一种吲哚青绿复合纳米粒子及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种吲哚青绿复合纳米粒子及其制备方法与应用 (Indocyanine green composite nanoparticles and preparation method and application thereof ) 是由 叶瑞绒 蒋宁 李蓉涛 刘丹 陈宣钦 李洪梅 卢俊健 马秀蓉 于 2021-06-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种吲哚青绿复合纳米粒子及其制备方法与应用,其原理是利用白蛋白,将二氧化锰通过温和地反向生物矿化方法把吲哚青绿装载到纳米粒子中,得到吲哚青绿复合纳米粒子,其简写为ICG@BSA@MnO-(2)；相较于传统的高锰酸钾-生物矿化方法,本发明可以明显的保护药物结构的稳定,并且可以有效装载大部分的碱性药物,细胞动物实验也验证了此纳米粒子在抗肿瘤方面的作用。(The invention discloses indocyanine green composite nanoparticles and a preparation method and application thereof 2 (ii) a Compared with the traditional potassium permanganate-biomineralization method, the method can obviously protect the stability of the medicine structure, can effectively load most of alkaline medicines, and cell animal experiments also verify the effect of the nanoparticles on the aspect of tumor resistance.)
技术领域
本发明涉及一种白蛋白二氧化锰装载吲哚青绿复合纳米粒子及其制备方法与应用，属于生物材料领域。
背景技术
光敏剂-吲哚青绿(ICG)是光动力疗法中的效应分子，ICG在肿瘤部位聚集后通过特定波长的光(808nm)激发后和氧气产生反应，生成活性氧物种，活性氧物种可以抑制肿瘤细胞的增殖生长。因此增加ICG在肿瘤部位的有效聚集和改善肿瘤乏氧是曾强光动力治疗进一步临床应用的2个主要手段，但同时，ICG本身存在一些问题，包括体内代谢速率过快，全身分部，肿瘤部位聚集很少。因此，开发肿瘤靶向和高效的ICG运输载体是提升ICG抗肿瘤临床应用的有效策略，白蛋白@二氧化锰纳米载体凭借优秀的肿瘤微环境响应释放药物的能力和安全的生物相容性等特点在提升药物体内代谢行为方面得到了广泛的应用。高锰酸钾@白蛋白生物矿化方法是常用的制备白蛋白@二氧化锰纳米粒子的方法，具体的是利用高锰酸钾氧化白蛋白形成带正电的白蛋白二氧化锰纳米粒子，随后对带负电的光敏剂药物-ICG进行静电吸附，白蛋白@二氧化锰纳米粒子载药之后，为了保持结构稳定，防止被包裹的药物过早的泄露，高锰酸钾被反复滴加到上述溶液中，但是随着高锰酸钾含量的升高，ICG结构会被高锰酸钾破坏掉，所以高锰酸钾法制备纳米粒子时对药物结构稳定性，高锰酸钾含量等反应条件要求苛刻。因此ICG是不能通过高锰酸钾@白蛋白方法进行有效装载的。
发明内容
本发明提供一种白蛋白二氧化锰装载吲哚青绿复合纳米粒子及其制备方法与应用，通过添加氯化锰，并调节pH值的方法，不仅可以保护ICG结构稳定，还可以把ICG有效装载到白蛋白二氧化锰纳米粒子中，从而规避了高锰酸钾矿化法的苛刻条件，解决了ICG在体内代谢问题，进一步提升了ICG的光动力效果在临床前的应用。
本发明通过以下技术方案实现。
一种白蛋白二氧化锰装载吲哚青绿复合纳米粒子，其组成为[email protected]@MnO2。
所述白蛋白二氧化锰装载吲哚青绿复合纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：
