肽及其用作抗病毒剂的用途
阅读说明：本技术 肽及其用作抗病毒剂的用途 (Peptides and their use as antiviral agents ) 是由 ***·拉吉克·***·*** 于 2017-05-26 设计创作，主要内容包括：本文公开了具有抗病毒特性的肽。所述肽包括右旋糖(D)或右旋/左旋(L)氨基酸的混合物,具有针对多种类型的包膜病毒和基质蛋白层病毒的抗病毒特性,可用作治疗或预防包膜病毒和基质蛋白层病毒感染的药物组合物。(Disclosed herein are peptides having antiviral properties. The peptides comprise a mixture of dextrose (D) or D/L (L) amino acids, have antiviral properties against a variety of types of enveloped and matrix protein layer viruses, and are useful as pharmaceutical compositions for treating or preventing infection by enveloped and matrix protein layer viruses.)
技术领域
本发明涉及对多种包膜病毒和基质蛋白层病毒具有广谱抗病毒活性的治疗性肽。
背景技术
包膜病毒和基质蛋白层病毒的病毒性感染仍然是人类的一个严重问题。尽管流感病毒已经吸引了许多研究人员的注意，但是包括但不限于单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒和人类免疫缺陷病毒的其它包膜病毒和基质蛋白层病毒的病毒治疗，仍然是医疗领域亟待解决的重大问题。
呼吸道合胞病毒(RSV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，其包含有包膜、负义单链非RNA基因组1。尽管RSV是重要的儿科病原体之一，但它们可以影响各个年龄段的个体，尤其是老年人和免疫妥协的个体。RSV仅感染人类，并且具有高度传染性。目前，尚无批准的可用于治疗的疗法2。据估计，每年全球约有3400万名5岁以下的儿童被感染，导致约400万例入院患者和10万至20万例死亡。通常，RSV引起上呼吸道感染，但是20-30％的感染儿童表现出下呼吸道感染的症状，如细支气管炎和/或肺炎。RSV感染的症状包括虚弱、易怒、咳嗽、喘息、啰音(crackles)、呼吸急促和食欲不振。诸如心脏病、早产儿慢性肺部疾病、免疫缺陷和免疫抑制等因素会增加并加重疾病的症状。目前的RSV感染的治疗方法主要是针对高风险或极高风险情况下的患者进行预防性使用3。需要更通用的疗法以及感染后疗法。
巨细胞病毒(CMV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，其包含线性双链DNA基因组。该病毒的基因组被核衣壳蛋白包裹，核衣壳蛋白自身被被膜(基质层)和脂质双层包围4,5。CMV感染各个年龄段的人，据报道，到40岁时，大多数人在他们生命中的某个时期感染CMV。通常，CMV感染不显示任何症状，但是免疫系统较弱的人以及先天性感染的婴幼儿更容易出现严重的并发症6,7。CMV感染的症状从无症状、发烧、疲倦到严重症状不等，严重症状可能会损坏内部器官、眼睛和大脑。尽管可以使用一些抗病毒药物，如缬更昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦、膦甲酸或它们的组合治疗视网膜炎，但这些药物可能会引起严重的副作用，并且可能无法治愈感染。需要一种更通用的疗法，以及一种具有较少或较轻副作用的疗法8-10。
单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，其包含线性双链DNA作为基因组。单纯疱疹病毒的基因组被二十面体形的核衣壳蛋白包裹，核衣壳蛋白自身被被膜(基质层)和脂质双层包围5,11。这些病毒通常会引起皮肤、眼睛、嘴唇和生殖器感染。症状包括感染部位的疼痛水疱或溃疡、口腔、生殖器和臀部周围发麻、***肿大、发烧和身体疼痛。单纯疱疹病毒还可能导致免疫妥协个体的脑膜炎和脑炎以及新生儿的新生儿疱疹11。据世界卫生组织最近的估计，全球约有35亿人感染HSV-112,13，约5亿人感染HSV-214。目前将用于单纯疱疹病毒的抗病毒药物，如阿昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦，用于治疗HSV感染，但通常仅在减轻疾病症状方面有效；其无法治愈感染15,16。
人类免疫缺陷病毒(HIV)属于逆转录病毒科(Retroviridae)，其包含两个单链RNA作为其基因组。该病毒的基因组被核衣壳蛋白包裹，核衣壳蛋白自身被与基质蛋白相关的脂质双层包围17。HIV攻击人类免疫系统并导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。由于免疫系统的削弱，艾滋病患者更容易受到无数种可能威胁生命的感染。目前存在治疗HIV感染的疗法，但没有一种能够治愈这种感染18,19。
尽管病毒感染的流行率很高，但诸如本文公开的那些的用于治疗和/或预防包膜病毒感染的批准药物仍然很少。另外，当前的疗法仍然遭受具有次优功效和严重毒性的问题，并且由于较高的治疗成本和耐药菌株的出现而受到阻碍。
制药公司在扩展其产品线方面面临越来越多的挑战，特别是由于诸如蛋白质-蛋白质相互作用的无成药性靶点20。尽管蛋白质-蛋白质相互作用是宿主-病原体相互作用的一部分，但是蛋白质-蛋白质相互作用也在健康细胞的许多细胞功能中也起着至关重要的作用。调节蛋白质-蛋白质相互作用被认为是缓解许多疾病的引人注目的方法，包括抑制病原体的进入或复制21。然而，据报道，小分子通常不能有效地抑制这种相互作用22。尽管单克隆抗体具有高度特异性并有效地抑制或调节这些相互作用，但它们通常缺乏足够的组织或细胞渗透性23。不受理论的束缚，本文认为具有细胞渗透性的大环肽可以作为最佳解决方案。考虑到许多病毒具有高度变异性，因此，靶向蛋白质与蛋白质相互作用的药物应具有足够的灵活性以承受此类突变，由此大环肽可能也是最佳选择。此外，与小分子相比，肽具有许多优势，包括高特异性、选择性、出色的效能，并且其通常具有良好的耐受性24,25。同样，由于其较低的制造复杂性和更好靶点可及性(target accessibility)，与其它大分子如抗体相比，肽可能更受青睐24。不受理论的束缚，本文认为与小分子或巨大分子相比，肽可能具有更多的优势并克服了更多的限制24-30。
已经发现了对流感病毒具有广谱活性的新型肽治疗剂(FPT)31,32。研究了FPT对流感病毒的作用机理。不受理论的束缚，本文认为FPT通过结合并改变流感病毒的基质蛋白(M1)的完整性来发挥其作用。后来发现，流感病毒基质蛋白与HIV、HSV、RSV和CMV具有足够的结构相似性，因此FPT对这些病毒以及其它包膜病毒和基质蛋白层病毒也具有活性。
发明内容
意外地发现，包含序列twftfin的肽对多种包膜病毒和基质蛋白层病毒具有活性。还意外地发现，包含twftfin的序列变体的肽(其中一个或两个其它氨基酸独立地被***、缺失或改变为不同的D-氨基酸、甘氨酸或任何L-氨基酸)也对多种包膜病毒和基质蛋白层病毒具有高活性。本文所述的肽通常表现出比包含全部L-氨基酸序列的肽高许多倍的抗病毒活性，并且显示出对多种包膜病毒和基质蛋白层病毒的广谱活性。
在本发明的一种示例性实施方式中，本文描述了包括右旋氨基酸或右旋/左旋氨基酸的混合物的肽，在本文中也称为FTP。在另一实施方式中，本文描述了具有针对包膜病毒或基质蛋白层病毒的抗病毒特性的肽。在另一实施方式中，本文描述了具有针对多种包膜病毒和基质蛋白层病毒的抗病毒特性的肽。在另一种示例性实施方式中，描述了本文所述的任意一种或多种肽在制备用于治疗或预防包膜病毒和基质蛋白层病毒感染的药物中的用途。在另一种示例性实施方式中，描述了包含本文所述的任意一种或多种肽的药物组合物、剂型和剂量单位，用于治疗或预防包膜病毒和基质蛋白层病毒感染。在另一种示例性实施方式中，本文描述了用于治疗或预防包膜病毒和基质蛋白层病毒感染的方法，其中所述方法包括给药本文所述的任意一种或多种肽，或包含所述肽的药物组合物、剂型、剂量单位和药物。
在另一实施方式中，包膜病毒或基质蛋白层病毒是逆转录病毒、慢病毒、副粘病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、蜱媒脑炎、黄热病、登革热病毒、丝状病毒、披膜病毒、布尼亚病毒、疱疹病毒、hepnavirus、副粘病毒或冠状病毒。在另一实施方式中，包膜病毒或基质蛋白层病毒是单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒或人类免疫缺陷病毒。在另一实施方式中，该病毒是HIV、埃博拉病毒、马尔堡病毒、风疹病毒、汉坦病毒、沙粒病毒(arenavirus)、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或环曲病毒(torovirus)。
在另一实施方式中，感染是AIDS、疱疹或SARS。
在另一实施方式中，本文描述了包含序列tksrfX/xn(式I)的肽。在另一实施方式中，本文描述了包含序列tX/xsrfin(式II)的肽。在另一实施方式中，本文描述了包含序列twX/xrfin(式V)的肽。在另一实施方式中，本文描述了包含序列twfX/xfin(式VI)的肽。在另一实施方式中，本文描述了包含序列X/xwftfin(式VII)的肽。在另一实施方式中，本文描述了包含序列wwftfiX/x(式VIII)的肽。在另一实施方式中，本文描述了包含序列wwftX/xia(式IX)的肽。在另一实施方式中，本文描述了包含序列X/xwftfiX/x(式X)的肽。在前述的每一个序列中，X/x是甘氨酸，或任意D-氨基酸，或任意L-氨基酸。
在另一实施方式中，本文描述的任何肽还包括N端和/或C端半胱氨酸残基。当N端和C端二者都包含半胱氨酸残基时，肽可以是环化的。应当理解，在每种情况下，半胱氨酸残基独立地选自D-半胱氨酸和L-半胱氨酸。
在另一实施方式中，本文描述的任何肽还包括一个或多个溶解度标签。示例性地，溶解度标签被包括在N端和/或C端。应当理解，本文描述的包括N端和/或C端半胱氨酸残基的肽(包括其环衍生物)也可以包括一个或多个溶解度标签。还应理解，在每种情况下，每个溶解度标签是独立选择的。
关于FPT的其它细节在PCT国际申请序列号PCT/IB2016/057146中公开，其全部公开内容通过引用并入本文。
在另一实施方式中，描述了本文描述的肽的类似物和衍生物。应当理解，本文所述的类似物和衍生物不包括PCT国际公开号WO 2009/151313中公开的肽。在另一实施方式中，本文描述的肽不包括PCT国际公开号WO 2009/151313中公开的任何序列。
