阅读说明：本技术 一种抗氧化广谱抑菌剂的制备方法 (Preparation method of antioxidant broad-spectrum bacteriostatic agent ) 是由 许威 郑树青 李志帆 罗登林 葛佩佩 金伟平 孙玉青 徐路阳 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种抗氧化广谱抑菌剂及其制备方法,该抑菌剂为利用抗坏血酸/过氧化氢作为反应体系偶联溶菌酶和茶多酚得到的溶菌酶-茶多酚共聚物。制备方法包括1：取溶菌酶溶于超纯水中,在氮气保护下,加入过氧化氢与抗坏血酸,水浴锅中搅拌,得混合溶液A；2：向混合液A中加入茶多酚溶液,搅拌得混合溶液B,然后将混合溶液B搅拌；3：将步骤2所得溶液进行透析,得溶菌酶-茶多酚复合体系；4：将步骤3所得溶菌酶-茶多酚复合体系置于冷冻干燥器中进行冷冻干燥,得到溶菌酶-茶多酚共聚物,即为抗氧化广谱抑菌剂。本发明方法采用抗坏血酸作为还原剂,过氧化氢作为氧化剂,制备过程中无需添加有毒有害的试剂,制备过程简单、温和、绿色。(The invention provides an antioxidant broad-spectrum bacteriostatic agent and a preparation method thereof, wherein the bacteriostatic agent is lysozyme-tea polyphenol copolymer obtained by coupling lysozyme and tea polyphenol by using ascorbic acid/hydrogen peroxide as a reaction system. The preparation method comprises the following steps of 1: dissolving lysozyme in ultrapure water, adding hydrogen peroxide and ascorbic acid under the protection of nitrogen, and stirring in a water bath kettle to obtain a mixed solution A; 2: adding a tea polyphenol solution into the mixed solution A, stirring to obtain a mixed solution B, and then stirring the mixed solution B; 3: dialyzing the solution obtained in the step 2 to obtain a lysozyme-tea polyphenol composite system; 4: and (3) placing the lysozyme-tea polyphenol composite system obtained in the step (3) into a freeze dryer for freeze drying to obtain a lysozyme-tea polyphenol copolymer, namely the antioxidant broad-spectrum bacteriostatic agent. The method adopts the ascorbic acid as a reducing agent and the hydrogen peroxide as an oxidizing agent, does not need to add toxic and harmful reagents in the preparation process, and has simple, mild and green preparation process.)

一种抗氧化广谱抑菌剂的制备方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种抗氧化广谱抑菌剂及其制备方法。

背景技术

溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶有较强的抗热性。不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复，可被冷冻或干燥处理，且活力稳定。1992年FAO/WTO的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，是一种安全的天然防腐剂。茶多酚，是绿茶茶多酚的主要组成成分，是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用。

抗坏血酸和过氧化氢体系是一种不含金属元素的氧化还原引发体系，正在引起人们的普遍重视，这种引发剂在聚合物合成中具有十分重要的意义。

目前抗氧化剂和抑菌剂在食品的应用是分别发挥其功能的，如溶菌酶常用于食品的保鲜和防腐工作，但缺乏抗氧化特性(王者,关荣发,刘振峰,等，食品科学,2018,39(11):227-232；Xu,Jin,Zhang,et al.,Food Research International,2014,59:61-66.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备过程简单、安全可食的抗氧化广谱抑菌剂及其制备方法。本发明利用抗坏血酸和过氧化氢体系可偶联溶菌酶和茶多酚，发挥两者抑菌和抗氧化的作用，制备具有抗氧化的广谱抑菌剂，以满足食品、药品等领域的要求。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种抗氧化广谱抑菌剂，该抑菌剂是利用抗坏血酸/过氧化氢作为反应体系偶联溶菌酶和茶多酚得到的溶菌酶-茶多酚共聚物。

第二方面，本发明提供一种抗氧化广谱抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取溶菌酶溶解于超纯水中，在氮气保护下加入过氧化氢与抗坏血酸，恒温搅拌，得混合溶液A；

