阅读说明：本技术 一种新型荧光探针的合成及在检测半胱氨酸中的应用 (Synthesis of novel fluorescent probe and application of novel fluorescent probe in cysteine detection ) 是由 朱海亮 张萌 王保忠 于 2018-09-13 设计创作，主要内容包括：一种新型荧光探针,它具有如下结构式。经实验证明,该新型荧光探针对半胱氨酸具有较好的选择性,可以定量检测生物体内外的半胱氨酸。本发明公开了该新型荧光探针的合成方法。<Image he="186" wi="700" file="DSA0000170610960000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(A novel fluorescent probe has the following structural formula. Experiments prove that the novel fluorescent probe has better selectivity on cysteine and can quantitatively detect cysteine in and out of organisms. The invention discloses a synthetic method of the novel fluorescent probe.)

一种新型荧光探针的合成及在检测半胱氨酸中的应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种新型荧光探针的制备方法、活性评价及其在检测半胱氨酸中的应用。

背景技术

硫是植物生长发育的重要营养元素之一，而半胱氨酸(Cys)是生物体内组成蛋白质的氨基酸中唯一含有巯基(-SH)的氨基酸。半胱氨酸具有重要的生理功能，由于其功能涉及微量元素代谢、重金属解毒、消除自由基等许多生理调控过程，故体内半胱氨酸代谢失调会导致一系列免疫系统功能性疾病。通过监测生物体中半胱氨酸浓度，可实现某些疾病的前期诊断。因此，研发一种可以快速、灵敏、选择性高的检测半胱氨酸的方法具有重要的意义。

目前，测定Cys的方法主要有电化学法、高效液相色谱法、共振散射光谱法、毛细管区带电泳法、分光光度法和荧光光谱法等。其中，荧光光谱法以其方便快捷、反应迅速、成本较低等优势脱颖而出。荧光探针与Cys作用后，发生荧光变化，如荧光强度或者发射波长的改变等，实现其分析测定。

因此，本发明设计合成了一种新型荧光探针，通过体内、体外测定半胱氨酸，研究其在检测半胱氨酸活性的潜在价值。

发明内容

本发明涉及一种新型荧光探针的合成及在检测半胱氨酸中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种新型的荧光探针，中文名：反式乙-3-(7-(丙烯酰氧基)-2-氧-2氢苯并吡喃-3-基)丙烯酸酯。具体化学结构如下：

该新型荧光探针的合成方法，其特征由如下步骤组成：

步骤1称取适量化合物1、2倒入容积一定的反应器，并溶解在一定体积的溶剂中，加入化合物2、哌啶并在特定的反应温度下反应，直至原料完全消耗，处理获得化合物3。

步骤2称取适量化合物3、三乙胺倒入含有一定溶剂的容器中，置于某温度下，缓慢加入特定量的丙烯酰氯，反应直至原料消耗完全，处理获得化合物4，即荧光探针。

本发明涉及合成的一种新型荧光探针，在体内、外测定半胱氨酸具有较好的效果，因此本发明的荧光探针可定量检测半胱氨酸。

附图说明

图1、本发明荧光探针的紫外吸收谱图

图2、本发明荧光探针的荧光光谱图

图3、本发明荧光探针对半胱氨酸等氨基酸选择性的柱形图

图4、本发明荧光探针关于半胱氨酸等生物巯基物质干扰性的柱形图

图5、本发明荧光探针在细胞内检测半胱氨酸的荧光成像

具体实施方式

通过以下实例详细介绍本发明，但本发明的保护范围并不受任何实施实例的限制。

实施实例一：荧光探针的合成与制备

步骤1称量化合物1(740mg，5.36mmol)、化合物2(1.05g，5.65mmol)和哌啶(44.64μL，0.57mmol)倒入50mL圆底烧瓶中，并溶解于15mL无水乙醇。置于85℃加热回流12h，TLC检测反应，直至原料完全消耗。旋转蒸发仪浓缩反应液，获得粗产品。通过200-300目硅胶柱层析纯化，洗脱比例为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10，最终获得化合物3。产物为黄色固体，产率76.15％.1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.44(s，1H)，7.59-7.47(m，2H)，6.90-6.79(m，2H)，6.74(d，J＝2.0Hz，1H)，4.18(q，J＝7.1Hz，2H)，1.25(t，J＝7.1Hz，3H).13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ166.74，163.69，159.71，155.89，146.02，139.44，131.32，120.05，116.52，114.63，118.7 102.44，60.52，14.65.

