阅读说明：本技术 一种单宁酶的共交联固定化方法 (Tannase co-crosslinking immobilization method ) 是由 吴嘉沁 张瑞丰 李艳 肖通虎 龙能兵 于 2019-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明是关于一种单宁酶的共交联固定化方法。使用油溶性的三羟甲基丙烷三丙烯酸酯作为交联剂,水相中的反应物为含有氨基的单宁酶以及胺化环氧树脂与β-环糊精形成的超分子复合物,利用双键与氨基的迈克尔加成反应,在较低的温度下发生共交联聚合反应,制备出不同负载量的固定化单宁酶。通过控制交联程度,提高分散性,改善其内部的传质微环境,该固定化酶具有较高的催化活性,负载量在89mg酶/g载体时具有最高的活性,达到游离酶的92％。(The invention relates to a tannase co-crosslinking immobilization method, wherein oil-soluble trimethylolpropane triacrylate is used as a crosslinking agent, reactants in a water phase are amino-containing tannase and a supermolecular complex formed by aminated epoxy resin and β -cyclodextrin, and the immobilized tannase with different loading amounts is prepared by utilizing Michael addition reaction of double bonds and amino groups to perform co-crosslinking polymerization reaction at a lower temperature.)

一种单宁酶的共交联固定化方法

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种单宁酶的共交联固定化方法，该新型固定化单宁酶可专门用于去除天然食品中由于单宁物质所造成的苦涩味。

背景技术

单宁酶(EC 3.1.1.20)又称为单宁酰基水解酶(等电点为4.5)，是一种由微生物在单宁存在的条件下诱导而产生的细胞膜结合酶。单宁酶来源丰富，不仅广泛存在于自然界中富含单宁的植物体内，还存在于大量的单宁酶产生菌中。单宁酶分子量在50～320kDa之间，其四级结构是由两个或两个以上不同亚基通过二硫键形成的异六聚体或异八聚体。纯单宁酶为白色或淡黑色粉末，不溶于乙醇，能溶于水形成无色澄清溶液。该酶能催化单宁和没食子酸酯类中的酯键和缩酚键的水解，生成没食子酸和相应的醇类，不同来源的单宁酶酶学性质有所差异。

单宁酶在化工、制药、食品、饲料、皮革、化妆品等领域均得到了广泛的应用。单宁酶在皮革生产过程中促使生皮鞣化过程更加均匀，有利于高级皮革的制造。许多植物饲料经常含有一些单宁，这些单宁能够与家畜的消化蛋白酶或者植物蛋白质发生反应凝固沉淀，降低家畜对蛋白质的吸收效率。使用单宁酶处理后的饲料会提高家畜对饲料中营养物质的吸收率。在化妆品生产中，许多公司为了使化妆品具有滋养、祛斑、防晒等功效，经常会在配方中加入植物提取液，当植物提取物中含有单宁时会出现化妆品浑浊、结块现象。单宁酶处理则可以解决这一问题。单宁酶在食品加工工业中可用于去除天然食品中由于单宁物质所造成的苦涩味。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的单宁酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的单宁酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的单宁酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于单宁酶的固定，利用单宁酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种单宁酶的固定化方法，这种方法是基于单宁酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为单宁酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过单宁酶的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联，同时交联剂含有多个双键，使交联产物形成支化结构，更大限度地阻止酶的聚集，增强酶的活力；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使单宁酶能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的单宁酶；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。

2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将单宁酶溶解在pH＝6.5的磷酸缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的单宁酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.2g三羟甲基丙烷三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置3～4小时，过滤后即得到不同负载量的固定化单宁酶的产物。

非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，单宁酶首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；

非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；

非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。

本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精分子复合物改善了固定化单宁酶的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使单宁酶以极高的效率被固定化；4)采用多官能度的交联剂能使固定化产物形成支化结构，阻止酶的聚集，提高酶的催化性能。

具体实施方式

酶的固定化

1)将双酚A环氧树脂(牌号为E-51，环氧值为0.51，数均分子量为392)、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；

3)将单宁酶溶解在pH＝6.5的磷酸缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；

4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的单宁酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；

5)在搅拌下将1.2g三羟甲基丙烷三丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置3～4小时，过滤后即得到不同负载量的固定化单宁酶的产物。

固定化酶的负载量测定：

由于共交联法固定单宁酶后，反应残留液中测不到单宁酶的活性，说明经过交联后单宁酶全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：

其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。

酶活力测定：

(1)游离酶活力测定：取三支洁净的试管分别加入0.25mL没食子酸丙酯溶液(0.01mol/L)，接着0.25mL柠檬酸缓冲液加入空白管中，0.25mL粗酶液加入到测试管中后将三支试管都放入30℃水浴中保温5min，然后在所有试管中都加入0.3mL甲醇绕丹宁(0.05mol/L)溶液，30℃水浴中保持5min，后在对照管中加入0.25mL粗酶液，然后三只试管中再分别加入0.3mL的KOH(0.5mol/L)溶液，在30℃水浴中保持5min，最后每支试管都用4mL蒸馏水稀释，30℃下保温10min后，在520nm波长下，测定反应混合物的吸光值。单宁酶的活性由吸光值的变化来计算。酶活计算公式：

式中：E为样品酶活力(IU/mL)；S为标准曲线的斜率；I为标准曲线的截距；WM为没食子酸分子量；Df为样品酶液的稀释倍数；t为反应时间(min)；V为反应酶液的体积(mL)；Ae为酶液反应的吸光值；Ao为灭活酶液空白的吸光值。

酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟产生1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。

(2)固定化酶活力测定：将载体与固定化酶分别用一定量柠檬酸缓冲液悬浮均匀备用。取3支试管分别标记为空白管、对照管和测试管，各加入0.5mL底物没食子酸丙酯(0.01mol/L)。空白管中加入0.5mL柠檬酸缓冲液(0.05mol/L，pH 5.0)，测试管中加入0.5mL固定化酶，对照管中加入等量载体，所有处理均30℃水浴5min。分离测试管与对照管中的固定化酶和载体，反应液加入0.6mL丹宁甲醇溶液(6.67g/L)，30℃水浴5min。加入0.4mL KOH(0.7mol/L)，30℃保温5min。所有处理中均加入8mL蒸馏水，振荡均匀后30℃保温10min，在520nm处测定吸光值。将30℃条件下每分钟产生1μmol没食子酸所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

相对活性：

将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。

实验结果：

实验一共得到7个不同负载量的固定化单宁酶的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图2是相对活性与负载量的关系，当负载量为89mg酶/g载体时其相对活性达到最大值，其比活力是游离酶的92％，这个结果说明单宁酶在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量小于89mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而增大，这主要是因为，酶的含量较低时，聚合物结构比较紧密，酶的催化活性不容易发挥出来，随着酶含量增加，聚合物的结构变的松散，酶与底物的接触机会增大，其相对活性也随之提高。当负载量大于89mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法能使酶的微环境得到改善，这与引入环糊精超分子结构单元有关，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外支化程度高的交联剂还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性。但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性又迅速下降。

我们以负载量为89mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图3所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝6.5条件下经过28天的储存，游离酶溶液只残留41％的活性，固定化酶能残留74％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。

附图说明

图1交联剂的化学结构。

图2固定化的单宁酶催化活性与其负载量的依赖关系。

图3固定化与游离的单宁酶储存稳定性比较。