阅读说明：本技术 肽和用肽治疗营养不良相关病症的方法 (Peptides and methods of treating malnutrition-related disorders with peptides ) 是由 E·R·巴内阿 于 2018-02-22 设计创作，主要内容包括：本公开涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含PIF肽或者其类似物或药学上可接受的盐中的任一种或组合。还公开了使用PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合治疗营养不良相关病症的方法。(The present disclosure relates to a pharmaceutical composition comprising any one or combination of PIF peptide, or an analog or pharmaceutically acceptable salt thereof. Also disclosed are methods of treating a malnutrition-associated disorder using one or a combination of PIF peptides or analogs thereof or pharmaceutically acceptable salts thereof.)

肽和用肽治疗营养不良相关病症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年2月22日提交的美国临时申请号62/462,292的优先权和权益，该临时申请据此全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开整体涉及用于治疗杜兴氏肌肉营养不良(Duchenne’s MuscularDystrophy)和营养不良相关病症的组合物和方法。本公开还涉及植入前因子(PIF)突变体和使用PIF突变体的治疗方法，包括治疗杜兴氏肌肉营养不良。

背景技术

植入前因子(PIF)存在于母体循环中，是由可存活的哺乳动物胚胎分泌的含15个氨基酸的肽。合成PIF(sPIF)目前用于治疗自身免疫性肝炎的临床试验中。肌肉营养不良相关病症，包括杜兴氏肌肉营养不良(DMD)，是由基因突变引起的骨骼肌和心肌的进行性致死性X连锁疾病。患有这些病症之一的患者患有肌肉退化。就DMD而言，肌营养不良蛋白功能丧失导致损伤并最终导致：(1)肌肉纤维萎缩；以及(2)发生非对称***的卫星细胞受损，而非对称***对于肌肉再生至关重要。退化的肌肉使***增多，该过程通常被称为纤维化。现在有多种多样的治疗策略，但这些策略目前收效有限。至于基因疗法，尽管可能前景看好，但必须克服几个障碍才能使其在临床上成为现实。附加的策略是使用药剂来减轻炎症并改善肌肉祖细胞再生。皮质类固醇是疗法的主要组成部分，还使用色甘酸钠来减轻炎症。目前建议的其他干预手段是用于改善肌肉功能的克仑特罗(clenbutrol)和用于维持钙通量的丹曲林。这些治疗中的每一种都无法大幅改善纤维化组织，并且每一种都有很强的副作用。

发明内容

我们的结果表明，包含PIF、其突变体或其药用盐的治疗促进了小鼠成肌细胞和人类卫星细胞的分化，如通过MyoD和MyHC表达的增加和Pax-7水平的降低所证实。PIF治疗还增加了成肌细胞向多核肌管中的融合。此外，PIF治疗经由下调let-7而增加肌营养不良蛋白相关蛋白(utrophin)(抗肌萎缩蛋白的蛋白质同源物)的水平。我们还使用mdx小鼠检查了施用PIF对DMD的治疗作用。施用PIF显著降低了血清的肌酸激酶(CK，一种肌肉损伤标志物)水平，以及mdx小鼠隔膜中的IV型胶原蛋白水平，这表明肌肉纤维化显著减轻。考虑到PIF的已知抗炎作用，连同PIF对细胞再生以及抑制肌肉损伤和纤维化的当前作用，我们认为PIF可以是治疗DMD的潜在治疗剂。

本公开涉及治疗或预防有需要的受试者中的营养不良相关病症(诸如杜兴氏肌肉营养不良)的方法，该方法包括以治疗有效量向该受试者施用至少一种植入前因子(PIF)肽、其模拟物、其类似物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，向该受试者施用至少一种PIF肽、其模拟物、其类似物或其药学上可接受的盐的步骤包括施用治疗有效剂量的至少一种PIF分子、其类似物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，向该受试者施用至少一种PIF肽、其模拟物、其类似物或其药学上可接受的盐的步骤包括施用治疗有效剂量从约0.001mg/kg至约200mg/kg的PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，向该受试者施用至少一种PIF肽、其模拟物、其类似物或其药学上可接受的盐的步骤包括施用治疗有效剂量从约0.5mg/kg至约5mg/kg的PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，PIF肽、其模拟物、其类似物或其药学上可接受的盐至少包含化学靶向部分和/或放射性部分。

在一些实施方案中，β-连环蛋白的至少一种核转位抑制剂或其药学上可接受的盐包含至少一个放射性部分，所述放射性部分包含以下同位素的至少一种或组合：²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁶O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。

在一些实施方案中，该方法还包括施用至少一种镇痛化合物和/或一种抗炎化合物。

在一些实施方案中，该方法还包括在施用治疗有效剂量的至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时施用至少一种镇痛化合物和或一种抗炎化合物。

在一些实施方案中，治疗有效剂量从约1.0mg/kg至约5.5mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量从约1.0mg/kg至约5.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量从约1.0mg/kg至约4.5mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量从约1.0mg/kg至约4.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量从约1.0mg/kg至约3.5mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量以皮下、静脉内、腹膜内、局部、口服、舌下、鼻内或肌内的方式施用。在一些实施方案中，治疗有效剂量每周施用一次、每周施用两次、每周施用三次、每周施用四次或每周施用五次，并且任选地，其中该剂量在连续的两天、三天、四天或五天中施用一次。在一些实施方案中，治疗有效剂量每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每五周施用一次、每六周施用一次、每七周施用一次、每八周施用一次、每九周施用一次、每十周施用一次、每十一周施用一次或每十二周施用一次。在一些实施方案中，治疗有效剂量每月施用一次、每月施用两次、每月施用三次、每月施用四次或每月施用五次。在一些实施方案中，治疗有效剂量每年施用一次、每年施用两次、每年施用三次、每年施用四次、每年施用五次、每年施用六次、每年施用七次、每年施用八次、每年施用九次、每年施用十次或每年施用十一次。

在一些实施方案中，所述组合物或药物组合物包含PIF肽，该PIF肽包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:4或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:5或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:6或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:7或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:8或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:9或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:10或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:11或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:12或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:13或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:14或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:15或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:16或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:17或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:18或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:19或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:20或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:21或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:22或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:23或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:24或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:25或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:26或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:27或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:28或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该PIF肽包含SEQ ID NO:29或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，提供了式R₁-R₂-R₃-R₄(SEQ ID NO:31)的化合物，其中R₁是Pro或Pro的模拟物，R₂是Gly或Gly的模拟物，R₃是Ser或Ser的模拟物，并且R₄是Ala或Ala的模拟物。在替代性实施方案中，该化合物可以包含最多11个附加氨基酸残基中的一个或多个。本发明的实施方案包括衍生自植入前胚胎的那些肽，这些肽诱导TH2型细胞因子(如IL-10)从淋巴细胞或其他白血细胞合成或分泌，以及与PIF受体(诸如但不限于PGSA(A)VRIKPGSANKPSDD或(Q)VRIKPGSANKPSDD)特异性结合或通过用D氨基酸置换或通过添加PEG而形成的药效基团。优选地，此类肽来自植入前胚胎，并且通过增加含有所需细胞因子的淋巴细胞的数量和或通过使TH2细胞因子优先于THI细胞因子分泌到培养基中来增大TH2/TH1比率。这种植入前胚胎衍生的肽可以用于引起淋巴细胞中的从促炎活性向抗炎活性的转变。在另一个实施方案中，该药物组合物包含式MVRIK(SEQ ID NO:32)的化合物。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体是无菌且无热原的水或水性缓冲液，诸如盐水或乳酸林格氏溶液(Lactated Ringer’s solution)。

在一些实施方案中，治疗有效剂量为约1.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约2.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约3.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约4.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约0.2mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约0.3mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约0.4mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约0.5mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约0.6mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约0.7mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约0.8mg/kg，其中kg为受试者的千克数，并且mg为治疗有效剂量的毫克数。

本公开还涉及药物组合物，该药物组合物包含：(i)治疗有效剂量的PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合；和(ii)药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，该组合物还包含治疗有效剂量的一种或多种活性剂。

在一些实施方案中，所述一种或多种活性剂是选自以下的化合物中的一种或组合：抗炎化合物、α-肾上腺素能激动剂、抗心律失常化合物、镇痛化合物和麻醉化合物，或激素疗法。

在一些实施方案中，PIF肽或其模拟物或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约1.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其模拟物或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约2.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约3.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约4.0mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，其中PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约0.2mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约0.3mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约0.4mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约0.5mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约0.6mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约0.7mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，其中PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约0.8mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，PIF肽或其类似物或其药学上可接受的盐中的一种或组合的治疗有效剂量为约0.9mg/kg，其中kg为受试者的千克数，mg为治疗有效剂量的毫克数。

在一些实施方案中，该组合物还包含一种或多种干细胞。在一些实施方案中，干细胞是自体干细胞。

在一些实施方案中，该药物组合物经由肠胃外注射、皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、透皮、口服、经颊、眼部途径、***内、通过吸入、通过积存注射或通过植入物施用。

在一些实施方案中，所述组合物还包含选自以下的活性剂中的一种或组合：抗炎化合物、α-肾上腺素能激动剂、抗心律失常化合物、镇痛化合物和/或麻醉化合物。

在一些实施方案中，活性剂中的一种或组合选自表Y。

本公开还涉及改善患有、被诊断患有或疑似患有杜兴氏肌肉营养不良的受试者中的临床结果的方法，包括向该受试者施用至少一种药物组合物，该药物组合物包含：植入前因子(PIF)肽、其类似物或其药学上可接受的盐；和药学上可接受的载体。

本公开涉及治疗人类受试者中的杜兴氏肌肉营养不良的方法，其中该人类受试者已被鉴定为患有杜兴氏肌肉营养不良，该方法包括：向该受试者施用至少一种药物组合物，该药物组合物包含：植入前因子(PIF)肽、其类似物或其药学上可接受的盐；和测量CDK的药学上可接受的载体。

本文所公开的任何组合物可以在本文所公开的任何方法中用作单一疗法，或者用作一种或多种所公开组合物的组合疗法。

本公开涉及治疗或预防表2中的营养不良相关病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的PIF肽或其药学上可接受的盐。本公开涉及治疗或预防DMD的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐。

本公开涉及治疗和/或预防受试者中的纤维化的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法还包括在施用治疗有效量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐之前、的同时或之后向该受试者施用一种或多种活性剂。本公开涉及抑制受试者中的纤维化组织沉积的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，纤维化组织是肌肉组织。在一些实施方案中，受试者患有肌营养不良蛋白相关病症。在一些实施方案中，受试者患有选自表2的肌营养不良蛋白相关病症。

本公开涉及增加受试者中的肌营养不良蛋白相关蛋白的水平的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法包括增加受试者体内神经肌肉接头处或附近的肌营养不良蛋白相关蛋白的水平。

本公开还涉及在体外或体内分化成肌细胞的方法，该方法包括使细胞在体内或体外与足以引起成肌细胞分化的一定量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐接触。在一些实施方案中，如果该方法在体内进行，则该方法包括向受试者施用治疗有效量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用治疗有效量的PIF肽或其药学上可接受的盐，使得成肌细胞融合到肌管中。

本公开涉及增加受试者中的成肌细胞向多核肌管中的融合的方法，该方法包括向受试者施用足以诱导受试者中的功能性肌管形成的一定量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，受试者已被诊断或疑似患有肌营养不良蛋白相关病症。在一些实施方案中，受试者患有肌肉退化。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有杜兴氏肌肉营养不良。

本公开还涉及降低患有肌营养不良蛋白相关病症的受试者中的肌肉退化速率的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的PIF、经修饰的PIF肽或其药学上可接受的盐。

附图说明

图1是示出C2C12成肌细胞(左)和人类卫星细胞(右)的sPIF诱导的增殖的一系列图。

图2是示出C2C12成肌细胞(左上)和人类卫星细胞(右上)中的sPIF诱导的肌肉分化的一系列图和照片。sPIF治疗还增加了肌营养不良蛋白相关蛋白(肌营养不良蛋白的蛋白质同源物)的水平(中部)，以及成肌细胞向多核肌管中融合的水平(底部)。

图3是示出sPIF下调let-7表达(左上)，以及上调H19表达(左下)和miR-675表达(右下)的一系列图。该途径在右上方的照片中示出。

图4是在DMD的mdx小鼠模型中接受sPIF施用的代表性小鼠的照片(左)。施用PIF显著降低了血清的CK水平(右)，其中CK是一种肌肉损伤标志物。

图5是一系列代表性照片，示出sPIF处理减轻了mdx小鼠隔膜中的组织纤维化，如IV型胶原蛋白的水平所表示，表明肌肉纤维化明显减轻。

图6是示出sPIF处理增加了mdx小鼠的股四头肌中的肌营养不良蛋白相关蛋白的一系列代表性照片。

图7是示出sPIF处理增加了mdx小鼠的隔膜中的肌营养不良蛋白相关蛋白的一系列代表性照片。

图8是示出小鼠成肌细胞的代表性显微照片的一系列图(左)和融合指数百分比图(中部)，后者表明PIF对分化和融合的作用是剂量依赖性的。蛋白质印迹中示出的肌细胞生成素水平增加(右)表明肌肉分化。

图9A至图9D示出sPIF增加了小鼠成肌细胞和人成肌细胞的分化。C2C12细胞在2％HS中培养，并且用sPIF(300ng/ml)处理5天。使用蛋白质印迹分析确定不同肌原性蛋白的表达(图9A)。C2C12细胞在2％HS中培养，5天后用DAPI和抗肌球蛋白重链(MyHC)抗体(FITC)染色。使用共聚焦显微镜分析细胞融合(图9B)。取来源于两名DMD患者(DMD-mus)和两名健康供体(H-mus)的人成肌细胞用浓度为300ng/ml的sPIF处理，5天后使用RT-PCR分析MyHC和肌钙蛋白在融合培养基中的表达(图9C)。使用共聚焦显微镜在活细胞成像中分析sPIF-FITC向C2C12细胞的内化(图9D)。*P<0.001。

图10A至图10F示出sPIF经由诱导H19/miR-675途径而增加了DMD成肌细胞的分化。使用RT-PCR分析来源于健康供体和DMD患者的经培养肌细胞中的H19和miR-675的表达(图10A)。如通过RT-PCR测定的，sPIF不仅诱导H19表达上调(图10B)，还诱导miR-675-3p和5p表达上调(图10C)。用对照或H19 siRNA转染DMD成肌细胞，然后用sPIF处理7天。通过RT-PCR测定MyHC的表达(图10D)。用miR-675-3p或miR-675-5p模拟物转染DMD成肌细胞，并在7天后测定MyHC的表达(图10E)。在用对照或miR-675 antagomiR转染的DMD成肌细胞中测定sPIF对MyHC表达的作用(图10F)。*P<0.001。

图11A至图11F示出sPIF经由H19/Let-7途径上调肌营养不良蛋白相关蛋白表达。用sPIF将C2C12成肌细胞和DMD成肌细胞处理7天，然后通过蛋白质印迹分析来测定肌营养不良蛋白相关蛋白表达(图11A)。如通过RT-PCR测定的，在通过sPIF处理的DMD成肌细胞中也出现了肌营养不良蛋白相关蛋白表达(图11B)。使DMD成肌细胞对H19沉默，然后在处理5天后测定sPIF对肌营养不良蛋白相关蛋白表达的作用(图11C)。用对照或let-7 antagomiR处理DMD成肌细胞，并在三天后使用RT-PCR分析肌营养不良蛋白相关蛋白表达(图11D)。在sPIF处理3天后，通过RT-PCR在DMD成肌细胞中测定let-7的表达(图11E)。用对照或let-7模拟物转染DMD成肌细胞，然后用sPIF处理5天。通过RT-PCR测定肌营养不良蛋白相关蛋白表达(图11F)。*P<0.001。

