一种高纯度莨菪亭的制备方法
阅读说明：本技术 一种高纯度莨菪亭的制备方法 (Preparation method of high-purity hyoscyamine ) 是由 裴栋 邸多隆 于 2021-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高纯度莨菪亭的制备方法,将枸杞子粉碎后利用亚临界技术脱脂,脱脂产物利用乙醇溶液进行回流提取得到枸杞粗提物；将枸杞粗提物利用大孔吸附树脂进行分离富集且用乙醇洗脱后得到莨菪亭粗提物；将莨菪亭粗提物用水溶解后利用有机溶剂分层,上层浓缩干燥后得到莨菪亭粗品；将莨菪亭粗品利用色谱纯甲醇重结晶,浓缩液干燥后得到高纯度莨菪亭。本发明提取的莨菪亭纯度高,纯度＞98.5％,均匀性和稳定性良好,能够作为莨菪亭的标准样品。(The invention discloses a preparation method of high-purity hyoscyamine, which comprises the steps of crushing wolfberry fruits, degreasing by using a subcritical technology, and carrying out reflux extraction on a degreased product by using an ethanol solution to obtain a wolfberry crude extract; separating and enriching the crude extract of the Chinese wolfberry by using macroporous adsorption resin, and eluting by using ethanol to obtain a scopoletin crude extract; dissolving the crude scopoletin extract with water, layering by using an organic solvent, and concentrating and drying the upper layer to obtain a crude scopoletin product; recrystallizing the crude scopoletin product with chromatographic pure methanol, and drying the concentrated solution to obtain the high-purity scopoletin. The hyoscyamine extracted by the method has high purity which is more than 98.5 percent, and good uniformity and stability, and can be used as a standard sample of the hyoscyamine.)
技术领域
本发明涉及一种高纯度莨菪亭的制备方法，属于药效成分提取技术领域。
背景技术
莨菪亭(Scopoletin)是一种香豆素类化合物，具有抑制人前列腺细胞增殖与诱导凋亡、抑制血管内皮细胞再生、抗炎和抗抑郁等作用，在枸杞果实中的含量较高，可达2-8％。莨菪亭，CAS：92-61-5、分子式：C10H8O4、分子量：192.17、化学命名：2H-1-Benzopyran-2-one,7-hydroxy-6-methoxy、性状：淡黄色针状或棱柱状结晶、熔点：204℃、溶解性：溶于热乙醇、热甲醇或热冰醋酸，微溶于冷乙醇、冷甲醇或水，略溶于氯仿。化学结构式：
当前研究认为枸杞的诸多生理活性与莨菪亭有一定的关系。因此，越来越多的研究者将莨菪亭作为枸杞活性的主要指标之一，用以衡量枸杞的品质。目前国内市场缺乏规范统一的莨菪亭标准样品，相关产品质量良莠不齐，因此，亟待研制莨菪亭标准样品，规范以莨菪亭为主要成分的枸杞提取物的品质，保证以此为原料的功能食品、保健食品和化妆品的质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种高纯度莨菪亭的制备方法，本发明提取的莨菪亭纯度高，纯度＞98.5％，均匀性和稳定性良好，能够作为莨菪亭的标准样品。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高纯度莨菪亭的制备方法，包括以下步骤：
(1)将枸杞子粉碎后利用亚临界技术脱脂，脱脂产物利用乙醇溶液进行回流提取得到枸杞粗提物；
(2)将枸杞粗提物利用大孔吸附树脂进行分离富集且用乙醇洗脱后得到莨菪亭粗提物；
(3)将莨菪亭粗提物用水溶解后利用有机溶剂分层，上层浓缩干燥后得到莨菪亭粗品；
(4)将莨菪亭粗品利用色谱纯甲醇重结晶，浓缩液干燥后得到高纯度莨菪亭。
上述技术方案中，步骤(1)的操作步骤为：将枸杞子粉碎后过筛得到枸杞粉末，向枸杞粉末中加入乙醇溶液进行搅拌浸泡后得到枸杞混合液，对枸杞混合液利用亚临界丁烷脱脂，脱脂产物加入利用乙醇溶液进行回流提取得到枸杞粗提物；
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的枸杞子为宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥成熟果实，粉碎过50目筛得到枸杞粉末，将枸杞粉末加入10倍重量的70％乙醇中，加热到60℃，在此温度下搅拌浸泡1h后得到枸杞混合液。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的亚临界丁烷脱脂，操作条件为：萃取温度为45-55℃、萃取压力0.3-0.6MPa，萃取时间为35-45min，萃取后得到的枸杞渣即为脱脂产物。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的脱脂产物，加入到8-12倍重量的95％乙醇中，加热至50-60℃回流提取3-5h得到的提取液为枸杞粗提物(得率为23-27％、提取率为78-82％)。
