阅读说明：本技术 二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用 (Dihydrolipoic dehydrogenase mutant P213R and application thereof in poly-gamma-glutamic acid synthesis of bacillus licheniformis ) 是由 陈守文 张蒙 蔡冬波 杨帆 陈耀中 张清 马昕 于 2019-12-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程和酶工程技术领域,公开了二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R在地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸合成中的应用。本发明通过基因组上定点突变的方式,将来源于地衣芽胞杆菌WX-02(<I>Baclicus lincheniformis</I> WX-02)二氢硫辛酸脱氢酶PdhD的第213位脯氨酸编码的碱基CCA改为CGG,即213位由脯氨酸改成精氨酸,显著提高了聚γ-谷氨酸合成水平,突变菌株聚γ-谷氨酸产量相较于对照菌株至少提高了21%以上。本发明为聚γ-谷氨酸的高效生产提供了一种新策略。(The invention belongs to the technical field of genetic engineering and enzyme engineering, and discloses application of a dihydrolipoic dehydrogenase mutant P213R in synthesis of bacillus licheniformis poly gamma-glutamic acid. The invention uses the mode of site-directed mutagenesis on genome to lead the bacillus licheniformis WX-02 (B) Baclicus lincheniformis WX-02) dihydrolipoic dehydrogenase PdhD, wherein the base CCA coded by the 213 th proline of PdhD is changed into CGG, namely the 213 th proline is changed into arginine, so that the synthesis level of poly-gamma-glutamic acid is obviously improved, and the yield of the mutant strain poly-gamma-glutamic acid is compared with that of the mutant strain poly-gamma-glutamic acidThe control strain is at least improved by more than 21 percent. The invention provides a new strategy for the efficient production of poly-gamma-glutamic acid.)

二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ- 谷氨酸合成中的应用

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用。

背景技术

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种阴离子型生物高分子聚合物，分子间氢键的作用力由羧基提供，具有吸附性、水溶性、生物可降解性等优良性质，是一种良好的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、农药及肥料的缓释剂等，在食品加工、环境治理、化妆品、医疗、农业等产业均有很大的应用价值。

目前，聚γ-谷氨酸的商业化生产主要依赖于微生物发酵法，但是由于需要添加聚γ-谷氨酸合成前体物和发酵副产物过多，导致葡萄糖向聚γ-谷氨酸的转化率偏低。从目前报道看，聚γ-谷氨酸的商业生产菌株几乎完全依赖于芽胞杆菌属，如枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等。

二氢硫辛酸脱氢酶PdhD为丙酮酸脱氢酶复合体的一个亚基，丙酮酸脱氢酶是催化丙酮酸到乙酰CoA反应的关键酶。目前，丙酮酸脱氢酶和二氢硫辛酸脱氢酶的表达水平及表达活性与聚γ-谷氨酸合成水平之间的关系尚未研究，对二氢硫辛酸脱氢酶进行定点改造能否提高聚γ-谷氨酸合成水平也是不可预知的。本研究通过对二氢硫辛酸脱氢酶进行定点改造，提高了聚γ-谷氨酸合成水平。本发明提供了一种显著聚γ-谷氨酸合成水平的技术策略，为实现γ-PGA的工业化生产提供理论指导和技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供了二氢硫辛酸脱氢酶PdhD突变体P213R，所述的二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

二氢硫辛酸脱氢酶PdhD突变体P213R，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用，包括将地衣芽孢杆菌中的将二氢硫辛酸脱氢酶PdhD的第213位由脯氨酸变成了精氨酸，然后利用获得的重组菌株发酵生产聚γ-谷氨酸，所述的突变体P213R的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。

以上所述的应用中，优选的，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为能生产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌。

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformi s)WX-02。

以上所述的应用中，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：

葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠0～10g/L，NaNO₃ 0～10g/L，NH₄Cl0-10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5-1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0-1g/L，MnSO₄·H₂O 0-0.15g/L，CaCl₂ 0-1g/L；所述的谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaNO₃、NH₄Cl、ZnSO₄·7H₂ O、MnSO₄·H₂O和CaCl₂在每一组配方中，每次至多只有一种组分取零。