图12A至图12B示出sPIF降低了mdx小鼠中的CK水平和组织纤维化。用sPIF(0.75mg/kg)处理小鼠，再过两周后分析CK水平(图12A)。从经处理的小鼠中取出隔膜肌，对抗胶原蛋白I和胶原蛋白IV染色(图12B)。

图13A至图13C示出sPIF增加MDX小鼠中的肌营养不良蛋白相关蛋白的表达，用sPIF(0.75mg/kg，每天两次，持续两周)对mdx小鼠(6周；每组n＝8)进行注射，方式为：皮下注射，或一次皮下注射、一次注射到TA肌。再过两周后，用抗肌营养不良蛋白相关蛋白抗体对股四头肌组织(图13A)、隔膜组织(图13B)和心脏组织(图13C)进行免疫染色，并通过共聚焦显微镜观察切片。使用Cell Profiler软件工具分析肌营养不良蛋白相关蛋白的荧光信号强度水平，并以图的形式呈现(*P<0.001)

具体实施方式

在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解本公开不限于所描述的特定分子、组合物、方法和方案，因为这些都可以变化。还应当理解，说明书中使用的术语仅用于描述特定型式或实施方案的目的，而并不旨在限制本公开的范围，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。应当理解，这些实施方案不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、载体和试剂，因为它们都可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的实施方案和权利要求的范围。本文所述的组合物可以包含D氨基酸、L氨基酸、D氨基酸和L氨基酸的外消旋主链，或它们在每个残基处的任何混合物。也就是说，在每个位置处，残基可以是D氨基酸残基或L-氨基酸残基，并且每个位置可以独立地为每个其他位置的D或L，除非上下文另有指示。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以用于实践或测试本公开的实施方案，但现在描述优选的方法、装置和材料。本文所提及的所有出版物均以引用方式并入。本文中的任何内容均不应解释为承认本公开无权借助在先公开而先于此类公开。

如本文所用，短语“有需要的”意味着已被鉴定为需要或疑似需要特定的方法或治疗的动物或哺乳动物。在一些实施方案中，鉴定可以通过任何诊断或观察方式来进行。在本文所述的任何方法和治疗中，动物或哺乳动物可能是有需要的。在一些实施方案中，动物或哺乳动物处于特定的病症或病症流行或更可能发生的环境中，或将前往该环境中。

如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”可互换使用，意味着任何动物，包括哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、犬、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，诸如人。如本文所用，术语“动物”包括但不限于人和非人脊椎动物，诸如野生动物、啮齿类动物，诸如大鼠、雪貂和驯养动物，以及农场动物，诸如马、猪、奶牛、绵羊、山羊。在一些实施方案中，动物是哺乳动物。在一些实施方案中，动物是人。在一些实施方案中，动物是非人哺乳动物。

如本文所用，术语“一个”或“一种”意味着“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”，除非上下文另有明确指示。还必须注意，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”就是提及一个或多个细胞，以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

如本文所用，术语“约”意味着数值是近似值，并且微小的变化不会显著影响所公开实施方案的实践。在使用数值限制的情况下，除非上下文另有指示，否则“约”意味着数值可以变化10％并且仍然在所公开实施方案的范围之内。在数值与术语“约”一起使用的情况下，也公开了没有术语“约”的数值，并且该数值可以在没有术语“约”的情况下使用。

如本文所用，术语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含，如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的具有，如“具有(contains)”和“具有(contain)”)是包括性或开放式的，并且不排除附加的未列举的要素和方法步骤。

如本文所用，短语“从X到Y的整数”意味着包括端点的任何整数。也就是说，在公开一个范围的情况下，公开了该范围中包括端点在内的每个整数。例如，短语“从X到Y的整数”公开了约1、2、3、4或5，以及从约1至约5的范围。

如本文所用，术语“哺乳动物”意味着哺乳动物纲中的任何动物，诸如啮齿类动物(即，小鼠、大鼠或豚鼠)、猴、猫、犬、奶牛、马、猪或人。在一些实施方案中，哺乳动物是人。

如本文所用，短语“治疗有效量”意味着活性化合物或药剂引发研究人员、兽医、医师或其他临床医生所寻求的在组织、系统、动物、个体或人类中的生物应答或药物应答的量。治疗作用取决于正在治疗的病症或期望的生物学作用。因此，治疗作用可以是降低与所述病症相关联的症状的严重程度和/或抑制(部分或完全)所述病症的进展，或者改善病症或副作用的治疗、治愈、预防或消除。引发治疗应答所需的量可以基于受试者的年龄、健康状况、体重和性别来确定。还可以基于监测受试者对治疗的应答来确定最佳量。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”可以指治疗性治疗和/或防治性或预防性措施，其中目的是为了预防或减缓(减轻)不期望的生理病症、病症或疾病，或者获得有益的或期望的临床结果。出于本文所述实施方案的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于：症状减轻；病症、病症或疾病的程度减弱；病症、病症或疾病的稳定(即不恶化)状态；病症、病症或疾病的发作延迟，或者病症、病症或疾病的进展减慢；病症、病症或疾病的状态改善或缓解(无论是部分还是全部)，无论可检测还是不可检测；至少一种可测量生理参数(不一定是患者可辩别的)改善；或者病症、病症或疾病增强或改善。治疗还可以包括引发临床上显著的应答而无过度的副作用水平。治疗还包括相比于未接受治疗时的预期存活期延长的存活期。因此，“治疗杜兴氏肌肉营养不良”意味着预防、缓解或改善与营养不良相关病症(包括杜兴氏肌肉营养不良)相关联的任何主要现象或继发症状的活动。

本申请描述了一些化合物和将这些化合物施用于有需要的受试者的方法。在一些实施方案中，“植入前因子”或“PIF”还可以指合成的PIF-1，该合成的PIF-1复制天然肽的作用并且对活化的外周血单核细胞(PBMC)增殖和细胞因子分泌发挥强效的免疫调节作用，其通过PBMC上的新颖位点起作用并且具有与已知免疫抑制药物不同的作用。在一些实施方案中，“植入前因子”或“PIF”或“PIF类似物”是指选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、或者其肽模拟物或突变体的氨基酸，以及它们的与任何这种氨基酸约75、80、81、82、83、84 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源的组合。在一些实施方案中，术语“PIF”、“PIF肽”或“PIF类似物”是指表1的氨基酸序列，或者与表1的任何序列约75％至约100％同源的其任何肽模拟物、突变体或类似物，它们任选地在其羧基末端和/或其氨基末端处与一个或多个其他氨基酸序列融合或未融合。本公开的药物组合物涉及本文所公开的任何或全部化合物或PIF肽，或者它们各自的药学上有效的盐或多晶型物。

不受任何特定理论的束缚，本文所述的化合物可以经由PIF的一种或多种受体来充当PIF介导的信号转导的激动剂。因此，这些化合物调节在治疗杜兴氏肌肉营养不良但又不限于此的疾病时提供显著治疗益处的信号传导途径。本公开的化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。本公开的化合物还能够形成两种药学上可接受的盐，包括但不限于酸加成盐和/或碱加成盐。另外，本公开的化合物可以以各种固体状态存在，包括无定形形式(非结晶形式)，以及包合物、前药、多晶型物、生物可水解酯、外消旋混合物、非外消旋混合物的形式，或作为纯化的立体异构体，包括但不限于光学纯的对映异构体和非对映异构体。一般来讲，所有这些形式都可以用作如上所述化合物的游离碱或游离酸形式的替代性形式，并且旨在涵盖于本公开的范围之内。

“多晶型物”是指化合物的固体结晶形式。同一化合物的不同多晶型物可以呈现不同的物理特性、化学特性和/或光谱特性。不同的物理特性包括但不限于稳定性(例如，对热或光的稳定性)、可压缩性和密度(对于配制物和产品的制造很重要)，以及溶解速率(可以影响生物利用率)。多晶型物的不同物理特性可能影响其加工。本公开涉及包含任何所公开的PIF肽或其盐的多晶型物的组合物。

如上所述，本公开的化合物尤其可以作为药学上可接受的盐、酯、酰胺或前药来施用。术语“盐”是指本公开化合物的无机盐和有机盐。这些盐可以在化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或通过使游离碱或游离酸形式的纯化化合物分别与合适的有机或无机碱或酸反应并且分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐，等等。这些盐可以包含基于碱金属和碱土金属的阳离子，诸如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。参见，例如，S.M.Berge等人，“Pharmaceutical Salts,”J Pharm Sci,66:1-19(1977)。术语“盐”是指与无机酸和/或有机酸形成的酸性盐，以及与无机碱和/或有机碱形成的碱性盐。这些酸和碱的实例是本领域的普通技术人员众所周知的。此类酸加成盐通常会是药学上可接受的，不过非药学上可接受的酸的盐也可以用于制备和纯化所考虑的化合物。盐包括由盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、甲烷磺酸和苯磺酸形成的盐。

在一些实施方案中，包含PIF或PIF类似物或PIF突变体的组合物的盐可以通过使游离碱或其盐、对映异构体或其外消旋体与一当量或多于一当量的适当的酸反应来形成。在一些实施方案中，本公开的药学上可接受的盐是指具有至少一个碱性基团或至少一个碱性自由基的类似物。在一些实施方案中，本公开的药学上可接受的盐包含形成酸加成盐的游离氨基基团、游离胍基基团、吡嗪基自由基或吡啶基自由基。在一些实施方案中，本公开的药学上可接受的盐是指为主题化合物与(例如)下述物质的酸加成盐的类似物：无机酸，诸如盐酸、硫酸或磷酸，或合适的有机羧酸或磺酸，例如脂族单羧酸或二羧酸，诸如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸，或氨基酸诸如精氨酸或赖氨酸，芳族羧酸诸如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸，芳族-脂族羧酸诸如扁桃酸或肉桂酸，杂芳族羧酸诸如烟酸或异烟酸，脂族磺酸诸如甲烷磺酸、乙烷磺酸或2-羟基乙烷磺酸，或芳族磺酸例如苯磺酸、对甲苯磺酸或萘-2-磺酸。当存在若干个碱性基团时，可以形成单酸加成盐或聚酸加成盐。该反应可以在盐不可溶的溶剂或介质中、或者在盐可溶的溶剂中进行，所述溶剂例如水、二噁烷、乙醇、四氢呋喃或二***，或溶剂的混合物，其可以在真空中移除或通过冷冻干燥来移除。该反应也可以是复分解过程，或者可以在离子交换树脂上进行。在一些实施方案中，这些盐可以是患者生理上耐受的盐。根据本公开的盐可以以其无水形式或以水合结晶形式(即，与一个或多个水分子络合或结晶)存在。

本公开化合物的药学上可接受的酯的实例包括C₁-C₈烷基酯。可接受的酯还包括C₅-C₇环烷基酯，以及芳基烷基酯诸如苄基酯。常用的是C₁-C₄烷基酯。本公开化合物的酯可以根据本领域中众所周知的方法来制备。本公开化合物的药学上可接受的酰胺的实例包括衍生自氨、C₁-C₈烷基伯胺和C₁-C₈二烷基仲胺的酰胺。就仲胺而言，胺也可以是含有至少一个氮原子的5或6元杂环烷基基团的形式。常用的是衍生自氨、C₁-C₃烷基伯胺和C₁-C₂二烷基仲胺的酰胺。本公开化合物的酰胺可以根据本领域技术人员众所周知的方法来制备。

当与治疗手段结合使用时，“施用”意味着将治疗剂直接施用到靶组织中或靶组织上，或者将治疗剂施用于患者，由此治疗剂积极地影响其靶向的组织。因此，如本文所用，术语“施用”当与PIF结合使用时，可以包括但不限于：将PIF肽提供到靶组织中或靶组织上；向患者全身性地提供PIF肽(通过例如静脉内注射)，由此治疗剂到达靶标；向靶标提供编码序列形式的PIF肽(例如，通过所谓的基因疗法技术)。“施用”组合物可以通过肠胃外、口服或局部施用来完成。

如本文所用，术语“治疗剂”意味着用于治疗、对抗、改善、预防或改良受试者所不希望的病症、症状或疾病的药剂。本公开的实施方案部分地涉及治疗、改善、预防或改良自身免疫性疾病。

组合物的“治疗有效量”或“有效量”或“生理上相关的量”是被计算为达到预期效果的量，其中预期效果即有效地抑制或减轻与肌营养不良蛋白相关病症(诸如杜兴氏肌肉营养不良)相关联的症状和/或并发症。本公开化合物的有效量可以客观地或主观地降低与杜兴氏肌肉营养不良相关联的症状的严重性、或减小该症状的频率。当然，根据本公开施用以获得治疗效果和/或防治效果的化合物的具体剂量将由病例周围的特定情况确定，包括例如施用的化合物、施用途径和正在治疗的病症。该化合物在很宽的剂量范围内有效，例如，每天的剂量通常将属于从约0.01mg/kg至约100mg/kg、更优选地从约0.1mg/kg至约1mg/kg的范围。在一些实施方案中，PIF或PIF类似物或肽的治疗有效剂量为约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg和1mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg 8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12mg/kg，其中“mg”是PIF类似物或肽的毫克数，“kg”是受试者的千克数。

在一些实施方案中，该药物组合物包含治疗有效量的PIF肽或类似物，但该组合物不含SEQ ID NO:1或其药学上可接受的盐。

应当理解，施用的有效量将由医师根据相关情况确定，这些相关情况包括待治疗的病症、对待施用化合物的选择和所选择的施用途径，因此上述剂量范围并不旨在以任何方式限制本公开的范围。本公开化合物的治疗有效量典型地是这样的量：该量使得当其在生理上可耐受的赋形剂组合物中施用时，足以在组织中实现有效的全身浓度或局部浓度。在一些实施方案中，如本文所用的术语“治疗有效量”是指活性化合物或药剂引发研究人员、兽医、医师或其他临床医生所寻求的在组织系统、动物或人类中的生物应答或药物应答(包括减轻正在治疗的疾病或病症的症状)的量。在一个方面，治疗有效量是可以以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比治疗或减轻疾病或疾病症状的量。然而，应当理解，本文所述的化合物和组合物的每日总用量可以由主治医师在合理的医学判断范围之内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：正在治疗的病症，和该病症的严重程度；采用的具体化合物的活性；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食：施用时间、施用途径和采用的具体化合物的***率；治疗的持续时间；与采用的具体化合物组合使用或碰巧一起使用的药物；以及研究人员、兽医、医师或其他普通技术的临床医生众所周知的类似因素。

还应当认识到，无论是指单一疗法还是组合疗法，治疗有效量都有利地参照在施用一种或多种本文所述化合物期间可能发生的任何毒性、或其他不期望的副作用来选择。另外，应当认识到，本文所述的共同疗法可以允许施用较低剂量的显示这样的毒性或其他不期望的副作用的化合物，其中这些较低剂量低于毒性阈值，或在治疗窗口中低于在没有共同疗法的情况下原本会施用的剂量。

如本文所用，术语“组合物”通常是指包含规定量的规定成分的任何产品，以及由规定量的规定成分的组合直接或间接产生的任何产品。应当理解，本文所述的组合物可以由本文所述的分离的化合物制备，或由本文所述的化合物的盐、溶液、水合物、溶剂化物和其他形式制备。还应当理解，所述组合物可以由本文所述的化合物的各种无定形、非无定形、部分结晶、结晶和/或其他形态学形式制备。还应当理解，所述组合物可以由本文所述化合物的各种水合物和/或溶剂化物制备。因此，列举本文所述化合物的此类药物组合物应理解为包括本文所述化合物的各种形态学形式和/或溶剂化物形式或水合物形式中的每一种或任意组合。

