***相关受体α新激动剂及其用途
阅读说明：本技术 ***相关受体α新激动剂及其用途 (Estrogen-related receptor alpha novel agonists and uses thereof ) 是由 刘桂霞 王蕊 唐赟 李冬萍 苏琳 李伏兴 焦茜 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种雌激素相关受体α(ERRα)新激动剂,分别是：7,8-二甲基-4-(1-哌啶基)-2H-1-苯并吡喃-2-酮、2,4-二氯-1-奈基-1-哌啶酸、2-[(己烷氧基-1(2H)-偶氮杂环)甲基]-8-甲基-4H-吡啶-[1,2-a]嘧啶酮、7-氯-2-[(4-甲基-1-哌啶基)甲基]-4(3H)-喹唑啉酮、N-[5-[(2-氨基-2-氧代乙基)硫代]-2-噻唑基]-3-甲基-1-苯基-1H-噻吩[2,3-c]吡唑-5-羧胺以及4-[(2,4-二氯苯基)甲氧基]-3-甲氧基-2-氨基-1-甲基-2-氧代乙基-苯甲酸。本发明还提供了上述ERRα新激动剂的筛选方法及用途。(the invention relates to a new agonist of estrogen related receptor alpha (ERR alpha), which is respectively: 7,8-dimethyl-4- (1-piperidinyl) -2H-1-benzopyran-2-one, 2, 4-dichloro-1-naphthalenyl-1-piperidinoic acid, 2- [ (hexyloxy-1 (2H) -azoheterocycle) methyl ] -8-methyl-4H-pyridine- [1,2-a ] pyrimidinone, 7-chloro-2- [ (4-methyl-1-piperidinyl) methyl ] -4(3H) -quinazolinone, N- [5- [ (2-amino-2-oxoethyl) thio ] -2-thiazolyl ] -3-methyl-1-phenyl-1H-thiophene [2 ], 3-c ] pyrazole-5-carboxamide and 4- [ (2,4-dichlorophenyl) methoxy ] -3-methoxy-2-amino-1-methyl-2-oxoethyl-benzoic acid. The invention also provides a screening method and application of the ERR alpha new agonist.)
技术领域
本发明涉及药物学技术领域，特别涉及糖尿病治疗药物技术领域，具体是指一种***相关受体α(ERRα)新激动剂及用途。
背景技术
随着人们生活水平的逐渐提高，糖尿病也成了继肿瘤和心血管疾病之后危害人类生命健康的第三大疾病。糖尿病是一种当人体不能产生足够的胰岛素或不能正确识别胰岛素时，引起的以糖代谢紊乱为主，同时包括脂肪蛋白质代谢紊乱的一种全身性疾病。糖尿病患者除了体内血糖升高外，还有许多临床表现，比如三多一少即多饮、多食、多尿、消瘦等。医学上将其分为四大类：1型糖尿病(βcell受破坏引起的胰岛素绝对缺陷)、2型糖尿病(胰岛素相对缺乏)、其他特殊类型(βcell遗传性缺陷，胰岛素作用遗传性缺陷以及药物等引起的糖尿病)和妊娠期糖尿病(妊娠期间诊断的糖尿病)。其中最主要的就是1型和2型这两种类型，尤其是2型糖尿病患者人数约占据了患者总数的90％-95％。2017年，国际糖尿病联盟(IDF)(http://www.diabetesatlas.org/)更新了全球糖尿病地图(IDF Diabetes Atlas)。根据这些数据，可以看出2017年全球约4.25亿人患糖尿病，预计到2045年，糖尿病患者人数可能达到6.29亿。
2型糖尿病的治疗一般是通过药物促进胰岛素分泌、增加胰岛素敏感性等方式降低血糖浓度。目前已有不少上市的口服降糖药，比如：二甲双胍类、磺脲类、DPP4竞争性抑制剂等。但是到目前为止，已上市的2型糖尿病治疗药物有易造成低血糖、引起肝肾损伤、乳酸酸中毒、胃肠道反应等副作用；而糖尿病患者人数不断增加，所以寻找可以治疗2型糖尿病的靶标并开发可治疗药物一直是一个研究热点。
