阅读说明：本技术 活组织模型装置、血管壁模型，血管壁模型装置及评价被检物质的方法 (Biopsy phantom device, blood vessel wall phantom device, and method for evaluating test substance ) 是由 伊藤晃寿 柿沼千早 西野雅史 美马伸治 C·M·内维尔 C·A·森德巴克 于 2018-06-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种活组织模型装置、血管壁模型及血管壁模型装置。所述活组织模型装置包括：第一液体隔室,储存液体组合物；第二液体隔室,储存液体组合物；及细胞层叠体,配置于第一液体隔室与第二液体隔室之间作为两个隔室之间的隔层。所述血管壁模型包括：多孔膜,具有蜂窝结构；血管内皮细胞层,配置于多孔膜的一表面；及平滑肌细胞层或间充质干细胞层,配置于多孔膜的另一表面。血管壁模型装置包括：第一液体隔室,储存液体组合物；第二液体隔室,储存液体组合物；及血管壁模型,配置于第一液体隔室与第二液体隔室之间作为两个隔室的隔层。本发明还提供一种这些模型或模型装置的应用。(The invention provides living tissue model devices, a blood vessel wall model and a blood vessel wall model device, wherein the living tissue model device comprises a th liquid compartment for storing a liquid composition, a second liquid compartment for storing the liquid composition and a cell laminated body arranged between a th liquid compartment and the second liquid compartment as a partition between the two compartments, the blood vessel wall model comprises a porous membrane with a honeycomb structure, a blood vessel endothelial cell layer arranged on the surface of the porous membrane and a smooth muscle cell layer or an mesenchymal stem cell layer arranged on the other surface of the porous membrane, the blood vessel wall model device comprises a th liquid compartment for storing the liquid composition, a second liquid compartment for storing the liquid composition and a blood vessel wall model arranged between a th liquid compartment and the second liquid compartment as a partition between the two compartments, and the invention also provides application of the models or model devices.)

活组织模型装置、血管壁模型，血管壁模型装置及评价被检物 质的方法

技术领域

本发明涉及一种活组织模型装置、血管壁模型、血管壁模型装置及评价被检物质的方法。

背景技术

日本专利第5,113,332号公开了一种血脑屏障体外模型及使用该模型的药物评价方法。该血脑屏障体外模型具有将被称为“细胞培养***物”的过滤装置***培养皿的结构，还具有如下结构：将脑毛细血管内皮细胞层配置于细胞培养***物的过滤器上表面，将脑周细胞层配置于细胞培养***物的过滤器下表面，并且将星形胶质细胞层配置于培养皿的底面。

在该血脑屏障体外模型中，细胞培养***物的过滤器部分是脑毛细血管内皮细胞层、径迹蚀刻(TE)膜及脑周细胞层的层叠体通过在TE膜的一表面培养脑周细胞，接着在TE膜的另一表面培养脑毛细血管内皮细胞来获得该层叠体。

上述血脑屏障体外模型具有如下结构：培养皿的内部空间通过细胞培养***物被分成两个液体隔室。日本专利第5,113,332号公开了一种使用血脑屏障体外模型的方法，其包括：将药物添加至细胞培养***物(配置有脑毛细血管内皮细胞层一侧的液体隔室)内侧的工序，测量泄漏至细胞培养***物(配置有脑周细胞层一侧的液体隔室)的外侧的药物量的工序及评价药物通过血脑屏障的能力。

发明内容

发明要解决的技术课题

为了获得能够代替动物试验的用于评价药物或病状的活组织模型装置，需要构建具有类似于生物体内组织的结构和功能的细胞组织。从构件具有类似于生物体内组织的结构和功能的细胞组织的观点考虑，优选在具有比TE膜(TE膜通常具有约2％～约20％的开口率)更高的开口率的多孔膜的两面培养细胞而获得细胞层叠体，并将该细胞层叠体适用于活组织模型装置，该多孔膜用作细胞培养支架。

作为细胞培养支架，已知有在日本专利申请公开(JP-A)第2002-335949号中公开的蜂窝结构膜及在日本专利申请公开(JP-A)第2007-006987号中公开的蜂窝薄膜。JP-A第2002-335949号公开了一种细胞层叠体，其通过在蜂窝结构膜的两面培养相同种类的细胞(干细胞或心肌细胞)来获得。JP-A第2007-006987号公开了一种用于皮肤再生用移植的细胞片，其通过在蜂窝薄膜的一表面培养成纤维细胞，接着在蜂窝薄膜的另一表面培养上皮角质细胞来获得。在上述两个专利文献中，未能实现例如能够用于药物评价的装置的构件。

根据本发明的实施方式是鉴于上述情况而提出的。

本发明的目的在于提供一种本发明所要解决的课题即新型活组织模型装置、新型血管壁模型、新型血管壁模型装置及其应用。

用于解决技术课题的手段

解决上述问题的具体方法包括以下方面。

[A1]一种活组织模型装置，其包括：

第一液体隔室，储存液体组合物；

第二液体隔室，储存液体组合物；及

细胞层叠体，配置于所述第一液体隔室与所述第二液体隔室之间作为所述第一液体隔室与所述第二液体隔室之间的隔层，

所述细胞层叠体包括：具有蜂窝结构的多孔膜；包含第一种细胞且配置于所述多孔膜的一表面的细胞层；及包含与所述第一种细胞不同的第二种细胞且配置于所述多孔膜的另一表面的细胞层。

[A2]根据[A1]所述的活组织模型装置，其中，

所述第一种细胞及所述第二种细胞是选自包括实质细胞、基质细胞、肌细胞、成纤维细胞、神经细胞、胶质细胞、内皮细胞及上皮细胞的组中的两种细胞。

[A3]根据[A1]或[A2]所述的活组织模型装置，其中，

所述多孔膜的材料包括选自包括聚丁二烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯、聚(甘油癸二酸酯)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚萘二甲酸乙二酯、聚乙二醇丁二酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚己内酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚硅氧烷衍生物及三醋酸纤维素的组中的至少一种。

[A4]根据[A1]至[A3]中任一项所述的活组织模型装置，其中，

所述多孔膜的各表面被选自包括纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、基底膜蛋白聚糖(perlecan)、巢蛋白、蛋白聚糖、骨桥蛋白、生腱蛋白、肾连蛋白、基底膜基质、重组肽及聚赖氨酸的组中的至少一种包覆。

[A5]根据[A1]至[A4]中任一项所述的活组织模型装置，其中，

所述多孔膜上贯穿孔开口的平均直径为1μm～20μm，且所述多孔膜的开口率为30％～70％。

[A6]一种利用[A1]至[A5]中任一项所述的活组织模型装置来评价被检物质的方法，其包括：

将被检物质添加至所述第一液体隔室或所述第二液体隔室中的至少一个工序；及

(i)对包含在所述第一液体隔室的化学物质或包含在所述第一液体隔室的细胞中的至少一种进行定量的工序，或(ii)对包含在所述第二液体隔室的化学物质或包含在所述第二液体隔室的细胞中的至少一种进行定量的工序中的至少一个工序。

[A7]根据[A6]所述的评价被检物质的方法，其中，

工序(i)包括对包含在所述第一液体隔室的miRNA、包含在所述第一液体隔室的蛋白质或包含在所述第一液体隔室的转录因子中的至少一种进行定量，工序(ii)包括对包含在所述第二液体隔室的miRNA、包含在所述第二液体隔室的蛋白质或包含在所述第二液体隔室的转录因子中的至少一种进行定量。

[A8]根据[A6]所述的评价被检物质的方法，其还包括：

将示踪剂添加至已添加所述被检物质的液体隔室的工序，其中测量从已添加所述示踪剂的所述液体隔室泄漏至另一液体隔室的示踪剂的量的工序构成工序(i)或(ii)。

[B1]一种血管壁模型，其包括：

多孔膜，具有蜂窝结构；

血管内皮细胞层，配置于所述多孔膜的一表面；及

平滑肌细胞层，配置于所述多孔膜的另一表面。

[B2]根据[B1]所述的血管壁模型，其中，

在所述血管壁模型中，从所述血管内皮细胞层侧至所述平滑肌细胞层侧的FITC-葡聚糖70渗透性为从所述多孔膜的一表面至所述多孔膜的另一表面的所述FITC-葡聚糖70渗透性的0％～10％。

[B3]一种血管壁模型，其包括：

多孔膜，具有蜂窝结构；

血管内皮细胞层，配置于所述多孔膜的一表面；及

间充质干细胞层，配置于所述多孔膜的另一表面。

[B4]根据[B3]所述的血管壁模型，其中，

在血管壁模型中，从所述血管内皮细胞层侧至所述间充质干细胞层侧的FITC-葡聚糖70渗透性为从所述多孔膜的一表面至所述多孔膜的另一表面的所述FITC-葡聚糖70渗透性的0％～10％。

[B5]根据[B1]至[B4]中任一项所述的血管壁模型，其中，

所述多孔膜的材料包括选自包括聚丁二烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯、聚(甘油癸二酸酯)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚萘二甲酸乙二酯、聚乙二醇丁二酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚己内酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚硅氧烷衍生物及三醋酸纤维素的组中的至少一种。

[B6]根据[B1]至[B5]中任一项所述的血管壁模型，其中，

所述多孔膜的各表面被选自包括纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、基底膜蛋白聚糖、巢蛋白、蛋白聚糖、骨桥蛋白、生腱蛋白、肾连蛋白、基底膜基质、重组肽及聚赖氨酸的组中的至少一种包覆。

