具体实施方式

本发明提供了日本血吸虫可溶性虫卵抗原在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

本发明对日本血吸虫可溶性虫卵抗原的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的日本血吸虫可溶性虫卵抗原的来源即可，例如商业购买或申请人制备均可。在本发明实施例中，所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原，优选采用方法制备得到：将日本血吸虫虫卵加入0.9％氯化钠溶液研磨20～30min，研磨液4℃，10000g离心10min取上清液，重复离心三次，用0.22μm孔径滤膜过滤杂菌，得到日本血吸虫提取物。所述日本血吸虫优选包括日本血吸虫尾蚴。

在本发明中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎。在本发明实施例中，以葡聚糖硫酸钠造模小鼠，通过H.E染色，小鼠结肠组织出现淋巴细胞聚集、腺体萎缩、杯状细胞消失，表明溃疡性结肠炎模型小鼠构建成功。

在本发明中，治疗溃疡性结肠炎优选包括缓解结肠缩短、降低疾病活动指数、减轻炎症症状以及抑制炎症反应。所述疾病活动指数包括体重、大便性状、血便三方面。减轻炎症症状优选包括减轻淋巴细胞聚集和腺体萎缩情况，减少杯状细胞消失数量等。所述抑制炎症反应优选包括抑制促炎因子表达和促进抗炎因子的上调。所述促炎因子优选包括IFN-γ和IL-2。所述抗炎因子优选包括TGF-β和IL-10。

在本发明中，所述药物包括日本血吸虫可溶性虫卵抗原外，还优选包括药学上可接受的辅料。本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物剂型即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物制备方法即可。

本发明提供了一种检测炎症性肠病预后的生物标志物，包括螺杆菌(Helicobacter sp.)、普雷沃式菌(Prevotellaceae sp.)和lachnoclostridium sp.。所述螺杆菌、普雷沃式菌和乳酸杆菌为DSS组(模型组)和SEA50μg+DSS组(治疗组)中与肠炎相关的丰度差异显著的三种菌群，因此，通过检测患者用药前后三种菌的丰度，根据三种菌的丰度变化判断炎症性肠病的治疗效果。所述三种菌的检测方法优选包括采用16S rRNA通用引物扩增给药前后患者粪便中细菌，测序结果经过生物信息学分析，得到菌群数据后，比较给药前后三种菌丰度变化判断炎症性肠病的治疗效果。所述三种菌的丰度变化的判断方法优选如下：与患者用药前相比，用药后的螺杆菌、lachnoclostridium丰度显著下调，而普雷沃式菌丰度显著上调。因此，本发明提供了所述生物标志物在制备治疗炎症肠道疾病的日本血吸虫可溶性虫卵抗原药效评估试剂盒中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的SEA在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用以及检测炎症性肠病疗效的生物标志物进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

肠道炎症小鼠模型的构建以及给药处理方法(见图1)

1.小鼠分组及给药：

将40只小鼠(体重26.22±1.12g)随机分为4组，分别是control组(10只)、SEA50μg组(10只)、DSS组(10只)、DSS+SEA50μg组(10只)。

实验第0天给予DSS组、SEA50μg+DSS组用3％DSS(每100ml饮用水中加入3g DSS)代替正常饮水。并在小鼠DSS造模第0d时，SEA50μg组、SEA50μg+DSS组每只小鼠给予腹腔注射SEA50μg，而control组小鼠正常饮食。

造模方法以及验证造模成功的标准参见现有技术：[1]BAUER C,DUEWELL P,MAYERC,et al.Colitis induced in mice with dextran sulfate sodium(DSS)is mediatedby the NLRP3 inflammasome[J].Gut,2010,59(9):1192-1199.

[2]EICHELE D D,KHARBANDA K K.Dextran sodium sulfate colitis murinemodel:An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatorybowel diseases pathogenesis[J].World J Gastroenterol,2017,23(33):6016-6029.