或甘油20-60g/L，谷氨酸钠25-35g/L，柠檬酸钠8-12g/L，NaNO₃ 8-12g/L，NH₄Cl 8-12g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.7-1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8-1.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8-1.2g/ L，MnSO₄·H₂O 0.1-0.25g/L，CaCl₂ 0.7-1.3g/L。

以上所述的应用中，所述的发酵培养基配方优选为：

葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠9-10g/L，NaNO₃ 9-10g/L，NH₄Cl 9-10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.9-1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.9-1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.9-1g/L，MnS O₄·H₂O 0.12-0.15g/L，CaCl₂ 0.9-1g/L。

或

甘油20-40g/L，谷氨酸钠25-35g/L，柠檬酸钠8-12g/L，NaNO₃ 8-12g/L，NH₄Cl 8 -12g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.7-1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8-1.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8-1.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.1-0.25g/L，CaCl₂ 0.7-1.3g/L。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过基因组定点突变策略，将二氢硫辛酸脱氢酶PdhD的第213位脯氨酸编码的碱基CCA改为精氨酸编码的碱基CGG，获得了二氢硫辛酸脱氢酶PdhD突变体P213R，，该酶在聚γ-谷氨酸合成应用中显著提高了聚γ-谷氨酸合成水平，其聚γ-谷氨酸合成水平相较于对照菌株有显著性提高。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实验材料和试剂

1、菌株：地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02，保藏号为CCTCCNO.M208065，菌株E.coli DH5α购自于北京全式金生物技术有限公司。

2、酶类及其它生化试剂：高保真Taq酶购自武汉擎科生物技术有限公司。细菌基因组 DNA提取试剂盒购自Tiangen公司，T4DNA连接酶、限制性内切酶等分子生物学试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

LB培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min后使用。

实施例1：

二氢硫辛酸脱氢酶基因突变的地衣芽胞杆菌WX-P213R的构建：

1、根据地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02基因组DNA序列通过基因合成序列突变的二氢硫辛酸脱氢酶基因P213R(SEQ ID NO.2所示)；以地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02基因组DNA为模板，PCR扩增出PdhD基因的上游同源臂(引物为T2-F1和T2-R1) 和PdhD基因的下游同源臂(引物为T2-F2和T2-R2)；

T2-F1:GACGACAATACAGATGAAGT

T2-R1:AAATCTCCTACTACCATTACATTACGCCTCCATTA

T2-F2:TAATGGAGGCGTAATGTAATGGTAGTAGGAGATTT

T2-R2:TAACAACGAAATAGTGGC 2、通过重叠延伸PCR将PdhD基因的上游同源臂、二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R基因和 PdhD基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为： PdhD基因的上游同源臂-突变体基因P213R-PdhD基因的下游同源臂；

3、采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-Ori进行双酶切得到线性质粒片段；

4、将步骤3得到的酶切目的片段和步骤3得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶连接，验证正确后得到质粒T2(2)-P213R；

5、将质粒T2(2)-P213R转入地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis WX-02中，经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证；

6、将步骤4得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3 次，每次培养12h，并以T2-F和P213R-R为引物进行菌落PCR检测单交换菌株；

T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA

P213R-R：ACAGAGGGGGTTTTTGATTTATTTTACAACGTGGAT 7、将步骤5得到的菌株和步骤6得到的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为T2-KYF和 T2-KYR)。得到阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的P213R突变菌株(即地衣芽胞杆菌WX-P213R)，该菌株中的二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；

T2-KYF:GAGATTATTCGTAAAGCCGAGATG

T2-KYR:TGGAAGGATTTCTTCTCC。

实施例2：

二氢硫辛酸脱氢酶突变体菌株WX-P213R在提高聚γ-谷氨酸发酵产量中的应用：

发酵产物产量分析

将实施例1获得的地衣芽胞杆菌WX-P213R菌株接种到LB培养基中，37℃，培养14h；向500mL三角瓶中装入50mL的聚γ-谷氨酸发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)接种至发酵培养基中。培养条件为转速230r/min，温度37℃，发酵周期36小时。