[B7]根据[B1]至[B6]中任一项所述的血管壁模型，其中，

所述多孔膜的贯穿孔开口的平均直径为1μm～20μm，且所述多孔膜的开口率为30％～70％。

[C1]一种血管壁模型装置，其包括：

第一液体隔室，储存液体组合物；第二液体隔室，储存液体组合物；及[B1]至[B7]中任一项所述的血管壁模型，配置于所述第一液体隔室与所述第二液体隔室之间作为所述第一液体隔室与所述第二液体隔室之间的隔层。

[C2]一种利用[C1]所述的血管壁模型装置来评价被检物质的方法，其包括：

将被检物质添加至所述第一液体隔室或所述第二液体隔室中的至少一个工序；及

(i)对包含在所述第一液体隔室的化学物质或包含在所述第一液体隔室的细胞中的至少一种进行定量的工序，或(ii)对包含在所述第二液体隔室的化学物质或包含在所述第二液体隔室的细胞中的至少一种进行定量的工序中的至少一个工序。

[C3]根据[C2]所述的评价被检物质的方法，其中，

工序(i)包括对包含在所述第一液体隔室的miRNA、包含在所述第一液体隔室的蛋白质或包含在所述第一液体隔室的转录因子中的至少一种进行定量，工序(ii)包括对包含在所述第二液体隔室的miRNA、包含在所述第二液体隔室的蛋白质或包含在所述第二液体隔室的转录因子中的至少一种进行定量。

[C4]根据[C2]所述的评价被检物质的方法，其中，

所述第一液体隔室或所述第二液体隔室中的一个液体隔室是储存血液、包含红细胞的液体组合物或模仿血液并包含选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种的液体组合物的液体隔室，向所述第一液体隔室或所述第二液体隔室中的至少一个中添加被检物质的工序包括将被检物质添加至储存血液、包含红细胞的液体组合物或模仿血液并包含选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种的液体组合物的液体隔室的工序，并且测量从已添加所述被检物质的所述液体隔室泄漏至所述另一液体隔室的红细胞的量，从已添加所述被检物质的所述液体隔室泄漏至所述另一液体隔室的血红蛋白的量或从已添加所述被检物质的所述液体隔室泄漏至所述另一液体隔室的选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种的量中的至少一个的工序构成工序(i)或(ii)。

[D1]一种制作在多孔膜的两面具有细胞层的细胞层叠体的方法，所述方法使用具有底部及从底部边缘竖立的侧壁部的容器、所述多孔膜及构成为保持多孔膜以使所述多孔膜与所述容器的内底面相向且保持在不与内底面接触的位置的保持部件，所述方法包括：

在与容器内底面及多孔膜的表面接触的液体培养基中，在将多孔膜通过保持部件保持在不与容器内底面接触的位置使得与内底面相向，并且沿重力方向，容器的底部位于上侧而多孔膜位于下侧的状态下培养第一细胞的工序；及

在将多孔膜通过保持部件保持在不与容器内底面接触的位置使得与内底面相向，并且沿重力方向，容器的底部位于上侧而多孔膜位于下侧的状态下，在多孔膜的下表面培养所述第一细胞，在多孔膜的上表面培养所述第二细胞的工序。

发明效果

根据本发明，提供一种新型活组织模型装置、新型血管壁模型、新型血管壁模型装置及其应用。

附图说明

图1是表示活组织模型装置的一例的概略剖视图。

图2是表示活组织模型装置中的细胞层叠体的一例的概略局部剖视图。

图3A是表示具有蜂窝结构的多孔膜的一例的立体图。

图3B是表示从上方观察的图3A所示的多孔膜的俯视图。

图3C是表示在图3B中沿线c-c截取的多孔膜的剖视图。

图4A是表示保持部件的一例的立体图。

图4B是表示图4A所示的保持部件配置于培养容器中的状态的立体图。

图5是表示制作细胞层叠体的方法的一例的示意图。

图6是表示制作细胞层叠体的方法的一例的示意图。

图7是实施例1中使用的多孔膜的显微照片。

图8是实施例1中形成于多孔膜的任一表面的细胞层的免疫荧光图像。

图9是表示FITC-葡聚糖70的相对荧光强度的图表。

图10是表示FITC-葡聚糖70的相对荧光强度的图表。

图11是实施例2中形成于多孔膜的任一表面的细胞层的免疫荧光图像。

图12是实施例2中细胞层叠体的免疫荧光图像。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。以下提供的记载及实施例对例示性实施方式进行说明，并不限制本发明的范围。在本发明中记载的作用机制包括推测，无论该推测准确与否，并不限制本发明的范围。

本发明中，使用“～”表示的各数值范围表示包括将记载于“～”前后的数值分别作为下限值及上限值的范围。

存在两种以上的分别与组合物中的特定成分对应的物质时，除非另有说明，记载于本发明的组合物中的特定成分量表示存在于组合物中的两种以上的物质的合计量。

＜活组织模型装置及血管壁模型装置＞

根据本发明的活组织模型装置包括：

第一液体隔室，储存液体组合物；

第二液体隔室，储存液体组合物；及

细胞层叠体，配置于所述第一液体隔室与所述第二液体隔室之间作为所述第一液体隔室与所述第二液体隔室之间的隔层，

根据本发明的活组织模型装置中的细胞层叠体包括：

具有蜂窝结构的多孔膜；

包含第一种细胞且配置于具有蜂窝结构的多孔膜的一表面的细胞层；及

包含与第一种细胞不同的第二种细胞且配置于具有蜂窝结构的多孔膜的另一表面的细胞层。

以下，将具有蜂窝结构的多孔膜还称为“蜂窝膜”。

在根据本发明的活组织模型装置中，将细胞层叠体配置成一细胞层与第一液体隔室相向，另一细胞层与第二液体隔室相向。

在根据本发明的活组织模型装置中，储存在第一液体隔室的液体组合物与储存在第二液体隔室的液体组合物可以具有相同的组合物或相互不同的组合物。这些液体组合物优选分别具有以将细胞在细胞层叠体中的细胞层维持为活体状态的方式组成的组合物。液体组合物的例子包括磷酸盐缓冲生理盐水、生理盐水、哺乳动物细胞用基础培养基及血液。

作为根据本发明的活组织模型装置的一例的活组织模型装置500示于图1。图1是活组织模型装置500的概略剖视图。图1中，各部件的尺寸为概念性尺寸，部件尺寸之间的相对关系并不受其限制。活组织模型装置500包括第一液体隔室410、第二液体隔室420及细胞层叠体300。各第一液体隔室410及第二液体隔室420储存液体组合物。储存在第一液体隔室410的液体组合物和储存在第二液体隔室420的液体组合物可以具有相同的组合物或相互不同的组合物。细胞层叠体300是第一液体隔室410与第二液体隔室420之间的隔层部分。

图1所示的活组织模型装置500的结构的例子是将细胞培养***物配置于培养容器中的结构。该结构的活组织模型装置包括具有底部及从底部边缘竖立的侧壁部的容器、配置于容器中的细胞培养***物、以及包含细胞层叠体的细胞培养***物。该结构由培养容器及根据以下记载的制作方法，使用培养容器和细胞培养***物成为一体的培养装置(例如，以下记载的图4B所示结构)来制作细胞层叠体后获得的细胞培养***物构成。以下，将该结构称为“细胞培养***物式装置”。作为一例，参考图4B说明细胞培养***物式装置的结构时，通过保持部件40的中空圆柱部42和蜂窝膜20来定义的空间与图1所示的第一液体隔室410对应，通过培养容器60的底部62、培养容器60的侧壁部64、保持部件40的中空圆柱部42及蜂窝膜20来定义的空间与图1所示的第二液体隔室420对应。

根据本发明的活组织模型装置的一例为血管壁模型装置。根据本发明的血管壁模型装置包括：

第一液体隔室，储存液体组合物；

第二液体隔室，储存液体组合物；及

血管壁模型，配置于所述第一液体隔室与所述第二液体隔室之间作为所述第一液体隔室与所述第二液体隔室之间的隔层，

根据本发明的血管壁模型装置中的血管壁模型包括蜂窝膜、配置于蜂窝膜的一表面的血管内皮细胞层及配置于蜂窝膜的另一表面的平滑肌细胞层或间充质干细胞层。在根据本发明的血管壁模型装置中，将血管壁模型中的血管内皮细胞层及平滑肌细胞层或间充质干细胞层配置成各血管内皮细胞层及平滑肌细胞层/间充质干细胞层分别与其相应的液体隔室相向。

在根据本发明的血管壁模型装置中，储存在第一液体隔室的液体组合物与储存在第二液体隔室的液体组合物可以具有相同的组合物或相互不同的组合物。液体组合物优选具有以将血管内皮细胞及平滑肌细胞/间充质干细胞维持为活体状态的方式组成的组合物。液体组合物的例子包括磷酸盐缓冲生理盐水、生理盐水、哺乳动物细胞用基础培养基、血液、包含红细胞的液体组合物及模仿血液并包含选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种的液体组合物。本发明中，血液范围例如包括用生理盐水稀释的血液；通过对血液添加葡萄糖和抗凝剂等添加剂而获得的可储存的血液；及其一部分等血液试样。

