invention relates to biochemistry and biotechnology and to the production of peptides with sexual and reproductive function stimulating activity, said peptides having the general formula: A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X, wherein A is 0, Met (O), Thr, Ala, His, Phe, Lys, Gly, B is 0, Gly, Asp, Trp, Gln, Asn, Tyr, Pro, Arg, C is 0, Arg, Phe, Tyr, Gly, His, Pro, Lys, D is 0, Val, Gly, Tyr, Trp, Phe, His, X is OH, OCH 3 、NH 2 Wherein 0 is the absence of an amino acid residue, with the proviso that if A.noteq.0, then B and/or C and/or D.noteq.0, and if B.noteq.0, then C and/or D.noteq.0, excluding the peptides Phe-Thr-Lys-Pro-Gly, Thr-Lys-Pro-Pro-Arg, Thr-Lys-Pro-Arg-Gly. The invention also relates to the use of the gene engineeringMethods of producing the peptides.)
本申请是申请日2013年5月28日、申请号为201380028491.4的专利申请“用于生产重组肽的方法及所得到的肽”的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物化学领域，并与生产肽的重组方法和生成的肽相关。特别地，本发明涉及具有下列通式的肽：
A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X，其中：
A-0、Met、Met(O)、Thr、Ala、His、Phe、Lys、Gly
B-0、Gly、Asp、Trp、Gln、Asn、Tyr、Pro、Arg
C-0、Arg、Phe、Tyr、Gly、His、Pro、Lys
D-0、Val、Gly、Tyr、Trp、Phe、His
X-OH、OCH3、NH2,
其中0是没有氨基酸残基，条件是如果A≠0，则B和/或C和/或D≠0，如果B≠0，则C和/或D≠0，不包括肽Phe-Thr-Lys-Pro-Gly(SEQ ID NO:1)、Thr-Lys-Pro-Pro-Arg(SEQ IDNO:2)、Thr-Lys-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO:3)。
背景技术
已知小肽显示极高的活性，在发生紊乱的器官中刺激自我愈合。众所周知，较小的肽最初来源于动物组织，随后人们在实验室条件下学会了生产它们。
含肽的医药产品能够再生受损体细胞，使丧失的功能恢复到受影响器官，并使其恢复活力。三十多年前已开发含肽的医药产品；自此以后，已进行了数百次试验，证明了肽在治疗和预防各种全身系统疾病以及单一器官-和全身-恢复活力中的效力。
在体内，肽充当信息使者：它们将信息由一个细胞转移到另一细胞，从而使所有事件能够良好并及时完成。如果一个细胞正常运行，则相应器官运转良好。如果发生失调，则影响整个器官，导致疾病。显然，通过将缺失物质导入身体能够治疗疾病，但是该方法会完全“宠坏”细胞，细胞会适当地终止正常运行。因此，需要使肽使者(peptide messengers)输送到细胞，使其发挥功能，从而身体将自我愈合。各器官具有储备干细胞的供应库。如果该供应库完全耗尽，人存活100-110岁。肽对于所有哺乳动物是一样的。因此，如果将牛肽(calf peptide)导入到人类，人类身体将把其当作天然分子。主要的问题是发现如何从动物器官分离肽。早在1971年由Vladimir Morozov教授和Vyacheslav Havinson教授在Military Medical Academy中发明了该技术。开发了医药产品，然后，基于此，制造了食物增补剂，这是因为食物增补剂使用方便。在他们对老化过程及其影响方法的研究中，圣彼得堡老年学研究所(St.Petersburg Institute of Gerontology)的员工得出结论：将肽导入到小鼠实验组饮食使它们的预期寿命(life expectancy)增加30-38％。随后，在老年学基辅研究所(Kiev Institute of Gerontology)和圣彼得堡进行了对老年人的肽研究。这显示死亡率几乎降低2倍，表现出肽的高老化保护(geroprotective)活性。肽医药产品的长期研究和使用显示它们在不同年龄组患者中的效力高；然而，在老人(50多岁)中观察到特别的效力。肽生物调节物的绝对优势为没有任何不良反应。26年来，超过1500万患有各种病理的人接受该产品。它们的效力平均为75-95％。随着年龄和病理变化肽缺乏显著地加快组织消耗和身体老化。事实上，细胞和组织充分发挥功能需要充足量的肽，这反过来，支持基因发挥最佳功能。在对其特异性的细胞中发挥功能的肽在该处合成。因此，在病理变化以及老化时，细胞功能被破坏；因而，同样地影响肽的再生。相应地，继而影响细胞功能。因此，组织进程的退化，最终表现于临床。所以，在医学中小肽的应用是主要的创新之一，并且通过刺激细胞增殖和组织再生可显著地减慢老化速度，并且延长细胞寿命。肽的另一重要优点是它们的抗肿瘤作用。目前，在康复(身体恢复活力)和癌症预防中使用肽是最好的不二之选，因为其不仅通过调节和同步化所有周期过程，而且通过提高细胞分裂的能力使细胞和组织恢复活力，而没有异型(异型(atypia)为不正常的细胞结构，或异常)。
当然，现阶段的技术中，由动物组织生产小肽是不切实际的，因为该方法非常昂贵，更不用说生产方法的人道性。
现代先进的生产方法包括使用重组微生物。最方便的微生物为大肠杆菌(E.coli)。现有技术中已知适于实验室条件的大肠杆菌的商用菌株，例如大肠杆菌K12、大肠杆菌0104。这些及类似的已知大肠杆菌菌株可用于获得生产请求保护的小肽的菌株。编码相应靶标小肽的核酸可整合到适于实验室条件的任何已知菌株中。载体，例如细菌质粒、病毒、病毒体、含噬菌体DNA的杂合载体、和质粒用于将DNA插入到宿主细胞中。这些载体包括，比如粘粒和噬粒。
