阅读说明：本技术 异黄酮-查尔酮二聚体和查尔酮二聚体及制备方法和用途 (Isoflavone-chalcone dimer and chalcone dimer, preparation method and application ) 是由 杨学东 王立娜 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种异黄酮-查尔酮二聚体和查尔酮二聚体及制备方法和用途,通过对藏药藏锦鸡儿进行提取分离和系统的化学成分研究和炎症介质抑制活性评价,本发明提供的四个新的黄酮二聚体类化合物具有抑制IL-6、TNF-α和NO生成的活性,可用于制备抗炎、治疗缺血性心脑血管疾病药物。(The invention discloses an isoflavone-chalcone dimer and a chalcone dimer, a preparation method and application thereof, wherein four novel flavone dimer compounds provided by the invention have the activity of inhibiting IL-6, TNF-alpha and NO generation by carrying out extraction and separation on Tibetan medicine caragana and systematic chemical component research and inflammation medium inhibition activity evaluation, and can be used for preparing medicaments for resisting inflammation and treating ischemic cardiovascular and cerebrovascular diseases.)

异黄酮-查尔酮二聚体和查尔酮二聚体及制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及藏药藏锦鸡儿中异黄酮-查尔酮二聚体(caraganins A和B)和查尔酮二聚体(caraganins C和D)及其制备方法和应用。

背景技术

藏锦鸡儿作为藏医用于破血化瘀的主要藏药之一始载于《四部医典》，主要采用青藏高原产的豆科锦鸡儿属的鬼箭锦鸡儿(Caragana jubata)、昌都锦鸡儿(Caraganachangduensis)和川青锦鸡儿(Caragana tibetica)等三种植物的红色木部心材入药。藏锦鸡儿的主要功效为破血、化瘀、降压，常用于治疗多血症、高血压症和***等疾病。

炎症是当外来病原体和有害刺激侵入人体时，人体组织产生自我保护反应的过程，涉及局部血管系统和免疫系统，以及损伤组织中的多种分子介质。然而，不受控制的炎症可能导致一系列疾病。缺血性心脑血管疾病是人类最严重的疾病之一，它可导致机体的病理改变，而这种改变则是由这种失控的炎症引起的。因此，控制炎症介质如白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和一氧化氮(NO)的级联激活是治疗炎症性疾病以及缺血性心脑血管疾病的一种有前途的方法。

发明内容

本发明提供一种异黄酮-查尔酮二聚体和查尔酮二聚体及制备方法和用途，解决现有技术中治疗炎症性疾病药物可选择少问题。

本发明的技术方案为：

如下结构所示的化合物：

所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)藏锦鸡儿药材粉碎后采用溶剂提取，回收提取液得总提取物；

(2)步骤(1)所得总提取物分散于水中，采用与水不相混溶的有机溶剂萃取，回收溶剂得到萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经中压液相色谱分离，以甲醇/水或乙腈/水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得流份经制备高效液相色谱分离，以甲醇/水或乙腈/水为流动相进行梯度洗脱，得到化合物1-4。

所述藏锦鸡儿为豆科(Leguminosae)锦鸡儿属植物鬼箭锦鸡儿(Caraganajubata)、昌都锦鸡儿(Caragana changduensis)和川青锦鸡儿(Caragana tibetica)根茎的红色木部心材。

所述步骤(1)所述的提取方法为加热回流提取、浸提、渗漉或超声提取，所用溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、60％以上的甲醇-水或乙醇-水中的至少一种，药材∶溶剂的重量体积比为1∶4～1∶15。

所述步骤(2)所述的萃取方法，所用有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、***、乙酸乙酯中的任意一种，水溶液和有机溶剂体积比1∶1～1∶2。

所述步骤(3)中，以甲醇/水系统25∶75～100∶0梯度洗脱，或以乙腈/水系统20∶80～90∶10梯度洗脱。其中甲醇/水系统优化比例为40∶60～95∶5，乙腈/水系统优化比例为35∶65～80∶20。