***相关受体(Estrogen related receptors,ERRs)是核受体家族的成员之一，包括ERRα、ERRβ、ERRγ三个亚型。与***受体结构具有很高的同源性，包括非保守的N末端区域、高度保守的DNA结合域(DBD)、铰链区域、保守的配体结合域(LBD)。LBD域处于C端，包含一个转录活化功能域2。研究表明ERRα主要分布于肠、褐色脂肪组织、骨骼肌等代谢活跃的组织，作为一种孤儿核受体，在不同细胞环境中与多种辅助因子相结合从而发挥其调控靶基因转录的功能。
基因功能学和生物化学研究表明ERRα通过与辅助因子结合，从而调控参与三羧酸循环、氧化磷酸化和糖酵解等主要糖类和脂质代谢途径中的重要蛋白或酶的表达量和活性，最终调控能量代谢。在不同组织中，PGC-1α是线粒体生物合成、糖脂代谢等能量代谢的重要调节剂，并且ERRα是PGC-1α的直接下游靶基因，PGC-1α通过与ERRα和GA-结合蛋白A(GABPA)的相互作用来调控许多参与线粒体OXPHOS的基因转录。ERRα还涉及脂肪酸β氧化过程，激活ERRα可以改善脂肪在骨骼肌中的积聚，因此ERRα是一个氧化磷酸化和脂肪酸氧化基因表达的调节剂。从原理上说，ERRα小分子激动剂能够激活GABPA和ERRα中的双倍阳性反馈循环，从而激活线粒体生物合成的整个转录信号通路。研究表明，2型糖尿病患者的线粒体OXPHO基因表达下降，阻碍了葡萄糖和脂肪等能量物质的吸收和代谢，使得这些物质蓄积于骨骼肌中，最终引起胰岛素抵抗及2型糖尿病。所以增强线粒体OXPHO能力可以改善糖尿病症状。
因此，设计ERRα的小分子激动剂能增强糖尿病患者线粒体OXPHOS功能以及脂肪酸氧化，降低血糖水平，有望治疗2型糖尿病和肥胖症等代谢类疾病。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种***相关受体α新激动剂、筛选方法及用途，该***相关受体α新激动剂结构新颖，具有较强的***相关受体α的激动活性，从而可以作为治疗糖尿病的先导化合物，为今后进一步设计开发新型糖尿病治疗药物提供帮助。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种***相关受体α新激动剂，其特点是，所述***相关受体α(ERRα)新激动剂分别是化合物1：7,8-二甲基-4-(1-哌啶基)-2H-1-苯并吡喃-2-酮(7,8-dimethyl-4-(1-piperidinylmethyl)-2H-1-Benzopyran-2-one)，化合物2：2,4-二氯-1-奈基-1-哌啶酸(2,4-dichloro-1-naphthalenyl-1-piperidinecarboxylic acid)，化合物3：2-[(己烷氧基-1(2H)-偶氮杂环)甲基]-8-甲基-4H-吡啶-[1,2-a]嘧啶酮(2-[(hexahydro-1(2H)-azocinyl)methyl]-8-methyl-4H-Pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one)，化合物4：7-氯-2-[(4-甲基-1-哌啶基)甲基]-4(3H)-喹唑啉酮(7-chloro-2-[(4-methyl-1-piperidinyl)methyl]-4(3H)-quinazolinone)，化合物5：N-[5-[(2-氨基-2-氧代乙基)硫代]-4-甲基-2-噻唑基]-3-甲基-1-苯基-1H-噻吩[2,3-c]吡唑-5-羧胺(N-[5-[(2-amino-2-oxoethyl)thio]-4-methyl-2-thiazolyl]-3-methyl-1-phenyl-1H-thieno[2,3-c]pyrazole-5-carboxamide)，化合物6：4-[(2,4-二氯苯基)甲氧基]-3-甲氧基-2-氨基-1-甲基-2-氧代乙基-苯甲酸(4-[(2,4-dichlorophenyl)methoxy]-3-methoxy-2-amino-1-methyl-2-oxoethyl-benzoic acid)，其结构式分别如下：