本实施例，针对不同的发酵培养基配方，考察了地衣芽胞杆菌WX-P213R对聚γ-谷氨酸合成水平的影响(同时也在这24种培养基中以同样接种量接种地衣芽胞杆菌WX-02作为对照)，24组培养基配方具体如表1所示：

表1发酵培养基配方

以上培养基成分单位均为g/L。

采用干重法测量聚γ-谷氨酸产量，具体操作步骤如下：取一定体积的发酵液样品，使用6mol/L HCl将pH调至3.0，12000r/min离心10min，上清用6mol/L NaOH将上清液pH调至中性，加入3倍体积乙醇沉淀聚γ-谷氨酸，离心收集聚γ-谷氨酸絮状沉淀，将沉淀在80℃烘箱烘干，测干重。根据干重法计算生产发酵的菌液中聚γ-谷氨酸产量(见表2)。

表2发酵试验聚γ-谷氨酸的产量

序列表

<110> 湖北大学

<120> 二氢硫辛酸脱氢酶突变体P213R及其在地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸合成中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Val Gly Asp Phe Pro Ile Glu Thr Asp Thr Leu Val Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Val Ala Ala Ile Arg Ala Ala Gln Leu Gly

20 25 30

Gln Lys Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Asn Leu Gly Gly Val Cys Leu

35 40 45

Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Ile Asn Ala Gly His Arg

50 55 60

Tyr Glu Asn Ala Lys His Ser Glu Glu Met Gly Ile Thr Ala Glu Asn

65 70 75 80

Val Lys Val Asp Phe Thr Lys Val Gln Glu Trp Lys Ala Ser Val Val

85 90 95

Asn Lys Leu Thr Gly Gly Val Glu Gly Leu Leu Lys Gly Asn Lys Val

100 105 110

Asp Ile Val Lys Gly Glu Ala Tyr Phe Val Asp Ser Asn Ser Val Arg

115 120 125

Val Met Asp Glu Asn Ser Ala Gln Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Ala Ile

130 135 140

Ile Ala Thr Gly Ser Arg Pro Ile Glu Leu Pro Asn Phe Lys Tyr Ser

145 150 155 160

Asp Arg Val Leu Asn Ser Thr Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Ile Pro

165 170 175

Lys Lys Leu Val Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Thr Glu Leu Gly

180 185 190

Thr Ala Tyr Ala Asn Phe Gly Thr Glu Val Val Ile Leu Glu Gly Gly

195 200 205

Glu Glu Ile Leu Arg Gly Phe Glu Lys Gln Met Ser Ser Leu Val Lys

210 215 220

Arg Asn Leu Lys Lys Lys Gly Asn Val Glu Ile His Thr Lys Ala Met

225 230 235 240

Ala Lys Gly Val Glu Glu Lys Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Phe Glu

245 250 255

Val Lys Gly Glu Glu Gln Thr Ile Asp Ala Asp Tyr Val Leu Val Thr

260 265 270

Val Gly Arg Val Ala Asn Thr Asp Glu Leu Gly Leu Glu Gln Val Gly

275 280 285

Val Glu Met Thr Asp Arg Gly Ile Ile Lys Thr Asp Lys Gln Cys Arg

290 295 300

Thr Asn Ile Pro Asn Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Ile Glu Gly Pro

305 310 315 320

Pro Leu Ala His Lys Ala Ser Tyr Glu Gly Lys Ile Ala Ala Glu Ala

325 330 335

Ile Ala Gly Glu Ala Ala Glu Ile Asp Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Val