此外，通过常规化学合成可生产肽。
提出的肽解决了扩展用于刺激生殖功能和性功能以及治疗生殖功能障碍和性功能障碍的工具范围的问题，该问题目前仍然适用。当前，使用心理疗法、抗抑郁药、抗焦虑药、适应原(Adaptogens)以及维生素、一般植物类刺激物和饮食增补剂进行该病理的发病机理治疗。该治疗长期、低效并伴随许多副作用。
适于生殖功能和性功能的刺激物产生的最有效类型的生理活性物质之一为作为内源性物质的，实质上不具有消极副作用的肽。
我们自己的研究显示具有通式Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:2680)的七肽Selank(内源性产生的肽Tuftsin的合成类似物)可用作预防和治疗生殖功能障碍及性功能障碍的工具(俄罗斯联邦专利第2404793号)。然而，七肽Selank的合成是多阶段的，这大大增加了基于此的医药产品的成本；另外，在体内其受到强烈的蛋白水解，这降低了其对预防和治疗生殖功能障碍及性功能障碍的刺激作用。
发明内容
发明的目的是扩展具有生殖功能和性功能刺激活性的工具的范围。
当实施本发明时实现的技术结果是增强预防和治疗生殖功能障碍及性功能障碍的效力，降低疗程持续时间和药疗法的成本降低，其中提出具有下列通式的肽作为医药产品：
A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X，其中：
A -0、Met、Met(O)、Thr、Ala、His、Phe、Lys、Gly
B-0、Gly、Asp、Trp、Gln、Asn、Tyr、Pro、Arg
C-0、Arg、Phe、Tyr、Gly、His、Pro、Lys
D-0、Val、Gly、Tyr、Trp、Phe、His
X-OH、OCH3、NH2，
其中0指没有氨基酸残基。
条件是如果A≠0，则B和/或C和/或D≠0；如果B≠0，则C和/或D≠0，不包括肽Phe-Thr-Lys-Pro-Gly(SEQ ID NO:1)、Thr-Lys-Pro-Pro-Arg(SEQ ID NO:2)、Thr-Lys-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO:3)。
在位置A、B、C、D和X的氨基酸残基的选择基于数据库[EROP-Moscow(http://erop.inbi.ras.ru/)Zamyatin A.A.]中N末端和C末端氨基酸残基的相应位置上氨基酸残基频率的生物信息学分析。基于在此位置上氨基酸残基大于50％发生率的标准进行这些氨基酸残基的选择。该氨基酸残基样品通过单个肽的合成以及它们在活体模型中生殖功能活性和性功能活性的刺激试验来试验性证实。通过试验确定药效团在肽中位置。已知任何肽暴露于肽酶并降解为特定片段。为此，在合成Selank七肽片段：Thr-Lys(SEQ ID NO:2678)、Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:5)、Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:2677)、Arg-Pro-Gly-Pro(SEQ IDNO:2676)、Pro-Arg-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:2675)后，研究它们的活性。结果提供于表4中。在该分析中，确定药效团：其为Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:5)。如研究(表5，实施例10)所示，显示将单独试验性鉴定的氨基酸残基附加到C末端保持肽活性(刺激生殖功能和性功能)，假定肽中氨基酸残基数为3或大于4。四肽不具有生殖功能和性功能刺激活性。
通过具有通式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X的各种肽(不包括四肽)的定向合成并通过使用这些肽作为用于预防和治疗生殖功能障碍及性功能障碍的生殖功能及性功能刺激物实现提到的技术结果。我们自己的研究显示可将合成肽，即对应于通式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X的Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:5)三肽、Thr-Lys-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:6)五肽和Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe(SEQ ID NO:7)六肽推荐为生殖功能和性功能刺激物。
具有通式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X的全部肽(不包括四肽)推荐为生殖功能和性功能刺激物，具有共同的模式，即在其分子结构中存在Thr-Lys-Pro三肽分子。
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:2680)七肽(Selank)用作对照。
进行研究的结果显示具有通式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X的肽(不包括四肽)具有生殖功能和性功能刺激活性，并且可用作用于预防和治疗生殖功能障碍及性功能障碍的医药产品。
通式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X的某些肽示于表1中。
表1
附图说明
图1示出Arg-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:2676)四肽合成的图；
图2示出Pro-Arg-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:2675)五肽合成的图；
图3示出Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:2677)三肽合成的图；
图4示出Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe(SEQ ID NO:7)六肽合成的图；
图5示出Thr-Lys-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:6)五肽合成的图；