其中，SEA的制备方法，将日本血吸虫(江苏株)由江苏省血吸虫病防治研究所保种尾蚴由钉螺生物学实验室感染并于动物实验前逸出，采用1500条日本血吸虫尾蚴，通过腹壁贴片法，实验室感染新西兰兔42天后剖杀，取肝脏并收集虫卵。收集的虫卵放入研磨器添加5倍质量的生理盐水研磨20min，将研磨液4℃，10000g离心10min取上清液，重复三次，用0.22μm孔径滤膜过滤杂菌，得到日本血吸虫提取物(SEA)。用BCA法检测浓度。本发明提供的日本血吸虫提取物的浓度为1mg/ml。

2.指标检测

2.1各处理组小鼠的体重测量和DAI评分

在实验0d、3d、5d、7d、10d分别测定上述4组小鼠的体重、观察大便性状以及血便情况，按照DAI评分规则统计DAI评分结果。其中，DAI评分规则如下：疾病活动指数结合患者(患病动物)的体重下降百分率(体重不变为0，1％～3％为1分，3％～6％为2分，6％～9％为3分，大于9％为4分)、大便黏稠度(正常为0，松散的大便为2分，腹泻为4分)和大便出血(正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分)三种情况进行综合评分，将3项结果的相加即得到DAI值。

2.2各处理组小鼠结肠长度的测量

实验第10d，分别取上述4组小鼠，处死后解剖结肠，测量结肠长度。

2.3各处理组小鼠组织学评分

实验第10d，分别取上述4组小鼠，处死后解剖结肠，采用H.E染色法对结肠组织进行染色，观察结肠组织形态，并拍照。每组随机抽取三张组织切片，被张切片用盲法选择三个视野进行评估并记录。按照结肠切片组织学评分方法对不同处理组小鼠结肠形态特征进行评分。所述切片组织学评分方法如下：1)细胞浸润：评分0，固有层偶尔有炎性细胞(LP)；1、主要在隐窝底部的淋巴细胞浸润增加；2、炎性浸润延伸至粘膜的汇合；3、透壁浸润延伸。2)组织损伤:评分0，无粘膜损伤；1、大面积部分(高达50％)丢失隐窝；2、大面积隐窝部分或全部损失50～100％，上皮完整；3、大面积隐窝完全丧失，上皮丧失。结果计算总和(参考文献：FLOUDAS A,AVIELLO G,SCHWARTZ C,et al.Schistosoma mansoni Worm InfectionRegulates the Intestinal Microbiota and Susceptibility to Colitis[J].InfectImmun,2019,87(8).)。

2.4各处理组小鼠血液炎症因子表达情况

采用血清ELISA检测试剂盒(Elabscience试剂盒)分别检测上述4组小鼠的血清中IFN-γ、IL-2因子以及TGF-β、IL-10因子的表达量。

3.检测结果

3.1小鼠结肠长度结果

四组结肠结果显示，DSS组结肠较control组与SEA50μg组明显缩短，而SEA50μg+DSS组可缓解DSS组结肠缩短现象(见图1)。

3.2小鼠体重以及DAI评分结果

DAI评分结果，即疾病活动指数，从体重降低；大便性状；血便三方面进行的综合评分，分数越高，则疾病程度越严重。结果见图2。DSS组、SEA50μg+DSS组DAI评分随时间呈上升趋势，而SEA50μg+DSS组上升趋势较DSS组减缓，且有统计学差异。与DSS造模组相比，SEA50μg给予降低了DAI评分。

3.3小鼠结肠H.E染色结果

结肠H.E染色(见图3)显示：与control组、SEA50μg组相比，DSS组的结肠组织形态出现淋巴细胞聚集，腺体萎缩，杯状细胞消失，这表明DSS组造模成功。而SEA50μg+DSS组症状减轻。结肠切片组织学评分结果见图4。这表明SEA50μg+DSS组减轻DSS引起的溃疡型结肠炎症状，从而起到保护作用。

3.4小鼠炎症因子的表达

对各组小鼠免疫因子及细胞进行检测，血清ELISA显示，SEA50μg+DSS组与DSS组相比，促炎的IFN-γ、IL-2因子下调，抗炎的TGF-β、IL-10因子上调(见图5)。