举例来说，组合物可以包含一种或多种载体、稀释剂和/或赋形剂。本文所述的化合物或包含本文所述化合物的组合物可以以适合于本文所述方法的任何常规剂型，以治疗有效量来配制。本文所述的化合物或包含本文所述化合物的组合物(包括此类配制物)可以利用已知程序，通过本文所述的方法的大量常规途径并且以各种各样的剂量形式来施用(大体上参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,(第21版，2005))。

“免疫调节”是指本公开化合物改变(调节)免疫系统的一个或多个方面的能力。免疫系统通过涉及借助于多个细胞-细胞相互作用彼此调节的淋巴细胞、巨噬细胞和其他抗原呈递细胞的细胞和体液机制，以及通过产生对免疫细胞具有自分泌、旁分泌和内分泌作用的可溶因子(包括淋巴因子和抗体)而起到保护生物体免受感染和免受外来抗原影响的作用。

如本文所用的“营养不良相关病症”或“肌营养不良蛋白相关病症”是指由导致肌微管蛋白退化的蛋白质或肽的异常表达引起的各种疾病。这可以局限于某些器官或涉及受试者的不同部分中的特定组织。大量的肌营养不良蛋白相关病症被人们认识到，包括但不限于表2中鉴定的那些病症：

表2.肌肉营养不良(MD)的类型

在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是肌肉营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是杜兴氏肌肉营养不良(DMD)。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是先天性肌肉营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是肌强直性肌肉营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是贝克尔肌肉营养不良(Becker muscular dystrophy)。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是肢带型肌肉营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是面肩肱型肌肉营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是眼咽型肌肉营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是远端型肌肉营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是埃-德型肌肉营养不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)。

在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是肌肉营养不良诱导的纤维化。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是辐射诱导的纤维化。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白相关病症是外科手术诱导的纤维化。

“炎性应答”或“炎症”是用于由物理损伤、感染或局部免疫应答引发的液体、血浆蛋白和白血细胞局部聚积的一般术语。炎症是许多疾病和病症的一个方面，包括但不限于与免疫病症、病毒感染、关节炎、自身免疫性疾病、胶原蛋白疾病、***反应、哮喘、花粉病和特应性有关的疾病。炎症的特征在于红(发红)、痛(疼痛)、灼烧(发热)和肿块(肿胀)，从而反应了局部血管的变化，这些变化导致：局部血流增加，这造成发热和发红；白血球迁移到周围组织中(外渗)；流体和蛋白从发炎组织中的血液和它们的局部聚积中退出，这导致肿胀和疼痛；以及辅助宿主防御的血浆蛋白聚积。这些变化由活化的巨噬细胞产生的细胞因子引发。炎症经常伴随着由于用损伤组织替换实质组织而造成的功能丧失(例如，在受损的心肌中)、由于疼痛造成的反射性废用，以及对功能的机械约束，例如，当关节在急性炎症期间肿胀时，或当发炎的关节上连接的疤痕组织随着它成熟为慢性炎性病变而收缩时。

“抗炎”是指化合物预防或减轻炎性应答、或通过减轻炎症的症状(诸如发红、疼痛、发热或肿胀)而缓和炎症的能力。炎性应答可以由损伤(例如对皮肤、肌肉、肌腱或神经的损伤)触发。炎性应答也可以作为免疫应答的一部分而被触发。炎性应答也可以由感染触发，在这种情况下，病原体识别和组织损伤可以在感染部位处引发炎性应答。一般来讲，传染因子通过激活先天免疫来诱导炎性应答。炎症通过下述方式来抗击感染：递送另外的效应分子和细胞，以增强前线巨噬细胞对入侵微生物的杀伤；提供物理屏障来阻止感染扩散；以及促进损伤组织的修复。“炎性病症”有时用来指由任何原因造成的慢性炎症。

如本文所用，术语“神经肌肉接头”(或“肌肉神经接头”)是由运动神经元和肌肉纤维之间的接触形成的化学突触。在神经肌肉接头处，运动神经元能够向肌纤维传递信号，导致肌肉收缩。

如本文所用，“保守”氨基酸置换可以如下表A、B或C中所述进行定义。本公开的PIF肽包括肽或肽模拟物或其盐，这些肽或肽模拟物或其盐包含已通过修饰编码本公开多肽的多核苷酸或通过在固体基质上合成简单的蛋白质或肽而引入的保守置换(来自核酸序列或氨基酸序列)。氨基酸可以根据物理特性以及对二级和三级蛋白质结构的贡献来进行分类。保守置换在本领域中被认为是一种氨基酸被具有类似特性的另一种氨基酸置换。在一些实施方案中，保守置换在本领域中被认为是一种核酸被具有类似特性或当编码时具有类似结合亲和力的另一种核酸置换。示例性保守置换在表A中说明。

表A--保守置换I

另选地，保守氨基酸可以如Lehninger,(Biochemistry，第二版；WorthPublishers,Inc.NY,N.Y.(1975)，第71-77页)中所述进行分组，如表B中所述。

表B--保守置换II

另选地，示例性保守置换在表C中说明。

表C--保守置换III

应当理解，本文所述的抑制剂旨在包括核酸，并且在这种情况下，抑制剂包括多肽，具有氨基酸残基的一个或多个***、缺失或置换或它们的任意组合，以及除氨基酸残基的***、缺失或置换之外的修饰的多肽。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指通过酰胺键或非酰胺等效物共价连接的两个或更多个氨基酸。本公开的肽可以具有任何长度。例如，这些肽可以具有从约2至约100或更多个残基，诸如约4至约15、约12至约15、约8至约18、约18至约25、约15至约50、约50至约75、或约75至约100或更多个氨基酸的长度。优选地，肽的长度为从约4至约18个残基。本公开的肽还包括1-异构体和d-异构体，以及1-异构体与d-异构体的组合。这些肽可以包含典型地与蛋白质的翻译后加工相关联的修饰，例如环化(例如二硫键或酰胺键)、磷酸化、糖基化、羧基化、泛素化、十四烷基化或脂化。在一些实施方案中，本公开的组合物或药物组合物涉及表1中所述的任何PIF序列的类似物，这些类似物与表1中所述的PIF序列中的任一者或组合共有不低于约70％、约75％、约79％、约80％、约85％、约86％、约87％、约90％、约93％、约94％约95％、约96％、约97％、约98％、约99％的同源性。在一些实施方案中，PIF或PIF肽可以指选自SEQ ID NO:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29的氨基酸序列，或其与任一此类氨基酸序列约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源的功能片段。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID.NO:20具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID.NO:21具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQID.NO:22具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID.NO:23具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID.NO:24具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID.NO:25具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID.NO:26具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID.NO:27具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID.NO:28具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，PIF可以指包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成的氨基酸序列：该序列与SEQ ID NO:29具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。在一些实施方案中，该PIF突变体包含选自以下的序列：XVZIKPGSANKPSD、XVZIKPGSANKPS XVZIKPGSANKP XVZIKPGSANK XVZIKPGSAN、XVZIKPGSA、XVZIKPGS、XVZIKPG、XVZIKP、XVZIK、XVZI、XVZ，其中X是非天然氨基酸或天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，该PIF突变体包含选自以下的序列：XVZIKPGSANKPSD、XVZIKPGSANKPSXVZIKPGSANKP XVZIKPGSANK XVZIKPGSAN、XVZIKPGSA、XVZIKPGS、XVZIKPG、XVZIKP、XVZIK、XVZI、XVZ，其中X是非天然氨基酸或天然存在的氨基酸，只不过在Z是精氨酸的情况下，X不是蛋氨酸，并且在X是蛋氨酸的情况下，Z不是精氨酸。在一些实施方案中，该PIF类似物或突变体是合成的或以合成方式制造的。

本文所公开的肽还包括具有氨基酸结构类似物和功能类似物的化合物，例如具有合成或非天然氨基酸(诸如正亮氨酸)或氨基酸类似物或非天然侧链的肽模拟物，只要所述模拟物具有本公开化合物的一种或多种功能或活性即可。因此，本公开的化合物包括“模拟物”形式和“肽模拟物”形式。如本文所用，“非天然侧链”是原子通过共价键接合至α-碳原子、β-碳原子或γ-碳原子而形成的经修饰链或合成链，该链不构成氨基酸多肽链的主链。肽类似物可以包括选自以下的非天然氨基酸中的一种或组合:正缬氨酸、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、He、7-氮杂色氨酸、4-氟苯丙氨酸、N-甲基-蛋氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-丙氨酸、肌氨酸、N-甲基-叔丁基甘氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-苯基甘氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-色氨酸、N-甲基-7-氮杂色氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-4-氟苯丙氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-酪氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-赖氨酸、高半胱氨酸和Tyr；Xaa2不存在，或是选自下列的氨基酸：Ala、D-Ala、N-甲基-丙氨酸、Glu、N-甲基-谷氨酸、D-Glu、Gly、肌氨酸、正亮氨酸、Lys、D-Lys、Asn、D-Asn、D-Glu、Arg、D-Arg、Phe、D-Phe、N-甲基-苯丙氨酸、Gin、D-Gln、Asp、D-Asp、Ser、D-Ser、N-甲基-丝氨酸、Thr、D-Thr、N-甲基-苏氨酸、D-ProD-Leu、N-甲基-亮氨酸、D-Ile、N-甲基-异亮氨酸、D-Val、N-甲基-缬氨酸、叔丁基甘氨酸、D-叔丁基甘氨酸、N-甲基-叔丁基甘氨酸、Trp、D-Trp、N-甲基-色氨酸、D-Tyr、N-甲基-酪氨酸、1-氨基环丙烷羧酸、1-氨基环丁烷羧酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环己烷羧酸、4-氨基四氢-2H-吡喃-4-羧酸、氨基异丁酸、(5)-2-氨基-3-(lH-四唑-5-基)丙酸、Glu、Gly、N-甲基-谷氨酸、2-氨基戊酸、2-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基辛酸、2-氨基壬酸、2-氨基癸酸、2-氨基十一烷酸、2-氨基十二烷酸、辛基甘氨酸、氨甲环酸、氨基缬草酸和2-(2-氨基乙氧基)乙酸。丙氨酸的天然侧链或R基团是甲基基团。在一些实施方案中，该组合物的非天然侧链是其中一个或多个氢原子被氘原子替换的甲基基团。非天然侧链在本领域中公开于以下公布中：WO/2013/172954、WO2013123267、WO/2014/071241、WO/2014/138429、WO/2013/050615、WO/2013/050616、WO/2012/166559、美国申请号20150094457，Ma,Z.，以及Hartman,M.C.(2012).In Vitro Selection of Unnatural Cyclic Peptide Libraries via mRNADisplay.载于J.A.Douthwaite&R.H.Jackson(编辑),Ribosome Display and RelatedTechnologies:Methods and Protocols(第367-390页)Springer New York.，所有这些都全文以引用方式并入本文。

术语“模拟物”和“肽模拟物”在本文中可互换使用，并且通常是指模拟所选择的天然肽或蛋白质功能结构域(例如，结合基序或活性位点)的三级结合结构或活性的肽、部分肽或非肽分子。如下文进一步描述，这些肽模拟物包括重组或化学修饰的肽，以及非肽试剂，诸如小分子药物模拟物。在一些实施方案中，PIF是具有本文所公开的一种或多种修饰的PIF模拟物或PIF肽模拟物。术语“类似物”是指包含至少一个α氨基酸和至少一个非天然氨基酸残基的任何多肽，其中该多肽在结构上类似于天然存在的全长PIF蛋白质，并且共有作为该类似物的基础的天然存在全长蛋白质的生物化学活性或生物活性。在一些实施方案中，PIF是具有本文所公开的一种或多种修饰的类似物。在一些实施方案中，组合物、药物组合物和试剂盒包含与表1中所述的PIF序列中的任一者或组合共有不低于约70％、约75％、约79％、约80％、约85％、约86％、约87％、约90％、约93％、约94％约95％、约96％、约97％、约98％、约99％的同源性的肽或肽模拟物；并且其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸残基或具有非天然侧链的氨基酸残基。在一些实施方案中，提供肽或肽模拟物，其中在两个半胱氨酸残基之间形成环。在一些实施方案中，肽模拟物可以与天然肽具有许多类似性，诸如：在已知的20种蛋白质型氨基酸中未发现的氨基酸侧链、用于实现分子的末端或内部部分之间的环化的非肽类接头、酰胺键氢部分被甲基基团(N-甲基化)或其他烷基基团置换、肽键被对化学处理或酶处理具有抗性的化学基团或化学键替换、N-末端和C-末端修饰，以及与非肽延伸部分(诸如聚乙二醇、脂质、碳水化合物、核苷、核苷酸、核苷碱基、各种小分子，或者磷酸酯基团或硫酸酯基团)偶联。如本文所用，术语“环肽模拟物”或“环状多肽模拟物”是指具有一种或多种环特征，诸如环、桥连部分和/或内部键联作为其结构的一部分的肽模拟物。如本文所用，术语“桥连部分”是指将氨基酸序列内的一条或多条氨基酸侧链彼此共价连接的一个或一系列键合原子。

在一些实施方案中，提供肽或肽模拟物，其中环包含选自下列的桥连部分：

其中每个X独立地为N或CH，使得环不含超过2个N；每个Z独立地为键、NR、0、S、CH2、C(O)NR、NRC(O)、S(O)vNR、NRS(O)v；每个m独立地选自0、1、2和3；每个vis独立地选自1和2；每个R独立地选自H和C₁-C₆；并且每个桥连部分通过独立选择的C₀-C₆间隔基与肽连接。

在一些实施方案中，通过用其他侧链，例如用诸如烷基、低级烷基，环状4元、5元、6元至7元烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基和其低级酯衍生物的基团，以及用4元、5元、6元至7元杂环替换20种遗传编码的氨基酸(或D氨基酸)的一条或多条天然存在的侧链来修饰本公开的PIF肽，由此产生肽模拟物。例如，可以制备脯氨酸残基的环大小从5个成员变为4、6或7个成员的脯氨酸类似物。环状基团可以是饱和或不饱和的，并且如果是不饱和的，则可以是芳族基团或非芳族基团。杂环基团可以含有一个或多个氮、氧和/或硫杂原子。此类基团的实例包括呋吖基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基(例如吗啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如1-哌嗪基)、哌啶基(例如1-哌啶基、哌啶基(piperidino))、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如，硫代吗啉代)和***基。这些杂环基团可以是经取代的或未经取代的。在基团被取代的情况下，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧，或者经取代或未经取代的苯基。肽模拟物还可以具有已通过磷酸化、磺化、生物素化或者添加或移除其他部分进行化学修饰的氨基酸残基。

在另一个实施方案中，PIF是式R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-R₇-R₈-R₉-R₁₀-R₁₁-R₁₂-R₁₃-R₁₄-R₁₅化合物，其中R₁是Met或Met模拟物或其盐，R₂是Val或Val模拟物或其盐，R₃是Arg或Arg模拟物，或者任何氨基酸或其盐，R₄是Ile或Ile模拟物或其盐，R₅是Lys或Lys模拟物或其盐，R₆是Pro或Pro模拟物或其盐，R₇是Gly或Gly模拟物或其盐，R₈是Ser或Ser模拟物或其盐，R₉是Ala或Ala模拟物或其盐，R₁₀是Asn或Asn模拟物或其盐，R₁₁是Lys或Lys模拟物或其盐，R₁₂是Pro或Pro模拟物或其盐，R₁₃是Ser或Ser模拟物或其盐，R₁₄是Asp或Asp模拟物或其盐，并且R₁₅是Asp或Asp模拟物或其盐。在另一个实施方案中，化合物具有式R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-R₇-R₈-R₉-R₁₀-R₁₁-R₁₂-R₁₃-R₁₄-R₁₅，其中R₁是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:29的位置1处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₂是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置2处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₃是SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置3处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₄是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置4处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₅是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置5处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₆是SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置6处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₇是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28或SEQ ID NO:29的位置7处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₈是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置5处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₉是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置9处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₁₀是SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置10处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₁₁是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置11处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₁₂是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置12处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₁₃是SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置13处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₁₄是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28或SEQ ID NO:29的位置14处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基；其中R₁₅是SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的位置15处的天然存在残基的模拟物或其盐，或者是此类序列的该位置处的残基。