如本文所用，术语分离的肽通常是指体外的肽和/或本体形式的肽(peptide inbulk form)。应当理解，分离的肽可以是与其它化合物的混合物形式，和/或是溶液或悬浮液形式。
通常使用每个氨基酸的常规单字母代码列出本文所述的肽的序列。大写字母的代码对应于氨基酸的左旋形式，而小写字母的代码对应于氨基酸的右旋形式。例如，单个字母代码“A”表示L-丙氨酸，而单个字母代码“a”表示D-丙氨酸；“R”表示L-精氨酸，而“r”表示D-精氨酸，等等。
在另一实施方式中，本文描述了一种分离的肽，其包含序列A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7，其中A1是t或w，A2是k或w，A3是s或f，A4是r或t，A5是h、i、n或w，A6是i或d，A7是n或a，并且A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个或两个任选地被另一D-氨基酸、甘氨酸或任意L-氨基酸替代。在一个变化例中，本文描述了其中A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的一个或两个被相应的L-氨基酸替代的肽。
在另一实施方式中，本文描述了一种分离的肽，其包含序列A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7，其中A1是t或w，A2是k或w，A3是s或f，A4是r或t，A5是h、i、n或w，A6是i或d，A7是n或a，并且其中A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个任选地被另一D-氨基酸、甘氨酸或任意L-氨基酸替代。在一个变化例中，本文描述了其中A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7之一被相应的L-氨基酸替代的肽。
在另一实施方式中，本文描述了分离的抗病毒肽，其包含选自以下的序列：twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn、twftfiX/x和X/xwftfiX/x。
在另一实施方式中，本文描述了分离的抗病毒肽，其包含选自以下的序列：twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn、twftfiX/x和X/xwftfiX/x，在每个序列中一个另外的氨基酸被***、缺失或改变为不同的D-氨基酸、甘氨酸或任意L-氨基酸。
在另一实施方式中，本文描述了分离的抗病毒肽，其包含选自PSP IV A17、PSP VA19和PSP VI A1的序列。
在另一实施方式中，本文描述了包含表1-8中任何一个所示的序列的肽。应当理解，这些表中保留生物活性的肽的功能性变体也在本文所述的本发明的范围内。
附图说明
图1：在体外H-RRKKcwwftfiac-OH(PSP VI A1)抗RSV A2的作用。通过对Hep-2细胞的CPE测定确定肽抑制RSV A2复制的能力。实验一式三份，并在DMSO或递增浓度的测试化合物的情况下进行。
图2：在体外H-RRKKcwwftfiac-OH(PSP IV A17)抗RSV A2的作用。通过对Hep-2细胞的CPE测定确定肽抑制RSV A2复制的能力。实验一式三份，并在DMSO或递增浓度的测试化合物的情况下进行。
图3：在体外PSP VI A1抗HSV-2的作用。通过对Vero细胞的CPE测定确定肽抑制HSV复制的能力。实验一式三份，并在DMSO或递增浓度的测试化合物的情况下进行。
图4：在体外PSP IV A17抗HSV-2的作用。通过对Vero细胞的CPE测定确定肽抑制HSV复制的能力。实验一式三份，并在DMSO或递增浓度的测试化合物的情况下进行。
图5：在体外PSP VI A1抗CMV的作用。通过对HFFF-2细胞的CPE测定确定肽抑制CMV复制的能力。实验一式三份，并在DMSO或递增浓度的测试化合物的情况下进行。
图6：在体外PSP IV A17抗CMV的作用。通过对HFFF-2细胞的CPE测定确定肽抑制CMV复制的能力。实验一式三份，并在DMSO或递增浓度的测试化合物的情况下进行。
图7：在体外PSP VI A1抗HIV-1 92UG029的作用。通过对PBMC的逆转录酶测定确定肽抑制HIV复制的能力。实验是在DMSO或递增浓度的肽的情况下进行。结果表示为三次测量的平均值。
图8：在体外H-cwwftfinc-OH(PSP V A19-C)抗HIV-1 92UG029的作用。通过对PBMC的逆转录酶测定法确定了肽抑制HIV复制的能力。实验是在DMSO或递增浓度的肽的情况下进行。结果表示为三次测量的平均值。
图9：在体外H-RRKKtwftfin-OH(PSP IV A17-LS)抗HIV-1 92UG029的作用。通过对PBMC的逆转录酶测定确定肽抑制HIV复制的能力。实验是在DMSO或递增浓度的肽的情况下进行。结果表示为三次测量的平均值。
图10：抗病毒肽在人肝细胞中的细胞毒性作用。抗病毒肽H-RRKKctwdrfinc-OH(PSP III B3)、H-RRKKctwfrfinc-OH(PSP III B5)、H-RRKKctwsrfinc-OH(PSP III B16)、H-RRKKctwwrfinc-OH(PSP III B19)、H-RRKKctwyrfinc-OH(PSP III B20)和H-RRKKctwfffinc-OH(PSP IV A5)的细胞毒性作用。在两种不同浓度的人肝细胞HepaRGTM(在细胞培养条件下具有已证明的分化的肝细胞表型细胞)中测试了毒性作用。数据表示为三次测量的平均值±标准偏差。如实施例3所述进行该实验。
图11：抗病毒肽在人肝细胞中的细胞毒性作用。抗病毒肽PSP IV A17、H-RRKKcwwftfinc-OH(PSP V A19)、H-RRKKcmwftfinc-OH(PSP V A11)、PSP VI A1和H-RRKKcwwftfisc-OH(PSP VI A16)的细胞毒性作用。在两种不同浓度的人肝细胞HepaRGTM(在细胞培养条件下具有已证明的分化的肝细胞表型的细胞)中测试了毒性作用。数据表示为三次测量的平均值±标准偏差。如实施例3所述进行该实验。
图12：抗病毒肽PSP V A19对MDCK和A549细胞的细胞毒性作用。抗病毒肽PSP VA19的细胞毒性作用。如实施例4所述，以许多不同的浓度测试上述肽对MDCK和A549细胞的毒性作用，并与未处理的对照进行比较。数据表示为三次测量的平均值±标准偏差。
图13：抗病毒肽PSP VI A1对MDCK和A549细胞的细胞毒性作用。抗病毒肽PSP VIA1的细胞毒性作用。如实施例4所述，以多种不同浓度测试上述肽对MDCK和A549细胞的毒性作用，并与未处理的对照进行比较。数据表示为三次测量的平均值±标准偏差。
图14：30μM浓度下不同抗病毒肽的溶血活性。如实施例5所述，以30μM的浓度测试曲拉通X-100或不同抗病毒肽PSP III B5、PSP IV A17、PSP V A19和PSP VI A1的溶血活性，并与未处理的对照进行比较。
具体实施方式
现在将通过以下示例性实施方式进一步描述本发明。在以下段落中，将更详细地定义本发明的不同的示例性方面。如此定义的每个方面可以与任何其它一个或多个方面结合，除非明确指出为相反情况。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其它一个或多个特征组合。然而，应当理解，本发明不限于被指示为优选或有利的这样一个或多个特征，并且被指示为优选或有利的任何一个或多个特征都不是必要的。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、重组DNA技术、细胞生物学、免疫学和生物信息学的常规技术。文献中对这类技术进行了充分的解释。
在整个本公开中，根据IUPAC/IUB指南，使用标准单字母代码表示氨基酸。在本文列出的序列中，任何序列末端的最左端氨基酸代表氨基末端(任选地用H-表示)，而最右边的氨基酸代表羧基末端(任选地用-OH表示)。除了非手性的甘氨酸以外，在本文中左旋形式的氨基酸用大写字母表示，而右旋形式的氨基酸用小写字母表示。应当理解，除非另有说明，否则提及L-氨基酸时包括甘氨酸。
本发明涉及具有抗病毒活性的肽。另外，本发明涉及对多于一种的包膜或基质蛋白层病毒具有抗病毒活性的肽。另外，本发明涉及对多于一种的包膜或基质蛋白层病毒亚型具有抗病毒活性的肽。另外，本发明涉及包含本文所述的肽的药物组合物，以及使用本文所述的肽预防和/或治疗病毒感染的方法。
通过以下项目描述本发明的示例性实施方式：
一种序列为twftfin或包含序列twftfin的分离的肽。
一种序列为twftfin的类似物或衍生物或包含twftfin的类似物或衍生物的序列的分离的肽。
一种序列为A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7或包含序列A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7的分离的肽，其中，A1是t或w，A2是k或w，A3是s或f，A4是r或t，A5是f、h、i、n或w，A6是i或d，A7是n或a，并且其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个或任意两个任选地被另一D-氨基酸或L-氨基酸替代。
一种序列为A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7或包含序列A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7的分离的肽，其中，A1是t或w，A2是k或w，A3是s或f，A4是r或t，A5是h、i、n或w，A6是i或d，A7是n或a，并且其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个或任意两个任选地被另一D-氨基酸或L-氨基酸替代。
如前一项目所述的肽，其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的一个或两个被相应的L-氨基酸替代。
一种序列为A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7或包含序列A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7的分离的肽，其中，A1是t或w，A2是k或w，A3是s或f，A4是r或t，A5是i或w，A6是i或d，A7是n或a，并且其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个或任意两个任选地被另一D-氨基酸或L-氨基酸替代。
如前一项目所述的肽，其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的一个或两个被相应的L-氨基酸替代。