所述步骤(4)中甲醇/水或乙腈/水以体积比30∶70～90∶10梯度洗脱，优化比例为50∶50～80∶10。

药物组合物，包含权利要求1所述化合物和药学上可接受的辅料。

所述化合物、所述药物组合物在制备抗炎、缺血性心脑血管疾病药物中的应用。

所述抗炎药物为抑制IL-6、TNF-α和NO生成的活性的药物。

本发明有益效果：通过对藏药藏锦鸡儿进行系统的化学成分研究和炎症介质抑制活性评价，研究发现，本发明提供的四个新的黄酮二聚体类化合物具有抑制IL-6、TNF-α和NO生成的活性，可用于制备抗炎、治疗缺血性心脑血管疾病药物。

附图说明

图1本发明化合物1的HRESIMS谱；

图2本发明化合物1的¹H-NMR谱；

图3本发明化合物1的¹³C-NMR谱；

图4本发明化合物1的DEPT-135谱；

图5本发明化合物1的¹H,¹H COSY谱；

图6本发明化合物1的HSQC谱；

图7本发明化合物1的HMBC谱；

图8本发明化合物2的HRESIMS谱；

图9本发明化合物2的¹H-NMR谱；

图10本发明化合物2的¹³C-NMR谱；

图11本发明化合物2的DEPT-135谱；

图12本发明化合物2的¹H,¹H COSY谱；

图13本发明化合物2的HSQC谱；

图14本发明化合物2的HMBC谱；

图15本发明化合物3的HRESIMS谱；

图16本发明化合物3的¹H-NMR谱；

图17本发明化合物3的¹³C-NMR谱；

图18本发明化合物3的DEPT-135谱；

图19本发明化合物3的¹H,¹H COSY谱；

图20本发明化合物3的HSQC谱；

图21本发明化合物3的HMBC谱；

图22本发明化合物3的NOESY谱；

图23本发明化合物4的HRESIMS谱；

图24本发明化合物4的¹H-NMR谱；

图25本发明化合物4的¹³C-NMR谱；

图26本发明化合物4的DEPT-135谱；

图27本发明化合物4的¹H,¹H COSY谱；

图28本发明化合物4的HSQC谱；

图29本发明化合物4的HMBC谱；

图30本发明化合物4的NOESY谱；

图31本发明化合物1～4的HMBC和¹H-¹H COSY相关示意图；

图32本发明化合物3～4的NOESY相关示意图；

图33本发明化合物1～4的实验和计算ECD谱；

图34本发明化合物1～4的结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

(1)藏锦鸡儿药材(原植物鬼箭锦鸡儿)1公斤，粉碎后在室温下采用95％乙醇浸提3次，每次5L浸泡24小时，减压回收溶剂得95％乙醇提取物；

(2)步骤(1)所得95％乙醇提取物分散于水中制成混悬液，先用石油醚萃取除去杂质后，再用二氯甲烷萃取，回收溶剂得二氯甲烷萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经中压液相色谱(反相硅胶C18)分离，以甲醇/水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱(35:65～100:0)；

(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(45∶55～65∶35)流份经制备高效液相色谱(反相硅胶C18)分离，以乙腈/水为流动相进行梯度洗脱(45：55～60：40)得到新化合物1(收率0.0012％)，2(收率0.001％)，3(收率0.0008％)，4(收率0.0005％)。

实施例2

(1)藏锦鸡儿药材(原植物昌都锦鸡儿)2公斤，粉碎后在室温下采用85％乙醇浸泡8小时，然后回流提取3次，每次回流8L×1小时，减压回收溶剂得85％乙醇提取物；

(2)步骤(1)所得85％乙醇提取物分散于水中制成混悬液，先用石油醚萃取除去杂质后，再用乙酸乙酯萃取，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经中压液相色谱(反相硅胶C18)分离，以乙腈/水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱(25∶75～80∶20)；

(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(40：60～60∶40)流份经制备高效液相色谱(反相硅胶C18)分离，以乙腈/水为流动相进行梯度洗脱(50∶50～90∶10)得到新化合物1(收率0.0015％)，2(收率0.0011％)，3(收率0.0009％)，4(收率0.0008％)。