根据本发明的活组织模型装置的结构的一例是细胞层叠体300为图1所示的活组织模型装置500的血管壁模型的结构。根据本发明的活组织模型装置的结构的一例包括上述细胞培养***物式装置。

以下，对根据本发明的活组织模型装置中的细胞层叠体及根据本发明的血管壁模型装置的血管壁模型进行说明。

[细胞层叠体及血管壁模型]

根据本发明的活组织模型装置中的细胞层叠体包括蜂窝膜、包含第一种细胞且配置于蜂窝膜的一表面的细胞层、包含与所述第一种细胞不同的第二种细胞且配置于所述蜂窝膜的另一表面的细胞层。配置于蜂窝膜的各表面的细胞层数可以为1层、2层以上。

作为根据本发明的活组织模型装置中的细胞层叠体的一例的细胞层叠体300示于图2。图2是细胞层叠体300的概略局部剖视图。图2中，各部件的尺寸为概念性尺寸，部件尺寸之间的相对关系并不受其限制。

所述细胞层叠体300包括蜂窝膜200、包含第一种细胞的细胞层110及包含第二种细胞的细胞层120。包含第一种细胞的细胞层110配置于蜂窝膜200的一主表面，包含第二种细胞的细胞层120配置于蜂窝膜200的另一主表面。

[蜂窝膜]

根据本发明的细胞层叠体中的蜂窝膜在细胞层叠体的制作中用作细胞粘附并增殖的支架。更具体而言，细胞在蜂窝膜两面上增殖而在两面形成细胞层，从而提供根据本发明的细胞层叠体。

本发明的蜂窝结构表示由隔壁隔断而形成多个贯穿孔的结构。在根据本发明的细胞层叠体中的蜂窝膜，蜂窝结构的贯穿孔在蜂窝膜的主表面形成开口。根据本发明的细胞层叠体中的蜂窝膜可以是具有多个蜂窝结构以层状层叠的结构的膜。

在根据本发明的细胞层叠体中的蜂窝膜中，并不限制蜂窝结构的贯穿孔的形状。贯穿孔的形状例如是球体的一部分缺少的截球形、筒形、圆柱形或多边柱形，并且多种形状的贯穿孔可以同时存在。贯穿孔的开口形状例如是圆形、椭圆形或多边形，并且多种形状的开口可以同时存在。蜂窝结构中，相邻的贯穿孔彼此可以部分连通。

在蜂窝膜中，从提高配置于蜂窝膜的细胞层的均匀性的观点考虑，优选规则地排列贯穿孔。规则排列可以包括间断或交替。然而，规则排列优选包括在所有方向上无间断地连续重复。

以下，参考附图对蜂窝膜的例子进行说明。在各附图中，对于相同或等同的要件或部分标注相同的参考符号。在以下说明中，较长直径表示轮廓线上的任意两点之间的最长距离、或在指定方向时表示指定方向上的任意两点之间的最长距离。

作为蜂窝膜的一例的蜂窝膜20，示于图3A～3C。图3A是蜂窝膜20的立体图，图3B是从上方观察图3A所示的蜂窝膜20的俯视图，图3C是表示在图3B中沿线c-c截取的多孔膜的剖视图。

贯穿孔22配置在蜂窝膜20的主表面上所有区域。然而，在蜂窝膜20上存在无法与细胞接触的区域时，无需在该区域设置贯穿孔22。在蜂窝膜20，相邻的贯穿孔22通过隔壁24而相互分离。

在贯穿孔22的排列中，以对边平行的六边形(优选为正六边形)或类似形状作为一个单位，开口中心位于该形状的顶点及对角线的交叉点。开口中心表示主表面的平面上的开口的二维形状的重力中心。

贯穿孔22的形状例如是球体的一部分缺少的截球形、筒形、圆柱形或多边柱形。贯穿孔22开口形状例如是圆形、椭圆形或多边形。在蜂窝结构中，相邻的贯穿孔22可以通过蜂窝膜20内部的连通孔彼此连通。

以下，对蜂窝膜20的尺寸进行说明。

贯穿孔22的间距P1是相邻开口的中心之间的距离。间距P1优选根据配置于蜂窝膜20的细胞层中包含的细胞的尺寸来调整。间距P1例如为1μm～50μm。

开口直径Da是贯穿孔22的开口的较长直径。开口直径Da优选为使细胞层中包含的细胞保持在蜂窝膜20上的尺寸。开口直径Da例如是细胞层中包含的细胞的较长直径(例如是10μm～50μm)的10％～150％。血管壁模型构建成用于实施红细胞渗漏测试时，开口直径Da优选为使红细胞通过的尺寸。从一表面上的细胞与另一表面上的细胞之间的细胞间接触的观点考虑，开口直径Da优选不要过小。另一方面，从使细胞层中包含的细胞保持在蜂窝膜20的观点考虑，开口直径Da优选不要过大。从这些观点考虑，开口直径Da优选为1μm～20μm，更优选为2μm～10μm，进一步优选为3μm～5μm。同样地，开口直径Da的平均值优选为1μm～20μm，更优选为2μm～10μm，进一步优选为3μm～5μm。

开口直径Da的变异系数优选为20％以下，更优选更小的变异系数。开口直径Da的更小的变异系数提供配置于蜂窝膜20的细胞层的更高均匀性。变异系数是通过将集合的标准偏差除以集合的算术平均值而得的值，且变异系数是集合内的变动程度的指数。本发明中，变异系数以％表示。

隔壁24的宽度W是作为相邻的开口之间的最短距离而测量的隔壁24的宽度。宽度W优选为使细胞层中包含的细胞保持在蜂窝膜20上的宽度。

从物质渗透性和蜂窝膜的强度的观点考虑，蜂窝膜20的开口率优选为30％～70％，更优选为35％～65％，进一步优选为40％～60％。蜂窝膜20的开口率是在俯视图中开口的总面积相对于主表面面积(包括开口的面积)之比。分别计算一表面上和另一表面上的开口率。

从使一表面上的细胞与另一表面上的细胞之间的细胞间接触的观点考虑，蜂窝膜20的厚度优选不要过厚。从蜂窝膜20的强度的观点考虑，蜂窝膜20的厚度优选不要过薄。从这些观点考虑，蜂窝膜20的厚度优选为0.5μm～40μm，更优选为1μm～20μm，进一步优选为2μm～8μm。

用于制作蜂窝膜的方法并不受限制。用于制作蜂窝膜的方法的例子包括：在日本专利第4,734,157、4,945,281、5,405,374及5,422,230号、以及日本专利申请公开(JP-A)第2011-74140号中公开的通过使水滴在包含聚合物和溶剂的涂膜中生长而形成贯穿孔的制作方法；及通过在由树脂形成的膜上进行蚀刻处理或冲孔处理来形成贯穿孔而形成蜂窝膜的制作方法。

蜂窝膜的材料的例子包括以下聚合物，例如聚丁二烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯(例如，聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二酯、聚乙二醇丁二酸酯、聚丁二酸丁二醇酯及聚-3-羟基丁酸酯)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺(polyacrylamine)、聚甲基丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚六氟丙烯、聚乙烯醚、聚乙烯咔唑、聚乙酸乙烯酯、聚四氟乙烯、聚内酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨酯、聚脲、多环芳烃(polyaromatics)、聚砜、聚醚砜、聚硅氧烷衍生物及纤维素酰化物(例如，三乙基纤维素、酸丙酸纤维素及乙酸丁酸纤维素)、聚(甘油癸二酸酯)及聚丙烯酰胺(polyacrylamine)。从例如使用在日本专利第4,734,157中公开的制作方法来制作蜂窝膜的观点考虑，优选为溶解于疏水性有机溶剂的聚合物。例如从溶剂中的溶解性、光学特性、电特性、膜强度及弹性的观点考虑，这些聚合物可根据需要具有均聚物、共聚物、共混聚合物或聚合物合金的形式。这些聚合物可以单独使用，也可以组合两种以上来使用。

作为蜂窝膜的材料，从自我支撑特性的观点考虑，优选为聚丁二烯、聚氨酯、聚碳酸酯或聚乳酸，从细胞层的移植维护的观点考虑，优选为聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物或聚乳酸-聚己内酯共聚物。

从细胞粘附特性的观点考虑，蜂窝膜的各表面优选被选自包括纤连蛋白、胶原蛋白(例如，I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白或V型胶原蛋白)，层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、基底膜蛋白聚糖、巢蛋白、蛋白聚糖、骨桥蛋白、生腱蛋白、肾连蛋白、基底膜基质、重组肽及聚赖氨酸的组中的至少一种包覆，且至少包覆配置有细胞层的区域。关于基底膜基质，可使用市售品(例如MATRIGEL(注册商标)、GELTREX(注册商标))。关于重组肽，可使用市售品(例如，CELLNEST(注册商标))。在蜂窝膜中，孔内侧也优选被这些材料中的至少一种包覆。

[第一种细胞及第二种细胞]

在根据本发明的活组织模型装置中的细胞层叠体中，第一种细胞与第二种细胞是不同种类的细胞。第一种细胞及第二种细胞这两种细胞例如是选自包括实质细胞(例如，肝实质细胞或胰腺实质细胞)、基质细胞(例如，周细胞)，肌细胞(例如，平滑肌细胞、心肌细胞或骨骼肌细胞)、成纤维细胞、神经细胞、胶质细胞、内皮细胞(例如，血管内皮细胞或淋巴内皮细胞)、上皮细胞(例如，肺泡上皮细胞、口腔上皮细胞、胆管上皮细胞、肠上皮细胞、胰管上皮细胞、肾脏上皮细胞、肾小管上皮细胞或胎盘上皮细胞)及干细胞(例如，间充质干细胞)的组中的两种细胞。