如前述任一项目所述的肽，其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个被另一D-氨基酸或L-氨基酸替代。
如前一项目所述的肽，其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的一个被相应的L-氨基酸替代。
如前述任一项目所述的肽，其中，A1是t。
如前述任一项目所述的肽，其中，A1-A2是tk或tw。
如前述任一项目所述的肽，其中，A2-A3是ks或wf。
如前述任一项目所述的肽，其中，A1-A2-A3是tks或twf。
如前述任一项目所述的肽，其中，A3-A4是sr或ft。
如前述任一项目所述的肽，其中，A2-A3-A4是ksr或wft。
如前述任一项目所述的肽，其中，A4是r或t。
如前述任一项目所述的肽，其中，A5是f、h、i、n或w。
如前述任一项目所述的肽，其中，A5是h、i、n或w。
如前述任一项目所述的肽，其中，A5是i或w。
如前述任一项目所述的肽，其中，A5是f。
如前述任一项目所述的肽，其中，A1-A2是ww。
如前述任一项目所述的肽，其中，A6-A7是ia。
如前述任一项目所述的肽，其中，A4是r或t，并且A6是i。
如前述任一项目所述的肽，其中，A6-A7是in。
如前述任一项目所述的肽，其中，A7是n。
如前述任一项目所述的肽，其包含tksrfX/xn，其中，X/x是i、l或y。
如前述任一项目所述的肽，其包含twfX/xfin，其中，X/x是i、l、m、r、s、t、v或w。
如前述任一项目所述的肽，其包含twX/xrfin，其中，X/x是a、c、e、f、G、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y。
如前述任一项目所述的肽，其包含tX/xsrfin，其中，X/x是p、r、s或w。
如前述任一项目所述的肽，其包含X/xwftfin，其中，X/x是m或w。
如前述任一项目所述的肽，其包含wwftX/xia，其中，X/x是h、i、n或w。
如前述任一项目所述的肽，其包含wwftX/xia，其中，X/x是i或w。
如前述任一项目所述的肽，其包含选自以下的序列：tksrfX/xn、tX/xsrfin、twX/xrfin、twfX/xfin、X/xwftfin、wwftfiX/x、wwftX/xia和tksrfdn或其衍生物，其中X/x是甘氨酸，或任意D-氨基酸，或任意L-氨基酸。
如前述任一项目所述的肽，其包含选自以下的序列：twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn、twftfiX/x和X/xwftfiX/x，其中X/x是甘氨酸，或任意D-氨基酸，或任意L-氨基酸。
如前述任一项目所述的肽，其包含选自以下的序列：twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn、twftfiX/x和X/xwftfiX/x，其中X/x是甘氨酸，或任意D-氨基酸，或任意L-氨基酸，并且其中，在每个序列中，一个其它氨基酸被***、缺失或改变为不同的D-氨基酸、甘氨酸或任何L-氨基酸一个氨基酸。
如前述任一项目所述的肽，其包含选自以下的序列：PSP IV A17、PSP V A19和PSPVI A1。
如前述任一项目所述的肽，其包含序列tksrfX/xn(式I)。
如前述任一项目所述的肽，其包含序列tX/xsrfin(式II)。
如前述任一项目所述的肽，其包含序列twX/xrfin(式V)。
如前述任一项目所述的肽，其包含序列twfX/xfin(式VI)。
如前述任一项目所述的肽，其包含序列X/xwftfin(式VII)。
如前述任一项目所述的肽，其包含序列wwftfiX/x(式VIII)。
如前述任一项目所述的肽，其包含序列wwftX/xia(式IX)。
如前述任一项目所述的肽，其包含序列X/xwftfiX/x(式X)。
如前述任一项目所述的肽，其还包含N端和/或C端半胱氨酸残基。
如前述任一项目所述的肽，其为环状。
如前述任一项目所述的肽，其还包括一个或多个溶解度标签，每个溶解度标签独立地选择。
如前述任一项目所述的肽，溶解度标签在N端和/或C端。
如前述任一项目所述的肽，溶解度标签选自RRKK和rrkk。
如前述或以下项目中任一项所述的肽，其中，所述肽具有针对逆转录病毒、慢病毒、副粘病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、蜱媒脑炎、黄热病、登革热病毒、丝状病毒、披膜病毒、布尼亚病毒、疱疹病毒、hepnavirus、副粘病毒或冠状病毒的抗病毒活性。
如前述或以下项目中任一项所述的肽，其中，所述肽具有针对单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒或人类免疫缺陷病毒的抗病毒活性。
如前述或以下项目中任一项所述的肽，其中，所述肽具有针对HIV、埃博拉病毒、马尔堡病毒、风疹病毒、汉坦病毒、沙粒病毒、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或环曲病毒的抗病毒活性。
如前述或以下项目中任一项所述的肽，其中，感染是AIDS、疱疹或SARS。
如前述或以下项目中任一项所述的肽，其中，所述肽具有针对单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒和/或人类免疫缺陷病毒的抗病毒活性。
如前述或以下项目中任一项所述的肽，其中，其针对病毒的IC50小于100μM。
如前述任一项目所述的肽，其中，X/x选自任何蛋白原氨基酸。
如前述任一项目所述的肽，其中，X/x选自任何蛋白原氨基酸的D-异构体。
如前述任一项目所述的肽，其选自ctksrfX/xnc、rrkkctX/xsrfinc、RRKKctwX/xrfinc、RRKKctwfX/xfinc、RRKKcX/xwftfinc、RRKKcwwftfiX/xc、RRKKcwwftX/xiac和ctksrfdnc。
如前述任一项目所述的肽，其中，x选自a、c、d、e、f、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w、y或G。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽包括序列RRKKctwX/xrfinc，或者选自RRKKctwarfinc、RRKKctwcrfinc、RRKKctwdrfinc、RRKKctwerfinc、RRKKctwfrfinc、RRKKctwGrfinc,RRKKctwhrfinc、RRKKctwirfinc、RRKKctwkrfinc、RRKKctwlrfinc、RRKKctwmrfinc,RRKKctwnrfinc、RRKKctwprfinc、RRKKctwqrfinc、RRKKctwrrfinc、RRKKctwsrfinc、RRKKctwtrfinc,RRKKctwvrfinc、RRKKctwwrfinc或RRKKctwyrfinc。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽包括序列RRKKctwfX/xfinc，或者选自RRKKctwfafinc、RRKKctwfcfinc、RRKKctwfdfinc、RRKKctwfefinc、RRKKctwfffinc、RRKKctwfGfinc、RRKKctwfhfinc、RRKKctwfifinc、RRKKctwfkfinc、RRKKctwflfinc、RRKKctwfmfinc、RRKKctwfnfinc、RRKKctwfpfinc、RRKKctwfqfinc、RRKKctwfrfinc、RRKKctwfsfinc、RRKKctwftfinc、RRKKctwfvfinc、RRKKctwfwfinc和RRKKctwfyfinc。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽包括序列RRKKcX/xwftfinc，或者选自RRKKcawftfinc、RRKKccwftfinc、RRKKcdwftfinc、RRKKcewftfinc、RRKKcfwftfinc,RRKKcGwftfinc、RRKKchwftfinc、RRKKciwftfinc、RRKKckwftfinc、RRKKclwftfinc、RRKKcmwftfinc、RRKKcnwftfinc、RRKKcpwftfinc、RRKKcqwftfinc、RRKKcrwftfinc、RRKKcswftfinc、RRKKctwftfinc、RRKKcvwftfinc、RRKKcwwftfinc和RRKKcywftfinc。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽包括序列RRKKcwwftfiX/xc，或者选自RRKKcwwftfiac、RRKKcwwftficc、RRKKcwwftfidc、RRKKcwwftfiec、RRKKcwwftfifc、RRKKcwwftfiGc、RRKKcwwftfihc、RRKKcwwftfiic、RRKKcwwftfikc、RRKKcwwftfilc、RRKKcwwftfimc、RRKKcwwftfipc、RRKKcwwftfiqc、RRKKcwwftfirc、RRKKcwwftfisc、RRKKcwwftfitc、RRKKcwwftfivc、RRKKcwwftfiwc和RRKKcwwftfiyc。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽选自ctksrfanc、ctksrfcnc、ctksrfdnc、ctksrfenc、ctksrffnc、ctksrfGnc、ctksrfhnc、ctksrfinc、ctksrfknc、ctksrflnc、ctksrfmnc、ctksrfnnc、ctksrfpnc、ctksrfqnc、ctksrfrnc、ctksrfsnc、ctksrftnc、ctksrfvnc、ctksrfwnc和ctksrfync。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽选自rrkkctasrfinc、rrkkctcsrfinc、rrkkctdsrfinc、rrkkctesrfinc、rrkkctfsrfinc、rrkkctGsrfinc、rrkkcthsrfinc、rrkkctisrfinc、rrkkctksrfinc、rrkkctlsrfinc、rrkkctmsrfinc、rrkkctnsrfinc、rrkkctpsrfinc、rrkkctqsrfinc、rrkkctrsrfinc、rrkkctssrfinc、rrkkcttsrfinc、rrkkctvsrfinc、rrkkctwsrfinc和rrkkctysrfinc.