在一些实施方案中，提供了具有式R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-R₇-R₈-R₉-R₁₀-R₁₁-R₁₂-R₁₃-R₁₄-R₁₅-R₁₆-R₁₇-R₁₈的药物组合物，其中R₁是Ser或Ser模拟物或其盐，R₂是Gly或Gly模拟物或其盐，R₃是Ile或Ile模拟物或其盐，R₄是Val或Val模拟物或其盐，R₅是Ile或Ile模拟物或其盐，R₆是Tyr或Tyr模拟物或其盐，R₇是Gln或Gln模拟物或其盐，R₈是Tyr或Tyr模拟物或其盐，R₉是Met或Met模拟物或其盐，R₁₀是Asp或Asp模拟物或其盐，R₁₁是Asp或Asp模拟物或其盐，R₁₂是Arg或Arg模拟物或其盐，R₁₃是Tyr或Tyr模拟物或其盐，R₁₄是Val或Val模拟物或其盐，R₁₅是Gly或Gly模拟物或其盐，R₁₆是Ser或Ser模拟物或其盐，R₁₇是Asp或Asp模拟物或其盐；并且R₁₈是Leu或Leu模拟物或其盐；以及具有式R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆-R₇-R₈-R₉的化合物，其中R₁是Val或Val模拟物或其盐，R₂是Ile或Ile模拟物或其盐，R₃是Ile或Ile模拟物或其盐，R₄是Ile或Ile模拟物或其盐，R₅是Ala或Ala模拟物或其盐，R₆是Gln或Gln模拟物或其盐，R₇是Tyr或Tyr模拟物或其盐，R₈是Met或Met模拟物或其盐，并且R₉是Asp或Asp模拟物或其盐。在一些实施方案中，R₃不是Arg，也不是Arg模拟物和其盐。

多种技术可用于构建与相应的天然肽具有相同或类似的期望生物活性，但在溶解度、稳定性和/或对水解或蛋白水解的敏感性方面的活性比所述肽更有利的肽模拟物(参见，例如Morgan和Gainor,Ann.Rep.Med.Chem.24,243-252,1989)。某些肽模拟物化合物以本公开的肽的氨基酸序列为基础。通常，肽模拟物化合物是具有基于所选择肽的三维结构的三维结构(即“肽基序)的合成化合物。该肽基序提供具有期望的生物活性(即结合到PIF受体)的肽模拟物化合物，其中该模拟物化合物的结合活性基本上未降低，并且通常与作为该模拟物的模型的天然肽的活性相同或比该活性更高。肽模拟物化合物可以具有增进其治疗应用的附加特征，诸如增加的细胞渗透性、较高的亲和力和/或亲合力，以及延长的生物半衰期。

肽模拟物设计策略是本领域中易于得到的(参见，例如Ripka和Rich，Curr.Op.Chem.Bioi.2,441-452,1998；Hruby等人，Curr.Op.Chem.Bioi.1,114-119,1997；Hruby和Baise,Curr.Med.Chem.9,945-970,2000)。一类肽模拟物的主链是部分或完全非肽的，但从原子看，模拟肽主链原子，并且包含同样模拟天然氨基酸残基的侧链基团的功能的侧基团。本领域中已知若干类型的化学键(例如酯、硫酯、硫代酰胺、逆酰胺、还原羰基、二亚甲基和酮基亚甲基键)通常可用于取代肽键构建蛋白酶抗性肽模拟物。另一类肽模拟物包括结合到另一种肽或蛋白质，但未必是天然肽的结构模拟物的非肽小分子。又一类肽模拟物源自于组合化学性质和大型化学文库的产生。这些通常构成新颖模板，这些模板虽然在结构上与天然肽不相关，但在非肽骨架上安置有必需的官能团以充当原始肽的“表面形状”模拟物(Ripka和Rich，1998,出处同上)。

PIF氨基酸序列的清单在下表1中提供。还提供了针对各种PIF肽和乱序PIF肽的抗体。

表1.PIF肽

在本公开的一些实施方案中，提供了PIF肽(或类似物)。在一些实施方案中，PIF类似物与人胰岛素降解酶(IDE-SEQ ID NO:30)结合或缔合的程度比天然或野生型PIF序列高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更高。在一些实施方案中，PIF类似物对胰岛素降解酶(IDE)的结合亲和力可以比天然或野生型PIF序列高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更高。在一些实施方案中，PIF类似物对胰岛素降解酶的结合亲和力可以比天然或野生型PIF序列对IDE的亲和力高约1％至约30％或更高。在一些实施方案中，PIF类似物对胰岛素降解酶的结合亲和力可以比天然或野生型PIF序列对IDE的亲和力高约1％至约10％或更高。在一些实施方案中，PIF类似物对胰岛素降解酶的结合亲和力可以比天然或野生型PIF序列对IDE的亲和力高约1％至约20％或更高。在一些实施方案中，PIF类似物对胰岛素降解酶的结合亲和力可以比天然或野生型PIF序列对IDE的亲和力高约10％至约20％或更高。治疗有效量的此类PIF肽可以用于治疗本文所公开的任何疾病或病症。

IDE序列：

在另一个实施方案中，提供了包含PIF肽的药物组合物。在优选的实施方案中，该药物组合物包含治疗有效量的PIF肽或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，提供了治疗杜兴氏肌肉营养不良的方法。在一个优选的实施方案中，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的PIF肽。在另一个实施方案中，提供了用于治疗杜兴氏肌肉营养不良的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的PIF肽与一种或多种免疫治疗、抗癫痫、利尿或血压控制药物或化合物的组合。这种组合可以增强任一单独组分的治疗有效性，或者可以提供较低副作用并/或能够减少任一组分的剂量。

在本发明的一个实施方案中，提供了PIF肽。此类PIF肽可以用于治疗或改善营养不良相关病症，诸如DMD。

在另一个实施方案中，提供了包含PIF肽或其药学上可接受的盐的药物组合物。在优选的实施方案中，该药物组合物包含治疗有效量的PIF肽或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，提供了治疗或预防病症的方法。在一个优选的实施方案中，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的PIF肽。这些方法特别可用于治疗或预防免疫介导的病症，包括但不限于移植物抗宿主病1型糖尿病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn's disease)、类风湿性关节炎等。

对于指定适应症的治疗性治疗，PIF肽可以如此施用，或者可以混配并配制成呈单位剂型的药物组合物，以便肠胃外、透皮、直肠、鼻腔、局部静脉内施用，或优选地经口施用。此类药物组合物以本领域中众所周知的方式制备，并且包含与药用载体缔合的至少一种活性PIF肽。如本说明书通篇所用，术语“活性化合物”是指选自所述式的化合物的至少一种化合物或其药学上可接受的盐。

在这种组合物中，活性化合物被称为“活性成分”。在制备组合物时，活性成分通常将与载体混合，或用载体稀释，或封装于可以为胶囊、药囊、纸或其他容器形式的载体之内。当载体充当稀释剂时，它可以是充当活性成分的媒介物、介质的赋形剂的固体、半固体或液体材料。因此，该组合物可以为片剂、丸剂、散剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、混悬剂、软质和硬质明胶胶囊、无菌可注射溶液剂和无菌带包装散剂的形式。

术语“药物制剂”或“药物组合物”包括适合施用于哺乳动物(例如人类)的制剂。当将本公开的化合物作为药物施用于哺乳动物(例如人类)时，这些化合物可以原样给予或作为含有例如从约0.1％至约99.5％的活性成分与药学上可接受的载体的组合的药物组合物给予。

短语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物当施用于人类时是生理上可耐受的并且典型地不会产生***反应或类似不良反应，诸如反胃、眩晕等。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”意味着得到联邦监管机构或州政府批准，或者在美国药典或其他公认的药典中列出适用于动物，并且更确切地说适用于人。在一个优选的实施方案中，该治疗组合物在出于治疗目的施用于受试者时，不具有免疫原性。

短语“药学上可接受的载体”是技术公认的，并且包括适合于将本公开的化合物施用给哺乳动物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。在一些实施方案中，本公开的组合物和药物组合物包含一种或多种本文所公开的药学上可接受的载体。载体包括将主题药剂从一个器官或身体部分载运或运送至另一个器官或身体部分所涉及的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。每种载体在与配制物的其他成分相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液或乳酸林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和药物配制物中采用的其他无毒相容性物质。合适的药物载体描述于E.W.Martin所著的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中，该文献全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是无菌且无热原的水。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是是林格氏乳酸盐，有时称为乳酸林格氏溶液。

润湿剂、乳化剂和润滑剂(诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于该组合物中。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基大茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

本公开的配制物包括适合于经口、鼻、局部、经颊、舌下、直肠、***和/或肠胃外施用的那些。这些配制物可以适合地呈单位剂型，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗作用的该化合物的量。一般来讲，以100％计，该量将在从约1％至约99％、优选地从约5％至约70％、最优选地从约10％至约30％活性成分的范围内。

合适的载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、***胶、磷酸钙海藻酸盐、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、黄蓍胶、明胶、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、水和矿物油。所述配制物可以另外包含润滑剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂。所述组合物可以被配制成在采用本领域众所周知的程序施用于患者之后，提供活性成分的快速、持续或延迟释放。

对于经口施用，可以将化合物与载体和稀释剂混合，模制成片剂，或封装于明胶胶囊中。作为替代，可以将混合物溶解于诸如10％葡萄糖水溶液、等渗盐水、无菌水等液体中，然后静脉内施用或通过注射施用。

可以通过在靶标部位处或靠近靶标部位施用活性化合物的多种技术局部递送抑制量的该化合物以治疗营养不良相关病症。局部递送技术的实例不旨在作为限制，而是对可用技术的说明。实例包含局部递送导管、位点特异性载体、植入物、直接注射或直接涂覆，诸如局部涂覆。

通过植入物局部递送描述了将含有药剂的基质手术放置到感染部位中。植入的基质通过扩散、化学反应或溶剂活化剂来释放药剂。

例如，在一些方面，本公开涉及包含PIF肽和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，或者治疗有效量的包含PIF肽或其盐的药物组合物。

本公开的化合物可以通过这些化合物有活性的任何途径以常规方式施用。施用可以是全身性的、局部的，或经口施用。例如，施用可以是但不限于肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、透皮、经口、经颊、眼部途径、***内、通过吸入、通过积存注射或通过植入物。因此，本公开化合物(单独地或与其他药物组合)的施用方式可以是但不限于舌下、可注射(包括皮下或肌内注射的短效形式、积存形式、植入物形式和团粒形式)，或通过使用***霜剂、栓剂、***栓、***环、直肠栓剂、子宫内装置和透皮形式，诸如贴剂和霜剂。

具体的施用方式将取决于适应症。具体施用途径和剂量方案的选择将由临床医师根据临床医师已知的方法调整或滴定，以便获得最佳临床应答。待施用的化合物的量是治疗有效的量。待施用的剂量将取决于正在治疗的受试者的特征，例如所治疗的特定哺乳动物或人类、年龄、体重、健康状况、同期联合治疗(如果存在的话)的类型和治疗频率，并且可以由本领域的技术人员(例如，由临床医师)容易地确定。

含有本公开化合物与合适载体的药物配制物可以是固体剂型，包括但不限于片剂、胶囊、扁囊剂、团粒、丸剂、散剂和颗粒剂；局部用剂型，包括但不限于溶液剂、散剂、流体乳剂、流体混悬剂、半固体、软膏剂、糊剂、霜剂、凝胶和凝胶剂，以及泡沫剂；和肠胃外剂型，包括但不限于溶液剂、混悬剂、乳剂和干燥散剂；这些剂型包含有效量的本公开的聚合物或共聚物。本领域中还知道，此类配制物中可以含有活性成分与药学上可接受的稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水性媒介物、水溶性媒介物、乳化剂、缓冲剂、保湿剂、增湿剂、增溶剂、防腐剂等。施用的方式和方法是本领域中已知的，并且从业者可以参考各种药理学参考文献的指导。例如，可以查阅Modern Pharmaceutics,Banker和Rhodes,Marcel Dekker,Inc.(1979)；以及Goodman和Gilman的The Pharmaceutical Basis ofTherapeutics,第6版，MacMillan Publishing Co.,New York(1980)。

本公开的化合物可以被配制用于通过注射(例如通过弹丸式注射或连续输注)而肠胃外施用。这些化合物可以通过在预定的时间段内连续皮下输注来施用。用于注射的配制物可以呈例如在安瓿或多剂量容器中的单位剂型，其中添加有防腐剂。所述组合物可以呈如在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配制剂。

对于经口施用，可以通过将这些化合物与本领域中众所周知的药学上可接受的载体组合，来容易地配制所述化合物。此类载体使本公开的化合物能够被配制成片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬剂等，以供待治疗的患者口服摄取。可以通过添加固体赋形剂，任选地研磨所得的混合物，并且处理颗粒混合物，必要时改变添加合适的助剂，以获得片剂或糖衣药丸芯，来获得供口服使用的药物制剂。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，诸如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；纤维素制剂，诸如但不限于玉蜀黍淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。必要时，可以添加崩解剂，诸如但不限于交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、或者海藻酸或其盐(诸如海藻酸钠)。

糖衣药丸芯可以具有合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地含有***胶、滑石、聚乙烯基吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、亮漆溶液，与合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣药丸包衣中添加染料或颜料，以标识或表征活性化合物剂量的不同组合。

可以口服使用的药物制剂包括但不限于：明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂(诸如甘油或山梨糖醇)制成的软质带刻度胶囊。推入配合胶囊可以含有活性成分与填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及任选使用的稳定剂的混合物。在软质胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮于合适的液体(诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。此外，可以添加稳定剂。经口施用的所有配制物都应当呈适合于此类施用的剂量。

对于经颊施用，所述组合物可以呈以常规方式配制的例如片剂或锭剂的形式。

对于通过吸入施用，根据本公开使用的化合物适合地使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)，以从加压包装或喷雾器提供的气雾剂喷雾的形式递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀递送计量数量来测定剂量单位。可以配制含有所述化合物与合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物的例如明胶胶囊和药筒，以用于吸入器或吹入器中。

本公开的化合物还可以配制成例如含有常规栓剂基质(诸如可可脂或其他甘油酯)的直肠组合物(诸如栓剂或滞留型灌肠剂)。

除先前描述的配制物之外，本公开的化合物还可以配制成贮存制剂。此类长效配制物可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。

贮存注射液可以按约1个月至约6个月或更长的时间间隔施用。因此，例如，所述化合物可以用合适的聚合材料或疏水性材料(例如作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如，配制为微溶性盐。