图6示出Thr-Lys(SEQ ID NO:2678)二肽合成的图；
图7示出Thr-Lys-Pro-Phe(SEQ ID NO:2679)四肽合成的图；
具体实施方式
以下为说明本发明的实施例。
使用L-氨基酸通过溶液中的肽化学方法进行具有通式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X的肽合成。通过肽链的逐步延伸，以及使用混合酸酐法的片段缩合、添加1-羟基苯并三唑作为辅助亲核试剂的碳二亚胺法、活化酯法和混合酸酐法进行肽合成。分离并表征所有中间体和最产物。使用真空蒸发器在40℃下实施溶液的蒸发。在没有校正的情况下给出用伯蒂乌斯设备(Boethius apparatus)测定的熔点。通过TLC在Silufol硅胶涂布板(CzechRepublic)上试验获得的化合物的特性。通过UV光使用茚三酮、巴顿试剂(Barton'sreagent)、帕乌试剂(Pauly reagent)、赖因德尔-霍佩试剂(Reindel-Hoppe reagent)和邻联甲苯胺在氯环境中检测物质。通过AI-EPO旋光计测定旋光率。通过高效液相色谱(HPLC)测试肽同源性，并通过质谱法确定肽结构。所有溶剂相应地无水。不校正熔点。
还通过基因工程技术使用由已知的大肠杆菌实验室菌株工程化的宿主细胞，用已知商购可得的含编码靶标肽的核酸的质粒转化获得肽。
实施例描述了肽合成。
实施例1.Arg-Pro-Gly-Pro四肽的合成
根据图1所示的图表进行四肽的合成。
合成时，使用混合酸酐法、叠氮法和碳二亚胺法。将L-氨基酸的衍生物用于合成。使用转子蒸发器在40℃下实施溶液蒸发。在不校正的情况下给出用伯蒂乌斯设备测定的熔点。通过TLC在Silufol硅胶涂布板(Czech Republic)上试验获得的化合物的特性。通过用茚三酮和(或)邻联甲苯胺的溶液喷雾平板来检测物质。提供在以下溶剂体系中的色谱迁移率(Rf)值：丙酮:苯:乙酸(50:100:1)-(1)；氯仿:甲醇(9:1)-(2)；己烷:丙酮(3:2)-(3)；丁醇:乙酸:水(4:1:1)-(4)；丁醇:乙酸:吡啶:水(30:6:20:24)-(5)；氯仿:甲醇:氨(6:4:1)-(6)；苯:乙醇(8:2)-(7)；乙酸乙酯:丙酮:50％乙酸:水(2:1:1)-(8)；氯仿:甲醇(14:1)-(9)；氯仿:甲醇:氨(8:1.75:0.25)-(10)；氯仿:甲醇:氨(6.5:3.0:0.5)-(11)。
通过AI-EPO旋光计测定旋光率。
使用Carlo-Erba型号1106分析仪元素分析。
I.Boc-Pro-Gly-OEt.将8.3g(3.45mmol)Boc-Pro-OH溶解于50ml CH2Cl2，冷却降至5℃；然后，添加38.45mmol(5.38ml)TEA。将反应混合物冷却降至-25～-30℃。在该温度下，使用移液管添加38.45mmol(4.84ml)氯甲酸异丁酯。将反应混合物温度保持在-18～-20℃范围中20分钟。同时，5.9g(42.3mmol)1.1倍过量的在75ml氯仿中的HCl·H-Gly-Oet的溶液，包含5.92ml TEA。溶液冷却降至-25℃，并且在第一烧瓶中形成混合酸酐后，马上将其内含物倒入到醚溶液。在-10℃下温育反应混合物1小时，然后在4℃下在磁性搅拌器上搅拌12小时。蒸发反应混合物，然后添加250ml乙酸乙酯；然后，将乙酸乙酯溶液用25ml 0.1N HCl洗涤3次，用25ml H2O洗涤3次，并用NaCl饱和溶液洗涤一次。经MgSO4干燥有机层，过滤并蒸发。在真空下经P2O5/KOH和链烷烃干燥残渣。
产量：10.2g(30.3mmol)78.83％
Rf-0.5(7)；0.862(8)
熔点68-70℃。
II.Boc-Pro-Gly-N2H3.将10.2g Boc-Pro-Gly-OEt(30.3mmol)溶解于80ml无水甲醇，并添加4倍过量的水合肼，即5.88ml(121.2mmol)。在磁性搅拌器上在室温下搅拌溶液12小时。蒸发反应混合物，然后用醚蒸发两次；然后，将醚(～5ml)倒入残渣，置于冰箱过夜(为更好结晶化，添加晶种(seeding agent))。过滤沉淀的晶体，使用过滤器用醚洗涤并在干燥器中干燥。
产量：6.9g(20.79mmol)68.62％
Rf-0.284(7)；0.474(8)；0.189(9)
熔点98-100℃。
III.Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.将58.4mmol(4倍过量)乙酸乙酯中的氯化氢添加到在40ml DMF中含4.7g(14.6mmol)Boc-Pro-Gly-N2H3的溶液，冷却降至-20℃，即刻地，1.73ml(14.6mmol)新蒸馏的亚硝酸叔丁酯；然后，在-5℃下搅拌反应混合物30分钟。将反应混合物冷却降至-40℃，并添加冷却降至-10℃的8.2ml(58.4mmol)在4ml DMF中的TEA的溶液；当反应混合物的温度升至-20℃时，添加3.7g(15.3mmol)1.05倍过量的HCl·H-Pro-OBzl至20mlDMF和2.14ml TEA。然后，在磁性搅拌器上在4℃下搅拌24小时。蒸发反应混合物，并将残渣溶解于200mL乙酸乙酯，并用20ml H2O洗涤2次，用20ml 10％KHSO4溶液洗涤3次，用20ml H2O洗涤3次，用20mL5％NaHCO3洗涤3次，并用20ml H2O洗涤3次。经MgSO4干燥乙酸乙酯溶液。然后将其蒸发，并添加少量醚(～10mL)至残渣。然后，置于冰箱以便结晶化。为了更好的产物结晶化，添加晶种。过滤沉淀晶体并使用过滤器用少量醚洗涤。然后，在干燥器中将其干燥。
产量：5.358g(11.65mmol)79.92％
Rf-0.326(7)；0.947(8)；0.390(9)
熔点125-126℃。
[α]D 22＝-101.18°(с＝0.85；СН3ОН).
元素分析：С62.89(62.73)；N 9.21(9.14)；H 7.52(7.24)。
IV.TFA·H-Pro-Gly-Pro-OBzl.将5.358g(11.65mmol)Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl溶解于29.13ml二氯甲烷中；然后，添加29.13mL TFA，在室温下温育45分钟，用无水乙醇蒸发2次，用苯蒸发2次，用醚蒸发2次，并溶解于苯；然后，倒入己烷。倾析己烷，并在真空下在干燥器中经KOH、P2O5和链烷烃干燥所得物质，同时更换干燥剂若干次。
产量：4.63g(9.7mmol)98％
Rf-0.043(7)；0.247(8)；0.018(9)。