步骤2称取化合物3(200mg，0.77mM)和三乙胺(77mg，0.77mM)倒入50mL圆底烧瓶中，并溶解于15mL二氯甲烷中。置于0℃时，缓慢加入丙烯酰氯(415.8μL，4.62mM)，TLC检测反应，直至原料消耗完全。旋转蒸发仪浓缩反应液，获得粗产物。通过200-300目硅胶柱层析纯化，洗脱比例为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶20，最终获得化合物4，即荧光探针。产物为白色固体，产率为88.54％。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.59(s，1H)，7.80(d，J＝8.5Hz，1H)，7.56(d，J＝16.0Hz，1H)，7.43(d，J＝2.1Hz，1H)，7.28(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，6.96(d，J＝16.0Hz，1H)，6.59(dd，J＝17.3，1.1Hz，1H)，6.45(dd，J＝17.3，10.4Hz，1H)，6.22(dd，J＝10.4，1.1Hz，1H)，4.21(q，J＝7.1Hz，2H)，1.27(t，J＝7.1Hz，3H).13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ166.43，164.04，159.14，154.18，154.00，144.64，138.60，134.97，130.66，127.70，122.29，121.01，119.62，117.4，110.47，60.76，14.62.

实施实例二：荧光探针的紫外吸收谱图

本实验设置空白组与对照组。空白组：取1.5mL离心管3个，每个离心管加入PBS100μL，水98μL，探针溶液2μL(DMSO，1mM)。对照组：取1.5mL离心管3个，每个离心管加入PBS100μL，水96μL，探针溶液2μL(DMSO，1mM)，Cys 2μL(水，10mM)。空白组与对照组置于37℃下反应15min，利用紫外分光光度计在200-800nm范围内测定吸收光谱。

实施实例三：荧光探针的荧光光谱图

本实验设置空白组与对照组。空白组：取1.5mL离心管3个，每个离心管加入PBS100μL，水98μL，探针溶液2μL(DMSO，1mM)。对照组：取1.5mL离心管3个，每个离心管加入PBS100μL，水96μL，探针溶液2μL(DMSO，1mM)，Cys 2μL(水，10mM)。空白组与对照组置于37℃下反应15min，利用荧光分光光度计，设置激发波长428nm，狭缝5nm，电压400v，在430-650nm范围内收集发射波长。

实施实例四：荧光探针对半胱氨酸等氨基酸选择性的柱形图

本实验设置空白组及20个对照组。空白组：取1.5mL离心管3个，每个离心管加入PBS 100μL，水98μL，探针溶液2μL(DMSO，1mM)。对照组：20个对照组，每组取1.5mL离心管3个，每个离心管加入PBS 100μL，水96μL，探针溶液2μL(DMSO，1mM)，氨基酸2μL(水，10mM)。20个对照组依次为：1)Cys，2)Val 3)Lys，4)Ala，5)Alg，6)Leu，7)Ile，8)Pro，9)Phe，10)Tyr，11)Trp，12)Thr，13)Ser，14)Met，15)Asn，16)Gln，17)Asp，18)Asn，19)His，20)Gly.空白组与对照组置于37℃下反应15min，利用荧光分光光度计，设置激发波长428nm，狭缝5nm，电压400v，在430-650nm范围内收集发射波长。取发射波长505nm处荧光强度绘制柱形图。

实施实例五：荧光探针关于半胱氨酸等生物巯基物质干扰性的柱形图

本实验设置空白组及3个对照组。空白组：取1.5mL离心管3个，每个离心管加入PBS100μL，水96μL，探针溶液2μL(DMSO，1mM)，Cys 2μL(水，10mM)。对照组：3个对照组，每组取1.5mL离心管3个，每个离心管加入PBS 100μL，水94μL，探针溶液2μL(DMSO，1mM)，Cys 2μL(水，10mM)，生物巯基底物2μL(水，10mM)。3个对照组依次为：1)Hcy，2)Na2S，3)GSH。空白组与对照组置于37℃下反应15min，利用荧光分光光度计，设置激发波长428nm，狭缝5nm，电压400v，在430-650nm范围内收集发射波长。取发射波长505nm处荧光强度绘制柱形图。

实施实例六：荧光探针在细胞内检测半胱氨酸的荧光成像

本实验设置空白组及5个对照组。空白组：在37℃下用终浓度为2mM的NEM DMEM培养基预处理hela细胞30min，之后用PBS清洗3次，加入终浓度为10μM的探针DMEM培养基孵育hela细胞30min。对照组：在37℃下用终浓度为2mM的NEM DMEM培养基预处理hela细胞30min，之后用PBS清洗3次，加入终浓度为10μM的探针DMEM培养基孵育hela细胞30min。PBS洗3次，依次加入终浓度为20μM、40μM、60μM、80μM、100μM Cys DMEM培养基孵育hela细胞30min。

通过单光子共聚焦荧光显微镜，设置激发通道405nm，观察各组荧光强度变化。