在透皮施用时，本公开的化合物例如可以施加至硬膏剂，或者可以通过透皮治疗系统施加，由此供应给生物体。

所述化合物的药物组合物还可以包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物，诸如聚乙二醇。

对于肠胃外施用，类似物可以例如与药学上可接受的肠胃外媒介物结合，配制成溶液剂、混悬剂、乳剂或冻干粉末。此类媒介物的实例是水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人类血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性媒介物(诸如不挥发性油)。媒介物或冻干粉末可以含有维持等渗性(例如氯化钠、甘露糖醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。所述配制物通过常用技术灭菌。例如，适合于通过注射施用的肠胃外组合物是通过将按重量计1.5％的类似物溶解于0.9％氯化钠溶液中来制备的。

本发明涉及施用途径，包括肌内、舌下、静脉内、腹膜内、鞘内、***内、尿道内、真皮内、颊内、经由吸入、经由喷雾器和经由皮下注射施用。作为替代，可以通过各种手段将药物组合物引入到从个体移除的细胞中。此类手段包括例如微弹轰击和脂质体或其他纳米粒子装置。

用于经口施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在固体剂型中，类似物通常与至少一种惰性的药学上可接受的载体(诸如蔗糖、乳糖、淀粉或其他通常被认为安全(GRAS)的添加剂)混合。与常规实践相同，此类剂型还可以包含除惰性稀释剂之外的附加物质，例如润滑剂，诸如镁状态。对于胶囊、片剂和丸剂，这些剂型还可以包含缓冲剂。片剂和丸剂可以另外使用本领域中已知的技术，用肠溶包衣或以控制释放形式制备。

供经口施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂和糖浆剂，其中酏剂含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水。这些组合物还可以包含一种或多种佐剂，诸如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂或芳香剂。

在本发明的其他实施方案中，使用本公开的组合物、本公开的药物组合物治疗患有或易患杜兴氏肌肉营养不良或营养不良相关病症的患者。

本领域的技术人员将认识到，所述组合物和药物组合物的适当剂量可以根据正在治疗的个体和目的而变化。例如，个体患者的年龄、体重和病史可能影响疗法的治疗功效。另外，可能需要较低剂量的组合物来使症状短暂终止，而可能需要较大剂量来使与疾病、病症或适应症相关联的症状完全终止。合格的医师可以考虑这些因素并调整给药方案，以确保剂量实现期望的治疗结果，而无需过度实验。还应当注意，临床医师和/或治疗医师结合个别患者的应答将了解如何并且何时中断、调整和/或终止疗法。剂量还可以取决于为药物组合物选择的特定类似物的强度。

所述组合物或药物组合物的剂量可以变化。所述组合物的剂量可以是每天一次。在一些实施方案中，可以每天向受试者施用多个剂量。在一些实施方案中，总剂量是以至少两个施加时段施用的。在一些实施方案中，该时段可以是一小时、一天、一个月、一年、一周或两周的时段。在本发明的另一个实施方案中，总剂量是以两个或更多个独立施加时段施用的，或在约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12或更多个小时、1天、1个月、1年、1周或2周的过程中以独立剂量施用的

在一些实施方案中，可以向受试者施用以下组合物：其中该组合物以约0.0001mg/kg至约5000mg/kg受试者重量的日剂量范围提供。向受试者施用的剂量还可以根据每天施用的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的总量来衡量。在一些实施方案中，每天向受试者施用从约0.001毫克至约3000毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约2000毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1800毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1600毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1400毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1200毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1000毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约800毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用从约0.001毫克至约700毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约700毫克的PIF肽或PIF类似物。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约600毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约500毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约400毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约300毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约200毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约100毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约50毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，可以向受试者施用以下组合物：其中包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的该组合物以约0.0001mg/kg至约5000mg/kg受试者重量的日剂量范围施用。在一些实施方案中，包含PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约450mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约400mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约350mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约300mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约250mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约200mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约150mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约100mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约50mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约25mg/kg受试者重量的日剂量施用。

在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约10mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约5mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约2.0mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约3.0mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约1mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF肽或PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约0.1mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约0.01mg/kg受试者重量的日剂量施用。在一些实施方案中，包含PIF类似物或其药学上可接受的盐的组合物以最多约0.001mg/kg受试者重量的日剂量施用。向受试者施用的剂量还可以根据每天施用的PIF肽或PIF类似物的总量来衡量。

在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约1ng至约500μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约1ng至约10ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约10ng至约20ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约10ng至约100ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约100ng至约200ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约200ng至约300ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约300ng至约400ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约400ng至约500ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约500ng至约600ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约600ng至约700ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约800ng至约900ng的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约900ng至约1μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约1μg至约100μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约100μg至约200μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约200μg至约300μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约300μg至约400μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约400μg至约500μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约500μg至约600μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约600μg至约700μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约800μg至约900μg的类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约900μg至约1mg的类似物或其药学上的盐。

在一些实施方案中，每天向有需要的受试者施用从约.0001毫克至约3000毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约2000毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1800毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1600毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1400毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1200毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约1000毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每天向受试者施用最多约800毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用从约0.0001毫克至约700毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约700毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约600毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约500毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约400毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约300毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约200毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约100毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约50毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约25毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约15毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约50、60、70、80、90或100毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。

在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约10毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约5毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约1毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约0.1毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。在一些实施方案中，每剂向受试者施用最多约0.001毫克的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐。

向受试者施用的剂量还可以根据每盎司制备的液体中所施用的PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的总量来衡量。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约2.5克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约2.25克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约2.25克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约2.0克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.9克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.8克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.7克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.6克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.5克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.4克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.3克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.2克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.1克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约1.0克每盎司溶液。

在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.9克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.8克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.7克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.6克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.5克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.4克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.3克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.2克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.1克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.01克每盎司溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.001克每盎司制备的溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.0001克每盎司制备的溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.00001克每盎司制备的溶液。在一些实施方案中，PIF肽或PIF类似物或其药学上的盐的浓度为约0.000001克每盎司制备的溶液。

剂量可以根据每升所制备的液体配制物中的类似物的质量来衡量。本领域的技术人员可以增加或减少剂量中的类似物的浓度，具体取决于治疗或预防与治疗有需要的受试者相关联的任何上文所提到的病症所需要的生物活性强度。例如，本发明的一些实施方案在每5mL液体配制物中可以包含最多0.00001克类似物，并且在每5mL液体配制物中可以包含最多约10克类似物。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ IDNO:11。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQID NO:15。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:21。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:28。在一些实施方案中，包含PIF类似物的药物组合物或在任何所公开的方法中的任何此类组合物不含SEQ ID NO:29。

在一些实施方案中，要求权利的本发明的药物组合物包含治疗有效量的至少一种或多种除PIF肽、其类似物或药学上可接受的盐之外的活性剂。在一些实施方案中，该活性剂任选地通过蛋白酶可切割接头(包括但不限于Pro-Pro或瓜氨酸-缬氨酸二-α-氨基酸接头)与本文所公开的PIF肽或PIF类似物共价连接。在一些实施方案中，所述一种或多种活性剂是选自以下的化合物中的一种或组合：抗炎化合物、α-肾上腺素能激动剂、抗心律失常化合物、镇痛化合物和/或麻醉化合物。

表Y

抗炎化合物的实例包括：

阿司匹林

塞来昔布

双氯芬酸

二氟尼柳

依托度酸

布洛芬

吲哚美辛

酮洛芬

酮咯酸萘丁美酮

萘普生

奥沙普秦

吡罗昔康

双水杨酸酯

舒林酸

托美丁

α-肾上腺素能激动剂的实例包括：

甲氧明

甲基去甲肾上腺素

米多君

羟甲唑啉

间羟胺

苯肾上腺素

可乐定(混合的α2-肾上腺素能激动剂和咪唑啉-I1受体激动剂)

胍法辛(倾向于α2A亚型肾上腺素受体)

胍那苄(选择性最强的α2-肾上腺素能激动剂，与咪唑啉-I1相对)胍诺沙苄(胍那苄的代谢物)

胍乙啶(外周α2受体激动剂)

甲苯噻嗪，

替扎尼定

美托咪定

甲基多巴

法度咪定

右美托咪定

抗心律失常化合物的实例包括：

胺碘酮(Cordarone，Pacerone)

盐酸苄普地尔(Vascor)

丙吡胺(Norpace)

多非利特(Tikosyn)

决奈达隆(Multaq)

氟卡尼(Tambocor)

伊布利特(Corvert)

利多卡因(Xylocaine)

普鲁卡因胺(Procan，Procanbid)

普罗帕酮(Rythmol)

***(Inderal)

奎尼丁(许多商品名)

索他洛尔(Betapace)

妥卡尼(Tonocarid)

镇痛化合物的实例包括：

可待因

氢可酮(Zohydro ER)，

羟考酮(OxyContin，Roxicodone)，

***

氢***酮(Dilaudid，Exalgo)，

***(Avinza，Kadian，MSIR，MS Contin)，和

芬太尼(Actiq，Duragesic)

麻醉化合物的实例包括：

地氟烷

异氟烷

氧化亚氮

七氟醚

氙气

本公开的化合物还可以与其他活性成分(诸如佐剂)或者其他相容的药物或化合物组合施用、相继施用，在这种情况下，发现这种组合在实现本文所述方法的期望作用方面是合乎需要的或有利的。

方法

国际申请序列号PCT/US2012/027480通过引用全文并入本文，并且其中所公开的任何方法可以用本申请的PIF类似物代替或加上用天然PIF序列进行的实验来进行。对比实验可以证实，本申请的PIF类似物可以共有在国际申请序列号PCT/US2012/027480中测试的一种或多种特性。

本文所公开的方法可以与本文所公开的任何化合物、组合物、制剂和试剂盒一起使用。

本公开还涉及用于治疗杜兴氏肌肉营养不良的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述组合物。

在一个实施方案中，该组合物每天向有需要的受试者施用一次。在另一个实施方案中，该组合物每隔一天、每隔两天施用，或每周施用一次。在另一个实施方案中，该组合物每天施用两次。在又一个实施方案中，该组合物每天施用三次或每天施用四次。在另一个实施方案中，该组合物每天至少施用一次，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。在又另一个实施方案中，该组合物每天至少施用一次，持续更长的期限，诸如至少4、6、8、10、12或24个月。在一些实施方案中，施用包括但不限于以每天最少1、2、3或4次的频率施用10至50mg剂量的组合物。任选地，继续施用，直到所有症状都被医务人员经由标准化测试(诸如SCAT 2)解决和清除。

在一些实施方案中，该组合物每天至少施用一次，直到病症已经改善到不需要进一步治疗的情形。在另一个实施方案中，施用该组合物直到杜兴氏肌肉营养不良的所有症状都得到解决。在另外的实施方案中，该组合物在受试者无症状之后施用至少1、2、3、6、8、10或12或24个月。

本公开的组合物当被施用以治疗杜兴氏肌肉营养不良时，是有用且有效的。该组合物中存在的每种组分的量将是治疗有效的量，即，当施用时会引起对所述病症(例如，杜兴氏肌肉营养不良)的有效治疗的量。治疗有效量将取决于受试者以及损伤的严重程度和性质而变化，并且可以由本领域的普通技术人员常规地确定。

在一些实施方案中，本公开涉及治疗或预防美国专利号8,222,211、7,723,289、7,723,290、8,454,967、9,097,725(各自全文以引用方式并入本文)中所述的任何适应症的方法，包括施用本文所公开的包含任何一种或多种PIF肽，其类似物或药学上可接受的盐的组合物或药物组合物。

在一些方法中，本公开涉及刺激有需要的受试者中的干细胞分化和/或增殖的方法，包括施用包含本文所公开的任一种或多种PIF肽、类似物或其药学上可接受的盐的组合物或药物组合物。

在一些实施方案中，本公开涉及美国专利号7,273,708、7,695,977、7,670,852、7,670,851、7,678,582、7,670,850、8,012,700(各自全文以引用方式并入本文)中所公开的任一种方法，包括施用本文所公开的包含任何一种或多种PIF肽、其类似物或药学上可接受的盐的组合物或药物组合物。

本公开还通过引用方式将下列美国专利全文并入本文：美国专利号7,789,289、7,723,290、8,222,211和8,454,967。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向受试者施用包含PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的至少一种或多种本文所公开的组合物来治疗该受试者中的营养不良相关病症的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向受试者施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来治疗该受试者中的营养不良相关病症的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用包含PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的至少一种或多种本文所公开的组合物来治疗营养不良相关病症的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来治疗营养不良相关病症的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过施用包含PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的至少一种或多种本文所公开的组合物来治疗杜兴氏肌肉营养不良的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来预防营养不良相关病症的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向受试者施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来预防营养不良相关病症的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来预防营养不良相关病症的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来预防杜兴氏肌肉营养不良的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向受试者施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来预防杜兴氏肌肉营养不良的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来预防杜兴氏肌肉营养不良的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向受试者施用下列药物组合物来治疗有需要的受试者中的杜兴氏肌肉营养不良的方法，该药物组合物包含治疗有效量或治疗有效剂量的至少：(i)一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐；和(ii)药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本公开涉及用于治疗受试者中的营养不良相关病症(诸如杜兴氏肌肉营养不良)的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量或治疗有效剂量的至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本公开涉及治疗有效量或治疗有效剂量的本文所公开的任何一种或多种组合物在制造用于治疗杜兴氏肌肉营养不良的药物中的用途，所述组合物包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本公开涉及药物组合物在制造用于杜兴氏肌肉营养不良的药物中的用途，该药物组合物包含治疗有效量或治疗有效剂量的至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本公开涉及当受试者已经患有或疑似患有杜兴氏肌肉营养不良时，在有需要的受试者中诱导免疫调节作用的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用包含PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的至少一种或多种本文所公开的组合物来治疗纤维化的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来治疗纤维化的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用包含PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的至少一种或多种本文所公开的组合物来预防纤维化的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用包含至少一种PIF肽、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗有效量或治疗有效剂量的一种或多种本文所公开的组合物来预防纤维化的方法。

在一些实施方案中，相比于在施用任何所公开的组合物之前测量的受试者中的纤维化的量，治疗纤维化的方法导致纤维化减少。在一些实施方案中，纤维化可以通过肌肉运动性、肌肉力量、肌肉张力和/或肌肉稳定性来测量。在一些实施方案中，纤维化可以通过肌肉电活动(诸如通过肌电描记术)测量。在一些实施方案中，纤维化可以使用基于不良反应的纤维化等级(诸如附录1中所示的NCI-CTCAE-V4)来衡量。

在一些实施方案中，相比于在施用任何所公开的组合物之前测得的受试者中的纤维化的量，本文所公开的方法将导致纤维化减少约5％、纤维化减少约10％、纤维化减少约20％、纤维化减少约30％、纤维化减少约40％、纤维化减少约50％、纤维化减少约60％、纤维化减少约70％、纤维化减少约80％、纤维化减少约90％、纤维化减少约95％、或纤维化减少约100％。

在一些实施方案中，这些方法包括改善受试者中的肌肉无力的方法，包括向有需要的受试者施用这样的药物组合物：该药物组合物包含药学有效量的PIF肽、其盐或其肽模拟物，和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，与施用治疗之前测得的受试者肌肉无力评分相比，肌肉无力改善了至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或约30％或更多。在一些实施方案中，通过牛津量表(Oxford Scale)和/或步行指数(AI)来衡量肌肉无力。

肌肉力量分级量表(牛津量表)

对改良牛津分级系统的改编可以用于通过使用操纵或触诊来评估肌肉的力量。该量表分为如下15个类别：

0＝“0”：没有活动的肌肉收缩

1＝”1-”

2＝“1”：非常轻微的肌肉收缩

3＝“1+”：

4＝“2-”

5＝“2”：克服重力的全动作

6＝“2+”

7＝“3-”

8＝“3”：对抗重力的全动作

9＝“3+”

10＝“4-”

11＝“4”：对抗轻微阻力的全动作

12＝“4+”

13＝“5-”