V.Boc-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl.将3.09g Boc-Arg(NO2)-OH(9.7mmol)溶解于50mL THF和10mL DMF，添加2.07g(10.67mmol)DCC，冷却降至0℃，搅拌40分钟；然后，将TFA·H-Pro-Gly-Pro-OBzl溶液添加到50ml THF和4.46ml(9.7mmol)TEA。搅拌反应混合物三天。过滤掉DCM沉淀物；在真空下蒸发溶液；然后，将200ml己烷添加到残渣。于是，将所需产物作为油分离，将其溶解于500mL乙酸乙酯并用25ml 0.1N HCl洗涤3次，用25ml H2O洗涤三次，并用NaCl饱和溶液洗涤一次。经MgSO4干燥有机层，过滤并蒸发。残渣溶解于乙酸乙酯，并用干燥醚沉淀。过滤沉淀物并在真空下经P2O5/KOH和链烷烃干燥，同时更换干燥剂若干次。
产量：4.76g(7.9mmol)85％
Rf-0.44(1)；0.8(11)
熔点108-110℃
[α]D 22＝-77.8°(с＝0.5；СН3СООН)。
VI.Boc-Arg-Pro-Gly-Pro.将4.76g(6.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl溶解于100ml甲醇；然后添加1ml 1N盐酸和4.67g催化剂，即在中性氧化铝上的10％氧化钯，实施在室温1atm.下在干燥氢气流中的氢化6小时。然后，过滤掉催化剂并用甲醇在过滤器上洗涤。蒸发收集的(pooled)滤液至干燥。用醚从无水甲醇中沉淀残渣。然后，将其在真空下干燥，同时更换干燥剂若干次。
产量：4.23g(5.8mmol)89％
Rf-0.125(4)；0.57(6)；0.37(5)
熔点123-125℃。
VII.Arg-Pro-Gly-Pro.将4.23g(5.8mmol)Boc-Arg-Pro-Gly-Pro-OH悬浮于10ml在二噁烷中的2N盐酸，并在室温下温育45分钟。然后，添加干燥醚，通过用干燥醚倾析洗涤沉淀物。用醚从无水甲醇再沉淀。将所得沉淀物溶解于7.5ml 30％乙醇，并施加到Amberlyst A-21(AcO-形式)柱用于乙酸盐/盐酸盐交换。用200ml 30％乙醇洗脱肽，在真空下蒸发至干燥并有无水醚从甲醇沉淀。产量：3.69g(4.93mmol)85％
Rf-0.287(4)；0.145(5)；0.338(14)
熔点120-122℃
HPLC结果：柱：Supercosil ABZ Plus,尺寸4.6×250mm；流速1mL/min；洗脱液A：NH4H2PO4+Н3РО4(50mМ,рН2.8)；洗脱液B：MeOH
梯度：0-20min(0-40％B)；保留时间21.21min。
Rf-0.24(6)
熔点＝151℃
[α]D 22＝-65.0°(с＝0.5СН3СООН)
HPLC结果：柱：Zorbax ODS d＝4.6mm；t＝35℃
流速1mL/min；A＝50mM NH4H2PO4(pH 2.5)；B＝A+MeOH(1:1)；10-60％B(25min内)。保留时间16.5min。
实施例2.Pro-Arg-Pro-Gly-Pro五肽的合成
通过肽化学的经典方法使用天然L-氨基酸根据图2所示的图表进行肽合成。
首先，生产Pro-Gly-Pro三肽；然后，通过从N末端逐步组装肽链获得五肽。合成时，使用混合酸酐法、叠氮法和碳二亚胺法。
提供以下溶剂体系的色谱迁移率(Rf)值：丁醇:乙酸:水(4:1:1)-(1)；氯仿:甲醇:氨(6:4:1)-(2)；丙酮:苯:乙酸(50:100:1)-(3)；氯仿:甲醇(9:1)-(4)；己烷:丙酮(3:2)-(5)；丁醇:乙酸:吡啶:水(30:6:20:24)-(6)；氯仿:甲醇(14:1)-(7)。
I.Boc-Pro-Gly-OEt.将8.3g(38.45mmol)Boc-Pro溶解于50mlCH2Cl2，冷却降至+5℃；并添加38.45mmol(5.38ml)TEA。将反应混合物冷却降至-25～-30℃。在该温度下，使用移液管添加38.45mmol(4.84ml)氯甲酸异丁酯。将反应混合物温度保持在-18～-20℃范围中20分钟。同时，5.9g(42.3mmol)1.1倍过量的在75ml氯仿中的HCl·H-Gly-Oet的溶液，包含5.92ml TEA。溶液冷却降至-25℃，并且在第一烧瓶中形成混合酸酐后，马上将其内含物倒入到醚溶液。在-10℃下温育反应混合物1小时，然后在4℃下在磁性搅拌器上搅拌12小时。蒸发反应混合物，并向其添加250ml乙酸乙酯；将乙酸乙酯溶液用25ml 0.1N HCl洗涤3次，用25ml H2O洗涤3次，并用NaCl饱和溶液洗涤一次。经MgSO4干燥有机层，过滤并蒸发。在真空下经P2O5/KOH和链烷烃干燥残渣。
产量：10.2g(30.3mmol)78.83％
Rf-0.5(3)；0.862(4)。
II.Boc-Pro-Gly-N 2 H 3 .将10.2g Boc-Pro-Gly-OEt(30.3mmol)溶解于80ml无水甲醇，并添加4倍过量的水合肼，即5.88ml(121.2mmol)。在磁性搅拌器上在室温下搅拌溶液12小时。蒸发反应混合物，然后用醚蒸发两次；然后，将醚(～5ml)倒入残渣，置于冰箱过夜(为更好结晶化，添加晶种)。过滤沉淀的晶体，使用过滤器用醚洗涤并在干燥器中干燥。
产量：6.9g(20.79mmol)68.62％
熔点98-100℃
Rf-0.284(3)；0.474(4)；0.189(5)。
III.Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.
将58.4mmol(4倍过量)乙酸乙酯中的氯化氢添加到在40ml DMF中含4.7g(14.6mmol)Boc-Pro-Gly-N2H3的溶液，冷却降至-20℃，即刻地，1.73mL(14.6mmol)新蒸馏的亚硝酸叔丁酯；然后，在-5℃下搅拌反应混合物30分钟。将反应混合物冷却降至-40℃，并添加冷却降至-10℃的8.2ml(58.4mmol)在4ml DMF中的TEA的溶液；当反应混合物的温度升至-20℃时，添加3.7g(15.3mmol)1.05倍过量的HCl·H-Pro-OBzl至20ml DMF和2.14mlTEA。然后，在磁性搅拌器上在4℃下搅拌24小时。蒸发反应混合物，并将残渣溶解于200ml乙酸乙酯，并用20ml H2O洗涤2次，用20mL10％KHSO4溶液洗涤3次，用20ml H2O洗涤3次，用20ml5％NaHCO3洗涤3次，并用3ml H2O洗涤3次。经MgSO4干燥乙酸乙酯溶液。然后将其蒸发，并添加少量醚(～10mL)至残渣。然后，置于冰箱。为了更好的产物结晶化，添加晶种。过滤沉淀晶体并使用过滤器用少量醚洗涤。然后，在干燥器中将其干燥。