在避光、搅拌条件下，将牛血清白蛋白(BSA)380mg溶解在25mL水中，然后加入5-6mg的ICG，反应2h后，将2-3mL的MnCl2溶液缓慢滴加到上述溶液中，调节溶液pH值到10-11，继续避光搅拌反应2h，反应结束后将上述反应液30mL用超滤杯进行超滤，当溶液体积到达10mL，加入PBS溶液20mL继续超滤(目的：把溶液中未反应的游离药物洗涤出去)重复洗涤3次，得到纯净[email protected]@MnO2纳米粒子，整个过程均是避光。
所述搅拌转速为500-700rad/min。
所述MnCl2溶液的浓度为13mg/mL。
所述调节pH值采用的是浓度为1-2mmol/L的氢氧化钠溶液。
所述超滤采用的氮气压力为0.2MPa以下。
本发明还提供所述基于白蛋白二氧化锰装载吲哚青绿复合纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用，在激光作用下，可以明显抑制肿瘤细胞CT26的生长，其效果优于单独的PBS组和ICG组。
本发明的有益效果：
1、本发明相较于传统的高锰酸钾-生物矿化方法，本发明可以明显的保护药物结构的稳定，并且可以有效装载大部分的碱性药物，细胞动物实验也验证了此纳米粒子在抗肿瘤方面的作用。
2、本发明通过利用反向生物矿化的方法，把ICG安全有效的装载到白蛋白@二氧化锰纳米粒子中，从而避免了高锰酸钾氧化ICG的弊端，进一步提升了白蛋白@二氧化锰纳米粒子作为药物载体的应用范围。
附图说明
图1为本发明复合纳米粒子的合成路线图；
图2为本发明[email protected]@MnO2复合纳米粒子透射电镜图；
图3为本发明[email protected]@MnO2复合纳米粒子荧光/紫外检测分析结果图；
图4为本发明[email protected]@MnO2复合纳米粒子细胞毒性分析结果图；
图5为本发明[email protected]@MnO2复合纳米粒子ICG在血液中的循环时间图；
图6为本发明[email protected]@MnO2复合纳米粒子ICG肿瘤部位药物累积荧光效果图；
图7为本发明[email protected]@MnO2复合纳米粒子体内药效实验结果图；
图8为本发明[email protected]@MnO2复合纳米粒子安全性检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，本发明使用的原材料在没有特殊说明的情况下，均是可以市场购买得到或通过常规方法制备得到；其中BSA为市购牛血清白蛋白，ICG为市购吲哚青绿，PBS溶液为市购磷酸盐缓冲液。
实施例1
一种白蛋白二氧化锰装载吲哚青绿复合纳米粒子的制备方法，如图1所示，具体步骤如下：
在避光、500rad/min搅拌条件下，将380mg的BSA溶解在25mL去离子水中，然后加入5mg的ICG，反应2h后，将2mL浓度为13mg/mL的MnCl2水溶液缓慢滴加到上述溶液中，随后用氢氧化钠溶液(1mM)调节上述溶液pH值到10，继续避光搅拌反应2h，反应结束后将上述反应液用超滤杯进行超滤(氮气压力控制在0.2Mpa以下)，当溶液体积到达10mL，加入20mL的PBS溶液继续超滤，重复用PBS溶液洗涤3次，得到纯净的[email protected]@MnO2纳米粒子，然后用PBS溶液配置成浓度为1mg/mL的溶液A，整个过程均是避光进行。
实施例2
一种白蛋白二氧化锰装载吲哚青绿复合纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：
在避光、600rad/min搅拌条件下，将380mg的BSA溶解在25mL去离子水中，然后加入5.5mg的ICG，反应2h后，将2.5mL浓度为13mg/mL的MnCl2溶液缓慢滴加到上述溶液中，随后用氢氧化钠溶液(1.5mM)调节上述溶液pH值到10，继续避光搅拌反应2h，反应结束后将上述反应液用超滤杯进行超滤(氮气压力控制在0.2Mpa以下)，当溶液体积到达10mL，加入20mL的PBS溶液继续超滤，重复用PBS溶液洗涤3次，得到纯净的[email protected]@MnO2纳米粒子，然后用PBS溶液配置成浓度为1mg/mL的溶液A2，整个过程均是避光搅拌。