14＝“5”：对抗强大阻力的全动作

15＝“5+”

AI是Hauser等人(1983)开发的评定量表，通过评估步行25英尺所需的时间和协助程度来评价移动性。分数范围为0(无症状且完全能活动)到10(卧床不起)。患者被要求尽可能快且安全地步行标记的25英尺路程。检查人员记录下所需的时间和协助类型(例如，手杖、助行器、拐杖)。

施用时间将根据患者的能力而变化。总施用时间应当为约1至5分钟。AI由受过训练的检查人员亲自管理。检查人员不必是医师和护士。

评分

尽管患者的步行具有时限性，但是时间并未直接使用，而是与其他因素结合用于按顺序量表用11个等级对患者评分。

Hauser步行指数

0＝无症状；完全能活动。

1＝正常行走，但报告疲劳妨碍了运动或其他要求高的活动。

2＝步态异常或偶发性失衡；步态病症被家人和朋友注意到；能够在10秒或更短时间内行走25英尺(8米)。

3＝独立行走；能够在20秒或更短时间内行走25英尺。

4＝需要单侧支撑(手杖或单拐)才能行走；在20秒或更短时间内行走25英尺。

5＝需要双侧支撑(手杖、拐杖或助行器)，并且在20秒或更短时间内行走25英尺；或需要单侧支撑，但需要超过20秒才能行走25英尺。

6＝需要双侧支撑，并且需要超过20秒才能行走25英尺；偶尔可能会使用轮椅*。

7＝在双侧支撑下，行走仅限于几步；无法行走25英尺；可以使用轮椅*进行大多数活动。

8＝局限于轮椅；能够独立自我转移。

9＝局限于轮椅；无法独立自我转移。

*使用轮椅可能由生活方式和动机决定。预计等级7的患者将比等级5或6的患者更频繁地使用轮椅。然而，分配在5至7范围内的等级由患者行走给定距离的能力决定，而不由患者使用轮椅的程度决定。

试剂盒

根据本发明的一些实施方案，配制物可以作为试剂盒的一部分提供。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:1至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:2至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:3至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:4至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:5至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:6至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ IDNO:7至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQID NO:8至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:9至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:10至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:11至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:12至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:13至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:14至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:15至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:16至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:17至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:18至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:19至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:20至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:21至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:22至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:23至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:24至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ IDNO:25至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含

PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:26至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:27至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:28至少70％同源。在一些实施方案中，该试剂盒包含PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐，所述PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐包含非天然氨基酸或与SEQ ID NO:29至少70％同源。在另一个实施方案中，该试剂盒包括类似物的药学上可接受的盐与复水混合物。在另一个实施方案中，类似物的药学上可接受的盐是在一个容器中，而复水混合物是在第二个容器中。供应的复水混合物可以是干燥形式，可以在施用之前向其中添加水或其他液体溶剂以形成悬浮液或溶液。复水混合物是被设计成在向受试者施用组合物利用至少一剂泻剂之前溶解本发明的冻干的不溶性盐的混合物。在另一个实施方案中，该试剂盒包括口服可用丸剂形式的药学上可接受的盐。

该试剂盒可以包括两个或更多个容器、包装或分配器，连同有关制备和施用的说明。在一些实施方案中，该试剂盒包括至少一个包含本文所述的一种或多种药物组合物的容器，以及包含用于递送所述组合物的装置(诸如注射器)的第二容器。在一些实施方案中，该试剂盒包括含有呈溶液或者冻干或干燥形式的类似物连同复水混合物的组合物。在一些实施方案中，所述类似物和复水混合物可以在一个或多个附加容器中。

试剂盒中所包含的组合物可以提供于任何种类的容器中，由此保持不同组分的保存期，而且不会被容器的材料吸附或改变。例如，合适的容器包括普通瓶子，这些普通瓶子可以由玻璃、有机聚合物(诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、陶瓷、金属或典型地用于保存试剂或食品的任何其他材料)制造；封包，这些封包可以由衬箔的内部(诸如铝或合金)组成。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶和注射器。这些容器可以具有由易于移除的膜分隔开的两个隔室，在移除该膜时，允许所述组合物的各组分混合。可移除膜可以是玻璃、塑料、橡胶或其他惰性材料。

试剂盒还可以提供有说明材料。说明可以印刷在纸或其他基材上，并且/或者可以作为电子装置可读介质，诸如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、压缩盘、录像带、录音带或其他可读存储器存储装置来供应。详细说明可能不是以物理方式与试剂盒相关联的；而是可以将用户导引至试剂盒的制造商或经销商指定的互联网网站，或作为电子邮件供应。

在另一个实施例中，提供了带包装的试剂盒，该试剂盒含有待施用的药物配制物，即，含有PIF肽和/或PIF类似物或其药学上可接受的盐的药物配制物；用于在储存期间和在使用之前容纳所述配制物的任选地密封的容器(例如，小瓶、瓶子、小袋、封包、罐、管、雾化器、气雾剂罐等)；以及用于以有效地治疗任一种或多种本文所公开的适应症的方式进行药物施用的说明。所述说明典型地将是在包装说明书、标签和/或试剂盒的其他部件上的书面说明。

取决于配制物的类型和预期的施用模式，该试剂盒还可以包括用于施用所述配制物的装置(例如，透皮递送装置)。该施用装置可以是滴管、药签、药棒，或者雾化器或气雾剂罐的喷嘴或出口。所述配制物可以是如本文所述的任何合适的配制物。例如，所述配制物可以是含有单位剂量的活性剂的口服剂型，或者管内所含的凝胶或软膏剂。该试剂盒可以含有不同剂量的同一药剂的多种配制物。该试剂盒也可以含有不同活性剂的多种配制物。该试剂盒可以在单独的容器或注射器中含有治疗营养不良相关病症的一种或多种症状所必需的多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，该试剂盒在1、2、3、4或5个容器(诸如注射器)中含有约1、2、3、4或5个或更多个剂量，所述容器能够将这些剂量中的任一者施用到有需要的受试者中。

本发明的试剂盒典型地还将包括用于包装各个试剂盒部件的构件，其中试剂盒部件即药物剂型、施用装置(如果包括的话)和书面使用说明。此类包装构件可以呈卡纸板或纸箱、塑料或箔制小袋等形式。

通过参考以下非限制性实施例，可以进一步理解说明所使用的方法和材料的本公开和实施方案。

实施例

实施例1

杜兴氏肌肉营养不良

植入前因子(PIF)存在于母体循环中，是由可存活的哺乳动物胚胎分泌的含15个氨基酸的肽。合成PIF(sPIF)目前用于自身免疫性肝炎的临床试验中。杜兴氏肌肉营养不良(DMD)是由肌营养不良蛋白基因突变引起的骨骼肌和心肌的进行性致死性X连锁疾病，该疾病导致肌肉退化。肌营养不良蛋白功能丧失导致损伤，并最终导致肌肉纤维萎缩以及发生非对称***的卫星细胞受损，而非对称***对于肌肉再生至关重要。退化的肌肉使***增多，该过程通常被称为纤维化。

植入前因子或PIF是由可存活的人胚胎、牛胚胎和鼠胚胎分泌的含十五个氨基酸的线性肽(Stamatkin等人，2011；Stamatkin等人，2011b；Barnea等人，2012；Ramu等人，2013)。在单独培养的牛胚胎和鼠胚胎中，培养基中PIF水平的增加与胚胎发育相关，而在不可存活的胚胎中不存在PIF(Stamatkin等人，2011)。PIF在人类妊娠中发挥至关重要的作用，因为它促使子宫内膜植入、促进滋养层侵入并调节全身免疫应答(Barnea等人，2012；Paidas等人，2010；Barnea等人，2012b；Duzyj等人，2010)。与PIF的免疫调节特征相关，记录了治疗非妊娠自身免疫模型和移植模型的转化方面(Weiss等人，2011；Weiss等人，2012；Azar等人，2013)。PIF还促进滋养层侵入，并协调母体的全身性免疫应答(Barnea等人，2012；Duzyj等人，Roussev等人，2013)。自身免疫模型和移植模型中的途径分析证实，作为单一药剂施用于非妊娠小鼠的sPIF通过减少氧化应激和蛋白质错误折叠而起作用(Weiss等人，2011；Weiss等人，2012；Paidas等人，2012；Azer等人，2013；Shainer等人，2013)。

Treg来源于T细胞的CD4谱系并且在胸腺中天然产生，表达IL-10受体(CD25+)和叉头框P3转录因子(Foxp3+)。CD4+T细胞通过细胞因子在微环境中增加所诱导的Foxp3表达而成为Treg。活化的Treg通过抑制树突状细胞或其他抗原呈递细胞(APC)触发效应T细胞增殖来间接地抑制效应T细胞的应答(Tang等人，2006)。Treg通过产生IL-10和转化生长因子-β来诱导免疫耐受，并且通过产生抗炎细胞因子或Th2来抑制T辅助细胞活化(von Boemer等人，2006)。Treg的缺失或耗尽导致小鼠和人类中的多系统自身免疫(Bruckner等人，2010)。据报道，Treg对于肿瘤生长至关重要，因为它们可以提供免疫保护的微环境(Bergman等人，2007；Strauss等人，2007；Bergmann等人，20011；Wang等人，2012)。已经报道了受杜兴氏肌肉营养不良影响的女性的在位和异位子宫内膜中存在Treg(Budiu等人，2009；Berbic等人，2010)。

材料和方法

在Bio-Synthesis,Inc.(Lewisville,TX)采用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)化学过程，通过固相肽合成(肽合成仪，Applied Biosystems)而合成的合成PIF15(MVRIKPGSANKPSDD)(SEQ ID NO:13)和具有相同氨基酸序列的乱序肽。通过反相HPLC进行最终纯化，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱和纯度大于95％的氨基酸分析来验证鉴别。

结果

到目前为止，我们的结果记录了PIF治疗促进小鼠成肌细胞和人类卫星细胞的分化，如通过MyoD和MyHC表达的增加和Pax-7水平的降低所证实的。PIF治疗还增加了成肌细胞向多核肌管中的融合。此外，PIF治疗经由下调let-7而增加肌营养不良蛋白相关蛋白(肌营养不良蛋白的蛋白质同源物)的水平。我们还使用mdx小鼠检查了施用PIF对DMD的治疗作用。施用PIF显著降低了血清的肌酸激酶(CK，一种肌肉损伤标志物)水平，以及mdx小鼠隔膜中的IV型胶原蛋白水平，这表明肌肉纤维化显著减轻。考虑到PIF的已知抗炎作用，连同PIF对细胞再生以及抑制肌肉损伤和纤维化的当前作用，我们认为PIF可以是治疗DMD的潜在治疗剂。

杜兴氏肌肉营养不良(DMD)是与肌肉功能的进行性退化相关联的一种常见的遗传性神经肌肉疾病，也是由已知最大的基因-肌营养不良蛋白基因中的突变引起的X连锁隐性病症，每3,500名男性中就有1名受其影响。该基因可以通过改变添加/缺失或甚至通过点突变来改变，这增加了疾病表现的可变性。绝大多数DMD患者缺乏肌营养不良蛋白。贝克尔肌肉营养不良与较温和的肌营养不良蛋白缺陷相关联。遗传筛查可以改善对携带者的早期鉴定。

临床前研究使用多种模型(Allamand,V.和Campbell,K.P.Hum.,Mol.Genet.9,2459-2467(2000)。)尽管犬可能具有DMD表型，但它们不适用于研究。由于可用性和易用性，mdx小鼠是使用最广泛的模型。(Bulfield,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,1189-1192(1984)。

通过借助在dmx小鼠中过表达而***靶向肌膜的缺失肌营养不良蛋白相关蛋白，在出生时就可以开始的潜在基因疗法将有助于恢复肌营养不良蛋白相关蛋白。(Khurana和Davies，Nat Review Drug Dis.2:379-390(2003)。因此，通过药物疗法增加肌营养不良蛋白相关蛋白的内源性表达的尝试可能有助于推动该领域的发展。当前DMD疗法的局限在于肌肉，尽管肌肉可以分化，但通常是终末的对称分化，因此只产生有限的储库。第二个要素是炎症，在这种情况下，尝试修复导致纤维化，以及严重和进行性的肌肉功能病症。第三个要素是神经肌肉接头，在这种情况下，尽管废用性萎缩在早期不会发生，但后来总是会影响相关联的神经传导，从而进一步影响个体的健康。在这方面，用PIF产生的数据试图既在体外又在体内解决不同的DMD病理问题

图1：PIF促进肌肉分化。C2C12小鼠成肌细胞是快速分化细胞。为了确认这一点，还测试了PIF对人类卫星细胞的作用。与肌肉分化相关联的标志物以剂量依赖性方式显著增加。这些标志物包括MyHC-β-肌球蛋白重链，其与肌动蛋白结合并且参与动能转导。MYOG-肌细胞生成素是肌细胞生成的诱导物。此外，MYOD-肌浆蛋白分化因子的增加是肌肉分化的另一个增强因素。重要的是，它还与肌肉再生相关联。总而言之，上调的这3种蛋白质提供了强有力的支持性证据，表明PIF通过直接作用促使肌肉细胞分化。PIF对这些细胞的附加作用是上调肌营养不良蛋白相关蛋白，该蛋白是目前用于基因递送的重要治疗靶标。能够增加肌肉之外的神经肌肉接头中存在的肌营养不良蛋白相关蛋白，也可以改善神经肌肉功能。这种增加也证实PIF促进了肌微管蛋白。(蛋白质印迹)

图8.PIF增强小鼠成肌细胞的分化和融合。检查了PIF对成肌细胞分化和融合以便发育为肌肉的能力的作用。通过评估显微照片，数据显示，PIF的作用是剂量依赖性的。融合指数百分比增加确认了这一点。肌细胞生成素水平的增加记录了肌肉分化已经发生。(蛋白质印迹)。

图2.PIF下调let-7并增加H19/miR675表达。我们报道过，体内鼠模型的脑中的PIF下调let-7，从而导致神经保护并逆转晚期缺氧缺血性损伤。(Muller等人，PNAS 2014)。在这里，我们证明，成肌细胞中的PIF导致let-7表达的类似减少，这与H19表达的互惠增加相结合。H19充当分子海绵，抑制了微RNA(miRNA)let-7。该发现的含义超出了DMD，因为增加的let-7/减少的H19改变了患有2型糖尿病的人类受试者和胰岛素抗性啮齿类动物的肌肉中的葡萄糖代谢。(Yuan Gao等人，Nucleic acids 42 13799,2014)。另外，为了定义PIF的具体作用机制，研究了H19的下游所涉及的微RNA，结果表明miR-675-3p和5p这两种变体的表达增加。成肌细胞和H19敲除小鼠卫星细胞中的H19RNA的敲低降低了分化。H19外显子1编码在骨骼肌分化期间均被诱导的miR-675-3p和miR-675-5p这两者。通过外源添加的miR-675-3p和miR-675-5，在成肌细胞分化期间通过耗尽H19挽救了对肌细胞生成的抑制(Dey BK,Genes Dev.28:491-501(2014))。该数据记录了PIF通过成肌细胞分化途径起作用而导致肌肉分化。

图3.在DMD模型中有效的PIF将CPK水平降低至正常水平。由外显子23中的肌营养不良蛋白无义突变诱导mdx C57BL/1小鼠模型。这导致卫星细胞的非对称***受损，从而导致肌肉衰竭，因为没有维持有效的成肌细胞储库。在该模型中测试了PIF的作用。以皮下注射或肌内注射方式施用PIF的PBS溶液，每天施用两次，持续2周，然后在没有进一步治疗的情况下观察5周。用于确定功效的标志物是这些小鼠的血浆中的CPK测量值。数据显示，到第49天，也就是实验结束时，CPK水平一直在正常限值之内。这提供了强有力的迹象，表明肌肉不受影响。相比之下，CPK的对照水平在研究的第49天之前逐渐增加。