产量：5.358g(11.65mmol)79.92％
Rf-0.326(3)；0.947(4)；0.390(5)
熔点125-126℃
[α]D 22＝-101.2°(с＝0.85；СН3ОН)
元素分析：С62.89(62.73)；N 9.21(9.14)；H 7.52(7.24)。
IV.TFA·H-Pro-Gly-Pro-OBzl.将5.358g(11.65mmol)Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl溶解于29.13ml二氯甲烷中；添加29.13ml TFA，在室温下温育45分钟，用无水乙醇蒸发2次，用苯蒸发2次，用醚蒸发2次，并溶解于苯；然后，倒入己烷。倾析己烷，并在真空下在干燥器中经P2O5/KOH和链烷烃干燥所得物质。产量：4.63g(9.7mmol)98％
Rf-0.043(3)；0.247(4)；0.018(5)。
V.Boc-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl.将3.09g(9.7mmol)Boc-Arg(NO2)溶解于50ml THF和10ml DMF中；然后，添加2.07g(10.67mmol)DCC，冷却降至0℃，并搅拌40分钟；将TFA·H-Pro-Gly-Pro-OBzl的溶液添加到50ml THF和4.46ml(9.7mmol)TEA。搅拌反应混合物三天。过滤掉DCM沉淀物；在真空下蒸发溶液；然后，将200ml己烷添加到残渣。接着，将所需产物作为油分离，将其溶解于500ml乙酸乙酯并用25ml0.1N HCl洗涤3次，用25ml H2O洗涤三次，并用NaCl饱和溶液洗涤一次。经MgSO4干燥有机层，过滤并蒸发。在真空下经P2O5/KOH和链烷烃干燥残渣，
产量：4.76g(7.9mmol)85％
Rf-0.44(1)；0.8(6)
熔点108-110℃。
VI.TFA-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl.将4.76g(7.9mmol)Boc-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl溶解于20ml二氯甲烷中；添加20ml TFA，在室温下温育45分钟，用无水乙醇蒸发2次，用苯蒸发2次，用醚蒸发2次，并溶解于苯；然后，倒入己烷。倾析己烷，并在真空下在干燥器中经P2O5/KOH和链烷烃干燥所得物质。
定量产量。
Rf-0.16(1)；0.27(6)。
VII.Boc-Pro-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl.将1.7g(7.9mmol)Boc-Pro溶解于20mL THF，并添加1.07g(7.9mmol)BT，冷却降至0℃；添加在50mL THF中的1.8g DCC。在40min中，将TFA-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl(7.9mmol)在50mL THF中的溶液和1.1mL(7.9mmol)TEA添加到反应混合物。在0℃下搅拌2小时并在在室温下搅拌2天；然后，过滤掉DCM，在真空下蒸发，溶解于500mL乙酸乙酯中，并与Boc-Pro-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl类似处理。
产量：4.07g(67.8％)
Rf-0.42(1)；0.72(6)；0.31(7)
熔点147-148℃。
VIII.Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro.将4.07g(6.5mmol)溶解于100ml甲醇；添加1ml1N盐酸和0.85g催化剂，即10％在中性氧化铝上的氧化钯，并在室温下在1atm.下进行在干燥氢蒸汽中的氢化6小时。然后，过滤掉催化剂并用甲醇在过滤器上洗涤。将收集的滤液蒸发至干燥。用醚从无水甲醇沉淀残渣。产量：3.02g(5.8mmol)89％
Rf-0.125(1),0.57(2),0.37(6)。
IX.Pro-Arg-Pro-Gly-Pro.将3.02g(5.8mmol)Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-OH悬浮于10ml在二噁烷中的2N盐酸，并在室温下温育45分钟。然后，添加干燥醚，并通过用干燥醚倾析洗涤沉淀物。用醚从无水甲醇再沉淀。将所得沉淀物溶解于7.5ml 30％乙醇，并施加到Amberlyst A-21(AcO-形式)柱用于乙酸盐/盐酸盐交换。用200ml 30％乙醇洗脱肽，在真空下蒸发至干燥并有无水醚从甲醇沉淀。
产量：2.27g(75％)
Rf-0.2(2)；0.1(6)
熔点180-185℃
[α]D 20＝-105°(с＝0.4；СН3СООН)。
相对于精氨酸的氨基酸组成：Pro 2.78(3)；Gly 1.1(1)。
HPLC结果：柱：Supercosil ABZ Plus，尺寸4.6×250mm；流速1mL/min；洗脱液A：NH4H2PO4+Н3РО4(50mМ,рН2.8)；洗脱液B：MeOH
梯度：0-20min(0-40％B)；保留时间10.13min。
实施例3.Pro-Gly-Pro三肽的合成。
根据图3所示的图表进行Pro-Gly-Pro三肽的合成。使用新式保护基团和溶液中肽键形成法进行Pro-Gly-Pro三肽的合成。使用PivCl的混合酸酐法用于肽键形成。叔丁氧基羰基保护(Boc)用于氨基的保护，并且采用苄基酯(OBzl)来保护羧基。使用逐步法来肽链延长。
L-氨基酸的衍生物用于合成。使用真空蒸发器在40℃下进行溶液的蒸发。给出没有校正的用伯蒂乌斯设备(Boethius apparatus)测定的熔点。
通过TLC在Silufol硅胶-涂布板(Czech Republic)上试验获得的化合物的特性。通过用茚三酮和(或)邻联甲苯胺的溶液喷雾平板来检测物质。提供在以下溶剂体系中的色谱迁移度(Rf)值：(乙酸乙酯:丙酮:50％乙酸：水(2:1:1)；苯:乙醇(8:2)；氯仿:甲醇:氨(6:4:1)；氯仿:甲醇:乙酸(42:7:1)；丙酮:苯:乙酸(50:100:1)；氯仿:甲醇(9:1)；己烷:丙酮(3:2)；丁醇:乙酸:水(4:1:1)；丁醇:乙酸:吡啶:水(30:6:20:24)；己烷:乙酸乙酯(4:1)；氯仿:甲醇:氨(8:1.75:0.25)；(异丙醇:甲酸:水)(20:5:1)；(氯仿:甲醇:氨)(7:2.5:0.5)；甲醇。通过AI-EPO旋光计测定旋光率)。使用Carlo-Erba型号1106分析器分析元素。