步骤2：向步骤1所得混合溶液中加入茶多酚溶液，搅拌得混合溶液B，然后将混合溶液B放入水浴锅中继续搅拌反应；

步骤3：将步骤2所得溶液进行透析，得溶菌酶-茶多酚复合体系；

步骤4：将步骤3所得溶菌酶-茶多酚复合体系置于冷冻干燥器中进行冷冻干燥，得到溶菌酶-茶多酚共聚物，所得溶菌酶-茶多酚共聚物即为抗氧化广谱抑菌剂。

进一步地，步骤1所述溶菌酶(Ly)溶液制备方法具体为：在25℃条件下将溶菌酶缓慢加入水中，在200～800转/分速度下搅拌2～4h，得到浓度≤1mg/mL的溶菌酶溶液；然后加入过氧化氢和抗坏血酸，恒温搅拌，搅拌速度200～800转/分，搅拌时间0.5～3h，得混合溶液A，所得混合溶液A中过氧化氢的浓度为0.05～30mol/L、抗坏血酸浓度为0.1～0.4％。

进一步地，步骤2中所述混合溶液B中茶多酚(EGCG)的浓度为0.1～1mmol/L，该浓度的茶多酚溶液一方面可与溶菌酶充分偶合，同时有利于除去多余茶多酚，搅拌速度200～800转/分，搅拌时间12～48h。

进一步地，步骤3所述透析具体为：在20℃条件下透析24～72小时，截留分子量3600Da的物质。

进一步地，步骤4所述冷冻干燥具体为：将步骤3所得溶菌酶-茶多酚复合体系在-4℃保存1～3天后放入冷冻干燥机里冻干，冻干温度-50～-80℃，真空度0.5～10pa，冻干时间48小时。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的一种抗氧化广谱抑菌剂的制备方法，采用抗坏血酸/过氧化氢作为反应体系，制备过程无需添加其他如稳定剂等物质，制备过程简单且温和、绿色、安全，制备的溶菌酶-茶多酚具有良好的广谱的抑菌性和抗氧化能力。

2、本发明方法采用温和的方法将溶菌酶与茶多酚偶联，充分发挥各自的抑菌和抗氧化特性，同时拓宽其抑菌谱。本发明提供的一种抗氧化广谱抑菌剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用。

附图说明

图1是Ly-EGCG共聚物的紫外可见吸收光谱。

图2是Ly-EGCG共聚物的稳态荧光光谱。

图3是Ly-EGCG共聚物清除自由基(a)及总抗氧化能力(b)。

图中LE表示Ly-EGCG共聚物，LE0.1，LE0.3，LE0.5，LE0.7表示EGCG添加量分别为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L。

具体实施方式

以下实施例是为了更好的说明本发明的技术方案，而不是以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

一种抗氧化广谱抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取1g溶菌酶(Ly)溶解于圆底烧瓶中的100ml超纯水中，在400转/分搅拌2小时，向Ly溶液中加入1ml的浓度为10mol/L的过氢化氢与0.25g的抗坏血酸，最后放入水浴锅中25℃搅拌(400转/分)2小时，得混合溶液A；

步骤2：向步骤1所得混合溶液A中加入茶多酚(EGCG)，400转/分搅拌24h，得混合溶液B，混合溶液B中茶多酚的浓度为0.1mmol/L；然后将混合溶液B放入水浴锅中25℃继续搅拌(400转/分)反应24h；

步骤3：将步骤2所得溶液进行透析，3600Da透析袋于25℃条件下透析48h，得Ly-EGCG复合体系；

步骤4：将步骤3透析所得Ly-EGCG复合体系在-4℃保存2天后放入冷冻干燥机里冻干，冻干温度-60℃，真空度0.8pa。

实施例1所得Ly-EGCG共聚物的DPPH清除率为49.06％，总抗为0.674T-AOC/mL，对大肠杆菌的抑菌圈为5.87mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为11.26mm。

实施例2

一种抗氧化广谱抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取2g溶菌酶溶解于圆底烧瓶中的200ml超纯水中，在400转/分搅拌2小时，向Ly溶液中加入2ml的浓度为10mol/L的过氢化氢与0.5g的抗坏血酸，最后放入水浴锅(500转/分)中25℃搅拌2小时，得混合溶液A；

步骤2：向步骤1所得混合溶液A中加入EGCG，400转/分搅拌24h，得混合溶液B，混合溶液B中茶多酚的浓度为0.3mmol/L；然后将混合溶液B放入水浴锅中25℃继续搅拌(500转/分)反应24h；