上述技术方案中，步骤(2)的具体操作为：将枸杞粗提物上大孔吸附树脂进行吸附，吸附结束后依次用20％、50％、70％、95％的乙醇进行洗脱，收集50％乙醇洗脱后得到的液体经过喷雾干燥至产物含水率低于10％得到莨菪亭粗提物(含有13-18％黄酮提取物)。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的大孔吸附树脂为HPD400A、LSA10、DA201-CIII、D101中的任意一种；以枸杞粗提物与大孔吸附树脂的质量比为1：50上柱吸附，吸附流速为1～3BV/h，洗脱液的洗脱流速为2～4BV/h，洗脱液用量为2-5BV。
上述技术方案中，步骤(3)的操作步骤为：将莨菪亭粗提物溶解于纯水中，再加入正丁醇，充分振荡后装入分液漏斗中静置8h分层，上层为正丁醇相、下层为水相，收集上层正丁醇相旋转蒸发去除溶剂浓缩回收得到浓缩液，将浓缩液水浴挥发干后得到莨菪亭粗品(含有28-30％的黄酮提取物)。
上述技术方案中，步骤(3)中，所述的莨菪亭粗提物溶解于纯水中时，60g莨菪亭粗提物溶解于3000mL纯水中，且超声溶解20min使之彻底溶解，彻底溶解后再加入3000mL正丁醇进行分层。
上述技术方案中，步骤(3)中，所述的旋转蒸发去除溶剂浓缩回收得到浓缩液，操作条件为：真空度为-0.9—-0.1mpa、温度为50-60℃，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-10℃以下、优选为-20—-10℃，取蒸发得到的部分溶剂加入酸性重铬酸钾溶液，如果变成灰绿色则说明没有蒸完，如果不变色则证明蒸发完毕。
上述技术方案中，步骤(4)的操作步骤为：将莨菪亭粗品用适量的甲醇溶解后和硅胶拌样，采用湿法装柱，利用二氯甲烷：甲醇依次增大比率的混合液为洗脱液进行洗脱，分级收集洗脱液，从第二个柱体积开始收集，将收集到的第二到四个柱体积的洗脱液合并，减压真空干燥待溶剂挥干后，出现大量淡黄色针状结晶，此结晶为高纯度莨菪亭。
上述技术方案中，步骤(4)中，莨菪亭粗品用甲醇溶解后得到浓度为140-160mg/mL的莨菪亭溶液，取45g硅胶和10ml莨菪亭溶液采用湿法装柱。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述的洗脱液为二氯甲烷与甲醇体积比分别为1:1、1:3、1:5依次增大比率的的混合液；每一种洗脱液的流速为1-2BV/h，用量为1-3BV。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述的减压真空干燥，操作条件为：真空度为2-8mp、温度-25—-10℃。
本发明提取的莨菪亭纯度高，纯度＞98.5％，均匀性和稳定性良好，能够作为莨菪亭的标准样品，规范以莨菪亭为主要成分的枸杞提取物的品质，保证以此为原料的功能食品、保健食品和化妆品的质量。
附图说明
图1-1为系统I检测实施例1得到的莨菪亭的薄层色谱图；
图1-2为系统II检测实施例1得到的莨菪亭的薄层色谱图；
图1-3为系统III检测实施例1得到的莨菪亭的薄层色谱图；
图2-1为洗脱条件一时检测实施例1得到的莨菪亭的HPLC图谱；
图2-2为洗脱条件二时检测实施例1得到的莨菪亭HPLC图谱；
图2-3为洗脱条件二时的空白谱图；
图3-1为检测波长为228nm时检测实施例1得到的莨菪亭放大色谱图；
图3-2为检测波长为295nm时检测实施例1得到的莨菪亭放大色谱图；
图3-3为检测波长为345nm时检测实施例1得到的莨菪亭放大色谱图；
图4-1为Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)检测实施例1得到的莨菪亭的HPLC图谱；
图4-2为SinoChrom ODS-BP C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)检测实施例1得到的莨菪亭的HPLC图谱；
图5为HPLC-MS检测实施例1得到的莨菪亭正离子模式下总离子流图；
图6-1为实施例1得到的莨菪亭的TG曲线(N2气氛)；
图6-2为实施例1得到的莨菪亭的TG曲线(O2气氛)；
图7-1为实施例1得到的莨菪亭的紫外光谱图；
图7-2为实施例1得到的莨菪亭的红外光谱图；
图7-3为实施例1得到的莨菪亭的高分辨质谱图。
具体实施方式
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
下面结合具体的实施例，对本发明进行阐述：
实施例1：一种高纯度莨菪亭的制备方法
包括以下步骤：
(1)以枸杞子为宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥成熟果实作为原料，粉碎过50目筛得到枸杞粉末，将枸杞粉末加入10倍重量的70％乙醇中，加热到60℃，在此温度下搅拌浸泡1h后得到枸杞混合液；对枸杞混合液利用亚临界丁烷脱脂，操作条件为：萃取温度为50℃左右、萃取压力0.4MPa左右，萃取时间为43min，萃取后得到的枸杞渣即为脱脂产物；向脱脂产物中加入到9倍重量的95％乙醇中，加热至52℃左右回流提取3.5h得到的提取液为枸杞粗提物(得率为25％、提取率为80％)。