I.Boc-Pro-Gly-OH的生产。
1.将10.75g(50mmol)Boc-Pro溶解于150ml乙腈，冷却降至-5℃；然后，添加7.7ml(50mmol)三乙胺(TEA)至溶液，并在磁性搅拌器上搅拌的同时，将其冷却降至-20℃。将6.8ml(55mmol)新戊酰氯(PivCl)添加到冷却的溶液，在磁性搅拌器上在-10℃搅拌20分钟，然后冷却降至-30℃；然后，添加Gly的预冷溶液。同时，制备Gly溶液。
2.将4.5g Gly(60mmol，1.2倍过量)溶解于35ml水和60ml乙腈，添加8.4ml(60mmol)三乙胺。将混合物冷却降至-10℃，并在20分钟后添加到第一烧瓶的溶液。在-10℃将反应混合物温育1小时，并在18-20℃在磁性搅拌器上搅拌2小时。在旋转蒸发器上蒸发反应混合物。添加约50ml水至残渣。用3倍过量的NaHSO4(24.84g)酸化水溶液至pH＝3，并用100ml乙酸乙酯提取5次。用H2O(50ml)、10％KHSO4溶液(50ml)、H2O(50ml)和饱和的NaCl(50ml)洗涤收集的乙酸乙酯溶液。经MgSO4干燥乙酸乙酯溶液。过滤并蒸发干燥的乙酸乙酯。添加干燥醚至残渣。在将醚添加至烧瓶时，沉淀产物，使用过滤器用干燥醚过滤并洗涤。在真空下在干燥器中经KOH、P2O5和链烷烃干燥所得物质，同时更换干燥剂若干次。
产物M.W.272.3
产量：5.97g(21.74mmol)；(43.5％)
熔点70℃。
Rf-0.863(丙酮-苯-乙酸)(50:100:1)；
0.746(苯-乙醇)(8:2)；0.903(氯仿:甲醇)(9:1)；
0.847(乙酸乙酯:丙酮:50％乙酸:水)(2:1:1)。
II.Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl的生产。
1.将5.97g(21.74mmol)Boc-Pro-Gly-OH溶解于100ml乙腈，冷却降至-5℃；然后，添加1.1倍过量(3.35ml，23.9mmol)的三乙胺(TEA)至溶液，并在磁性搅拌器上搅拌的同时，将其冷却降至-20℃。将1.1倍过量(2.34ml，23.9mmol)新戊酰氯(PivCl)添加到冷却的溶液，在磁性搅拌器上在-10℃搅拌20分钟，然后冷却降至-30℃；然后，添加HCl·Pro-OBzl的预冷溶液。同时，制备HCl·Pro-OBzl。
2.将6.3g HCl·Pro-OBzl(26.1mmol，1.2过量)溶解于50ml乙腈，添加4.0ml(28.71mmol；1.1倍过量)三乙胺。将混合物冷却降至-10℃，并在20分钟后添加到第一烧瓶的溶液。在-10℃将反应混合物温育1小时，并在18-20℃在磁性搅拌器上搅拌2小时。蒸发反应混合物。添加300ml乙酸乙酯至蒸发残渣。用H2O(用25mL 3次)、10％KHSO4溶液(用25ml 3次)H2O(用25ml 3次)、5％NaHCO3(用25ml 3次)H2O(25ml 3次)和饱和的NaCl溶液(25ml一次)洗涤乙酸乙酯溶液。经MgSO4干燥乙酸乙酯溶液。过滤并蒸发干燥的乙酸乙酯。添加约100ml干燥醚至残渣。在将醚添加至烧瓶时，沉淀产物，使用过滤器用干燥醚过滤并洗涤。在真空下在干燥器中经KOH、P2O5和链烷烃干燥所得物质，同时更换干燥剂若干次。
产物M.W.459.82
产量：8.12g(17.66mmol)；(81.23％)
熔点125-126℃
Rf-0.326(丙酮:苯:乙酸)(50:100:1)
0.390(己烷:丙酮)(3:2)
0.947(氯仿:甲醇)(9:1)
0.716(甲醇)
0.620(苯:乙醇)(8:2)
III.Boc-Pro-Gly-Pro-OH的生产。
将8g(17.4mmol)Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl溶解于100ml甲醇，添加0.5ml CH3COOH和钯黑，同时在磁性搅拌器上搅拌，并经2小时通氢。过滤溶液，蒸发，用苯蒸发3次并用乙酸乙酯蒸发2次。然后，将其用醚己烷从丙酮沉淀，并在干燥器中经P2O5/KOH和链烷烃干燥烧瓶中形成的沉淀物。
产物M.W.369.39
产量：6.3g(17.05mmol)98％
熔点99-100℃
Rf:0.560(氯仿-甲醇)(9:1)
0.812(氯仿-甲醇-乙酸)(42:7:1)
0.187(丙酮:苯:乙酸)(50:100:1)
0.164(己烷:丙酮)(3:2)
IV.Pro-Gly-Pro的生产。
将40.6ml二氯甲烷和40.6ml TFA添加到6.0g(16.24mmol)Boc-Pro-Gly-Pro-OH并在室温下温育45分钟；在除去保护基团后，用无水甲醇蒸发溶液2次、用苯蒸发2次并用醚蒸发2次。用醚从丙酮将其沉淀。在真空下经P2O5、KOH和链烷烃干燥残渣。用干燥的二乙醚从无水甲醇再沉淀干燥产物。
产物M.W.381.39
产量：5.6g(14.72mmol)(90.62％)
将所得TFA·Pro-Gly-Pro-OH的沉淀物溶解于10ml 30％乙醇；然后，添加25mLAmberlyst A-21(CH3COO-)离子交换树脂来将三氟醋酸盐交换为乙酸盐并在磁性搅拌器上搅拌45分钟；然后，将其用150ml 30％乙醇洗涤，在真空下蒸发至干燥并用干燥的二乙醚从无水甲醇沉淀。过滤掉所得沉淀物并在真空下经P2O5、KOH和链烷烃在干燥器中干燥，同时更换干燥剂若干次。
产物M.W.328.34
产量：4.54g(13.84mmol)(94％)
熔点143-145℃
[α]D 22-31.5°(с1,МеОН)
Rf:0.59(氯仿:甲醇:氨)(6:4:1)
0.52(氯仿:甲醇:氨)(4:4.5:1.5)
0.524(乙醇:氨)(7:3)
实施例4.Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe六肽的合成。
根据图4所示的图表进行Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe六肽的合成。
使用新式保护基团和溶液中肽键形成法进行Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe六肽的合成。使用TBA盐法、活化酯法、碳二亚胺法和混合酸酐法来形成肽键。使用逐步法(stepwiseapproach)和嵌段法(blockwise approach)两者。
实施例5.Thr-Lys-Pro-Arg-Pro五肽的合成。