上述化合物的发现，源于一种计算机模拟药物设计的技术来缩短发现的时间和流程。这项技术叫做虚拟筛选(Virtual Screening)。虚拟筛选所用的化合物库，包括本发明中的化合物都来源于Enamine多样性化合物库(http://www.enamine.net/)。
在本发明的第二方面，提供了一种***相关受体α新激动剂的筛选方法，包括步骤：
(1)第一轮筛选：利用基于配体三维结构相似性搜索对Enamine化合物数据库进行初步筛选，挑选出分子相似性指数大于0.8的化合物；同时，利用受体药效团的方法去筛选Enamine数据库，得到最少匹配4个药效特征，最多匹配8个药效特征的化合物；
(2)第二轮筛选：用Glide的SP方法对第一轮筛选所得化合物分子进行对接筛选，根据打分将对接结果排序，保留标准精度筛选得到的排名靠前20％的化合物；
(3)第三轮筛选：使用Glide对第二轮筛选所得化合物进行XP对接，保留打分排名靠前的2000个化合物；
(4)第四轮筛选：采用Prime中的MM-GBSA模块对第三轮筛选所得化合物分子进行结合自由能计算，得到基于结合自由能的打分，并结合第三轮筛选所得化合物分子的打分情况，筛选出打分高、作用模式好的化合物，作为潜在的***相关受体α新激动剂。
较佳地，还包括步骤：(5)对步骤(4)筛选出的化合物进行细胞水平ERRα激动活性测试。
在本发明的第三方面，提供了上述的***相关受体α新激动剂在制备治疗糖尿病及其并发症的药物中的应用。
较佳地，所述糖尿病是2型糖尿病。
较佳地，所述并发症是肥胖病。
本发明的有益效果在于：本发明的***相关受体α新激动剂结构新颖，具有较强的***相关受体α的激动活性，从而可以作为治疗糖尿病的先导化合物，为今后进一步设计开发新型糖尿病治疗药物提供帮助。
附图说明
图1为具有ERRα激动作用的化合物筛选的流程示意图。
图2-1～图2-6分别为本发明的***相关受体α新激动剂化合物1～6浓度及其对应的ERRα激动率的S型曲线示意图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
1、基于配体三维结构相似性搜索和受体药效团方法的组合虚拟筛选：
请参见图1所示，利用基于配体三维结构相似性搜索和受体药效团的组合虚拟筛选方法分别对Enamine数据库中的化合物分子进行筛选，最终得到了本发明的上述化合物，具体步骤如下：
(1)第一轮筛选：
利用基于配体三维结构相似性搜索和受体药效团方法分别对Enamine化合物数据库进行初步筛选。
基于小分子3D结构相似性搜索的虚拟筛选是以DK3为提问结构，使用Phase Shape中Shape only的方法对Enamine化合物数据库进行筛选，所得结果根据Phase sim打分进行排序，得到60788个与DK3相比较Shape sim>0.8的分子，随后这些化合物进入下一轮筛选。
基于受体药效团的方法是构建基于受体的ERRα的激动型药效团模型去筛选准备好的Enamine数据库。目前还没有ERRα与激动剂的复合物晶体结构被解析出来，所以得到该受体与小分子激动剂的复合构象是后续模拟的基础。首先从PDB库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中获取ERRα的激动构象晶体结构(PDB code：3D24)并将其进行处理优化，接着将丁克教授课题组设计的ERRα选择性激动剂DK3与受体3D24进行分子对接，该部分对接工作使用的软件是AutoDock 4.2，参数设置使用了拉马克遗传算法，结合口袋大小半径设置为20埃，其余采用默认参数进行对接实验，根据产生构象的打分以及聚类情况，选择合理的对接构象进行分子动力学模拟以获得MD优化后的小分子DK3与ERRα稳定结合的构象。经过长时间动力学模拟后得到的代表性瞬时结构作为该步骤的研究对象，之后删除该构象中的小分子DK3，并采用Discovery Studio 3.5软件中的“Pharmacophores”模块以MD优化后的空载蛋白构建基于受体的ERRα的激动型药效团模型。以该受体药效团模型去筛选准备好的Enamine数据库，设置最少匹配4个药效特征，最多匹配8个药效特征，得到13215个化合物进入下一轮筛选。
(2)第二轮筛选：