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽选自RRKKcwwftaiac、RRKKcwwftciac、RRKKcwwftdiac、RRKKcwwfteiac、RRKKcwwftGiac、RRKKcwwfthiac、RRKKcwwftiiac、RRKKcwwftkiac、RRKKcwwftliac、RRKKcwwftmiac、RRKKcwwftniac、RRKKcwwftpiac、RRKKcwwftqiac、RRKKcwwftriac、RRKKcwwftsiac、RRKKcwwftviac、RRKKcwwftwiac和RRKKcwwftyiac。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽包括twfrfin、twfffin、twftfin、wwftfin和wwftfia。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽包括ctwfrfinc、ctwfffinc、ctwftfinc、cwwftfinc和cwwftfiac。
如前述任一项目所述的肽，其中，所述肽选自RRKKctwfrfinc、RRKKctwfffinc、RRKKctwftfinc、RRKKcwwftfinc和RRKKcwwftfiac。
如前述任一项目所述的肽，用于制备药物。
如前述任一项目所述的肽，用作药物。
一种药物组合物，其包含前述任一项目所述的肽。
前述任一项目所述的肽或其药物组合物，其适用于治疗病毒感染。
前述任一项目所述的肽或其药物组合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途。
一种治疗宿主动物中病毒感染的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述任一项目所述的肽或其药物组合物给药于所述宿主动物。
前述任一项目所述的方法，其中，所述肽或药物组合物通过经鼻、经肺、支气管内、口服或肠胃外途径给药。
前述任一项目所述的方法，其中，所述肽或药物组合物被预防性给药。
一种用于检测具有抗病毒活性的肽的方法，其包括制备前述任一项目所述的肽的衍生物并筛选抗病毒活性。
一种试剂盒，其包括前述任一项目所述的肽或其药物组合物，以及所述肽或药物组合物用于治疗病毒感染的说明书。
一种载体，其包含编码前述任一项目所述的肽的核酸。
一种质粒，其包含编码前述任一项目所述的肽的核酸。
一种宿主细胞，其表达前述任一项目所述的肽。
一种组合，其包括前述任一项目所述的肽和第二剂，所述第二剂选自核酸、肽、蛋白质、造影剂、抗体、毒素和小分子。
一种重组文库，其包含前述任一项目所述的肽。
不受理论的束缚，本文还认为本文公开的肽包含破坏病毒脂质包膜以便实现接近在下面的基质蛋白的膜转换基序，其可能在其抗病毒活性中起关键作用。因此，预期本发明的肽结合并抑制任何含脂质包膜的病毒，包括但不限于：披膜病毒科(Togaviridae)，包括风疹病毒；逆转录病毒科，包括慢病毒，诸如HIV；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，诸如汉坦病毒和沙粒病毒；疱疹病毒科，诸如疱疹病毒和巨细胞病毒；Hepnaviridae，诸如乙型肝炎病毒；副粘病毒科，诸如副粘病毒；黄病毒科(Flaviviridae)，诸如黄病毒、丙型肝炎病毒、蜱媒脑炎、黄热病和登革热病毒；丝状病毒科(Filoviridae)，诸如埃博拉病毒和马尔堡病毒；冠状病毒科(Coronaviridae)，诸如冠状病毒，包括SARS病毒和环曲病毒。
twftfin的衍生物包括其中一个或多个氨基酸缺失或被不同氨基酸替代的肽，如表1所示。衍生物还包括具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的肽。衍生物优选包含7个氨基酸，或基本上由7个氨基酸组成，或由7个氨基酸组成。在另一实施方式中，衍生物包含7个氨基酸的核心肽，并且还包含另外的氨基酸，以改善本文所述的各种性质、溶解性或实现环化。核心肽是活性肽，即赋予抗病毒活性的肽。衍生物是功能性的，也就是说，它们具有生物活性并优选针对多于一种的病毒显示抗病毒特性。
如本文所用，术语“肽”是指包括氨基酸残基的聚合物。在示例性实施方式中，所述肽包含2至约100个残基或2至约50个残基。在其它实施方式中，所述肽包含约7至20个残基，例如7至10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个残基。在某些实施方式中，构成肽的氨基酸残基均为“D型”氨基酸残基，然而，应认识到，在各种实施方式中，“L”氨基酸可包括在肽中。因此，在一些实施方式中，本发明的肽是D型和L型氨基酸的混合物。例如，所述肽可以包含7个D-氨基酸的核心，其中一个或多个氨基酸可以是L形式。
肽还包括其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物或D-氨基酸类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。另外，该术语适用于通过肽键或其它“修饰键”(例如，肽键被ɑ-酯、β-酯、硫代酰胺、膦酰胺、氨基甲酸酯、羟基化物等替代)连接的氨基酸。
在某些实施方式中，本发明的肽包含具有7个残基的活性核心肽。另外，该肽可包含另外的残基，包括但不限于可允许肽形成环肽的一个或多个残基和/或可增加如本文所述的肽的溶解度的一个或多个残基。
本文所述的肽可以是天然存在的或非天然存在的。其可以a)通过化学合成产生，b)通过重组DNA技术产生，c)通过较大分子的生物化学或酶促裂解产生，d)通过上述从a到d列出的任何方法的组合产生，e)通过任何其它产生肽的方法产生。在另一实施方式中，所述肽是非天然存在的。在另一实施方式中，所述肽包含非天然存在的修饰。本文描述了这种修饰的示例。
表1：示例性twftfin衍生物家族；为了清楚起见，显示了N和C端。
在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自tksrfX/xn、tX/xsrfin、twX/xrfin、twfX/xfin、X/xwftfin、wwftfiX/x、wwftX/xia和tksrfdn的序列，基本由其组成，或由其组成。在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自tksrfX/xn、tX/xsrfin、twX/xrfin、twfX/xfin、X/xwftfin、wwftfiX/x和wwftX/xia的序列，或基本由其组成，或由其组成。
在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn、twftfiX/x和X/xwftfiX/x的序列，或基本由其组成，或由其组成，其中X/x是甘氨酸，或任何D-氨基酸，或任何L-氨基酸。
在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn、twftfiX/x和X/xwftfiX/x的序列，或基本由其组成，或由其组成，其中X/x是甘氨酸，或任意D-氨基酸，或任意L-氨基酸，并且其中，在每个序列中一个另外的氨基酸被***、缺失或改变为不同的D-氨基酸、甘氨酸或任意L-氨基酸一个氨基酸。
在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自ctksrfX/xnc、ctX/xsrfinc、ctwX/xrfinc、ctwfX/xfinc、cX/xwftfinc、cwwftfiX/xc、cwwftX/xiac和ctksrfdnc的序列，或基本由其组成，或由其组成。在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自ctksrfX/xnc、ctX/xsrfinc、ctwX/xrfinc、ctwfX/xfinc、cX/xwftfinc、cwwftfiX/xc和cwwftX/xiac的序列，或基本由其组成，或由其组成。
在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自RRKKctksrfX/xnc、RRKKctX/xsrfinc、RRKKctwX/xrfinc、RRKKctwfX/xfinc、RRKKcX/xwftfinc、RRKKcwwftfiX/xc、RRKKcwwftX/xiac和RRKKctksrfdnc的序列，或基本由其组成，或由其组成。在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自RRKKctksrfX/xnc、RRKKctX/xsrfinc、RRKKctwX/xrfinc、RRKKctwfX/xfinc、RRKKcX/xwftfinc、RRKKcwwftfiX/xc和RRKKcwwftX/xiac的序列，或基本由其组成，或由其组成。
在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自rrkkctksrfX/xnc、rrkkctX/xsrfinc、rrkkctwX/xrfinc、rrkkctwfX/xfinc、rrkkcX/xwftfinc、rrkkcwwftfiX/xc、rrkkcwwftX/xiac和rrkkctksrfdnc的序列，或基本由其组成，或由其组成。在另一实施方式中，描述了一种抗病毒肽，其包含选自rrkkctksrfX/xnc、rrkkctX/xsrfinc、rrkkctwX/xrfinc、rrkkctwfX/xfinc、rrkkcX/xwftfinc、rrkkcwwftfiX/xc和rrkkcwwftX/xiac的序列，或基本由其组成，或由其组成。
应当理解，在任何前述实施方式中，D-半胱氨酸可以是L-半胱氨酸。
在本文所述的序列中，氨基酸名称“X/x”表示进行置换的位置，其可以包括任何L-氨基酸或D-氨基酸或任何氨基酸类似物。字母“X/x”表示任何蛋白原氨基酸，即20种天然存在的氨基酸中的任何一种。除了非手性的G以外，X表示L形式的氨基酸，x表示D形式的氨基酸。在另一实施方式中，X/x为x，即D形式的氨基酸，或X，即L形式的氨基酸。在另一实施方式中，x选自D形式的以下氨基酸：a、c、d、e、f、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y。在另一实施方式中，X选自L形式的以下氨基酸：A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在另一实施方式中，X是甘氨酸。
在另一实施方式中，所述肽的IC50小于100μM，或小于50μM，或小于10μM，或小于5μM，或小于1μM，或小于0.1μM。在另一实施方式中，所述肽显示出对至少一种病毒和/或至少一种病毒亚型、优选至少两种病毒和/或至少两种病毒亚型的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的抑制。优选地，抑制为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高，或至少75％、80％、90％、95％或更高。
在另一实施方式中，所述肽具有针对优选2、3、4或更多种病毒和/或病毒亚型的抗病毒活性，例如在MDCK细胞上的噬斑减少测定中使用例如0.01μM至100μM的肽测量的。在另一实施方式中，所述肽显示出对至少两种病毒亚型的至少75％、80％、90％或95％的抑制。
在另一实施方式中，本发明的肽包含一个或多个溶解性标签。在一种示例性的实施方式中，溶解性标签是由带电荷的氨基酸组成的短肽，当其共价连接疏水性肽的N-末端或C-末端时，其将增加连接的肽的溶解性。例如，溶解性标签可以包含选自D、E、H、K、N、Q、R、S、T、羟基脯氨酸和焦谷氨酸的一种或多种氨基酸，因为这些氨基酸具有亲水性。这些氨基酸可以是左旋形式或右旋形式。在N末端或C末端以任何组合或重复添加任何这些氨基酸，特别是E/D/R/K，可用于增加肽的溶解性。还可通过添加二肽EE、三肽SGS和/或通过高糖基化和PEG化或本领域已知的增加溶解性的其它方法来增加溶解性。
例如，溶解性标签可以包含与肽的N端和/或C端的溶解性标签RRKK(以左旋形式RRKK或右旋形式rrkk)，或由其组成。