在根据本发明的细胞层叠体中，可以在一个细胞层中包含多种细胞。在根据本发明的细胞层叠体中，可以在一个细胞层或两个细胞层中包含除了第一种细胞和第二种细胞以外的一种以上的细胞(称为第三种细胞)。例如，第一种细胞为实质细胞，第二种细胞为基质细胞，而第三种细胞为神经细胞，该神经细胞可以包含在一个或两个细胞层中。

即使包含第一种细胞的一个细胞层中也包含与在另一个细胞层中包含的细胞相同的第二种细胞，该结构仍属于本发明，只要一个细胞层中包含的细胞与在另一细胞层中包含的细胞例如能够根据两种细胞之间的含量比来区分。例如，本发明包括如下构成：在一个细胞层中包含的细胞为实质细胞和基质细胞(含量比为9:1)，在另一个细胞层中包含的细胞为实质细胞和基质细胞(含量比为1:9)。

根据本发明的细胞层叠体是仿生物体内组织的组织模型，并包括在根据本发明的活组织模型装置中。因此，根据所要模仿的生物体内组织，选择第一种细胞及第二种细胞，需要时选择第三种细胞。在动物组织中，基底膜通常存在于一细胞层与另一细胞层之间。在根据本发明的细胞层叠体(用作组织模型)，蜂窝膜相当于基底膜。

作为模仿生物体内组织的组织模型的一例是血管壁模型。根据本发明的血管壁模型包括蜂窝膜、配置于蜂窝膜的一表面的血管内皮细胞层及配置于蜂窝膜的另一表面的平滑肌细胞层或间充质干细胞层。

血管壁模型优选防止化学物质在血管内皮细胞层中的细胞之间自由通过，换言之，优选具有屏障功能。血管壁模型的屏障功能能够利用荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖70(FITC-葡聚糖70)渗透性作为指数来表示。根据本发明的血管壁模型优选构成为从血管内皮细胞层侧至平滑肌细胞层侧或间充质干细胞层侧的FITC-葡聚糖70渗透性为蜂窝膜自身的FITC-葡聚糖70渗透性的0％～10％，更优选为蜂窝膜自身的FITC-葡聚糖70渗透性的0％～5％，进一步优选为蜂窝膜自身的FITC-葡聚糖70渗透性的0％～2％。在具有这种结构的血管壁模型中，血管内皮细胞中的细胞间粘附大概已发展到接近生物体内的血管壁的程度。为了使用血管壁模型准确地评价药物，血管壁模型优选具有与生物体内的血管壁相似的结构和功能。因此，具有上述结构的血管壁模型能够用作评价药物的优异的方法。

以下，对用于在血管壁模型中分析FITC-葡聚糖70渗透性的方法进行说明。

模仿生物体内组织的组织模型的另一例是病状再现模型。在该模型中，具有基因突变的细胞或来自患者的细胞用作第一种细胞或第二种细胞中的至少一种。

包括上述细胞层叠体的活组织模型装置可用作药物评价或病状评价用装置，或者可代替动物试验的测试装置。接着，将利用活组织模型装置的评价被检物质的方法作为根据本发明的活组织模型装置的应用而进行说明。

＜评价被检物质的方法＞

根据本发明的活组织模型装置可用作评价被检物质对细胞组织产生的影响的手段。具体而言，利用根据本发明的活组织模型装置，通过如下工序评价被检物质对细胞组织产生的影响：

将被检物质添加至所述第一液体隔室或所述第二液体隔室中的至少一个的工序；及

(i)对包含在所述第一液体隔室的化学物质或包含在所述第一液体隔室的细胞中的至少一种进行定量的工序，或(ii)对包含在所述第二液体隔室的化学物质或包含在所述第二液体隔室的细胞中的至少一种进行定量的工序中的至少一个工序。

例如，根据以下模式(a)及(b)来评价被检物质。

(a)对从细胞层叠体的细胞分泌的化学物质进行定量的模式

位于与已添加被检物质的液体隔室相向的一侧的细胞层中的细胞响应于被检物质而分泌化学物质(包括细胞破损导致的细胞内成分的泄漏)。其结果，已添加被检物质的液体隔室会包含由细胞分泌的物质。而且，在和与已添加被检物质的液体隔室相向的细胞层相反一侧的细胞层的细胞会因在一表面的细胞层与另一表面的细胞层之间的细胞间相互作用(即，由溶解因子导致的信号传导)或在一表面的细胞层与另一表面的细胞层之间的细胞间接触中的任一种而分泌化学物质。对由包含在已添加被检物质的液体隔室中的细胞分泌的物质或包含在另一液体隔室的细胞分泌的物质中的至少一种进行定量，所获得的量用于判定被检物质是否对细胞组织产生影响及影响程度。由细胞分泌的物质的例子包括小分子核糖核酸(miRNA)、蛋白质及转录因子。

(b)对从细胞层叠体的一侧泄漏至细胞层叠体的另一侧的化学物质或细胞进行定量的模式

位于与已添加被检物质的液体隔室相向的一侧的细胞层中的细胞响应于被检物质(包括细胞损伤)而改变它们的形态，并且会在细胞层中产生裂缝。其结果，储存在已添加被检物质的液体隔室的液体组合物中包含的化学物质或细胞会泄漏至另一液体隔室。对已泄漏至另一液体隔室的化学物质或细胞进行定量，所获得的量用于判定被检物质是否对细胞组织产生影响及影响程度。

模式(b)的一例是使用示踪剂的模式。具体而言，将被检物质添加至一液体隔室之后，将示踪剂添加至已添加被检物质的液体隔室，并对泄漏至另一液体隔室的示踪剂量进行定量。在该模式，将被检物质添加至一液体隔室之后进行培养，例如在37℃进行30分钟～24小时，并添加示踪剂。在该模式，示踪剂的例子包括荧光标记化学物质，包含放射性同位素的化学物质及着色剂化合物。根据示踪剂的种类，通过测量荧光强度、放射线或色度而对示踪剂进行定量。根据泄漏至另一液体隔室的示踪剂的量判定被检物质是否对细胞组织产生影响及影响程度。

在该模式(a)及(b)，根据本发明的活组织模型装置在以下方面优于常规活组织模型装置。

常规活组织模型装置包括在TE膜的两面具有细胞层的细胞层叠体。通常，TE膜的开口率为约2％～约20％。在TE膜的两面具有细胞层的细胞层叠体中，在一表面的细胞层与在另一表面的细胞层之间的细胞间相互作用相对不活跃。因此，在位于和与已添加被检物质的液体隔室相向的一侧的细胞层相反一侧的细胞层有可能不示出所需反应，并且也有可能不分泌所需化学物质。另外，在TE膜的两面具有细胞层的细胞层叠体中，即使细胞层中的细胞的形态发生变化而在细胞层中产生裂缝，由细胞层封闭的TE膜上的孔被穿透的可能性还是很低。即使细胞层的屏障功能因被检物质而消失，TE膜的屏障功能本身还是会起作用，并且可以防止示踪剂的泄漏。因此，常规活组织模型装置可能无法准确地评估被检物质对细胞组织产生的影响。尤其，当由被检物质引发的影响弱或被检物质的浓度低时，难以评价被检物质对细胞组织产生的影响。

根据本发明的活组织模型装置包括在蜂窝膜的两面包含细胞层的细胞层叠体。该蜂窝膜具有高开口率。在蜂窝膜的两面包含细胞层的细胞层叠体中，在一表面的细胞层与在另一表面的细胞层之间的细胞间相互作用相对活跃。推测活跃的细胞间相互作用会促使在位于和与已添加被检物质的液体隔室相向的一侧的细胞层相反一侧的细胞层示出所需反应，且分泌所需化学物质。而且，在蜂窝膜的两面包含细胞层的细胞层叠体中，当细胞层中的细胞的形态发生变化而在细胞层中产生裂缝，由细胞层封闭的蜂窝膜上的孔被穿透的可能性很高。因此，一旦细胞层的屏障功能因被检物质而消失，发生示踪剂泄漏的可能性很高。因此，利用根据本发明的活组织模型装置，能够以高灵敏度评价被检物质对细胞组织产生的影响。

根据本发明的血管壁模型装置可用作评价被检物质对血管壁产生的影响的手段。具体而言，利用根据本发明的血管壁模型装置，通过如下工序评价被检物质对血管壁产生的影响：

将被检物质添加至所述第一液体隔室或所述第二液体隔室中的至少一个；及

(i)对包含在所述第一液体隔室的化学物质或包含在所述第一液体隔室的细胞中的至少一种进行定量的工序，或(ii)对包含在所述第二液体隔室的化学物质或包含在所述第二液体隔室的细胞中的至少一种进行定量的工序中的至少一个工序。例如根据以下模式(a-1)或(b-1)来进行被检物质的评价。