实施例3
一种白蛋白二氧化锰装载吲哚青绿复合纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：
在避光、700rad/min搅拌条件下，将380mg的BSA溶解在25mL去离子水中，然后加入6mg的ICG，反应2h后，将3mL浓度为13mg/mL的MnCl2溶液缓慢滴加到上述溶液中，随后用氢氧化钠溶液(2mM)调节上述溶液pH值到11，继续避光搅拌反应2h，反应结束后将上述反应液用超滤杯进行超滤(氮气压力控制在0.2Mpa以下)，当溶液体积到达10mL，加入20mL的PBS溶液继续超滤，重复用PBS溶液洗涤3次，得到纯净的[email protected]@MnO2纳米粒子，然后用PBS溶液配置成浓度为1mg/mL的溶液A3，整个过程均是避光搅拌。
对比例1
在避光、500rad/min搅拌条件下，将380mg的BSA溶解在25mL去离子水中，然后缓慢滴加KMnO4(13mg/mL)600μL，5min后，5mg的ICG被加入到上述溶液中，5min后，KMnO4(13mg/mL)600μL被继续加入到溶液中，5min后，KMnO4(13mg/mL)600μL被继续加入到溶液中，5min后用超滤杯超滤移除游离药物，然后用PBS溶液配置成浓度为1mg/mL的溶液B。
性能检测：
1、透射电镜表征：
图2为实施例1得到的溶液A和对比例1得到的溶液B的透射电镜图；从图中可以观测到溶液A和溶液B中均有尺寸均匀的纳米颗粒，元素分析证明锰元素存在纳米粒子中。
2、为了检测ICG是否完整有效的装载到白蛋白@二氧化锰纳米粒子中，对实施例1得到的溶液A和对比例1得到的溶液B两种溶液用紫外分光光度计和荧光分光光度计进行检测：
紫外检测分析：将游离ICG，溶液A，溶液B各取100μL溶解到900μL的去离子水中，然后将上述溶液1mL分别放置到石英比色池中，用紫外分光光度计进行特征吸收峰的检测(扫描范围600-900nm)，检测结果如图3a所示；
荧光检测：分别取溶液A和溶液B各50μL溶解到950μL的超纯水中，100μM的过氧化氢溶液加入到上述溶液中，1min后，将上述溶液分别放置在干净透明的石英荧光比色池中，然后使用荧光分光光度计进行ICG的荧光检测(激发750nm，发射810nm)，检测结果如图3b所示。
图3a所示，紫外检测可以看出游离ICG的紫外吸收在788nm处，溶液A在795nm处出现了ICG的特征吸收，特征吸收峰的红移是因为ICG被包裹在白蛋白二氧化锰纳米粒子中产生了屏蔽作用；而溶液B中并没有出现ICG的特征吸收峰，出现这种结果是因为ICG的结构被高锰酸钾破坏；荧光检测的结果如图3b所示，溶液A组显示出强烈的ICG荧光，而溶液B只有极其微弱的荧光信号，这与紫外检测结果一致，这些数据表明，溶液A可以有效的保护ICG结构稳定。
3、细胞毒性分析
使用96孔板种植CT26小鼠结肠癌细胞，每孔8000个细胞，培养在DMEM培养液中，DMEM培养液包含10％的胎牛血清和1％青霉素-链霉素，孔板整体放置在细胞培养箱(37℃)中过夜，然后在孔板中分别加入含有相同浓度梯度的ICG和溶液A的培养基(浓度梯度为10、30、60、90、120μM，浓度均为复合纳米粒子的浓度，下同)，继续孵育12h后，移除含有药物的DMEM，加入新鲜的DMEM，并用2w/cm2的激光进行光照(每孔3s，重复3次)，继续孵育24h，然后移除DMEM，将细胞活性检测液(CCK-8)1：9溶解在DMEM中，摇匀后，每孔加入100μL配置好的CCK-8检测液，继续37℃孵育3h，最后用多功能酶标仪在450nm处进行细胞活度检测。
图4为[email protected]@MnO2纳米粒子细胞毒性分析结果图；从实验结果可知，在没有激光照射的情况下，当药物浓度达到120μM时，对细胞没有显著性的毒性，说明该纳米粒子的安全性；当加入激光照射后，仅60μM的药物就抑制了细胞的半数生长，细胞活性受到显著抑制，且溶液A比单独的ICG更加明显，证明了用此方法制备的白蛋白二氧化锰纳米载体可以有效提升光动力治疗效果。