本发明的肽可以是线性或环状形式。在另一实施方式中，本发明的肽为环状形式。可以例如通过在半胱氨酸残基之间(或更一般地，在多肽中存在的至少两个半胱氨酸残基(例如，在末端区域)中的两个之间)形成二硫键来使肽环化。应当理解，每个半胱氨酸残基独立地是D-半胱氨酸或L-半胱氨酸。例如，可以添加至少两个半胱氨酸残基，其中一个或两个都任选地在肽的C-端或N-端。因此，抗病毒肽及其衍生物可以用其末端半胱氨酸残基通过二硫键而环化。如本文所示，肽的线性形式(即没有任何环化)显示抗病毒特性。还应理解，在肽含有三个或多个半胱氨酸残基的情况下，可以修饰一个或多个残基，以防止该残基参与二硫键的形成。这可以方便地通过用乙酰氨基甲基保护半胱氨酸的巯基以形成半胱氨酸类似物乙酰氨基甲基-半胱氨酸(Cys(Acm))来实现。在本发明的肽的背景下，这可以用内部半胱氨酸残基完成。修饰可以在合成期间进行(即，修饰的残基用于合成)，或者可以在合成后进行。
已经描述了从线性前体制备环状多肽的策略，并且可以与本发明的肽一起使用。例如，方法包括化学交联、化学分子内连接方法和酶促分子内连接方法，其允许线性合成肽在水性条件下被有效地环化。
在另一实施方式中，本文描述了环状形式且包含溶解性标签的肽，例如RRKK(左旋或右旋形式)。
在另一实施方式中，所述肽选自ctksrfX/xnc、rrkkctX/xsrfinc、RRKKctwX/xrfinc、RRKKctwfX/xfinc、RRKKcX/wftfinc或RRKKcwwftfiX/xc、RRKKcwwftX/xiac，或ctksrfdnc。
在另一实施方式中，本发明的肽包含通用序列twX/xrfin(式V)，其中X/x是a、c、d、e、f、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y。所述肽可在N和C端包含半胱氨酸残基用于环化和/或包含溶解性标签。在另一实施方式中，所述肽选自RRKKctwarfinc、RRKKctwcrfinc、RRKKctwdrfinc、RRKKctwerfinc、RRKKctwfrfinc、RRKKctwGrfinc、RRKKctwhrfinc、RRKKctwirfinc、RRKKctwkrfinc、RRKKctwlrfinc、RRKKctwmrfinc、RRKKctwnrfinc、RRKKctwprfinc、RRKKctwqrfinc、RRKKctwrrfinc、RRKKctwsrfinc、RRKKctwtrfinc、RRKKctwvrfinc、RRKKctwwrfinc或RRKKctwyrfinc。溶解性标签为D形式(rrkk)的如上所述的肽也在本发明的范围内。没有任何环化的这些肽的功能衍生物，也在本发明的范围内。
表2：示例性肽
在另一实施方式中，本发明的肽包含通用序列twfX/xfin(式VI)，其中X/x是a、c、d、e、f、G、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y。所述肽可在N和C端包含半胱氨酸残基用于环化和/或包含溶解性标签。在另一实施方式中，所述肽选自RRKKctwfafinc、RRKKctwfcfinc、RRKKctwfdfinc、RRKKctwfefinc、RRKKctwfffinc、RRKKctwfGfinc、RRKKctwfhfinc、RRKKctwfifinc、RRKKctwfkfinc、RRKKctwflfinc、RRKKctwfmfinc、RRKKctwfnfinc、RRKKctwfpfinc、RRKKctwfqfinc、RRKKctwfrfinc、RRKKctwfsfinc、RRKKctwftfinc、RRKKctwfvfinc、RRKKctwfwfinc和RRKKctwfyfinc。溶解性标签为D形式(rrkk)的如上所述的肽也在本发明的范围内。没有任何环化的这些肽的功能衍生物，也在本发明的范围内。
表3：示例性肽
在另一实施方式中，本发明的肽包含通用序列X/xwftfin(式VII)，其中X/x是a、c、d、e、f、G、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y。所述肽可在N和C端包含半胱氨酸残基用于环化和/或包含溶解性标签。在另一实施方式中，所述肽选自RRKKcawftfinc、RRKKccwftfinc、RRKKcdwftfinc、RRKKcewftfinc、RRKKcfwftfinc、RRKKcGwftfinc、RRKKchwftfinc、RRKKciwftfinc、RRKKckwftfinc、RRKKclwftfinc、RRKKcmwftfinc、RRKKcnwftfinc、RRKKcpwftfinc、RRKKcqwftfinc、RRKKcrwftfinc、RRKKcswftfinc、RRKKctwftfinc、RRKKcvwftfinc、RRKKcwwftfinc和RRKKcywftfinc。溶解性标签为D形式(rrkk)的如上所述的肽也在本发明的范围内。没有任何环化的这些肽的功能衍生物，也在本发明的范围内。
表4：示例性肽
在另一实施方式中，本发明的肽包含通用序列wwftfiX/x(式VIII)，其中X/x是a、c、d、e、f、G、h、i、k、l、m、p、q、r、s、t、v、w或y。所述肽可在N和C端包含半胱氨酸残基用于环化和/或包含溶解性标签。在另一实施方式中，所述肽选自RRKKcwwftfiac、RRKKcwwftficc、RRKKcwwftfidc、RRKKcwwftfiec、RRKKcwwftfifc、RRKKcwwftfiGc、RRKKcwwftfihc、RRKKcwwftfiic、RRKKcwwftfikc、RRKKcwwftfilc、RRKKcwwftfimc、RRKKcwwftfipc、RRKKcwwftfiqc、RRKKcwwftfirc、RRKKcwwftfisc、RRKKcwwftfitc、RRKKcwwftfivc、RRKKcwwftfiwc、RRKKcwwftfiyc。溶解性标签为D形式(rrkk)的如上所述的肽也在本发明的范围内。没有任何环化的这些肽的功能衍生物，也在本发明的范围内。
表5：示例性肽
在另一实施方式中，本发明的肽包含通用序列tksrfX/xn(式I)，其中X/x是a、c、d、e、f、G、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y。所述肽可在N和C端包含半胱氨酸残基用于环化和/或包含溶解性标签。在另一实施方式中，所述肽选自ctksrfanc、ctksrfcnc、ctksrfdnc、ctksrfenc、ctksrffnc、ctksrfGnc、ctksrfhnc、ctksrfinc、ctksrfknc、ctksrflnc、ctksrfmnc、ctksrfnnc、ctksrfpnc、ctksrfqnc、ctksrfrnc、ctksrfsnc、ctksrftnc、ctksrfvnc、ctksrfwnc和ctksrfync。溶解性标签为L形式(RRKK)或D形式(rrkk)的如上所述的肽也在本发明的范围内。没有任何环化的这些肽的功能衍生物，也在本发明的范围内。
表6：示例性肽
在另一实施方式中，本发明的肽包含通用序列tX/xsrfin(式II)，其中X/x是a、c、d、e、f、G、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y。所述肽可在N和C端包含半胱氨酸残基用于环化和/或包含溶解性标签。在另一实施方式中，所述肽选自rrkkctasrfinc、rrkkctcsrfinc、rrkkctdsrfinc、rrkkctesrfinc、rrkkctfsrfinc、rrkkctGsrfinc、rrkkcthsrfinc、rrkkctisrfinc、rrkkctksrfinc、rrkkctlsrfinc、rrkkctmsrfinc、rrkkctnsrfinc、rrkkctpsrfinc、rrkkctqsrfinc、rrkkctrsrfinc、rrkkctssrfinc、rrkkcttsrfinc、rrkkctvsrfinc、rrkkctwsrfinc和rrkkctysrfinc。溶解性标签为L形式(RRKK)的如上所述的肽也在本发明的范围内。没有任何环化的这些肽的功能衍生物，也在本发明的范围内。
表7：示例性肽
在另一实施方式中，本发明的肽包含通用序列wwftX/xia(式IX)，其中X/x是a、c、d、e、G、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、v、w或y。所述肽可在N和C端包含半胱氨酸残基用于环化和/或包含溶解性标签。在另一实施方式中，所述肽选自RRKKcwwftaiac、RRKKcwwftciac、RRKKcwwftdiac、RRKKcwwfteiac、RRKKcwwftGiac、RRKKcwwfthiac、RRKKcwwftiiac、RRKKcwwftkiac、RRKKcwwftliac、RRKKcwwftmiac、RRKKcwwftniac、RRKKcwwftpiac、RRKKcwwftqiac、RRKKcwwftriac、RRKKcwwftsiac、RRKKcwwftviac、RRKKcwwftwiac和RRKKcwwftyiac。溶解性标签为D形式(rrkk)的如上所述的肽也在本发明的范围内。没有任何环化的这些肽的功能衍生物，也在本发明的范围内。
表8：示例性肽
在另一实施方式中，本文所述的肽对感染人类的至少一种、优选多于一种的病毒具有抗病毒活性。在另一实施方式中，本文所述的肽对多于一种病毒亚型(所述优选感染人类的亚型)具有抗病毒活性。例如，可以使用本文所述的肽治疗由HIV、RSV、HSV和CMV的各种亚型包括但不限于RSV A2、HSV-2、CMV AD 169、HIV-1 92UG029等引起的感染。在另一实施方式中，该病毒不是流感病毒或正粘病毒。
特征肽及其生物活性变体可以多种方式修饰。例如，可以将包括额外的氨基酸残基、其它取代基和保护基团的试剂添加至氨基末端、羧基末端或两者。例如，如上所述，可以修饰肽以包括半胱氨酸残基或可以参与二硫键形成的其它含硫残基或试剂。
本发明的肽还可以在任何位置(一个或多个)和/或N-端和/或C-端包含一个或多个修饰的氨基酸，以增加溶解度、稳定性、反应性或改善其它性质。这些修饰包括向氨基末端和/或叔丁氧羰基添加化学基团，例如但不限于乙酰基、苄氧羰基、丹磺酰基、叔丁氧羰基、9-芴基甲氧羰基或亲水基团，或向羧基末端添加酰胺基团或对硝基苄基酯基团或亲水基团。它们还可以包含修饰的酰胺键，诸如N-甲基化。
在另一实施方式中，本文所述的任何肽均包含一个或多个取代基。例如，所述肽可以在氨基末端、羧基末端和/或反应性氨基酸残基侧链上包含取代基。所述取代基可以是酰基或取代或未取代的胺基团(例如，在N-端的取代基可以是酰基，并且C-端可以被取代或未取代的胺基团(例如具有一个、两个或三个取代基(其可以相同或不同)的氨基)酰胺化)。胺基团可以是低级烷基(例如，具有1-4个碳的烷基)、烯基、炔基或卤代烷基。酰基可以是低级酰基(例如，具有至多四个碳原子的酰基)，特别是乙酰基。取代基可以是非蛋白质聚合物，例如聚醚、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯、聚亚烷基二醇(例如聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)，或PPG-PEG嵌段/无规聚合物)。
非蛋白质聚合物的大小和形状可以变化。例如，以上列出的任何非蛋白质聚合物(例如PEG)可以是线性、分支或梳状的。关于大小，分子量可以变化。例如，PEG的分子量可以为例如约300Da、约1000Da、约2000Da、约3000Da、约4000Da、约5000Da、约6000Da、约7000Da、约8000Da、约9000Da、约10000Da、约11000Da、约12000Da、约13000Da、约14000Da、约15000Da、约20000Da、约30000Da、约40000Da或约50000Da。例如，PEG的分子量可以是在300DA与2000Da之间，300Da与3000Da之间，1000Da与2000Da之间以及1000与3000Da之间的任何值。非蛋白质聚合物(例如PEG)可以通过任意数量的官能团化学物质(例如，羧基化的mPEG、对硝基苯基-PEG、醛-PEG、氨基-PEG、硫醇-PEG、马来酰亚胺-PEG、氨氧基-PEG、肼-PEG、甲苯磺酰基-PEG、碘乙酰胺-PEG、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯-PEG、琥珀酰亚胺基戊二酸酯-PEG、琥珀酰亚胺基羧基戊基-PEG、对硝基苯基碳酸酯-PEG或乙硫醇-PEG)连接至肽。非蛋白质聚合物(例如PEG)可通过任何数量的化学基团与肽连接，所述化学基团包括但不限于氨基末端氨基酸、羧基末端氨基酸、游离胺和游离巯基。