(a-1)对由血管壁模型中的细胞分泌的化学物质进行定量的模式

该模式以与上述模式(a)相同的方式进行。

(b-1)对从血管壁模型装置的一侧泄漏至血管壁模型装置的另一侧的化学物质或细胞进行定量的模式

该模式以与上述模式(b)相同的方式进行。一例是使用示踪剂的上述模式。还考虑到以下模式。

在作为模式(b-1)的一例的血管壁模型装置中，使用血液、包含红细胞的液体组合物或包含选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种且模仿血液的液体组合物储存在第一液体隔室或第二液体隔室中的至少一个。在该模式，S对液体隔室中储存血液、包含红细胞的液体组合物或包含选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种且模仿血液的液体组合物添加被检物质，并对泄漏至另一液体隔室的红细胞的量、泄漏至另一液体隔室的血红蛋白的量或泄漏至另一液体隔室的选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种的量中的至少一种进行定量。

在上述模式的一例中，使用将血液、包含红细胞的液体组合物或包含选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种且模仿血液的液体组合物储存在位于与血管内皮细胞层相向的一侧的液体隔室的血管壁模型，将被检物质添加至位于与血管内皮细胞层相向的一侧的液体隔室，并对泄漏至位于与平滑肌细胞层或间充质干细胞层相向的一侧的液体隔室的红细胞的量、泄漏至位于与平滑肌细胞层或间充质干细胞层相向的一侧的液体隔室的血红蛋白的量或泄漏至位于与平滑肌细胞层或间充质干细胞层相向的一侧的液体隔室的选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种的量进行定量。更具体而言，根据以下方式进行被检物质的评价。

在血管壁中，血管内皮细胞的成熟的细胞间粘附限制化学物质通过血管壁。当被检物质对血管内皮细胞具有影响时，该血管内皮细胞对被检物质做出反应(包括血管内皮细胞破损)，并且化学物质对血管壁的渗透性得到提高。其结果，位于与血管内皮细胞层相向的一侧的液体隔室中的液体组合物中包含的红细胞或选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种泄漏至位于与平滑肌细胞层或间充质干细胞层相向的一侧的液体隔室。当被检物质也具有溶血毒性时，血红蛋白从红细胞流出，且血红蛋白泄漏至位于与平滑肌细胞层或间充质干细胞层相向的一侧的液体隔室。测量泄漏至位于与平滑肌细胞层或间充质干细胞层相向的一侧的液体隔室的红细胞的量、泄漏至位于与平滑肌细胞层或间充质干细胞层相向的一侧的液体隔室的血红蛋白的量或泄漏至位于与平滑肌细胞层或间充质干细胞层相向的一侧的液体隔室的选自包括葡聚糖、伊文思蓝、荧光素钠盐及FITC-微球的组中的至少一种的量中的至少一种，并根据所获得的量来判定被检物质是否对血管壁及红细胞产生影响及影响程度。

根据本发明的血管壁模型装置可用作评价血管壁模型的屏障功能的手段。例如，利用过滤部为血管壁模型的细胞培养***物式装置，通过以下述方式分析FITC-葡聚糖70渗透性，例如由此评价血管壁模型的屏障功能

准备了过滤部分为血管壁模型(即，血管内皮细胞层配置于蜂窝膜的一表面且平滑肌细胞层或间充质干细胞层配置于蜂窝膜的另一表面的细胞层叠体)，并且血管内皮细胞层与细胞培养***物的内侧相向的细胞培养***物式装置。将FITC-葡聚糖70添加至细胞培养***物的内侧并在37℃培养，并测量10分钟内泄漏至细胞培养***物的外侧的FITC-葡聚糖70的量(即，测量在细胞培养***物外侧的FITC的荧光强度)。另外，利用过滤部分为蜂窝膜本身的细胞培养***物式装置，按照与上述相同的工序，测量泄漏至细胞培养***物的外侧的FITC-葡聚糖70的量(即，测量在细胞培养***物外侧的FITC的荧光强度)。计算在前一次测量中获得的荧光强度相对于在后一次测量中获得的荧光强度的比率，以％表示，即相对荧光强度(RFI)。较小的RFI值被视为表示更高的血管壁模型的屏障功能。RFI优选为0％～10％，更优选为0％～5％，进一步优选为0％～2％。

＜细胞层叠体及活组织模型装置的制作方法＞

根据本发明的活组织模型装置例如通过以下方法制作：包括作为隔层在活组织模型装置中安装细胞层叠体的工序及通过在蜂窝膜的各表面培养不同种类的细胞来获得细胞层叠体的工序的方法；或包括在活组织模型装置中将隔层部分构建成蜂窝膜的工序及在蜂窝膜的各表面培养不同种类的细胞来形成细胞层叠体的工序的方法。用于通过在蜂窝膜的各表面培养不同种类的细胞来获得细胞层叠体的方法可以是下述细胞层叠体的制作方法。细胞层叠体的制作方法的下述模式也是根据本发明的血管壁模型的制作方法。细胞层叠体的制作方法的下述模式也是根据本发明的活组织模型装置的一例的细胞培养***物式装置的制作方法。

根据本发明的制作方法中，使用具有底部及从底部边缘竖立的侧壁部的容器、蜂窝膜及构成为保持蜂窝膜以使蜂窝膜与容器的内底面相向且保持在不与内底面接触的位置的保持部件。以下，将容器称为“培养容器”。

根据本发明的制作方法包括利用培养容器、蜂窝膜及保持部件而在蜂窝膜的两面培养细胞，由此制作在蜂窝膜的两面具有细胞层的细胞层叠体。

首先，对用于根据本发明的制作方法的培养容器、蜂窝膜及保持部件进行说明。培养容器、蜂窝膜及保持部件的下述例子相当于细胞培养***物式装置中的优选例子。

培养容器例如是盘、多盘及多孔盘。培养容器底部的形状例如为圆形、矩形、正放形。培养容器的材料例如为聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯或玻璃。培养容器优选具有高透明度。

培养容器的内底面优选为平坦。培养容器的内底面优选具有使细胞不粘附在内底面的特性。因此，培养容器的内底面优选未进行电晕放电处理或蛋白涂层处理。为了降低细胞粘附，培养容器的内底面例如可以用磷酸胆碱基或聚乙二醇的聚合物包覆。与内底面同样地，培养容器的内侧面也优选具有使细胞不粘附在内侧面的特性。

用于根据本发明的制作方法的蜂窝膜与细胞层叠体中包含的蜂窝膜的含义相同，并且其优选例也相同。在根据本发明的制作方法中，蜂窝膜是细胞粘附并增殖的支架。

在根据本发明的制作方法中，蜂窝膜是细胞粘附并增殖的支架。蜂窝膜的较高的开口率及蜂窝膜的较薄的厚度分别提供一表面的细胞与另一表面的细包之间的更活跃的细胞间相互作用(即通过溶解因子的信号传导)或一表面的细胞与另一表面的细包之间的更活跃的细胞间接触中的至少一种。通过细胞培养期间的更活跃的细胞间相互作用，能够制作具有更接近生物体内组织的功能的细胞层叠体。通过根据本发明的制作方法，例如能够制作血管内皮细胞的细胞间粘附已发展至与生物体内的血管壁接近的状态的血管壁模型。

保持部件是构成为保持蜂窝膜以使蜂窝膜与容器的内底面相向且保持在不与内底面接触的位置的部件。

作为保持部件的材料，从高透明度、液体培养基中的化学稳定性和轻重量考虑，例如优选为聚碳酸酯、聚苯乙烯及聚酯。

保持部件的形状并不受限制。保持部件例如包括，构成为保持蜂窝膜的部分和构成为与培养容器接触的部分。保持部件例如是具有与培养容器的侧壁部分的边缘衔接的突出部线状部件、棒状部件或中空筒状部件。

关于保持部件的形态，保持部件例如是包括以下的部件：

构成为在中空筒状部的一轴向端部保持多孔膜的中空筒状部(筒状部具有比培养容器的内径小的外径，中空筒状部的轴向长度比培养容器的侧壁部分的高度短)；及

从中空筒状部的另一轴向端部向径向外侧突出的突出部(突出部构成为与培养容器的侧壁部分的边缘衔接)。以下，参考附图对这些形态进行说明。

在图4A中，以与蜂窝膜20(蜂窝膜的一例)组合的状态示出作为保持部件的一例的保持部件40。图4A保持部件40的立体图。图4B是表示将与蜂窝膜20组合的保持部件40安装在培养容器60(培养容器的一例)内的状态的立体图。

保持部件40包括中空筒状部42及突出部44。蜂窝膜20配置于中空筒状部42的一轴向端部。蜂窝膜20具有至少封闭位于中空筒状部42的一端部的开口的尺寸。蜂窝膜20通过热压接合、超声波焊接、激光焊接、粘合剂或双面胶带而粘附在中空筒状部42的一端部。或者，蜂窝膜20可以通过贴合在中空筒状部42的外侧面的环状固定部件而固定在中空筒状部42的一端部。

中空圆柱部42具有比培养容器60的内径小的外径，且能够***到培养容器60的内部(即由底部62及侧壁部64定义的空间)。中空筒状部42的轴向长度比培养容器60的侧壁部分64的高度短。因此，蜂窝膜20不与培养容器60的底部62接触。

中空筒状部42具有沿周向及轴向上连续的壁。该结构能够使液体储存在由蜂窝膜20和中空筒状部42定义的空间。然而，可以在中空筒状部42的壁中，接近突出部44的位置具有狭缝。中空筒状部42的内面的形状例如是圆柱形、多边柱形、圆锥台形或棱锥台形。