实施例2

分别以实施例1中实验第10d的小鼠的粪便为材料，采用16s rRNA通用引物对肠道菌群进行扩增并测序，探讨SEA、溃疡性结肠炎以及肠道菌群三者之间的关系。

将测序数据进行生物信息分析，具体方法如下：

原始数据为FASTQ格式。使用Trimmomatic^[1]软件对原始双端序列进行去杂。去杂参数为：检测并截去模糊碱基N；并采用滑窗法检查平均碱基质量，当质量低于20时，截取前面高质序列。去杂后的双端序列利用FLASH^[2]软件进行。拼接参数为：最小的overlap为10bp、最大的Overlap为200bp、最大错配率为20％。

为保证结果的准确性，可进行精准去杂，去除含有模糊碱基(ambiguous)、单碱基高重复区(homologous)的序列以及长度过短的序列。精准去杂的参数为：去掉含有N碱基的序列，保留碱基质量分数Q20达到至少75％的序列。同时，利用UCHIME检测并去除序列中的嵌合体序列。

测序数据进行预处理生成优质序列之后，采用Vsearch^[3]软件，根据序列的相似性，将序列归为多个OTU。参数为序列相似度大于或等于97％被归为一个OTU单元。

使用QIIME^[4]软件包挑选出各个OTU的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。16S使用Silva(version132)数据库比对，物种比对注释使用RDP classifier^[5]软件，保留置信区间大于0.7的注释结果。物种比对注释使用BLAST^[6]软件。

参考文献：

[1]Bolger Anthony M,Lohse Marc,Usadel Bjoern.Trimmomatic:a flexibletrimmer for Illumina sequence data.[J].Bioinformatics,2014,30:2114-20.

[2]Reyon Deepak,Tsai Shengdar Q,Khayter Cyd et al.FLASH assembly ofTALENs for high-throughput genome editing.[J].Nat.Biotechnol.,2012,30:460-5.

[3]Caporaso J Gregory,Kuczynski Justin,Stombaugh Jesse et al.QIIMEallows analysis of high-throughput community sequencing data.[J].Nat.Methods,2010,7:335-6.

[4]RognesFlouriNichols Ben et al.VSEARCH:a versatileopen source tool for metagenomics.[J].Peer J,2016,4:e2584.

[5]Wang Qiong,Garrity George M,Tiedje James M et al.Naive Bayesianclassifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterialtaxonomy.[J].Appl.Environ.Microbiol.,2007,73:5261-7.

[6]Lobo.Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)[J].J Mol.Biol.,2008,215(3):403-410.

将4组样品的测序结果进行肠道菌群非度量多维标度分析。并将DSS组和SEA50μg+DSS组中所得肠道菌群根据丰度排序，将丰度最高的前15种肠道菌群采用t检验进行差异分析。p值＜0.05为差异有统计学意义，(^*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。

结果见图6，其中三角形代表DSS组，圆形代表治疗组C50组，即SEA50μg+DSS组。由图7可知，两组各个样本较集中，组与组间无交叠，表示两组间代表性良好，具有可比性。

图7为DSS组和SEA50μg+DSS组丰度排名前15种肠道菌群排布热图，颜色越红表示丰度越高，越绿则丰度越低。从图7中可看出，两组组间存在差异，其中标黄的三种菌群(螺杆菌，普雷沃式菌，乳酸杆菌)，在两组间就出现了明显的丰度差异。

根据差异菌株结果进行Wilcoxon分析。结果见图8。排名前10的差异菌群，其中有三种菌群与肠炎方面相关,分别为螺杆菌、lachnoclostridium及普雷沃式菌。有研究报道，螺杆菌、lachnoclostridium与消化道癌症相关，普雷沃式菌作为近几年新发现的一种菌群，它的缺乏会导致肠源性内毒素水平的升高,导致肠道黏膜屏障受损。肠球菌,为机会致病菌,在临床上往往与感染相关。析显示，与DSS组相比，SEA50μg+DSS组出现了螺杆菌/lachnoclostridium/肠球菌的丰度显著下调，而普雷沃式菌的丰度显著上调。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。