非蛋白质聚合物(例如PEG)可以被官能化(例如单官能活化的线性PEG、同双官能活化的线性PEG、异双官能活化的线性PEG、多臂活化的PEG(例如2臂、4臂、8臂等)，分支状活化PEG和梳状活化PEG)。
为了检测、分离、纯化等目的，本发明的抗病毒肽还可在其末端氨基酸处包含反应性标签。这些标签可包括(但不限于)生物素、组氨酸、GST等。合适的标签在本领域中是已知的。
本发明的肽还可以与脂质(磷脂)或聚乙二醇连接，以增强/改变溶解性、蛋白水解稳定性或其它性质和/或活性。因此，本发明的肽包括这样的脂肽。
如本文所用，本发明的抗病毒肽可包括模拟物或拟肽衍生物，其为能够模拟肽的核心结构的化合物。类似地，应当理解，抗病毒肽可包括一种或多种氨基酸替代物，如等排体或生物等排体。
在另一实施方式中，本发明的抗病毒肽可以是多聚体形式。多聚体可以是二聚体、三聚体或四聚体；优选为二聚体。形成多聚体的单体抗病毒肽可以由相同或不同的肽组成。在优选的实施方式中，形成多聚体的肽是共价连接的。
在另一实施方式中，本发明的抗病毒肽可以不同的物理形式存在。物理形式可以是晶体、无定形或本领域熟知的其它形式。
本专利申请中提供的各种实例证明，具有置换的氨基酸的FPT保留了抗病毒活性，如表1-8中所述的各种序列所示。这样的衍生物在本发明的范围内。在另一实施方式中，本发明的抗病毒肽的氨基酸可以通过保守性置换而置换。保守性置换是指用可以改变一级序列但不会改变功能的替代氨基酸来替代氨基酸。保守氨基酸置换的示例包括：缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；赖氨酸和精氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；甘氨酸和丙氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸以及天冬氨酸和谷氨酸。给定组内的氨基酸可以被相同组中的另一氨基酸保守性置换。
在另一实施方式中，本发明的抗病毒肽的氨基酸可以被非天然或非天然(non-natural or unnatural)氨基酸及其衍生物替代，所述衍生物包括但不限于β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸(Homo-amino acids)、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、N-甲基氨基酸和本领域熟知的其它氨基酸衍生物。
可以使用以下实施例中解释的方法测试本发明的肽或其衍生物的抗病毒活性。
所公开的肽及其衍生物可以通过肽合成中使用的任何常用方法，例如液相或固相合成，或本领域熟知的任何其它方法来合成。
本发明的肽对包括各种类型和/或亚型的病毒表现出广谱的抗病毒活性。所述病毒可以是人或动物来源的，例如猿猴来源的。优选的病毒是人类来源的或人类感染性病毒。
因此，根据本发明的另一方面，可以将如上所述的本发明的一种或多种肽配制成药物组合物。该组合物可根据需要包含至少一种本发明的肽以及一种或多种药学上可接受的载体，包括赋形剂，如稀释剂、载体等，以及添加剂，诸如稳定剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂等。药学上可接受的载体是可以与本发明的肽一起给药并且包含一种或多种无毒成分的化合物，该成分不抑制或降低本文所述的活性抗病毒肽的有效性。
药学上可接受的载体或赋形剂可以是颗粒状的，使得该组合物为例如片剂或粉末形式。载体可以是液体，组合物例如是口服糖浆或可注射液体。另外，载体可以是气态的，以便提供可用于例如吸入给药的气雾剂组合物。
这样的药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水、***胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在另一实施方式中，当施用于动物时，本发明的肽或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当本发明的肽静脉内施用时，水是优选的载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可包含少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。
在另一实施方式中，载体和赋形剂的具体非限制性实例包括但不限于水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等或其组合。制剂赋形剂可包括聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、***胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠或柠檬酸钠。
作为用于口服的固体组合物，可以将所述组合物配制成粉剂、颗粒剂、压制片剂、丸剂、胶囊剂、口香糖、薄片等形式。这样的固体组合物通常包含一种或多种惰性稀释剂。此外，可以存在以下一种或多种：粘合剂，如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，如藻酸、藻酸钠、玉米淀粉等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂；和着色剂。
对于局部给药制剂，可以使用多种乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、洗剂等中的任何一种。
当用于口服给药时，该组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮剂和凝胶形式作为固体或液体包括在本文考虑的形式中。
所述组合物可以是液体的形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。该液体可用于口服给药或通过注射递送。当用于口服给药时，组合物可包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于注射给药的组合物中，还可以包括表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。含有至少一种或多种缓冲成分的水是优选的，同时含有或不含有稳定剂、防腐剂和增溶剂。当组合物为胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除上述类型的物质外，其还可包含液体载体，如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。
对于大多数药物制剂，非活性成分将占制剂重量或体积的较大部分。对于药物制剂，还考虑可以使用多种测定释放、缓慢释放或时间释放制剂中的任意一种以及添加剂，从而可以配制成剂型以实现在一段时间有效递送本发明的肽。
应当理解，本文所述的肽可以使用任何合适的给药途径或递送方法，包括但不限于口服、肠胃外、长效制剂、***等。
在某些实施方式中，肽(一种或多种)与非共价载体一起配制。非共价载体是本领域技术人员熟知的。
在某些实施方式中，将肽与诸如脂质的载体复合或配制成脂质体、可生物降解或不可生物降解的微粒、微胶囊、微球和纳米颗粒。产生脂质体、微粒、微胶囊、微球和纳米颗粒以及在其中复合或包封化合物的方法是本领域技术人员熟知的。
在某些实施方式中，本文所述的抗病毒肽被配制成纳米乳剂。纳米乳剂包括但不限于水包油(O/W)纳米乳剂和油包水(W/O)纳米乳剂。纳米乳剂可以定义为平均液滴直径为约20至约1000nm的乳液。通常，平均液滴尺寸在约20nm或50nm至约500nm之间。
示例性的水包油(O/W)和/或油包水(W/O)纳米乳剂包括但不限于：
1)表面活性剂胶束——由小分子表面活性剂或去污剂(例如SDS/PBS/2-丙醇)组成的胶束，其适用于主要疏水性的肽；
2聚合物胶束——由聚合物、共聚物或嵌段共聚物表面活性剂(例如PluronicL64/PBS/2-丙醇)组成的胶束，其适用于主要疏水性的肽；
3)混合胶束：其中存在多于一种表面活性剂组分或其中液相之一(通常是醇或脂肪酸化合物)参与胶束(例如辛酸/PBS/EtOH)的形成的胶束，其适用于主要疏水性的肽；
4)整体肽胶束～混合胶束，其中肽用作辅助表面活性剂，形成胶束的组成部分(例如，两亲肽/PBS/矿物油)，其适用于两亲肽；和
5)皮克林(固相)乳液～其中肽与固体纳米颗粒的外部连接的乳液(例如，聚苯乙烯纳米颗粒/PBS/无油相)，其适于两亲性肽。
在另一实施方式中，本发明涉及用作药物的本发明的肽或组合物。
本发明的肽和组合物的给药包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、***、眼、肺(吸入)和鼻内给药。肠胃外给药包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。优选地，肠胃外、肺或口服给药该组合物。可以配制本发明的药物组合物，以使得在将组合物施用于动物(优选人)后，本发明的肽可被生物利用。组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单个剂量单位，并且包含气雾剂形式的本发明的肽的容器可以容纳多个剂量单位。
肠胃外给药包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、脑内、心室内、鞘内、***内或透皮给药。优选的给药方式由从业者自行决定，并将部分取决于医学病症的部位。
本发明的液体组合物，无论是溶液、悬浮剂还是其它类似形式，还可以包括以下一种或多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠，固定油，诸如合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油或其它溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外组合物可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃、塑料或其它材料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。
肽或组合物以治疗有效量施用。术语“治疗有效量”或“药物有效量”是指产生所需结果所必需的一种或多种化合物的量和/或剂量和/或剂量方案，例如足以减少或阻止病毒繁殖的量，或足以减轻病毒性疾病的严重程度或延缓其症状发展的量(例如，治疗有效量)，足以降低由病毒感染引起的疾病的风险或延缓其发作和/或降低其最终严重程度的量(例如预防有效量)。
化合物的正确剂量将根据特定的制剂、施用方式及其特定的部位、宿主和所治疗的疾病而变化。还应考虑其它因素，如年龄、体重、性别、饮食、给药时间、***率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度。给药可以在最大耐受剂量范围内连续或定期进行。
通常，该量为组合物重量的至少约0.01％的本发明的肽。当用于口服时，该量可以在组合物重量的约0.1％至约80％的范围内变化。优选的口服组合物可以占组合物重量的约4％至约50％的本发明的肽。
制备本发明的优选组合物，使得肠胃外剂量单位包含按重量计约0.01％至约2％或更多的本发明的肽。
对于静脉内给药，组合物可包含约通常约0.1mg/天至约250mg/天，优选约0.1mg/天与约50mg/天之间。
所述肽可以治疗性或预防性地给药。每天给予1-4次合适的治疗，并且优选持续1-7天或更长时间。如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗(treat)”是指对疾病或病症的症状或病理产生期望效果的作用，特别是可以利用本文所述的肽实现的作用，并且治疗可能包括但不限于，对正在治疗的疾病或病症的一种或多种可测量标志物的甚至最小改变的或改善。治疗还指延迟该术语所适用的疾病或病症，或该疾病或病症的一种或多种症状的发作，延迟或逆转其进展，降低其严重性，或减轻或预防该疾病或病症。“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗(treat)”并不一定表示完全根除或治愈该疾病或病症或其相关症状。在另一实施方式中，治疗包括改善所治疗疾病的至少一种症状。改善可以是部分的或完全的。接受该治疗的受试者是有需要的任何受试者。临床改善的示例性标志物对本领域技术人员将是显而易见的。