突出部44在与具备蜂窝膜20的端部相对的中空筒状部42的轴向端部，沿中空筒状部42的径向向外突出。例如，三个突出部44沿中空筒状部42的周向，以约120°的间隔设置。然而，突出部44的数量及形状并不限于此。突出部44可以具有沿中空筒状部42的轴向连续的环状。

突出部44具有当保持部件40***到培养容器60的内部时可以使突出部44与培养容器60的侧壁部分64的边缘衔接的突出长度。保持部件40通过突出部44固定在培养容器60的侧壁部分64的边缘。

通常，具有图4A所示形状的培养装置被称为细胞培养***物。

以下，对根据本发明的制作方法进行说明。本发明中，“工序”的范围包括独立工序、及虽无法与其他工序明确区分但仍然能够实现所需目的的目标工序。

根据本发明的制作方法中，使用了培养容器、蜂窝膜及保持部件，制作工序包括以下工序(A)及(B)。图5是表示根据本发明的制作方法的一例的概略图，是用于说明工序(A)及(B)的概略图。在图5中，箭头G表示重力方向。

工序(A)：在与培养容器6的内底面及蜂窝膜2的表面接触的液体培养基中，在将蜂窝膜2通过保持部件4保持在不与培养容器6的内底面接触的位置使得与内底面相向，并且沿重力G方向，培养容器6的底部位于上侧而蜂窝膜2位于下侧的状态下，培养第一细胞11。

工序(B)：在将蜂窝膜2通过保持部件4保持在不与培养容器6的内底面接触的位置使得与内底面相向，并且沿重力G方向，培养容器6的底部位于下侧而蜂窝膜2位于下侧的状态下，在蜂窝膜2的上表面培养第一细胞12，在蜂窝膜2的下表面培养第二细胞11。

本发明中的“培养”并不一定涉及细胞增殖，并且不管存在增值与否，将细胞维持在活体状态包括在该术语的范围中。

在工序(A)中采用的状态下，沿重力G方向，蜂窝膜2位于下侧，而培养容器6的底部位于上侧。在工序(A)中，将包含第一细胞11的细胞悬浮液配置于培养容器6与蜂窝膜2之间而使细胞悬浮液与培养容器6的内底面及蜂窝膜2的表面接触，并且第一细胞11在该状态下培养。由于表面张力在培养容器6的内底面与细胞悬浮液中包含的液体培养基之间发挥作用，液体培养基残留在蜂窝膜2，通过蜂窝膜2的孔的液体培养基的滴落变少。因此，具有高开口率的蜂窝膜能够用于制作细胞层叠体。蜂窝膜2优选通过保持部件4，在接近培养容器6的内底面的位置，在蜂窝膜2与培养容器6的内底面相向且取向成与培养容器6的内底面平行或基本平行的状态下保持。蜂窝膜2与培养容器6的内底面之间的距离例如是0.5mm～10mm。

在工序(A)中，液体培养基中的第一细胞11由于自身重量会沿重力G方向迁移，并粘附到蜂窝膜2。工序(A)是将第一细胞11粘附-培养在蜂窝膜2的工序。

工序(A)中的细胞培养条件可以是常规的细胞培养条件。例如，可以利用温度37℃及5％(v/v)的CO₂浓度的培养箱(例如，Panasonic Corporation制CO₂培养箱)培养。培养期间优选为直到第一细胞11与蜂窝膜2的粘附变得稳定的期间。

在工序(B)中采用的状态下，沿重力G方向，蜂窝膜2位于上侧，而培养容器6的底部位于下侧。在工序(B)，第一细胞11在蜂窝膜2的下表面培养，第二细胞12的蜂窝膜2的上表面培养。将在蜂窝膜2的下表面培养的第一细胞11是在位于与培养容器6的内底面相向的一侧的蜂窝膜2的表面培养的第一细胞11，并且该细胞将会在工序(B)中继续培养。

工序(B)中的细胞培养条件可以是常规的细胞培养条件。例如，可以利用温度37℃及5％(v/v)的CO₂浓度的培养箱培养。培养期间优选为直到细胞在蜂窝膜2的两面达到聚满(confluence)的期间。例如能够通过光学显微镜观察而检测细胞达到聚满。在培养期间，培养基可以换成其他培养基。

参考图6对包括工序(A)及(B)的制作方法的一例进行说明。图6所示的例示性方法是利用具有图4B所示形状的培养装置的制作方法。图6的标题(1)至(5)分别对应于工序(1)至(5)。在图6中，箭头G表示重力方向。根据包括工序(1)至(5)的例示性方法，可易于实现包括工序(A)及(B)的制作方法。包括工序(1)至(5)的例示性方法是制作细胞层叠体的方法，同时是制作作为活组织模型装置的一例的细胞培养***物式装置的方法。

工序(1)：将包含第一细胞11的细胞悬浮液提供到培养容器6的内底面。

在工序(1)，优选将细胞悬浮液提供到内底面而使不与培养容器6的内侧面接触。这是因为，在工序(3)需要防止细胞悬浮液沿培养容器6的内侧壁落下。防止细胞悬浮液沿培养容器6的内侧壁落下的另一方法，例如是将蜂窝膜2在其主表面上的尺寸设定成在整个圆周上与培养容器6的内侧面接触的尺寸。

在工序(1)，提供到培养容器6的内底面的细胞悬浮液的量优选为与夹在培养容器6的内底面与蜂窝膜2之间的空间的体积相等的量。根据蜂窝膜2的面积，第一细胞11的接种密度例如是1.0×10³～1.0×10⁶细胞/cm²。

工序(2)：将具备蜂窝膜2的保持部件4配置在培养容器6，并使蜂窝膜2与提供到培养容器6的内底面的细胞悬浮液接触。

执行工序(2)的结果，包含第一细胞11的细胞悬浮液与培养容器6的内底面及蜂窝膜2的表面接触(换言之，细胞悬浮液夹在培养容器6的内底面与蜂窝膜2的表面)。在以下制作方法的说明中，将具备蜂窝膜2的保持部件4及培养容器6成为一体的装置称为“培养装置”。

工序(3)：在沿重力G方向，培养容器6的底部位于上侧，蜂窝膜2位于下侧的状态下，在培养容器6的内底面与蜂窝膜2之间培养第一细胞11。

以具备蜂窝膜2的保持部件4贴合在培养容器6的状态将培养装置倒置，之后使培养装置静置在培养箱中，由此实现了工序(3)。细胞悬浮液中包含的第一细胞11会因自身重量而沿重力G方向迁移并粘附到蜂窝膜2。

工序(4)：在沿重力G方向，培养容器6的底部位于下侧，蜂窝膜2位于上侧的状态下，在蜂窝膜2的上表面培养第二细胞12。

将培养装置从培养箱取出并再次将培养装置倒置，之后将包含第二细胞12的细胞悬浮液接种到蜂窝膜2，由此实现工序(4)。第二细胞12的接种密度例如是1.0×10³～1.0×10⁶细胞/cm²。优选在接种第二细胞12之前或之后，将液体培养基添加到第一细胞11侧。

工序(5)：在沿重力G方向，培养容器6的底部位于下侧，蜂窝膜2位于上侧的状态下，在蜂窝膜2的下表面培养第一细胞11，在蜂窝膜2的上表面培养第二细胞12。

接着工序(4)，将培养装置静置于培养箱，由此实现工序(5)。在工序(5)期间，可以将培养基换成其他培养基。当第一细胞11或第二细胞12中的至少一个为干细胞时，将诱导分化成所需体细胞的分化诱导因子添加至培养基。

通过工序(1)至(5)，获得包含蜂窝膜2的细胞层叠体、包含第一细胞11且配置于蜂窝膜2的一表面的细胞层及包含第二细胞12且配置于蜂窝膜2的另一表面的细胞层。

以下，对用于根据本发明的制作方法的细胞进行说明。

在根据本发明的制作方法中，第一细胞与第二细胞是不同种类的细胞，并基于根据本发明的细胞层叠体所要模仿的活组织来选择不同细胞的组合。第一细胞及第二细胞这两种细胞例如是选自包括实质细胞(例如，肝实质细胞或胰腺实质细胞)、基质细胞(例如，周细胞)、肌细胞(例如，平滑肌细胞、心肌细胞或骨骼肌细胞)、成纤维细胞、神经细胞、胶质细胞、内皮细胞(例如，血管内皮细胞或淋巴内皮细胞)及上皮细胞(例如，肺泡上皮细胞、口腔上皮细胞、胆管上皮细胞、肠上皮细胞、胰管上皮细胞、肾脏上皮细胞、肾小管上皮细胞或胎盘上皮细胞)以及能够分化成这些细胞(例如，祖细胞、间充质干细胞或多能干细胞)的细胞的组中的两种细胞。

可用作第一细胞或第二细胞的多能干细胞的例子包括胚胎干(ES)细胞、诱导性多能干细胞(iPS)细胞、胚胎生殖(EG)细胞、胚胎癌(EC)细胞、多能成体祖(MAP)细胞、成体多能干(APS)细胞及多系分化压力耐受(Muse)细胞。在根据本发明的制作方法的工序(B)中，将诱导分化成所需体细胞的分化诱导因子添加至培养基，由此将多能干细胞分化成体细胞。