图4.PIF减轻mdx小鼠中的组织纤维化。由于炎症改变而增加的胶原蛋白表达导致肌肉纤维化的发展。这对于能够充分扩张肺部以调节呼吸的隔膜至关重要。我们发现，基于胶原蛋白IV IHC的PIF通过DAPI染色确认，该肽显著降低了该纤维化标志物。在皮下注射后以及在与肌内注射结合时都证明了这一点。

图5.PIF增加mdx小鼠股四头肌中的肌营养不良蛋白相关蛋白。我们指出，在培养的成肌细胞中，PIF促进这些细胞的分化，这一点也由肌营养不良蛋白相关蛋白水平增加而证明。在这里，我们确认IHC肌营养不良蛋白相关蛋白在股四头肌中产生了相同的观察结果。在还使用DAPI染色的情况下，数据显示，与对照相比，PIF增加了肌营养不良蛋白相关蛋白。皮下注射PIF以及在与肌内注射结合时都注意到了这一点。

图6.PIF增加mdx小鼠隔膜中的肌营养不良蛋白相关蛋白。我们指出，在培养的成肌细胞中，PIF促进这些细胞的分化，这一点也由肌营养不良蛋白相关蛋白水平增加而证明。在这里，我们确认IHC肌营养不良蛋白相关蛋白在隔膜肌中产生了相同的观察结果。在还使用DAPI染色的情况下，数据显示，与对照相比，PIF增加了肌营养不良蛋白相关蛋白。皮下注射PIF以及在与肌内注射结合时都注意到了这一点。

图7.用于治疗DMD的PIF潜在治疗剂。这幅草图提供了PIF的潜在治疗作用的综合视图。从诱导成肌细胞和卫星细胞非对称分化为肌肉，到机械洞察Let-7减少/H19和下游的miR-675 3p/5p增加。另外，在mdx模型中确认了在体内的保护作用，其中PIF将CPK降低至正常水平。这与肌肉纤维化的减少相结合，并且增加了股四头肌和隔膜这两者中的关键肌营养不良蛋白相关蛋白。(N＝8只/组)

我们的结果记录了PIF治疗促进小鼠成肌细胞和人类卫星细胞的分化，如通过MyoD和MyHC表达的增加和Pax-7水平的降低所证实的。PIF治疗还增加了成肌细胞向多核肌管中的融合。此外，PIF治疗经由下调let-7而增加肌营养不良蛋白相关蛋白(肌营养不良蛋白的蛋白质同源物)的水平。我们还使用mdx小鼠检查了施用PIF对DMD的治疗作用。施用PIF显著降低了血清的肌酸激酶(CK，一种肌肉损伤标志物)水平，以及mdx小鼠隔膜中的IV型胶原蛋白水平，这表明肌肉纤维化显著减轻。考虑到PIF的已知抗炎作用，连同PIF对细胞再生以及抑制肌肉损伤和纤维化的当前作用，我们认为PIF可以是治疗DMD的潜在治疗剂。

讨论

在这项研究中，我们首次指出PIF可有效地逆转杜兴氏肌肉营养不良的病变。

实施例2

治疗肌肉纤维化和肌肉分化

第二系列实验的材料和方法

材料

采用了以下抗体：来自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX,USA)的肌球蛋白重链(sc-376157)、myoD(sc-760)、Pax-7(sc-81975)、β-肌动蛋白HRP-缀合抗体(sc-47778HRP)、GAPDH(sc-26778)；来自Abcam(Cambridge,UK)的胶原蛋白I(Ab21286)、胶原蛋白IV(ab19808)；来自Leica Biosystems Inc.(Buffalo Grove,IL,USA)的肌营养不良蛋白相关蛋白(NCL-DRP2)；来自Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.(West Grove,PA,USA)的驴抗兔Cy-3-缀合抗体(#711-166-152)、驴抗小鼠Cy-3-缀合抗体(#715-165-151)；山羊抗小鼠Alexa488-缀合抗体(1:200，Molecular Probes Inc.,Carlsbad,CA,USA,#A-11029)，来自Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA,USA)的山羊抗兔HRP-缀合抗体(#172-1019)、山羊抗小鼠HRP-缀合抗体(#170-6516)；来自Thermo Fischer Scientific(Oregon City,OR,USA)的DAPI(D1306)和Red CMTPX Dye CellTracker(#C34552)。

人类卫星细胞和C2C12细胞的培养物

卫星细胞制剂的纯度始终大于90％，如Pax7和α7-整联蛋白的表达以及缺乏肌细胞生成素或肌球蛋白重链(MyHC)的表达所指示。将分离的卫星细胞维持在涂布胶原蛋白的平板上，当在碱性FGF(bFGF)存在下培养时，这些细胞继续增殖而不分化。在除去低血清培养基中的bFGF和培养物(分化条件)后，卫星细胞迅速离开细胞周期并启动肌原性分化，这通过MyHC的表达增加得到确认。

在补充有10％FBS的DME(Invitrogen,Paisley,UK)中将C2C12成肌细胞维持在亚汇合密度。通过将亚汇合细胞改变为含有2％热灭活马血清的DME，来诱导肌原性分化。

转染miRNA模拟物和shRNA

对应于miR-675的RNA双链体从Sigma(St.Louis,MO)获得。根据制造商的说明，在6孔板中使用siIMPORTER(Millipore)，用miRNA双链体对细胞进行转染。从Dharmacon获得H19 shRNA，并且从SBI获得miR-675 antagomiR。

蛋白质印迹分析

通过SDS-PAGE分离细胞裂解物(30μg蛋白质)，并如前所述转移至硝酸纤维素膜。在与一抗和二抗一起温育后，通过ECL蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham,ArlingtonHeights,IL)显现免疫反应条带。

融合分析

将C2C12细胞接种于35mm成像皿中的补充有10％FBS的DMEM中，该成像皿具有高密度(80％)的ibidi聚合物盖玻片底部，并使其增殖48小时。然后用含有2％马血清的分化培养基替换该培养基，将细胞再培养10天。在分化阶段开始时将sPIF(300nM)添加到培养基中，之后每72小时添加一次。

将融合指数定量为具有多于3个核的MyHC阳性多核细胞中的DAPI染色核与染色核总数的比率。使用ImageJ软件对每组2个独立培养皿中的每个培养皿的49个视野进行分析。

动物研究

所有动物实验均按照以色列动物实验委员会(Israel Board for AnimalExperiment)的指导方针并遵守以色列动物福利法案和伦理委员会(The Israel AnimalWelfare Act and Ethics Committee)进行。将mdx小鼠(4至6周的雄性)饲养在笼中，使其处于恒定光周期的条件下(12小时光照/12小时黑暗)，能够自由地获取食物和水。用sPIF以0.75mg/kg处理小鼠，每周两次，持续两周，处理方式为皮下注射或皮下注射和肌内注射的组合，注射到胫骨前(TA)肌肉中。用盐水注射对照小鼠。两周后，收集来自隔膜、心脏、QC肌肉和TA肌肉的组织用于组织学分析和免疫荧光分析。

制备切片和免疫荧光

将肌肉活检组织冷冻在用液氮冷却的异戊烷中。制备、固定冷冻切片，用0.2％(重量/体积)明胶的PBS溶液和0.2％(体积/体积)吐温20(Sigma Aldrich,P1379)的PBS溶液封闭，然后单独用抗肌营养不良蛋白相关蛋白抗体(1:50)进行免疫染色，或者用I型胶原蛋白抗体(1:100)或IV型胶原蛋白抗体(1:50)进行双重免疫染色。用DAPI(1:1000)将细胞核染色。作为二抗，使用山羊抗小鼠IgG抗体与Alexa Fluor染料进行I型胶原蛋白检测，并使用Cy3抗山羊抗体进行肌营养不良蛋白相关蛋白检测。使用Leica SP8共聚焦显微镜和ZeissAxioimager荧光显微镜进行显微镜观察和图像采集，并使用CellProfiler软件进行分析。

结果

sPIF增加人和小鼠的成肌细胞的分化

在本研究中，我们采用了两种体外系统：来源于健康供体和DMD患者的小鼠C2C12细胞和人类成肌细胞。据报道，缺乏肌营养不良蛋白会减少卫星细胞的非对称***(Dumont等人，2015)和肌肉分化(Keefe等人，2015)。我们首先检查了sPIF对成肌细胞分化和融合的作用。将成肌细胞置于含有2％马血清的培养基中培养10天，以允许细胞分化。在培养开始时将sPIF添加到细胞中，之后每两天添加一次。用sPIF处理C2C12细胞显著增加了MyoD、MyHC和肌细胞生成素的表达(图9A)，并且还增强了细胞融合(图9B)。类似地，sPIF增加了来源于健康供体和DMD患者的成肌细胞中的MyHC的表达(图9C)。之后使用FITF标记的sPIF和共聚焦显微镜观察sPIF在肌肉细胞中的内化。如图9D中所呈现，sPIF在温育30至60分钟之内进入细胞并在细胞质中聚积。

sPIF经由诱导H19和miR-675增加成肌细胞分化

为了分析sPIF对肌肉分化的作用中所涉及的机制，我们关注H19/miR-675途径。H19在肌肉分化和再生中发挥至关重要的作用，其生物学功能经由通过H19的外显子1编码的miR-675-3p和miR-675-5p介导(Dey等人，2014)。与健康供体相比，来源于DMD患者的成肌细胞显示出H19和miR-675的表达显著降低(图10A)。用sPIF处理DMD成肌细胞显著上调了这些细胞中的H19(图10B)和miR-675(图10C)这两者的表达。

为了证实诱导miR-675在sPIF诱导的成肌细胞分化中起作用，我们做了两个实验。首先，我们用靶向H19的siRNA双链体转染DMD成肌细胞，并且指出沉默H19不但降低了miR-675在成肌细胞中的诱导，还降低了它们在sPIF作用下的分化(图10D)。接下来我们用miR-675-3p模拟物和miR-675-3p模拟物转染DMD-成肌细胞，并发现在处理5天后MyHC的表达显著增加(图10E)。我们还检查了sPIF对用miR-675 antagomiR转染的成肌细胞的分化的作用，并发现这些作用被明显消除，而在用对照antagomiR转染的成肌细胞中未观察到sPIF作用的显著降低(图10F)。这些结果表明，H19的诱导和后续sPIF对miR-675的诱导介导了观察到的人类成肌细胞的分化增加。

sPIF经由H19/let-7和miR-675/PTEN/AKT途径增加肌营养不良蛋白相关蛋白的表达

除了促进肌肉分化之外，sPIF处理还增加了小鼠(图11A)和人类肌肉细胞(图11A，图11B)中的肌营养不良蛋白相关蛋白的表达。人类成肌细胞中肌营养不良蛋白相关蛋白的诱导部分地依赖于H19的诱导，因为沉默该IncRNA消除了增加的肌营养不良蛋白相关蛋白表达(图11C)。据报道，H19充当let-7的海绵(Kallen等人，2013)，该let-7靶向肌营养不良蛋白相关蛋白的3’-UTR(Basu等人，2011；Mishra等人，2017)，这表明H19的上调可能妨碍let-7靶向肌营养不良蛋白相关蛋白的能力。然后我们检查了let-7沉默对DMD成肌细胞中的肌营养不良蛋白相关蛋白表达的作用，并发现let-7沉默的成肌细胞中的肌营养不良蛋白相关蛋白表达增加(图11D)。由于最近报道sPIF通过降低生物发生来下调神经细胞和淋巴细胞中的let-7表达，所以我们还检查了sPIF对肌肉细胞中的let-7表达的作用。用sPIF处理人成肌细胞降低了let-7的表达(图11E)，并且let-7的过表达消除了sPIF对肌营养不良蛋白相关蛋白的上调(图11F)。这些结果表明，sPIF经由直接降低let-7表达和通过抑制let-7经由H19上调靶向肌营养不良蛋白相关蛋白这两者诱导了肌营养不良蛋白相关蛋白表达的上调。

sPIF降低mdx小鼠中的肌酸激酶(CK)水平和肌肉组织纤维化

我们进一步研究了sPIF对mdx小鼠的治疗作用。每天皮下施用sPIF两次(0.75mg/kg)，持续2周，并在2周后处死小鼠。我们发现，用sPIF处理小鼠在施用后2周检查时显著降低了血清CK水平(图12A)，这表明sPIF处理在该疾病模型中发挥治疗作用。

肌肉纤维化是DMD中的标志性过程之一，反映肌肉退化，并且与患者的功能恶化相关(Mann等人，2011；Li等人，2004)。在mdx小鼠中，纤维化主要在隔膜和心脏中观察到(Barbin等人，2016；Levi等人，2015)。因此，我们分析了sPIF对这些组织中的纤维化的作用。2周后处死用sPIF处理2周的小鼠，并使用免疫荧光染色分析隔膜组织的胶原蛋白I和胶原蛋白IV的表达。与对照小鼠的组织相比，用sPIF处理的小鼠的膈膜中的胶原蛋白I的表达显著降低(图12B)。相反，sPIF没有诱导心脏组织中的胶原蛋白I和胶原蛋白IV表达的显著降低(数据未示出)。

sPIF增加DMD肌肉组织中的肌营养不良蛋白相关蛋白表达

最近的研究报道了患者活检组织和mdx小鼠这两者中的纤维化与肌营养不良蛋白相关蛋白表达的负相关性(Levi等人，2015)。我们发现，sPIF增加了培养细胞中的肌营养不良蛋白相关蛋白表达，因此检查了sPIF对mdx肌肉中的肌营养不良蛋白相关蛋白表达的作用。实际上，两周的sPIF处理显著增加了mdx小鼠的股四头肌组织(图13A)、隔膜组织(图13B)和心脏组织(图13C)中的肌营养不良蛋白相关蛋白表达。

讨论

该研究的结果证实，sPIF在体外促进肌肉分化，并且通过降低纤维化水平和诱导肌营养不良蛋白相关蛋白表达而在mdx小鼠中发挥治疗作用。sPIF代表用于治疗DMD和其他肌营养不良蛋白相关病症的治疗剂。

实施例3

本研究使用sPIF剂量依赖性设计评估杜兴氏肌肉营养不良患者中的安全性和耐受性。主要终点将是肌肉活动改善。次要终点将包括监测到循环CPK的水平降低。

在足够长的观察期之后，将评估患者的肌肉功能的改善情况。我们预计用sPIF处理的队列将显示出肌肉功能改善和/或肌肉退化的发作延迟。我们还预计，与未处理的患者群体相比，用sPIF处理的队列将在肌肉中显示出较少的纤维化病变。

实施例4

治疗纤维化

肌营养不良蛋白基因突变导致肌肉退化和即将发生非对称分化的卫星细胞受损。sPIF通过增加MyoD和MyHC的表达以及降低Pax-7水平来促进小鼠成肌细胞分化和人类卫星细胞分化。sPIF处理还将增加成肌细胞向多核肌管中的融合。此外，sPIF处理通过下调微RNA et-7而增加肌营养不良蛋白相关蛋白(肌营养不良蛋白的蛋白质同源物)的水平。将sPIF施用2周，之后是5周的疗法后时间，导致血清CPK水平降低至主要标志物的基线。肌肉分析显示，隔膜和股四头肌中的IV型胶原蛋白减少，这反映纤维化形成减少。数据表明，PIF肽和其盐可以逆转晚期纤维化，并且在一些实施方案中，可以逆转在放射后观察到的纤维化。