根据图5所示的图表进行Thr-Lys-Pro-Arg-Pro五肽的合成。
使用新式保护基团和溶液中肽键形成法进行Thr-Lys-Pro-Arg-Pro五肽的合成。使用TBA盐法、活化酯法和碳二亚胺法来形成肽键。使用逐步法和嵌段法两者。
实施例6.Thr-Lys二肽的合成。
根据图6所示的图表进行Thr-Lys二肽的合成。使用新式保护基团和溶液中肽键形成法进行Thr-Lys二肽的合成。使用TBA盐法形成肽键。使用受保护的和游离L-氨基酸两者的衍生物来合成实施例7-9所述的肽。肽合成时使用的溶剂相应地无水化。通过高效液相色谱(HPLC)使用Millichrome A-02微型柱液相色谱系统试验肽的同质性(homogeneity)。通过质谱使用Bruker质谱仪(Daltonik GmbH)表征合成的肽。
实施例7.Thr-Lys-Pro-Phe四肽的合成。
根据图7所示的图表进行Thr-Lys-Pro-Phe四肽的合成。
使用新式保护基团和溶液中肽键形成法进行Thr-Lys-Pro-Phe四肽的合成。使用TBA盐法和活化酯法来形成肽键。使用逐步法来延伸肽链。使用受保护和游离L-氨基酸两者的衍生物来合成。使用真空蒸发器在40℃进行溶液的蒸发。给出没有校正的用伯蒂乌斯设备测定的熔点。通过TLC在Silufol硅胶涂布板(Czech Republic)上试验获得的化合物的特性。通过用茚三酮和(或)邻联甲苯胺的溶液喷雾平板来检测物质。提供在以下溶剂体系中的色谱迁移度(Rf)值：(丁醇:乙酸:水)(4:1:1)；(苯-乙醇)(8:2)；(氯仿:甲醇)(9:1)；(异丙醇:甲酸:水)(20:5:1)；(氯仿-甲醇-乙酸)(42:7:1)；(氯仿:甲醇:氨)(8:1.75:0.25)；(丙酮-苯-乙酸)(50:100:1)；(氯仿:甲醇:氨)(6:4:1)；(氯仿:甲醇:氨)(44.5:1.5)；(丁醇:乙酸:吡啶:水)(30:6:20:24)。
I.Z-Lys(Boc)-Pro-OH的生产。
将TBA的13％溶液(98ml)添加到46.32mmol(5.34g)Pro并用乙醇蒸发两次，用乙醇/苯混合物蒸发两次和用苯蒸发2次。添加300ml无水乙酸乙酯；将反应混合物冷却降至0℃，并添加23.16mmol(12.66g)之前合成的Z-Lys(Boc)-OPfp，并在磁性搅拌器上搅拌1小时。蒸发反应物质(reaction mass)，并将40ml水添加到蒸发残渣。用80ml醚洗涤水溶液3次。用醚洗涤后，用柠檬酸酸化水溶液至pH 3。酸化后，用乙酸乙酯以40ml等分提取水溶液3次。用20ml水洗涤提取后收集的乙酸乙酯3次，用20ml 10％的KHSO4溶液洗涤3次，并用20ml水洗涤3次。经MgSO4干燥乙酸乙酯溶液。然后，将其过滤并在旋转蒸发器上蒸发。用己烷从乙酸乙酯沉淀所得物质。倾析己烷，并在真空下在干燥器中经KOH、P2O5和链烷烃干燥所得物质，重复更换干燥剂。产量：9.68g(20.26mmol)；(87.51％).
熔点76-77℃
Rf-0.705(丁醇:乙酸:水)(4:1:1)；
0.560(苯-乙醇)(8:2)；
0.476(氯仿:甲醇)(9:1)；
0.813(异丙醇:甲酸:水)(20:5:1)；
0.297(丙酮-苯-乙酸)(50:100:1).
II.H-Lys(Boc)-Pro-OH的生产。
将300ml无水甲醇、2ml乙酸和钯黑添加到9.68g(20.26mmol)Z-Lys(Boc)-Pro-OH，并在室温下在1atm下在干燥氢蒸汽中进行氢化8小时。然后，过滤掉催化剂并在过滤器用甲醇洗涤。蒸发收集的滤液至干燥。用醚从无水甲醇沉淀残渣。然后，在真空下将其干燥，同时更换干燥剂若干次。产量：6.38g(18.58mmol)；(91.87％)
熔点98-99℃
Rf-0.110(氯仿-甲醇-乙酸)(42:7:1)；
0.166(丁醇:乙酸:水)(4:1:1)；
0.235(氯仿:甲醇:氨)(8:1.75:0.25)；
0.494(异丙醇:甲酸:水)(20:5:1)(2:1:1)。
III.Boc-Thr-Lys-(Boc)-Pro-OH的生产。
将13％TBA的溶液(39.4ml)添加到18.58mmol(6.38g)Lys(Boc)-Pro-OH并用乙醇蒸发2次，用乙醇/苯混合物蒸发2次并用苯蒸发2次。添加250ml无水乙酸乙酯；将反应混合物冷却降至0℃，并添加9.2mmol(3.74g)之前合成的Boc-Thr-OPfp，并在磁性搅拌器上搅拌1小时。蒸发反应物质，并添加40ml水至蒸发残渣。用80ml醚洗涤水溶液3次。用醚洗涤后，用18.58mmol(3.95g)柠檬酸酸化水溶液至pH 3。酸化后，用乙酸乙酯以40ml等分提取水溶液3次。提取后收集的乙酸乙酯用20ml水洗涤3次，用20ml 10％的KHSO4溶液洗涤3次，并用20ml水洗涤3次。经MgSO4干燥乙酸乙酯溶液。
然后，将其过滤并在旋转蒸发器上蒸发。用己烷从乙酸乙酯沉淀所得物质。倾析己烷，并在真空下在干燥器中经KOH、P2O5和链烷烃干燥所得物质，同时更换干燥剂若干次。
产量：3.32g(6.1mmol)；(66.26％)熔点105-107℃
Rf-0.297(丙酮-苯-乙酸)(50:100:1)；
0.234(氯仿:甲醇)(9:1)；0.560(苯-乙醇)(8:2).
IV.Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro-Phe-OH的生产。
1.Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro-OSu的生产。
将3.53mmol(0.38g)羟基琥珀酰亚胺添加到1.66g(3.05mmol)在50ml无水乙酸乙酯中的Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro，将所得溶液冷却降至0℃，同时在磁性搅拌器上搅拌；然后，添加0.76g(3.53mmol)DCC(二环己基碳二亚胺)并在磁性搅拌器上在室温下搅拌2小时。反应停止后，过滤掉所得反应混合物并丢弃沉淀物。添加200ml无水乙酸乙酯至所得溶液。用20mlNaCl的饱和溶液洗涤收集的乙酸乙酯2次，用20ml 10％的KHSO4溶液洗涤两次，用20mlNaCl的饱和溶液洗涤2次，用20ml 5％NaHCO3洗涤2次，并用20ml NaCl的饱和溶液洗涤2次。经MgSO4干燥乙酸乙酯溶液。然后，将其在旋转蒸发器上过滤和蒸发。用醚和己烷从乙酸乙酯沉淀所得物质。在真空下经KOH、P2O5和链烷烃过滤和干燥沉淀物，同时更换干燥剂若干次。
产量：1.52g(2.37mmol)77.74％.