在根据本发明的制作方法中，与第一细胞及第二细胞不同的细胞(还称为“第三细胞”，其可以是一种或多种)可以与第一细胞或第二细胞中的至少一种共培养。共培养的结果，包含第三细胞及第一或第二细胞的细胞层形成于蜂窝膜的一面或两面。在例示性组合中，第一细胞为实质细胞，第二细胞为基质细胞，第三细胞为神经细胞。

在根据本发明的制作方法中，根据所要模仿的生物体内组织，可以选择第一细胞及第二细胞的组合，需要时选择第三种细胞，由此获得模仿生物体内组织的组织模型。在根据本发明的制作方法的一例中，第一细胞为平滑肌细胞或分化成平滑肌细胞的细胞，第二细胞为血管内皮细胞或分化成血管内皮细胞的细胞。在根据本发明的制作方法的另一例中，第一细胞为间充质干细胞，第二细胞为血管内皮细胞或分化成血管内皮细胞的细胞。根据本发明的制作方法提供一种血管内皮细胞层配置于蜂窝膜的一表面，平滑肌细胞层或间充质干细胞层配置于蜂窝膜的另一表面的细胞层叠体，即提供血管壁模型。

以再现病状为目的，将具有基因突变的细胞或来自患者的细胞用作第一细胞或第二细胞中的至少一种。

根据目标细胞的种类，选择用于细胞悬浮液的制备或细胞培养中的液体培养基。特定培养基的例子包括通过将细胞生长因子添加至哺乳动物细胞用基础培养基而使其最适于细胞种类的培养基，例如为达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's modifiedEagle's medium)(DMEM)、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基：营养混合物F-12(DMEM：F-12)、伊格尔氏基本成分培养基(Eagle's minimal essential medium)(EMEM)、基本成分培养基α(MEMα)或伊格尔氏基础培养基(BME)。这些培养基有市售。根据欲共培养的细胞的种类，液体培养基可以是通过混合两种以上的培养基来获得的培养基。液体培养基的pH例如是7.0～8.0。液体培养基优选具有使细胞因自身重量而沿重力方向迁移的比重及粘度。

实施例

以下，参考实施例，对本发明的实施方式进行说明。然而，本发明的实施方式并不限于这些实施例。

在以下说明中，关于物质浓度使用的“M”表示摩尔浓度，1M相当于1mol/L。

用缩写表示的在以下实施例中使用的化学物质等的标识如下。

EGM：内皮细胞生长培养基

FITC：荧光素异硫氰酸酯

HBSS：Hanks'平衡盐溶液

HCM：蜂窝膜

HUASMC：人脐动脉平滑肌细胞

HUVEC：人脐静脉内皮细胞

PBS：磷酸盐缓冲盐水

TEM：径迹蚀刻膜

实施例1

[材料]

·24孔盘：悬浮培养品质(#662-102，Greiner)

·TEM***物：24孔悬挂***物，径迹蚀刻膜(具有5.7μm孔径，10.6μm厚度，12.4％开口率，聚对苯二甲酸乙二酯，图7)(#MCMP24H48，Millipore)

·HCM***物：24孔悬挂***物，蜂窝膜(具有5.0μm孔径，2.2μm厚度，55％开口率，聚丁二烯，图7)

·蛋白涂层：纤连蛋白(#33016-015，Invitrogen)

[细胞]

·血管内皮细胞：HUVEC(#C2517AS，Lonza)

·平滑肌细胞：HUASMC(#C-12500，PromoCell)

[细胞培养基及剥离试剂]

·HUVEC用EGM-2(#CC-3162，Lonza)

·HUASMC用平滑肌细胞生长培养基2套(#C-22162，PromoCell)

·Accutase(AT104-500，Innovative cell technologies)

[HCM的灭菌]

(1)将70％(v/v)乙醇以500μl/孔的量添加到24孔盘的孔，并将PBS以500μl/孔的量添加到24孔盘的孔中。另外，准备了添加有70％(v/v)的杯子。

(2)将HCM***物浸渍在杯中的乙醇，之后将HCM***物放入包含乙醇的孔以使其HCM浸入乙醇，并静置HCM***物5分钟。

(3)将HCM***物从乙醇取出，并利用抽吸器从各HCM***物的内侧移除了乙醇。立即将HCM***物转移至包含PBS的孔以使HCM浸入PBS中。对其添加了1ml的PBS。

(4)将HCM***物从PBS取出，并利用抽吸器从各HCM***物的内侧移除了PBS。立即将HCM***物转移至包含PBS的孔以使HCM浸入PBS中。对其添加了1ml的PBS。

(5)将浸入PBS的HCM***物放入真空干燥器中，由此对HCM进行脱气。

(6)在显微镜下观察HCM***物已确认HCM***物无破损、附着物及HCM褶皱。

[HCM的纤连蛋白涂层]

(1)将纤连蛋白溶解于PBS来制备30μg/ml纤连蛋白溶液。

(2)70μl纤连蛋白溶液点在24孔盘的孔中心部分。

(3)将HCM***物从PBS取出，利用抽吸器将PBS从各HCM***物的内侧移除，并且立即将HCM***物置于孔中纤连蛋白溶液点上来将其HCM浸入纤连蛋白溶液。

(4)将100μl纤连蛋白溶液添加至各HCM***物的内侧，在室温下静置1小时(或在4℃下静置一夜)。

[利用HCM***物的细胞培养]

(1)将HUASMC的细胞悬浮液80μl，以圆顶状置于24孔盘的孔的中心部分。

(2)将涂层HCM***物分别置于HUASMC的细胞悬浮液，由此将细胞悬浮液夹在孔的底面与HCM之间。

(3)在细胞悬浮液夹在孔的底面与HCM之间的状态下，将培养盘和HCM***物倒置。将处于倒置状态的培养盘和HCM***物添加至培养箱(37℃，5％(v/v)CO₂)并进行了16小时的培养。

(4)将1200μl平滑肌细胞生长培养基2套添加到各HCM***物的外侧。将培养盘和HCM***物从培养箱取出，并将培养盘和HCM***物的取向恢复至初始取向，并将HCM***物转移至包含培养基的孔。之后，将HUVEC的细胞悬浮液300μl接种到各HCM***物的内侧。

(5)将培养盘和HCM***物添加至培养箱(37℃，5％(v/v)CO₂)，并培养了80小时。

各种细胞的接种条件如下。

HUASMC：培养面积为0.785cm²，接种密度为1.0×10⁴细胞/cm²，细胞悬浮液的体积为80μl。

HUVEC：培养面积为0.32cm²，接种密度为5.0×10⁴细胞/cm²，细胞悬浮液的体积为300μl。

上述培养的结果，获得了在过滤器的上表面提供血管内皮细胞层，在过滤器的下表面提供平滑肌细胞层的HCM***物(也称为“VEC/SMC-HCM***物”)。图8示出对CD31进行免疫荧光染色的上表面的细胞层、对免疫荧光α-平滑肌肌动蛋白进行免疫荧光染色的下表面的细胞层。

以与上述工序相同的方式，制备了在过滤器的上表面提供血管内皮细胞层且在过滤器的下表面无细胞层的HCM***物(也称为“VEC-HCM***物”)、及在过滤器的下表面提供平滑肌细胞层且在过滤器的上表面无细胞层的HCM***物(也称为“SMC-HCM***物”)。

[利用TEM***物的细胞培养]

在将TEM***物倒置的状态下，将HUASMC接种在其过滤器上，并将TEM***物添加至培养箱(37℃，5％(v/v)CO₂)，进行了16小时的培养。接着，将TEM***物添加至24孔盘的孔，将HUVEC接种在各TEM***物的内侧，并将1200μl平滑肌细胞生长培养基2套添加至TEM***物的外侧。接着，将TEM***物添加至培养箱(37℃，5％(v/v)CO₂)并进行了80小时的培养。

对TEM***物接种细胞的条件与对HCM***物接种细胞的条件相同。

上述培养的结果，获得了在过滤器的上表面提供血管内皮细胞层，在过滤器的下表面提供平滑肌细胞层的TEM***物(也称为“VEC/SMC-TEM***物”)。

以与上述工序相同的方式，制备了在过滤器的上表面提供血管内皮细胞层且在过滤器的下表面无细胞层的TEM***物(也称为“VEC-TEM***物”)、及在过滤器的下表面提供平滑肌细胞层且在过滤器的上表面无细胞层的TEM***物(也称为“SMC-TEM***物”)。

[渗透性分析]

(1)将2mg的FITC-葡聚糖70(70kDa，Sigma)溶解于8ml的HBSS(+)(084-08965，Wako)，由此制备了250μg/ml的FITC-葡聚糖70溶液。将FITC-葡聚糖70溶液在遮光条件下储存。

(2)将900μl/孔的HBSS(+)添加到24孔盘的第一至第三列的各孔中。

(3)从培养基取出具有细胞层叠体的***物，并利用抽吸器将培养基从各***物的内侧移除。将***物添加至第一列的孔中。

(4)将200μl的FITC-葡聚糖70溶液添加到添加至第一孔中各***物的内侧，并在37℃培养了10分钟。

(5)将***物转移至第二列孔中，并在37℃培养了10分钟。

(6)将***物转移至第三列孔中，并通过用铝片盖住培养盘来遮光。

(7)利用吸液管混合第一至第二列孔中的各样品液，从各孔中提取100μl的样品液并转移至96孔黑色培养盘。96孔黑色培养盘通过用铝片盖住而遮光。

(8)利用酶标仪(ENSPIRE，PerkinElmer)，以485nm的激发光波长(Ex)、530nm的发射波长(Em)及60次闪光测量了各样品液中FITC的荧光强度。