利用Maestro 10.5中的Glide模块进行SP精度的分子对接，根据打分将对接结果排序，保留标准精度筛选得到的排名靠前20％的化合物构象进行下一轮筛选。
(3)第三轮筛选：
用Glide工具对化合物进行XP对接，根据打分将对接结果排序，保留打分排名靠前的2000个化合物进入下一轮筛选；
(4)第四轮筛选：
将XP对接排名靠前的2000个化合物构象用Prime中的MM-GBSA模块计算结合自由能，计算时允许配体分子以及范围内的蛋白质原子进行柔性变动，蛋白中其他原子固定。根据结合自由能打分并结合化合物在受体中的对接模式，选出可能的活性化合物。
最终，通过两种组合的虚拟筛选方式，共得到了75个化合物，用于生物活性测试，其中包括本发明的***相关受体α新激动剂。
2、用于本实施例的化合物1～6均购自上海陶素生化技术有限公司(www.tsbiochem.com)，其在Enamine库中的编号分别为：化合物1为Z44489863，化合物2为Z274555302，化合物3为Z44533685，化合物4为Z44525616，化合物5为Z335325256，化合物6为Z15637670，产品量各为5mg。
3、本发明的***相关受体α新激动剂的生物活性测试——激动ERRα活性的化合物的筛选
萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒购于翊圣生物；Ad-ERRE-SV40-luc购于汉恒生物；Ad-ERRα购于汉恒生物；RPMI 1640培养基购于Hyclone；胎牛血清购于Gibco；缓冲液各成分(PBS)等均购自上海泰坦科技股份有限公司；白色384孔荧光板购自Corning公司；synergy 2酶标仪来自biotek公司；HeLa细胞来源于ATCC。
3.1实验材料
3.1.1实验仪器
Biotek synergy 2酶标仪；
3.2实验方法
3.2.1构建细胞模型
首先以感染复数(MOI)为100的Ad-ERRα和感染复数为300的Ad-ERRE-SV40-luc转入Hela细胞，构建ERRα激动剂筛选模型。
3.2.2ERRα激动剂筛选
所采用的活性测试方法为荧光素酶报告基因方法。
测试原理：在筛选过程中，加入萤火虫荧光素(luciferin)为底物，荧光素酶在Mg2+和O2的参与下催化荧光素氧化成oxyluciferin，荧光素在氧化的过程中，发出生物荧光(bioluminomescence)，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，激动效果越好，荧光越强。
实验步骤：
将Ad-ERRE-SV40-luc和Ad-ERRα放在冰上待用。
化合物用DMSO配制成10mM的母液备用。
将生长融汇至80％的HeLa细胞制成细胞悬液，接种于96孔板，培养箱种孵育过夜。
以感染复数(MOI)为100的Ad-ERRα和MOI为300的Ad-ERRE-SV40-luc感染细胞，4-8h后换新鲜的完全培养基。
病毒转染36-48h后，用RPMI 1640培养基将化合物母液稀释成所需的浓度，并加入细胞中孵育，其中对照组加入含0.1％DMSO的培养基。
培养24h后，按照萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明书用酶标仪检测荧光素酶的活性。
通过计算得到化合物的激动率。计算公式：
激动率％＝[luc(化合物)-luc(对照)]/luc(对照)*100％；(其中luc代表荧光强度)
实验中以含0.1％DMSO的培养基为空白对照组。待测化合物浓度不少于7个，在化合物反应体系中的浓度及其对应的激动率作S型曲线图，求出EC50值(使用数据处理软件GraphPad 7.0进行曲线拟合及EC50计算)。
如图2-1～2-6所示，结果表明，本发明的6个化合物对ERRα具有激动活性，EC50值均小于4.65μM，可作为药物先导化合物，进行进一步结构改造，开发新型ERRα激动剂。
综上，本发明的***相关受体α新激动剂结构新颖，具有较强的***相关受体α的激动活性，从而可以作为治疗糖尿病的先导化合物，为今后进一步设计开发新型糖尿病治疗药物提供帮助。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。