本发明的肽或组合物可以通过任何方便的途径给药，例如通过输注或团注法，通过上皮或粘膜皮肤内层吸收。
也可以采用肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及与雾化剂一起配制，或通过在碳氟或合成的肺表面活性剂中灌注来实现。在某些实施方式中，本发明的肽或组合物可以与传统的粘合剂和载体如甘油三酸酯一起配制成栓剂。
如上所述，根据给药途径，可以通过本领域已知的任何方式配制本发明的抗病毒肽，包括但不限于片剂、胶囊剂、囊片、混悬剂、散剂、冻干制剂、栓剂、滴眼剂、皮肤贴剂、口服可溶性制剂、喷雾剂、气雾剂等，可以与缓冲剂、粘合剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和本领域已知的其它试剂混合并配制。
给药也可以与另一种活性化合物，例如另一种抗病毒化合物一起进行。也可以施用多于一种的本发明的肽。
本文所述的肽也可以作为药学上可接受的盐提供。“药学上可接受的盐”包括与以下形成的盐：无机碱(例如，碱金属，诸如钠或钾；碱土金属，诸如钙和镁或铝；和氨)，有机碱(例如，三甲胺、三乙胺、吡啶、皮考啉、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)，无机酸(例如，盐酸、氢硼酸、硝酸、硫酸和磷酸)或有机酸(例如，甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸)。本文引用的实例是非限制性的。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明的肽或组合物、使用说明书和任选的佐剂。
本发明还涉及用于检测具有抗病毒活性的肽的筛选方法，该方法包括制备本文所述的分离的抗病毒肽的衍生物，将该肽暴露于病毒并筛选抗病毒活性。
本发明还涉及编码本发明的抗病毒肽的分离的核酸分子，包括DNA或RNA分子。在另一实施方式中，分离的核酸不是天然存在的。
本发明还涉及包含编码本发明抗病毒肽的核酸的载体。载体可以是表达载体，特别是用于在真核细胞中表达的载体。这样的载体可以是例如病毒、质粒、粘粒或人工染色体(例如酵母人工染色体)载体。
可通过本领域内多种已知方法中的任何一种将本文所述的载体引入细胞或组织。此类方法在例如Sambrook等，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,4th edition(June 15,2012)中有所描述。
本发明还涉及包含本发明的抗病毒肽的宿主细胞。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，但真核细胞是优选的。示例性的真核细胞包括哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)。其它合适的宿主细胞是本领域已知的。
因此，在本发明中，可以在体外或离体转染细胞，并且可以通过本领域已知的方法从中分离表达的肽。也可以向受试者给药细胞，或者，可以在体内直接修饰细胞。
本发明还涉及一种组合，其包含本发明的抗病毒肽和第二剂，第二剂选自例如核酸、肽、蛋白质、造影剂、抗体、毒素和小分子。
本发明还涉及包含本发明的肽的重组文库，例如噬菌体文库。
尽管前述公开内容提供了对本发明范围内包括的主题的一般描述，包括制造和使用本发明的方法及其最佳模式，但提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实施本发明并提供其完整书面说明。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应理解为对本发明的限制，本发明的范围应从本公开所附的权利要求及其等同物中理解。鉴于本公开，本发明的各种其它方面和实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。这些实施例的细节不应视为限制性的。
在本文中使用的“和/或”应被视为两个指定的特征或组件中的每个在具有或不具有另一个时的具体公开内容。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开内容，就如它们在本文中分别列出一样。
除非上下文另外指示，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式，并且等同地适用于所描述的所有方面和实施方式。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。
实施例1.材料和方法。
细胞培养和病毒：HSV、RSV、CMV和HIV通过多次传代分别在Vero、Hep-2、HFFF-2细胞和PBMC中繁殖，以获得高滴度的工作储料。
肽合成：使用固态方法由Mimotopes(澳大利亚)或Genscript(美国)合成肽。表1-8列出了该研究中使用的示例性肽的序列。所有肽均通过HPLC纯化(纯度大于>90)，并通过质谱分析确认序列。任选地将序列“RRKK”(或“rrkk”)添加至所有肽的N端以增加溶解性。根据序列，使用右旋氨基酸或左旋氨基酸合成所有肽。使用存在于肽中的半胱氨酸残基，通过二硫键使所有肽环化。
HSV、RSV和CMV的细胞病变效应(CPE)测定：将合适的细胞接种到96孔板中，温育过夜，直至达到约70％汇合度。在4℃下用各种浓度的肽或赋形剂处理病毒90分钟，并添加到汇合的细胞单层上以进行其余的测定。在温育期结束时，通过添加MTT试剂并将板在37℃在5％CO2下温育2-4小时来确定细胞的存活力。温育后，添加100％异丙醇以溶解甲臜晶体，并记录540nm处吸光度，减去620nm处的背景。
使用Pauwels公式(如下所示)来计算阳性对照或测试化合物所达到的细胞保护百分比。
细胞保护百分比＝([ODt]病毒–[ODc]病毒/[ODc]空白对照–[ODc]病毒)x 100
其中：
[ODt]病毒＝在检测给定浓度的测试物或阳性对照对病毒感染细胞的作用的孔中测得的光密度。
[ODc]病毒＝在检测阴性对照对病毒感染细胞的作用的孔中测得的光密度。
[ODc]空白对照＝在检测阴性对照对空白对照感染的细胞的作用的孔中测得的光密度。
这些百分比用于确定EC50，该EC50是使用IDBS XLFit Excel加载项版本5.4.0.8通过非线性回归分析计算得出的
表9：CPE测定长度和感染复数(MOI)
新鲜人PBMC中的抗HIV功效评价：PBMC用各种浓度的肽处理的病毒感染，并在37℃、5％CO2下温育7天。温育后，将细胞离心并收集上清液用于逆转录酶活性(RT)测定。在去除上清液后，向细胞中添加MTS，研究化合物的细胞毒性作用。IC50和TC50的数据分析由CRO及其内部的计算机程序完成。
逆转录酶活性测定：在微量滴定板中进行逆转录酶(RT)测定。通过将150μL polyrA(20mg/mL)与0.5mL oligo dT(20单位/mL)和5.35mL无菌dH2O合并，制备氚化胸苷三磷酸(3H-TTP，80Ci/mmol，NEN；(GE Healthcare)作为储备溶液。用125μL 1.0M EGTA、125μLdH2O、125μL 20％曲拉通X100、50μL 1.0M Tris(pH 7.4)、50μL 1.0M DTT和40μL 1.0MMgCl2制备新鲜RT反应缓冲液。通过将1份3H-TTP、4份dH2O、2.5份poly rA:oligo dT储料和2.5份反应缓冲液混合获得最终反应混合物。将10μL该反应混合物添加到微量滴定板中，并加入15μL含病毒的上清液并混合。然后将板在37℃下温育60分钟。温育后，将反应体积点在DE81滤垫(Wallac)上，用5％磷酸钠缓冲液或2X SSC(Life Technologies)充分洗涤，然后在蒸馏水中洗涤，之后用70％乙醇洗涤并空气干燥。使用标准液体闪烁技术对掺入的放射性进行定量(每分钟计数，CPM)。
细胞毒性测定1：在RT测定结束时，将20μL可溶性四唑鎓类MTS(CellTiter 96试剂，Promega)试剂添加到板的每个孔中，以确定细胞存活力并定量化合物毒性。然后将微量滴定板在潮湿的5％CO2气氛中于37℃温育4-6小时。基于经验确定的时间选择温育间隔以实现最佳的染料还原。用酶标仪在490/650nm处用分光光度法测量MTS细胞还原产生的可溶性甲臜的量。
细胞毒性测定2：使MDCK细胞或A549细胞(～5000细胞/孔)在96孔板上生长过夜。用连续稀释的肽代替培养基，并再次温育24/48小时。除去培养基，并加入20μl
丙氨酸扫描：纯化的病毒通过Bradford测定(Thermo Scientific，US)进行定量。将15μg/孔的纯化病毒在4℃下包被于96孔ELISA微孔板(Eppendorf，US)上过夜。包被的孔用1xPBST(含吐温20的磷酸盐缓冲盐水)洗涤两次，并在室温下用1xPBS中的5mg/ml BSA封闭1小时。将包被的孔用在1％BSA(牛血清白蛋白)/1xPBST中的150μM生物素偶联肽在室温下温育2小时。使用1xPBST洗涤3次后，使用第一抗生物素兔抗体(细胞信号传导1:250，MA)和HRP偶联抗兔第二抗体(Abcam 1:5000，MA)检测生物素偶联肽。在Biorad iMark酶标仪上在415nm下读取吸光度。
血凝测定：鸡红细胞(cRBC)的血凝是在V型底部96孔微量滴定板中进行的，如Jones et al.,Journal of Virology,80(24):11960-11967(2006)中所述。
Bradford测定：按照制造商的说明，使用考马斯(Bradford)蛋白质分析试剂盒(Thermo Scientific，USA)进行蛋白质定量。
IC50计算：所有实验一式三份，数据代表至少三个独立测定的结果。IC50值是根据Graphpad PrismTM软件或IDBS XLFit Excell附加版本5.4.0.8分析的剂量反应曲线计算得出的。
溶血测定：将新鲜获得的人红细胞用PBS(pH 7.4)缓冲液以500xg离心10分钟洗涤3次。将肽与洗涤的RBC在V型微量滴定板中温育1小时。1％曲拉通X-100用作阳性对照。温育后，将板以500xg离心5分钟，并将上清液转移至新鲜的透明底部96孔板中，并使用iMark酶标仪(Biorad，USA)在545nm下测量吸光度。
实施例2.抗病毒肽对血凝活性的影响：在该实施例中，测试抗病毒肽抑制病毒血凝的能力以支持该肽是否通过附着于病毒的HA蛋白来抑制病毒复制。简而言之，将10μM的肽与4HAU/50μl病毒混合，并用鸡红细胞测量HA活性。在肽处理的情况下，未观察到血凝活性的抑制。
实施例3.FPT对人肝细胞的细胞毒性作用：抗病毒肽对人肝细胞HepaRGTM(该细胞在细胞培养条件下具有被证实的分化的肝细胞表型)的细胞毒性作用，由英国AvantiCellScience Ltd公司进行分析。简而言之，测试材料的细胞毒性是以在24小时攻击过程中胞质内容物，特别是胞质脱氢酶的释放来衡量的。通过敏感的基于荧光的测定法测量释放到培养基中的细胞内容物。通过使用阴性对照(测试物质溶剂)和呈已知细胞毒性剂形式的阳性对照来监测测定性能。在攻击期结束时，通过标准方法生成测定读数，并通过将测试结果与完全裂解的去污剂处理过的对照(100％裂解)进行比较，将结果计算为细胞裂解百分比(％裂解)。
实施例4.抗病毒肽对MDCK细胞或A549细胞的细胞毒性作用：抗病毒肽的细胞毒性作用示于图12和图13中，其如实施例1所述进行评估。简而言之，MDCK细胞/A549细胞用0μM肽(空白对照)或递增浓度(即0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM和100μM)的PSP V A19和PSP VI A1处理，通过如制造商所述在感染后48小时通过
实施例5.FPT的溶血活性：抗病毒肽的溶血作用如图14所示，如实施例1所述进行评估。简而言之，将不同浓度的肽与人红细胞一起温育并在温育后一小时，用Biorad iMark酶标仪在545nm处上清液中释放的血红蛋白的吸光度来确定溶血度。
实施例6.表10中的肽显示了本文所述的针对各种含有基质层的病毒的示例性抗病毒肽的IC50或EC50值。
表10.通过本文所述的体外方法评估的示例性肽的IC50或EC50值(μM)。
参考文献
1.Robert A Lamb GDP,ed Paramyxoviridae.5ed.Philadelphia:LippincottWilliams&Wilkins；2007.David M Knipe PMH,ed.Fields Virology；No.1.