在第一列孔中样品液的FITC的相对荧光强度(即在添加FITC-葡聚糖70溶液后在10分钟内泄漏的FITC-葡聚糖70的相对量)示于图9。图9的曲线表示相对荧光强度，其中将在过滤器任一面均不具有细胞层的***物中的荧光强度作为标准。

TEM***物的情况下，VEC-TEM***物示出了3.0±0.5％(n＝5)的相对强度，SMC-TEM***物示出了8.2±2.9％(n＝5)的相对强度，VEC/SMC-TEM***物示出了0.4±0.2％(n＝5)的相对强度。即使平滑肌细胞层通常不具有非常紧致的细胞间粘合，SMC-TEM***物的相对荧光强度还是以上所述的值。因此，该结构可能表明TEM本身对TEM***物中的FITC-葡聚糖70具有屏障功能。

HCM***物的情况下，VEC-HCM***物示出了19.3±10.2％(n＝5)的相对强度，SMC-HCM***物示出了67.4±6.1％(n＝5)的相对强度，VEC/SMC-HCM***物示出了0.4±0.3％(n＝5)的相对强度。对FITC-葡聚糖70的屏障功能通过在HCM的一表面形成血管内皮细胞层，并在HCM的另一表面形成平滑肌细胞层来获得。

[利用组胺的渗透性分析]

(1)将2mg的FITC-葡聚糖70(70kDa，Sigma)溶解于8ml的HBSS(+)(084-08965，Wako)，由此制备了250μg/ml的FITC-葡聚糖70溶液。将FITC-葡聚糖70溶液在遮光条件下储存。将组胺溶解于HBSS(+)来制备了组胺溶液。

(2)将900μl/孔的HBSS(+)添加到了24孔盘的第一至第三列的各孔中。

(3)从培养基取出具有细胞层叠体的***物，并利用抽吸器将培养基从各***物的内侧移除。将***物添加至第一列的孔中。

(4)将组胺溶液以最终浓度10μM或100μM添加到孔中，并培养了120分钟。

(5)将200μl的FITC-葡聚糖70溶液添加到放入第一孔中的各***物的内侧，接着在37℃培养了10分钟。

(6)将***物转移至第二列孔中，并在37℃培养了10分钟。

(7)将***物转移至第三列孔中，并通过用铝片盖住培养盘来遮光。

(8)利用吸液管混合第一至第二列孔中的各样品液，从各孔中提取100μl的样品液并转移至96孔黑色培养盘。96孔黑色培养盘通过用铝片盖住而遮光。

(9)利用酶标仪(ENSPIRE，PerkinElmer)，以485nm的激发光波长(Ex)及530nm发射波长(Em)测量了各样品液中FITC的荧光强度。

在第一列孔中样品液的FITC的相对荧光强度(即在添加FITC-葡聚糖70溶液后在10分钟内泄漏的FITC-葡聚糖70的相对量)示于图10。图10的曲线表示相对荧光强度，其中将在过滤器任一面均不具有细胞层的***物中的荧光强度作为标准。

组胺具有强化血管内皮细胞的物质渗透性的活性。VEC/SMC-HCM***物显示了取决于组胺浓度的FITC-葡聚糖70渗透性的提高。而且，该结果证实VEC/SMC-HCM***物具有近似生物体内血管壁的功能。而且，该结果证实，通过利用VEC/SMC-HCM***物，能够以高灵敏度评价被检物质对血管壁的影响。

实施例2

[材料]

·24孔盘：悬浮培养品质(#662-102，Greiner)

·HCM***物：将具有蜂窝结构的多孔膜提供到过滤部分的24孔悬挂***物，多孔膜具有3.0μm的孔径，1.2μm的厚度，55％的开口率，且悬挂***物由聚碳酸酯制造。

·HCM涂层材料：源自大鼠尾巴的自胶原蛋白I(#354236，Corning)

[细胞]

·血管内皮细胞：大鼠血管内皮细胞(#cAP-r0001，Angioproteomie)

·平滑肌细胞：大鼠平滑肌细胞(#R-ASM-580，Lonza)

[液体培养基及细胞剥离试剂]

·大鼠血管内皮细胞用大鼠内皮细胞生长培养基(#cAP-03，cAP-04，Angioproteomie)

·DEMEM：大鼠平滑肌细胞用F-12(1:1)培养基(#BE04-687Q，Lonza)

·Accutase(AT104-500，Innovative cell technologies)

[HCM的灭菌]

以与实施例1中相同的方式进行了HCM的灭菌。

[HCM的胶原蛋白涂层]

(1)将胶原蛋白I溶解于0.2N的乙酸溶液来制备了50μg/ml的胶原蛋白I溶液。

(2)将70μl的胶原蛋白I溶液点在24孔盘的孔的中心部分。

(3)将HCM***物从PBS取出，利用抽吸器将PBS从各HCM***物的内侧移除，并且立即将HCM***物置于孔中胶原蛋白I溶液点上来将其HCM浸入胶原蛋白I溶液。

(4)将100μl胶原蛋白I溶液添加至各HCM***物的内侧，在室温下静置4小时(或在4℃下静置一夜)。

(5)添加500μl的PBS来中和HCM。

[利用HCM***物(细胞层叠体的制作)的细胞培养]

(1)将大鼠平滑肌细胞的细胞悬浮液80μl，以圆顶状置于24孔盘的孔的中心部分。

(2)将涂层HCM***物分别置于大鼠平滑肌细胞的细胞悬浮液，由此将细胞悬浮液夹在孔的底面与HCM之间。

(3)在细胞悬浮液夹在孔的底面与HCM之间的状态下，将培养盘和HCM***物倒置。将处于倒置状态的培养盘和HCM***物添加至培养箱(37℃，5％(v/v)CO₂)并培养了16小时。

(4)将1200μl的大鼠内皮细胞生长培养基添加到各HCM***物的外侧。将培养盘和HCM***物从培养箱取出，并将培养盘和HCM***物的取向恢复至初始取向，并将HCM***物转移至包含培养基的孔。之后，将大鼠血管内皮细胞的细胞悬浮液300μl接种到各HCM***物的内侧。

(5)将培养盘和HCM***物添加至培养箱(37℃，5％(v/v)CO₂)，并培养了80小时。

各种细胞的接种条件如下。

大鼠平滑肌细胞：培养面积为0.785cm²，接种密度为1.0×10⁴细胞/cm²，细胞悬浮液的体积为80μl。

大鼠血管内皮细胞：培养面积为0.32cm²，接种密度为5.0×10⁴细胞/cm²，细胞悬浮液的体积为300μl。

上述培养的结果，获得了在过滤器的上侧提供血管内皮细胞层，在过滤器的下侧提供平滑肌细胞层的HCM***物(也称为“VEC/SMC-HCM***物”)。图11示出对VE-钙粘蛋白进行免疫荧光染色的上表面的细胞层、对钙调理蛋白进行免疫荧光染色的下表面的细胞层。

如图11所示，清楚地观察到了聚满细胞层的形成及血管内皮钙粘蛋白的局部化。血管内皮钙粘蛋白的局部化表示血管内皮细胞之间的强烈粘附(细胞间结合的形成)，并表现出实际血管的特征。因此，通过在HCM的一侧形成血管内皮细胞层，在HCM的另一侧形成平滑肌细胞层来制备具有类似活组织结构的细胞层叠体。

[对生理活性物质的反应的评价]

(1)将0.1mg(100unit)的凝血酶(#T7009-100UN，Sigma)溶解于100μl的生理盐水来制备1000U/mL浓度的凝血酶溶液。用HBSS(+)稀释凝血酶溶液来制备了25U/mL凝血酶溶液及100U/mL凝血酶溶液。

(2)将900μL的HBSS(+)添加到24孔盘的各孔中。

(3)将提供有细胞层叠体的***物从培养基去除，并利用抽吸器将培养基从各***物的内侧移除，并将该***物添加至孔中。

(4)将HBSS(+)(对照用)、25U/mL的凝血酶溶液或100U/mL的凝血酶溶液，以200μL的量添加到添加至孔中的各***物的内侧，该***物在37℃培养了30分钟。

(5)在显微镜下观察了细胞层叠体。将细胞层叠体的显微照片示于图12，其为源自VE-钙粘蛋白的红色荧光与源自α-平滑肌肌动蛋白的绿色荧光的重叠图像。

如图12所示，观察到因由凝血酶的添加引起的肌动蛋白应力纤维的活跃而产生的细胞收缩。观察到细胞收缩发生在图12的上部以箭头表示的方向上。更高的凝血浓度引发更强的细胞收缩。确认到这是因为，在HCM的一侧具有血管内皮细胞层且在HCM的另一侧具有平滑肌细胞层的细胞层叠体以与在活组织中示出的方式类似的方式，与生理活性物质进行反应。

2017年6月9日提出的美国专利第15/618,150号公开内容全文通过参考编入于本说明书中。

本说明书中所记载的所有的文献、专利申请及技术标准，通过参考而援用于此的每个文献、专利申请及技术标准与具体且个别记载时相同程度地通过参考编入于本说明书中。