(2)将枸杞粗提物上LSA10大孔吸附树脂进行吸附，以枸杞粗提物与大孔吸附树脂的质量比为1：50上柱吸附，吸附流速为1BV/h，洗脱液的洗脱流速为2.54BV/h，洗脱液用量为4BV；吸附结束后依次用20％、50％、70％、95％的乙醇进行洗脱，收集50％乙醇洗脱后得到的液体经过喷雾干燥至产物含水率低于10％得到莨菪亭粗提物(含有15％黄酮提取物)。
(3)将60g莨菪亭粗提物溶解于3000mL纯水中，超声溶解20min使之彻底溶解，再加入3000mL正丁醇，充分振荡后装入分液漏斗中静置8h分层，上层为正丁醇相、下层为水相，收集上层正丁醇相旋转蒸发去除溶剂浓缩回收得到浓缩液，将浓缩液水浴挥发干后得到莨菪亭粗品(含有29.5％的黄酮提取物)。转蒸发的操作条件为：真空度为-0.9mpa、温度为52℃左右，蒸发过程配设有冷却水循环系统，冷凝水的温度为-20℃，取蒸发得到的部分溶剂加入酸性重铬酸钾溶液，如果变成灰绿色则说明没有蒸完，如果不变色则证明蒸发完毕。
(4)将莨菪亭粗品用适量的甲醇溶解后得到浓度为140-160mg/mL的莨菪亭溶液，取45g硅胶和10ml莨菪亭溶液采用湿法装柱利用二氯甲烷：甲醇依次增大比率(1:1、1:3、1:5)的混合液为洗脱液进行洗脱，每一种洗脱液的流速为2BV/h，用量为2BV；分级收集洗脱液，从第二个柱体积开始收集，将收集到的第二到四个柱体积的洗脱液合并，减压真空干燥(真空度为8mp、温度-15℃)待溶剂挥干后，出现大量淡黄色针状结晶，此结晶为高纯度莨菪亭。
验证试验一：利用3种不同的展开剂对实施例1得到的高纯度莨菪亭进行薄层色谱纯度分析
采用3种展开体系进行检测，薄层板硅胶254G板，设计五个点样量分别为20μg(点1)、40μg(点2)、60μg(点3)、80μg(点4)、100μg(点5)。
1、展开系统
1.1系统I
薄层板：烟台江友硅胶开发有限公司HPTLC预制板
展开剂：石油醚：乙酸乙酯(1:1，v/v)
显色剂：I2
显色方法：碘蒸汽熏蒸
Rf值：0.34
结论：各量下均未见杂质斑点出现，见图1-1。
1.2系统II
薄层板：烟台江友硅胶开发有限公司HPTLC预制板
展开剂：石油醚：丙酮(3:2，v/v)
显色剂：I2
显色方法：碘蒸汽熏蒸
Rf值：0.38
结论：各量下均未见杂质斑点出现，见图1-2。
1.3系统III
薄层板：烟台江友硅胶开发有限公司HPTLC预制板
展开剂：二氯甲烷：甲醇(50:1，v/v)
显色剂：I2
显色方法：碘蒸汽熏蒸
Rf值：0.40
结论：各量下均未见杂质斑点出现，见图1-3。
2、结论
利用3种不同的展开剂进行的薄层色谱检测，结果显示，莨菪亭样品在20～100μg的点样量范围内，仅见明显的一个显色斑点，未见杂质的斑点，说明该样品的纯度较高。
验证试验二：利用HPLC对实施例1得到的高纯度莨菪亭的进行纯度分析
1、不同洗脱条件下纯度分析
1.1洗脱条件一
分析条件：色谱柱：Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：0min0.1％TFA水:甲醇＝80:20；14min 0.1％TFA水:甲醇＝60:40；16～22min0.1％TFA水:甲醇＝30:70；25min 0.1％TFA水:甲醇＝80:20；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间：25min；检测波长：345nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，莨菪亭纯度为99.32％。HPLC测定图如图2-1所示。
3.3.1.2洗脱条件二
分析条件：色谱柱：Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：0min0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝80:10:10；14min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝60:20:20；16～22min0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝30:40:30；25min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝80:10:10；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间：25min；检测波长：345nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，莨菪亭纯度为99.34％。选定洗脱条件二对莨菪亭标准样品进行后续的均匀性、稳定性和定值试验。莨菪亭HPLC图谱如图2-2所示，空白图谱如图2-3所示。
2、不同检测波长下纯度分析
分析条件：色谱柱：Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：0min0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝80:10:10；14min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝60:20:20；16～22min0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝30:40:30；25min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝80:10:10；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间：25min；检测波长：200-400nm。除溶剂峰外，其他波长下无其他杂质峰出现。将228nm、295nm、345nm三个波长条件下的色谱图放大，纯度和放大色谱图见下表：