实施例5

sPIF防御50Gy胸壁辐射诱导的皮肤和心脏纤维化

局部高剂量的辐射导致皮肤和周围器官的纤维化。使大鼠暴露于胸壁的高50Gy辐射。施用sPIF 2周，之后每周注射两次，至第20周。sPIF降低了死亡率、心脏肥大和纤维化。此外，sPIF使体重正常化，导致瘢痕更快愈合，以及辐射部位上的毛发生长。用sPIF处理的大鼠的每日活动高于对照大鼠的活动。观察到的miR-21表达的增加可以防止辐射诱导的损伤。因此，sPIF防止长期诱导的纤维化。

实施例6

sPIF逆转亚致死辐射损伤后的胃肠道粘膜损伤

口咽粘膜极易受到辐射的损害。在亚致死辐射(6Gy)后，sPIF逆转了结肠隐窝和基底膜损伤，同时减少了一氧化氮合成酶(iNOS)并增加了(B7H1)表达。上胃肠道基因途径全局分析揭示，sPIF参与蛋白质-RNA相互作用、线粒体氧化途径和对细胞应激的应答。sPIF影响巨噬细胞的分化和功能。sPIF保护被辐射的巨噬细胞和被经典活化的M1巨噬细胞，从而减少炎性基因表达(iNOS，Cox2)、促进保护性(Arg1)基因表达并诱导促耐受细胞因子分泌。在6Gy亚致死辐射后48小时施用sPIF改善了造血恢复并降低了全身炎性细胞因子水平。

实施例7

sPIF在BMT后防止致死性辐射

sPIF防止半同种异体和完全同种异体骨髓移植(BMT)诱导的移植物抗宿主疾病，其中短期的低剂量sPIF降低了死亡率，并且在疗法后长达4个月预防GVHD的发展(33,32)。它还逆转了GVHD并促进同基因骨髓移植。当GVHD减少时，有益的移植物抗白血病作用得以维持。sPIF预防了肝脏炎症以及皮肤和结肠溃疡(导致纤维化)的发展。肝脏炎症减轻的原因是iNOS-氧化应激减轻、促炎细胞因子/趋化因子及其受体表达减少，再加上循环IL-la和IL-17水平(主要的促炎细胞因子)降低。因此，皮肤通过预防纤维化而得到保护。

实施例8

sPIF预防手术诱导的纤维化

与sPIF单一疗法一起使用的灵长类动物模型导致卵巢组织长期成功同种异体移植，并且证实了防止纤维化的作用。剖腹手术瘢痕完全愈合且毛发生长恢复证明了这一点。此外，在将同种异体移植物移植到腹膜腔中的情况下，即使在疗法后7个月观察，也没有外来物体引起局部炎症和纤维化发展的证据。因此，该数据证明了sPIF的抗纤维化作用。

实施例9

高剂量sPIF在鼠和犬模型中是安全的HED当量给出安全系数(21-32)并且证实sPIF在4小时内从循环中清除，甚至在每日施用后2周所施用的最高剂量(比治疗剂量高4000倍)下也是如此。这表明sPIF具有高安全裕度。尽管循环sPIF的半衰期短，但该药物的生物学作用取决于与具体受体的结合，这些受体引发并长期维持作用。这一点在施用2周后直到6个月得到证明。

实施例10

自身免疫性肝炎中的单次递增剂量sPIF：随机、双盲、安慰剂对照研究：NCT02239562

sPIF在所有入选患者的AIH单次递增剂量试验中都证实了安全性和耐受性。N＝18名患者接受了研究(以2:1的Rx/安慰剂比率，0.1、0.5、1mg/kg，肝功能正常或异常)。所有患者都完成了研究，并且具有临床意义的不良事件不超过1个。尽管同时使用了类固醇、免疫抑制剂，但并未观察到药物间相互作用。递增剂量的sPIF产生了与快速(小于2小时)清除相关联的肽血清水平的线性增加。对6名肝功能异常(ALT/AST)患者中的5名进行探索性分析，显示有所改善，并且2/6的病例在长达8天的时间里达到正常的ALT水平。sPIF不影响肝功能正常的患者。

自身免疫性肝炎中的多次递增剂量sPIF：随机、双盲、安慰剂对照研究

sPIF在AIH多次递增剂量试验中证实了安全性和耐受性。N＝18名肝功能正常或异常的患者以2:1的Rx/安慰剂比率被给予增加的sPIF(0.1、0.5和1mg/kg)5天。所有患者都完成了研究，并且没有具有临床意义的2、3或4级不良事件。直到第29天都具有高安全性，没有药物间相互作用，并且在观察到施用sPIF之后没有检测到抗体。5天后，sPIF在约2小时内迅速从循环中清除。探索性分析揭示肝功能异常患者的一项或多项肝脏指标(ALT/AST/GGT/ALP)改善(n＝5/6用sPIF处理)，且n＝2/6达到正常ALT水平。sPIF不影响肝功能正常的患者。连续细胞因子分析显示，sPIF对IL8的作用与对肝脏疾病的作用一致。正在计划进行对肝脏/胃肠道疾病的II期试验。

实施例11

II期临床试验

辐射诱导的头颈部损伤性疾病的表现。

在过去，辐射的主要作用是治疗无法通过手术切除的肿瘤。在其他情况下，辐射被用作手术后的后续治疗，在这种情况下，原发性肿瘤被切除，并且周围的转移可能得到治疗。当前放射疗法的目的是仅聚焦于正在治疗的区域，同时避免对周围健康组织的辐射。化学疗法用于增加辐射对肿瘤的功效。它也同时可以用于治疗远端转移。单一疗法或联合疗法具有短期、中期和长期的负面结果。损伤是作为血管衬里的内皮细胞遭受破坏而引起的。损伤后依次出现的事件是局部缺血、水肿，其导致炎症，并最终导致纤维化。这些事件可以在从随后的几个月直到几年范围内的各个时间点发生。受辐射影响的多个层是皮肤层、皮下层、脂肪层、肌肉层和腺体层，其中腺体诸如腮腺、甲状腺和***。症状涉及的范围包括一般疼痛、口腔或喉咙中的开放性溃烂、口干、张嘴吞咽困难、口味改变、恶心、耳痛、蛀牙、牙龈和喉咙肿胀、呼吸困难、颈部僵硬、毛发脱落、皮肤改变和下颌僵硬。鼻咽区受到辐射后可能发生麻痹。总而言之，最终结果是头颈部区域中的所有组织的功能性降低。可能发展为***炎症，并可能发生转移。由于颈椎可能暴露于辐射，因而可能发生骨退化。结果是出现与局部萎缩相关联的纤维化，即使在几年之后，也不会改善。因此，早期诊断和干预将阻止进行性纤维化和相关联功能病症的过程，这将是最有益的。

诊断方法主要通过成像进行。高分辨率超声用于对纤维化成像。CT测试和MRI测试是互补的，因为它们也评估肌肉和对骨骼的作用。此外，还可以评估对诸如腮腺和甲状腺等不同腺体的作用。CT扫描和MRI的使用还用于评估可能的肿瘤复发和转移(Amemiya等人，2005；Corvo 2007；Glastonbury等人，2010)。

当前疗法

经批准的辐射防护化合物只有两种，即氨磷汀和帕利夫明。氨磷汀是一种细胞保护剂，有助于减轻放射疗法后对唾液腺的损害。它还充当氧自由基清除剂。它通过静脉输注连同辐射一起施用。它与严重的副作用相关联，包括口干症治疗中的致命皮肤反应(Kouvaria等人，2007)。帕利夫明是一种重组人类角质形成细胞生长因子，其有助于治愈或预防正在接受化学疗法和干细胞治疗的人的口腔溃烂和溃疡。该药物的副作用是皮疹和瘙痒等(Spielberger等人，2004)。然而，在最近一项关于头颈癌患者的安慰剂对照研究中，虽然该药物减轻了吞咽困难，但是该药物的作用与安慰剂相似(Le等人，2009)。

还利用了具有各种成功率的其他实验疗法。这些疗法包括：自由基清除剂/抗氧化剂、超氧化物歧化酶和超氧化物歧化酶模拟物、氮氧化物和膳食抗氧化剂、细胞因子/生长因子、血管紧张素转化酶抑制剂和细胞凋亡调节剂都揭示有限的功效。免疫抑制剂可能在局部有帮助，却有严重的全身副作用。总而言之，改善辐射对生活质量量度的次要作用(导致纤维化和萎缩)，仍然是尚未满足的需求。

综合治疗方案将在局部和全身这两个方面实现炎症调节，同时提供免疫调节而不抑制免疫。治疗将促使功能恢复和创伤愈合，以及增强/加强免疫系统，以更好地对抗癌症。

临床试验概要

这是针对患有头颈癌的男性患者和女性患者的II期开放标签、自适应设计的剂量发现研究。招募的患者在接受放射疗法或联合放射/化学疗法之后且目前正在接受标准护理时具有≥2的纤维化等级和降低的生活质量(QOL)量度，包括肌肉僵硬、吞咽和唾液产生。该研究将在法国的单个中心启动。根据入选情况，可能在法国和法国以外增加另外的中心。

剂量比较诱导和维持阶段

sPIF将以0.5mg/kg或1mg/kg的剂量每天给药，持续14天，以便针对每组N＝7评估安全性和耐受性以及临床应答。如果耐受良好，则患者将过渡到维持阶段，每周接受他们各自的剂量，直到12周，以便评估对限定的三个QOL量度的作用。主要目标是在12周时将纤维化等级降低至1(30％)，这是通过超声在疗法后24周测定的。其中超过4/7的患者达到主要目标的队列将构成功效，并促使队列扩大以及注射间隔增加至长达4周。如果需要，患者将过渡到更短的剂量间隔并最多每日注射，直到超过4/7实现治疗作用为止。如果没有实现，则将随之递增剂量。

剂量递增诱导和维持阶段

sPIF将以1.5mg/kg的起始剂量每天给药，持续14天，以便针对每组N＝7评估安全性和耐受性以及临床应答。如果耐受良好，则患者将过渡到维持阶段，每周接受相同的剂量，直到12周，以便评估对限定的三个QOL量度的作用。将评估12周时有关将纤维化等级降低至1(30％)的作用，这是通过超声在疗法后24周测定的。其中超过4/7的患者构成功效的队列，并促使队列扩大以及注射间隔增加至长达4周。如果需要，患者将过渡到更短的剂量间隔并最多每日注射，直到超过4/7实现治疗作用为止。如果没有实现，则将随之以0.5mg/kg的增量进一步递增剂量。

此外，将测定抗sPIF抗体、血浆sPIF水平、PBMC基因和血清细胞因子水平。总而言之，目标是除当前的标准护理之外，建立有效的诱导/维持sPIF给药，以扩大患者队列，从而既证实sPIF的安全性，又证实其改善QOL量度和减轻纤维化的功效。

研究目标和研究终点

主要目标是确定sPIF在减轻头颈癌放射疗法(或放射/化学疗法)后3至6个月发生的纤维化，将其从≥2级降低至1级，从而导致持续改善的功效。

人群

研究人群将由年龄在18岁至65岁之间的男性患者和女性患者构成，这些患者具有继发于放射疗法或联合放射和化学疗法的纤维化。患者在该研究开始时将从法国巴黎的Bichat医院/Hartmann研究所招募。一旦在队列中确定有效剂量，就可以增加美国和其他国家的另外的中心。目标是筛选/入选总共约60名患者。

入选标准

·由头颈癌的放射疗法诱导2级皮肤或皮下纤维化(NCI-CTCAE v4毒性量表)，进展了至少3至6个月

·用放射疗法+/-化学疗法治疗过ENT领域的肿瘤，处于持续缓解状态

·年龄≥18岁

·卡氏评分(Karnofsky)PS>＝70

排除标准

·长期接受皮质类固醇疗法

·具有遗传性肌肉疾病的个人或家族史

·患者已经参与了另一项用实验性分子进行的治疗试验，

·孕妇或哺乳期妇女。育龄妇女在治疗期期间必须使用医学上认可的避孕方法，并且在被纳入该研究后使用该方法4周

·被剥夺自由或受监护的人员

·由于地理、社会或心理方面的原因，无法依从该试验的医学随访。

治疗组

该研究是开放标签的自适应设计。患者将在比较0.5mg/kg和1mg/kg剂量的(n＝7)队列中给药，诱导阶段持续14天，之后是维持阶段，通过12周时纤维化的减轻来评估功效，并且次要目标是直到12周将QOL改善客观的度量。维持阶段的剂量间隔可以增大或减小，直到该功效实现为止：即4/7的患者的主要目标改善。如果未达到该目的，则将按照与对比给药研究中所使用的相同的诱导和维持计划和方法进行剂量递增，其中剂量以0.5mg/kg的增量增加。一旦每个队列中有4/7显示有效的治疗应答，则该研究将被扩大以招募多达60名患者，并且使用功效分析，将建立该试验的功效。

参与该研究的诱导阶段(每个队列n＝5)的患者每日将接受单剂量，持续14天。如果没有观察到功效，则剂量将在2周的时间段内递增。

头颈部纤维化评估

sPIF的作用将使用描述性的统计汇总和表格汇总，通过每个队列中的患者和剂量水平来进行概述。这将在筛选时、注射之前和随后依次进行。最佳的sPIF诱导/维持剂量旨在被建立为：在12周记录的纤维化减轻约30％，并且该数据在24周维持。这通过使用基于不良反应NCI-CTCAE-V4(附录1)评估量表的纤维化等级以及下面示出的其他等级来检查。

附录1.

纤维化等级

不良反应-时间和事件的计划表：诱导*

*连续施用sPIF 14天(诱导阶段)**根据不良反应评估的需要

一旦实现该目标，将进一步招募患者以巩固数量，并通过功效分析达到统计显著性。这主要将在Bichat医院/Hartmann研究所进行，但后来的其他中心也将参与生成另外的支持数据。关于统计分析，将发生以下情况。由于这是一项可以实时分析数据的开放标签研究，所以将确定QOL/吞咽/唾液指标改善长达12周的患者的比例，在那时将分析对纤维化分数的作用-主要功效标准。所有个人数据都将按测量值列出。所有统计汇总和分析都将使用

软件(SAS Institute,Cary,North Carolina,USA)进行。二元/分类结果将通过适合于表格设计的卡方检验(Chi-square test)来评估，以达到统计显著性，P<0.05。也就是说，在达到初始最佳剂量的12周时，总数中有多少患者具有持续应答。在那时，将确定sPIF是否将头颈部纤维化减少最大厚度的30％，如通过超声在疗法后12周和24周所测定的。生成的数据将按如下方式评估。在旨在被招募和评估的60名患者中，在12周时发现QOL/吞咽/唾液指标有效，进行以下假设。在设计该研究时，该研究将持续到超过4/7的患者将改善纤维化分数-这将使得队列的大小增加以达到统计显著性。估计所需的患者数量达到60，以便能够进行功效分析。到目前为止，在SAD和MAD这两个阶段都没有人退出研究，并且所有36名患者一旦入选，就完成他们预定的药物治疗和血液测试，直到29天。然而，正如在任何研究中那样，患者可能无法完成所有测试、退出或失去随访。我们假设，入选该研究的患者中的80％至90％将完成该研究。因此，如果我们假设在要入选的最佳剂量队列中将总共需要60名患者，则我们计划根据退出率招募66至72名患者，以便能够进行功效统计分析。

尽管已经参考本发明的某些优选实施方案相当详细地描述了本发明，但是其他型式也是可能的。因此，所附权利要求书的实质和范围不应当限于说明书，并且优选的型式包含在本说明书之内。本文所公开的任何专利申请或其他期刊文章全文以引用方式并入本文。

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