2.Nair H,Nokes DJ,Gessner BD,et al.Global burden of acute lowerrespiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children:asystematic review and meta-analysis.Lancet.May 012010；375(9725):1545-1555.
3.Eric A.F.
4.Edward S Mocarski J,Thomas Shenk,Robert F Pass,edCytomegaloviruses.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins；2007.David M KnipePMH,ed.Fields Virology；No.2.
5.Philip E Pellet BR,ed Herpesviridae.5ed.Philadelphia:LippincottWilliams&Wilkins；2007.David M Knipe PMH,ed.Fields Virology；No.2.
6.Plosa EJ,Esbenshade JC,Fuller MP,Weitkamp JH.Cytomegalovirusinfection.Pediatr Rev.Apr 2012；33(4):156-163；quiz 163.
7.Rawlinson WD,Boppana SB,Fowler KB,et al.Congenital cytomegalovirusinfection in pregnancy and the neonate:consensus recommendations forprevention,diagnosis,and therapy.Lancet Infect Dis.Mar10 2017.
8.Khalil A,Jones C,Ville Y.Congenital cytomegalovirus infection:management update.Curr Opin Infect Dis.Jun 2017；30(3):274-280.
9.Tan BH.Cytomegalovirus Treatment.Curr Treat Options InfectDis.2014；6(3):256-270.
10.Harter G,Michel D.Antiviral treatment of cytomegalovirusinfection:an update.Expert Opin Pharmacother.Apr 2012；13(5):623-627.
11.Bernard Roizman DMK,Richard J Whitley,ed Herpes Simplex Viruses.5ed.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins；2007.David M Knipe PMH,ed.FieldsVirology；No.2.
12.Harris M.Globally,an estimated two-thirds of the populationunder50 are infected with herpes simplex virus type 1.Geneva:World HealthOrganization；2015.
13.Looker KJ,Magaret AS,May MT,et al.Global and Regional Estimates ofPrevalent and Incident Herpes Simplex Virus Type 1 Infections in2012.PLoSOne.2015；10(10):e0140765.
14.Katharine J Looker GPG,George P Schmid.An estimate of the globalprevalence and incidence of herpes simplex virus type 2 infection.Bulletin ofthe World Health Organization 2008；86(10):737-816.
15.Le Cleach L,Trinquart L,Do G,et al.Oral antiviral therapy forprevention of genital herpes outbreaks in immunocompetent and nonpregnantpatients.Cochrane Database Syst Rev.Aug 03 2014(8):CD009036.
16.Vere Hodge RA FH.Antiviral agents for herpes simplexvirus.Advances in Pharmacology.2013；67:1-38.
17.Goff SP,ed Retroviridae:The Retroviruses and their replication.5ed.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins；2007.David M Knipe PMH,ed.FieldsVirology；No.2.
18.Daniel R Kuritzkes BDW,ed HIV-1 Pathogenesis,clinicalmanifestations and treatment.5 ed.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins；2007.David M Knipe PMH,ed.Fields Virology；No.2.
19.Prokofjeva MM,Kochetkov SN,Prassolov VS.Therapy of HIV Infection:Current Approaches and Prospects.Acta Naturae.Oct-Dec2016；8(4):23-32.
20.Joseph L.Kukura MPT,ed Current Challenges and Opportunities in thePharmaceutical Industry:John Wiley&Sons；2010.Ende DJa,ed.Chemical Engineeringin the Pharmaceutical Industry:R&D to Manufacturing；No.1.
21.Fry DC.Targeting protein-protein interactions for drugdiscovery.Methods Mol Biol.2015；1278:93-106.
22.Scott DE,Bayly AR,Abell C,Skidmore J.Small molecules,big targets:drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.Nat Rev DrugDiscov.Aug 2016；15(8):533-550.
23.Samaranayake H,Wirth T,Schenkwein D,Raty JK,Yla-HerttualaS.Challenges in monoclonal antibody-based therapies.Ann Med.2009；41(5):322-331.
24.Fosgerau K,Hoffmann T.Peptide therapeutics:current status andfuture directions.Drug Discov Today.Jan 2015；20(1):122-128.
25.Otvos L,Jr.,Wade JD.Current challenges in peptide-based drugdiscovery.Front Chem.2014；2:62.
26.Oyston PC,Fox MA,Richards SJ,Clark GC.Novel peptide therapeuticsfor treatment of infections.J Med Microbiol.Aug 2009；58(Pt8):977-987.
27.Seo MD,Won HS,Kim JH,Mishig-Ochir T,Lee BJ.Antimicrobial peptidesfor therapeutic applications:a review.Molecules.Oct 18 2012；17(10):12276-12286.
28.Rajik M,Jahanshiri F,Omar AR,Ideris A,Hassan SS,YusoffK.Identification and characterisation of a novel anti-viral peptide againstavian influenza virus H9N2.Virol J.Jun 05 2009；6:74.
29.Rajik M,Yusoff K.Peptide inhibitors against influenzavirus.Antivir Chem Chemother.Mar 07 2011；21(4):151-154.
30.Vlieghe P,Lisowski V,Martinez J,Khrestchatisky M.Synthetictherapeutic peptides:science and market.Drug Discov Today.Jan2010；15(1-2):40-56.
31.Rajik M,Inventor；Viramatix Sdn Bhd,assignee.Broad-spectrum anti-influenza therapeutic peptides2015.
32.Rajik M,Inventor；Viramatix Sdn Bhd,assignee.Peptides and usestherefor as antiviral agents2016.
Each document and publication cited herein is incorporated herein byreference in its entirety。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.治疗有效量的肽或任何所述肽的药物组合物在制备用于治疗宿主动物中至少部分由基质蛋白层病毒或包膜病毒引起的感染的药物中的用途，其中，所述病毒不是流感病毒或正粘病毒，所述肽包含序列twftfin或式A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7的twftfin的类似物或衍生物，其中，A1是t或w，A2是k或w，A3是s或f，A4是r或t，A5是f、h、i、n或w，A6是i或d，A7是n或a，并且其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个或任意两个任选地被另一D-氨基酸或L-氨基酸替代，其中所述肽的长度为约50个残基或更少。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述病毒是逆转录病毒、慢病毒、副粘病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、蜱媒脑炎、黄热病、登革热病毒、丝状病毒、披膜病毒、布尼亚病毒、疱疹病毒、嗜肝DNA病毒、副粘病毒或冠状病毒。
3.如权利要求1所述的用途，其中，所述病毒是HIV、埃博拉病毒、马尔堡病毒、风疹病毒、汉坦病毒、沙粒病毒、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或环曲病毒。
4.如权利要求1所述的用途，其中，所述感染是AIDS、疱疹或SARS。
5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个任选地被另一D-氨基酸或L-氨基酸替代。
6.如权利要求1-4中任一项所述的用途，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个或任意两个被相应的L-氨基酸替代。
7.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，所述肽包含序列twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn、twftfiX/x或X/xwftfiX/x，其中X/x是甘氨酸，或任何D-氨基酸，或任何L-氨基酸，并且其中，在每个序列中，一个其它氨基酸被***、缺失或改变为不同的D-氨基酸、或甘氨酸、或任何L-氨基酸。
8.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，所述肽包含序列twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn、twftfiX/x或X/xwftfiX/x，其中X/x是甘氨酸或任何D-氨基酸或任何L-氨基酸。
9.如权利要求8所述的用途，其中，所述肽包含序列twftfin、X/xwftfin、tX/xftfin、twX/xtfin、twfX/xfin、twftX/xin、twftfX/xn或twftfiX/x。
10.如权利要求8所述的用途，其中，所述肽包含序列X/xwftfiX/x。
11.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，所述肽包含序列PSP IV A17、PSP VA19或PSP VI A1。
12.如权利要求1-11中任一项所述的用途，其中，所述肽还包含N端和/或C端半胱氨酸残基。
13.如权利要求1-12中任一项所述的用途，其中，所述肽还包含一个或多个溶解性标签，每个所述溶解性标签是独立选择的。
14.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述肽为环状形式。
15.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述肽对病毒的IC50小于100μM。
16.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述药物适合于经鼻、经肺、口服或肠胃外给药。
17.如前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述药物用于预防性治疗。
18.一种试剂盒，包含治疗有效量的用于治疗宿主动物中至少部分由基质蛋白层病毒或包膜病毒引起的感染的包含肽的药物组合物，以及使用所述药物组合物治疗所述感染的说明书，所述肽包含序列twftfin或式A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7的twftfin的类似物或衍生物，其中，A1是t或w，A2是k或w，A3是s或f，A4是r或t，A5是f、h、i、n或w，A6是i或d，A7是n或a，并且其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6或A7中的任意一个或任意两个任选地被另一D-氨基酸或L-氨基酸或甘氨酸替代，其中所述病毒不是流感病毒或正粘病毒。