表1不同检测波长结果
检测波长(nm)
纯度值(％)
放大色谱图·
·228·
·99.49·
·图3-1·
·295·
·99.37·
·图3-2·
·345·
·99.34·
·图3-3·
3、不同色谱柱条件下纯度分析
采用两根不同的C18色谱柱，在相同的洗脱条件下测定莨菪亭标准样品的纯度。
3.1Hypersil ODS2 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)
流动相：0min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝80:10:10；14min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝60:20:20；16～22min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝30:40:30；25min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝80:10:10；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间：25min；检测波长：345nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，莨菪亭纯度为99.34％。HPLC图谱如图4-1所示。
3.2SinoChrom ODS-BP C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)
流动相：0min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝80:10:10；14min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝60:20:20；16～22min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝30:40:30；25min 0.1％TFA水:乙腈:甲醇＝80:10:10；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间：25min；检测波长：345nm。扣除溶剂色谱峰后，对样品色谱峰进行面积归一法定量，经积分，莨菪亭纯度为99.37％。HPLC图谱如图4-2所示。
4、结论
不同洗脱条件、不同检测波长及不同色谱柱条件下，分别对样品色谱峰进行面积归一化法定量，经积分，莨菪亭样品纯度均大于98.5％。
验证试验三：利用HPLC-MS对实施例1得到的高纯度莨菪亭进行纯度分析
分析条件：色谱柱：SinoChrom ODS-BP C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：0min 0.1％甲酸:乙腈:甲醇＝80:10:10，14min 0.1％甲酸:乙腈:甲醇＝60:20:20，16～18min 0.1％甲酸:乙腈:甲醇＝30:40:30；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；运行时间：18min。MS条件如下：Gas Temp：225℃；Drying Gas：5L/min；Nebulizer：20psig；Sheath Gas Temp：400℃；Sheath Gas Flow：12L/min；Scan：150to 2000m/z。如图5所示，正离子总离子流图中未发现明显杂质峰存在。
验证试验四：对实施例1得到的高纯度莨菪亭进行热重分析
在N2气氛条件下可以看出温度在25～105℃范围内，TG曲线是一条水平线(图6-1)，表明样品中无吸附水和结晶水，热稳定性好。当温度超过205℃时，样品开始分解。在O2气氛条件下可以看出样品在加热到温度900℃时(图6-2)，重量损失在99.41～99.84％之间(平行分析3次)表明样品中无明显无机杂质。
验证试验五：对实施例1得到的高纯度莨菪亭进行结构确认
实施例1得到的高纯度莨菪亭的紫外光谱图如图7-1所示，莨菪亭UV(MeOH)λmax(logε)＝345(4.15)，符合莨菪亭紫外吸收的特征。
实施例1得到的高纯度莨菪亭的红外光谱图如图7-2所示：3338cm-1：-OH的伸缩振动；1703cm-1：O＝C-的伸缩振动；1628，1608，1566cm-1：多共轭双键的伸缩振动；1291cm-1：不对称C-O-C的伸缩振动；1018cm-1：对称C-O-C的伸缩振动；820，745cm-1：芳香C-H面外弯曲振动；714cm-1：环C＝C弯曲振动。该化合物存在-OH，O＝C-，C-O-C-，芳环共轭双键的官能团，与莨菪亭的结构完全相符。
实施例1得到的高纯度莨菪亭的高分辨质谱图如图7-3所示：莨菪亭加钠离子[C10H8O4+Na]+的理论精确质量数215.0320，高分辨质谱测得的莨菪亭加钠离子精确质量数为215.0320，两者数据完全一致，符合高分辨质谱的基本要求。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
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