4、药物代谢动力学分析
血液药物代谢检测：6周龄的雄性BABL/C小鼠分别被尾静脉注射ICG和溶液A(ICG和溶液A浓度均为5mg/mL，100μL，溶剂为PBS溶液，每组实验3只小鼠)，在预先设定的时间(0.08h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h、36h)点使用取血针从小鼠左眼眶对小鼠进行取血，每次每只取4滴，血液样本保存在质量分数5％的柠檬酸钠的PBS缓冲液中，摇匀，4℃储存，随后血液样品4℃-3500rad/min离心取上清液，在新的96孔板中分别加入上清液，每孔50μL，使用多功能酶标仪在788nm处进行紫外检测，测定血液中的ICG的含量。
肿瘤药物蓄积的免疫荧光切片检测：6周龄的雄性BABL/C小鼠被腋下种植体积为1mm3的CT26瘤块，当瘤块体积到达100mm3时，分别尾静脉注射ICG和溶液A，24小时后，安乐死小鼠，取出肿瘤，封存在OTC胶中，-20℃冷藏，OTC凝固后，用冰冻切片机进行切割肿瘤组织，厚度6mm，-20℃保存。
冰冻切片处理：冰冻切片复温后，使用丙酮(4℃)浸泡10min达到去除OTC胶的目的，然后用PBS把切片洗净，使用免疫组化笔对肿瘤组织进行圈写，用DAPI进行细胞核染色(室温/8min)，PBS洗掉多余染料后，用激光共聚焦显微镜进行拍照观察。
图5为体外模拟肿瘤微环境和小鼠体内的[email protected]@MnO2纳米粒子ICG在血液中的循环时间图，结果表明：小鼠体内的[email protected]@MnO2可以接近10倍延长ICG在血液中的循环时间，30min后游离ICG在血液中含量几乎为零，而溶液A中的ICG血液保留量为8mg/mL，在4h时血液含量接近于零，说明溶液A可以延长ICG在体内的血液循环时间将近4h，明显改善了ICG的药代动力学时间，为进一步临床应用提供了方法。
图6为肿瘤部位药物累积荧光效果图，图6免疫荧光切片结果显示，在24小时后，ICG组肿瘤部位ICG荧光强度很弱，而溶液A则有更多的ICG荧光信号(红色)，图中PBS为空白对照组，这说明[email protected]@MnO2可以更多的聚集在肿瘤部位增强光动力治疗肿瘤的效果，这和血液药代检测结果一致，说明纳米载药颗粒可以保护ICG以免受到核酸酶、血清等的降解并且在血液循环中可以更多的在肿瘤部位聚集。
5、动物模型药效检测
药效实验：6周龄的雄性BABL/C小鼠被腋下种植体积为1mm3的CT26瘤块，当瘤块体积到达100mm3时，分别尾静脉注射等浓度ICG和溶液A，空白组单独注射PBS，24h后使用2％的巴比妥溶液(100μL)麻醉小鼠，对小鼠肿瘤部位进行光动力治疗，激光功率2w/cm2，光照6s后，休息10s，防止肿瘤部位产生光热，重复6次，在以后的两周内，对小鼠肿瘤体积进行统计，公式：肿瘤体积＝长径×短径×短径/2。
老鼠治疗结束后，安乐死小鼠，通过手术将小鼠主要器官取出，放置在4％的多聚甲醛溶液中固定，进行苏木精/伊红染色，最后用显微镜进行10倍观察。
体内药效实验结果如图7展示，通过14天的肿瘤生长统计可以看出，PBS组，ICG组和[email protected]@MnO2组对肿瘤抑制没有产生效果，14天内肿瘤体积快速增长；在激光照射条件下，PBS组仍然对肿瘤抑制没有产生效果，单独ICG组和[email protected]@MnO2组对肿瘤抑制产生效果，[email protected]@MnO2纳米粒子相较于单独的ICG抑制肿瘤的生长的效果更佳明显，进一步为ICG的临床应用提供了充分的证明。
最后对[email protected]@MnO2的药物急性毒性进行检测，主要脏器的安全性检测(图8)表明，在[email protected]@MnO2治疗后，主要的脏器细胞核完整，细胞质均匀分布，没有出现损伤，与PBS组和ICG组相差不大，说明[email protected]@MnO2对脏器没有损伤，也进一步证明，[email protected]@MnO2具有优良的生物相容性。
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