Rf-0.560(苯-乙醇)(8:2)；0.457(氯仿：甲醇)(9:1)。
2.制备之后，将1.52g(2.37mmol)Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro-OSu溶解于25ml二甲基甲酰胺并添加到包含在25ml二甲基甲酰胺中的0.392g(2.37mmol)L-Phe的制备液。在磁性搅拌器上在室温下搅拌溶液。在旋转蒸发器上蒸发反应混合物并用醚从苯沉淀。过滤沉淀物并在真空下经P2O5/KOH和链烷烃干燥，同时更换干燥剂若干次。
产量：1.03g(1.64mmol)69.0％。
Rf-0.063(异丙醇:甲酸:水)(20:5:1)(2:1:1)。
0.745(氯仿:甲醇:氨)(8:1.75:0.25)；
V.H-Thr-Lys-Pro-Phe-OH的生产。
将1.03g(1.64mmol)Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro-Phe-OH添加到8.2mL二氯甲烷和8.2ml TFA，然后在室温下温育混合物45分钟，并在除去保护基团后，用无水甲醇蒸发溶液2次，用苯蒸发2次，并用醚蒸发2次。用醚从甲醇将其沉淀。在真空下经P2O5、KOH和链烷烃干燥残渣。将所得沉淀物溶解于5ml 30％乙醇，并施加到Amberlyst A-21(AcO-形式)柱用于乙酸盐/盐酸盐交换。用100ml 30％乙醇洗脱肽，在真空下蒸发至干燥，并用无水醚从无水甲醇沉淀。过滤所得沉淀物，并在真空下经P2O5、KOH和链烷烃在干燥器中干燥，同时更换干燥剂若干次。
产量：0.7g(1.43mmol)(87％)。
熔点129-131℃
Rf:-0.201(丁醇:乙酸:吡啶:水)(30:6:20:24)；
0.156(氯仿:甲醇:氨)(4:4.5:1.5)。
实施例1-7中所述的肽序列的色谱和质谱分析示于表2中。
表2.
注：
*对应于[М+Н]+的分子峰
**在与35eV的氦原子碰撞的能量下在分子离子峰的碎片化中形成的最强离子。
表2示出使用Millichrome A-02微型柱液相色谱系统的高效液相色谱(HPLC)的数据以及使用ThermoElectron LCQ Advantage MAX质谱仪获得的合成肽的特征。
显影色谱条件允许容易地获得色谱均一产物。
肽分析的色谱条件。
色谱：Milichrom-A02
柱：Prontosil 120-5C18aq,2*75mm
洗脱液A：0.2M LiClO4+5mM HClO4
洗脱液B：甲醇。
表3示出合成肽分离的梯度形状。
表3
时间
％В
0
5
16.5
80
流速：150μl/min
波长的设置：210,220,230,240nm
质谱条件
设备：ThermoElectron LCQ Advantage MAX
离子源：电喷射；通过离子碰撞(He)在35eV下分子离子碎片以5μl/min流速直接导入在0.1％乙酸中的浓度为10μg/ml的肽溶液
源温度：250℃.
电离电位3.5kV
实施例8.药效团位置的鉴定。
为了鉴定药效团，合成母肽Selank的片段：Thr-Lys；Thr-Lys-Pro；Pro-Gly-Pro；Arg-Pro-Gly-Pro；Pro-Arg-Pro-Gly-Pro；并使用相关临床前模型(pre-clinical model)(脊柱前凸试验(Lordosis test))在活体内进行效力试验。
我们以100μg/大鼠的剂量研究以下组的肽关于雌性大鼠性行为的效力：Thr-Lys；Thr-Lys-Pro；Pro-Gly-Pro；Arg-Pro-Gly-Pro；Pro-Arg-Pro-Gly-Pro。记录切除卵巢的荷尔蒙刺激的雌性与性欲活跃雄性直接接触，或当这种接触不可能时的性行为。发现在监控期间Thr-Lys-Pro肽使雌性性前接受行为(proceptive behavior)由14±4增加至29±6次行为(p＝0.028，威尔科克森试验(Wilcoxon test))。对雌性中脊柱前凸反应的作用具有相同趋势(p＝0.09)：在Thr-Lys-Pro肽作用下脊柱前凸的数量由0.73±0.12增加至0.97±0.12。这些结果表明在Thr-Lys-Pro肽作用的背景下性动机强化。在充分行为情形中效果是具体明显的。在表4中示出脊柱前凸模型中以下肽的效力研究结果：Thr-Lys；Thr-Lys-Pro；Pro-Gly-Pro；Arg-Pro-Gly-Pro；和Pro-Arg-Pro-Gly-Pro。
表4.
表4证明Thr-Lys-Pro三肽是药效团；此外，如表4的结果所述，较小的序列，即Thr-Lys二肽不起作用。
实施例9.药效团试验
为试验药效团，合成基于此的肽，即，相当于通式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X的Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:5)三肽、Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ ID NO:4)和Thr-Lys-Pro-Phe(SEQ IDNO:2679)四肽、Thr-Lys-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:6)五肽和Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe(SEQ ID NO:7)六肽，使用相关诊断前模型(脊柱前凸试验)在活体内进行效力试验。
我们研究在100μg/大鼠剂量下以下组的肽关于雌性大鼠性行为的效力：Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:5)；Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ ID NO:4)；Thr-Lys-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:6)；和Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe(SEQ ID NO:7)。记录切除卵巢的激素刺激的雌性与性欲活跃雄性直接接触，或当这种接触不可能时的性行为。发现在监控期间来自包括Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:5)、Thr-Lys-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:6)和Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe(SEQ ID NO:7)的组的肽使雌性中性前接受行为的强度由14±4增加至26±4至36±6次行为(p＝0.028，威尔科克森试验)。同时，Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ ID NO:4)和Thr-Lys-Pro-Phe(SEQ ID NO:2679)不影响雌性性前接受行为的强度并且不增加脊柱前凸的数量，且Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ ID NO:4)和Thr-Lys-Pro-Phe(SEQ ID NO:2679)四肽的基本参数保持在阴性对照的水平。对雌性脊柱前凸反应的作用具有相同的趋势(p＝0.09)。在没有与伴侣直接接触时，肽作用明显。结果表明在Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:5)、Thr-Lys-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:6)、Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe(SEQ ID NO:7)肽作用的背景下性动机强化并且在Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ ID NO:4)和Thr-Lys-Pro-Phe(SEQ ID NO:2679)四肽中缺少性动机效果。在充分行为情形中效果是具体和明显的。在表5中示出脊柱前凸模型中以下肽的效力研究结果：Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:5)；Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ ID NO:4)；Thr-Lys-Pro-Phe(SEQ ID NO:2679)；Thr-Lys-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:6)；Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe(SEQ ID NO:7)。
表5.
产业上的可利用性
本发明涉及生物化学领域，特别地，涉及显示高活性并能够刺激发生紊乱的器官自我愈合的肽的生产方法。特别地，本发明扩大了用于刺激性功能和治疗性功能障碍的工具范围，同时减少了疗程持续时间和药疗法的成本。