步骤3：将步骤2所得溶液进行透析，3600Da透析袋于温度25℃条件下透析48h，得Ly-EGCG复合体系；

步骤4：将步骤3透析所得Ly-EGCG复合体系在-4℃保存2天后放入冷冻干燥机里冻干，冻干温度-60℃，真空度0.8pa。

实施例2所得Ly-EGCG共聚物的DPPH清除率为61.51％，总抗为0.736T-AOC/mL，对大肠杆菌的抑菌圈为6.49mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为8.13mm。

实施例3

一种抗氧化广谱抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取1g溶菌酶溶解于圆底烧瓶中的100ml超纯水中，在400转/分搅拌2小时，向Ly溶液中加入1ml的浓度为10mol/L的过氢化氢与0.25g的抗坏血酸，最后放入水浴锅中25℃搅拌(400转/分)2小时，得混合溶液A；

步骤2：向步骤1所得混合溶液A中加入EGCG，400转/分搅拌24h，得混合溶液B，混合溶液B中茶多酚的浓度为0.5mmol/L；然后将混合溶液B放入水浴锅中25℃继续搅拌(400转/分)反应24h；

步骤3：将步骤2所得溶液进行透析，3600Da透析袋于温度25℃条件下透析48h，得Ly-EGCG复合体系；

步骤4：将步骤3透析所得Ly-EGCG复合体系在-4℃保存2天后放入冷冻干燥机里冻干，冻干温度-60℃，真空度0.8pa。

实施例3所得Ly-EGCG共聚物的DPPH清除率为80.91％，总抗为0.858T-AOC/mL，对大肠杆菌的抑菌圈为6.66mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为8.09mm。

实施例4

一种抗氧化广谱抑菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取1g溶菌酶溶解于圆底烧瓶中的100ml超纯水中，在400转/分搅拌2小时，向Ly溶液中加入1ml的浓度为10mol/L的过氢化氢与0.25g的抗坏血酸，最后放入水浴锅中25℃搅拌(400转/分)2小时，得混合溶液A；

步骤2：向步骤1所得混合溶液A中加入EGCG，400转/分搅拌24h，得混合溶液B，混合溶液B中茶多酚的浓度为0.7mmol/L；然后将混合溶液B放入水浴锅中25℃继续搅拌(400转/分)反应24h；

步骤3：将步骤2所得溶液进行透析，3600Da透析袋于温度25℃条件下透析48h，得Ly-EGCG复合体系；

步骤4：将步骤3透析所得Ly-EGCG复合体系在-4℃保存3天后放入冷冻干燥机里冻干，冻干温度-60℃，真空度0.8pa。

实施例4所得Ly-EGCG共聚物的DPPH清除率为88.84％，总抗为0.935T-AOC/mL，对大肠杆菌的抑菌圈为7.62mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为7.41mm。

实施例5

取1mg/mL的Ly溶液进行抑菌实验，1mg/mL的Ly溶液对大肠杆菌的抑菌圈为6.8mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为7.53mm。

表1 Ly-EGCG共聚物抑菌性能

实施例6

对实施例1～4制备的Ly-EGCG共聚物进行紫外可见吸收能力、荧光吸收能力以及清除自由基和总抗氧化能力检测。检测结果如图1～3所示。

图1是Ly-EGCG共聚物的紫外可见吸收光谱，从图中可以看出，Ly在280nm条件下的吸光值的变化说明与EGCG偶联后芳香族氨基酸微环境发生了改变，出现不同程度的增色效应，并随着EGCG含量的增加而增加。这说明与EGCG偶联后，Ly结构发生改变，氨基酸残基进一步暴露。

图2是Ly-EGCG共聚物的稳态荧光光谱，从图中可以看出，与EGCG偶联后没有出现明显的移动，说明偶联后的Ly仍保持着原有的三级结构，这也为保持其活性提供了结构基础。同时与EGCG偶联后荧光强度降低，进一步说明Ly氨基酸残基微环境发生改变，这与图1结果一致。

图3是Ly-EGCG共聚物清除自由基(a)及总抗氧化能力(b)，从图中可以看出，天然Ly具有较低的抗氧化能力，相比Ly-EGCG共聚物具有较高的清除自由基及总抗氧化能力，并且抗氧化能力随着EGCG添加量的增加而提高，最高可提高60％，这也说明Ly-EGCG共聚物具有较高的抗氧能力。

以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。