340 345 350

Val Phe Ser Glu Pro Glu Leu Ala Ser Val Gly Tyr Thr Glu Ala Gln

355 360 365

Ala Lys Glu Glu Gly Leu Ser Val Thr Ala Ala Lys Phe Pro Phe Ala

370 375 380

Ala Asn Gly Arg Ala Leu Ser Leu Asn Glu Thr Asp Gly Phe Leu Lys

385 390 395 400

Leu Val Thr Arg Lys Glu Asp Gly Leu Val Ile Gly Ala Gln Ile Ala

405 410 415

Gly Ala Ser Ala Ser Asp Met Ile Ser Glu Leu Ser Leu Ala Ile Glu

420 425 430

Ala Gly Met Thr Ala Glu Asp Ile Ala Met Thr Ile His Ala His Pro

435 440 445

Thr Leu Gly Glu Ile Thr Met Glu Ala Ala Glu Val Ala Ile Gly Met

450 455 460

Pro Ile His Val Val Lys

465 470

<210> 2

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtagtag gagatttccc tattgaaaca gatactcttg tcattggtgc gggacctggc 60

ggctatgtag ctgccatccg cgctgctcag cttggacaaa aagtaacaat cgtcgaaaaa 120

ggcaatcttg gaggcgtatg tctgaatgtc ggatgtatcc cttcaaaagc gcttatcaat 180

gcaggccacc gctatgagaa tgcgaagcat tctgaagaga tggggatcac tgctgaaaac 240

gtaaaagttg actttacaaa ggttcaagaa tggaaagcct ctgtcgttaa taagcttacc 300

ggcggtgttg aaggccttct gaaaggaaac aaagtcgaca tcgtaaaagg cgaagcatac 360

tttgtagaca gcaattctgt acgcgtgatg gatgagaact cagctcagac ttacacgttc 420

aaaaatgcga tcattgcaac aggttctcgc cctatcgaat tgccaaactt caaatatagc 480

gaccgcgtac tgaattcaac aggcgcactt gcactgaaag aaattcctaa gaagctcgtt 540

gtcatcggcg gcggctacat cggaacagag ctcggtactg catatgcaaa cttcggtact 600

gaagttgtca ttcttgaagg cggagaagaa atccttcggg gatttgagaa gcaaatgagc 660

tctcttgtga aacgcaacct gaagaaaaaa ggcaacgttg aaatccatac aaaagcaatg 720

gctaaaggcg tagaagaaaa agctgacggc gtaaccgtta cgttcgaagt gaaaggcgaa 780

gagcaaacga tcgatgcgga ctacgtactt gtcactgtcg gccgcgttgc aaacacggac 840

gagctcggac ttgaacaagt cggcgtcgaa atgacggacc gcggcatcat caaaacggac 900

aaacaatgcc gtacaaacat tccgaacatc tatgcgatcg gtgacatcat cgaaggtcct 960

ccgcttgcgc ataaagcttc ttatgaaggt aaaattgctg ctgaagcgat tgccggagaa 1020

gctgcggaaa tcgactatct tggaattcct gcggtcgtat tctctgagcc tgaacttgca 1080

tctgtaggct acactgaagc acaggctaaa gaagaaggtc tttcagtgac tgcagccaaa 1140

ttcccgtttg cagcaaacgg acgtgcgctg tcattaaacg aaactgacgg tttccttaaa 1200

cttgtaacac gcaaagaaga cggcttagtc atcggtgcac aaatcgccgg agcaagcgct 1260

tctgacatga tttctgagct gagcttggca atcgaagcag gaatgactgc tgaagatatc 1320

gcaatgacaa tccacgctca ccctacattg ggagaaatca caatggaagc tgcagaagtt 1380

gccatcggca tgccgatcca cgttgtaaaa taa 1413

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgacaata cagatgaagt 20

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaatctccta ctaccattac attacgcctc catta 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatggaggc gtaatgtaat ggtagtagga gattt 35

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taacaacgaa atagtggc 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtgataac tcggcgta 18

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acagaggggg tttttgattt attttacaac gtggat 36

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagattattc gtaaagccga gatg 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggaaggatt tcttctcc 18