实施例3

(1)藏锦鸡儿药材(原植物鬼箭锦鸡儿)1公斤，粉碎后在室温下采用75％乙醇浸泡4小时，然后超声震荡(超声频率：40KHz，超声功率：500W)提取3次，每次4.5L×1小时，减压回收溶剂得75％乙醇提取物；

(2)步骤(1)所得75％乙醇提取物分散于水中制成混悬液，先用石油醚萃取除去杂质后，再用氯仿萃取，回收溶剂得氯仿萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经中压液相色谱(反相硅胶C18)分离，以甲醇/水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱(40∶60～95∶5)；

(4)上述步骤(3)中所得甲醇/水(47∶53～68∶32)流份经制备高效液相色谱(反相硅胶C18)分离，以乙腈/水为流动相进行梯度洗脱(30∶70～65∶35)得到新化合物1(收率0.0010％)，2(收率0.0009％)，3(收率0.0010％)，4(收率0.0003％)。

实验例1

根据化合物1～4的理化性质和波谱数据鉴定了其结构(化合物1～4的波谱分析图谱见图1～34)。化合物1的结构鉴定数据如下：

黄色粉末(MeOH)；[α]²² _D-1.2(c 0.09,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)261(4.38)nm；ECD(MeOH)λ_max(Δε)206(+10.49),220(+5.06),240(-7.00)nm；IR(KBr)ν_max 3439,2921,1653,1610,1567,1549,1513,1464,1450,1438,1309,1265,1208,1112,1030,667,660cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)和¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)数据见表1；HRESIMS m/z 591.1614[M+Na]⁺,calcd for C₃₃H₂₈NaO₉,591.1626。化合物的HMBC相关信号见图31(1)。该化合物的绝对构型通过对比实验测定的ECD图谱和采用TDDFT(时间密度泛函理论)方法计算得到的对映异构体的ECD图谱确定。该化合物的绝对构型确定为9′R，ECD图谱见图33(A)。

化合物2的结构鉴定数据如下：

黄色粉末(MeOH)；[α]²² _D-1.0(c 0.09,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)261(4.26)nm；ECD(MeOH)λ_max(Δε)227(-26.82),239(-14.46),254(+6.41),284(+10.21)nm；IR(KBr)ν_max3433,2922,1612,1508,1459,1263,1207,1158,1039,559cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)和¹³C NMR(DMSO-d₆,100MHz)数据见表1；HRESIMS m/z 567.1666[M-H]^-,calcd for C₃₃H₂₇O₉,567.1661。化合物的HMBC相关信号见图31(2)。该化合物的绝对构型通过对比实验测定的ECD图谱和采用TDDFT(时间密度泛函理论)方法计算得到的对映异构体的ECD图谱确定。该化合物的绝对构型确定为9′R，ECD图谱见图33(B)。

化合物3的结构鉴定数据如下：

淡黄色油状物(MeOH)；[α]²² _D-1.0(c 0.08,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)274(3.99)nm；ECD(MeOH)λ_max(Δε)214(+3.59),221(+10.00),239(-12.70)nm；IR(KBr)ν_max 3432,2928,2378,1617,1508,1453,1378,1265,1208,1157,1119,1037,929,832cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)和¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)数据见表2；HRESIMS m/z 547.2072[M+Na]⁺,calcd for C₃₃H₃₂NaO₆,547.2091。化合物的HMBC相关信号见图31(3)，NOESY相关信号见图32(3)。该化合物的绝对构型通过对比实验测定的ECD图谱和采用TDDFT(时间密度泛函理论)方法计算得到的对映异构体的ECD图谱确定。该化合物的绝对构型确定为2R，3R，4R，ECD图谱见图33(C)。

化合物4的结构鉴定数据如下：

淡黄色粉末(MeOH)；[α]²² _D+1.2(c 0.10,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)267(3.79)nm；ECD(MeOH)λ_max(Δε)219(-4.50),231(+24.10),243(-20.00),267(+16.65),290(+10.85)nm；IR(KBr)ν_max 3438,2923,2853,1616,1513,1443,1261,1159,1024,804,578cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)和¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)数据见表2；HRESIMS m/z 507.1811[M-H]^-,calcd for C₃₂H₂₇O₆,507.1813。化合物的HMBC相关信号见图31(4)，NOESY相关信号见图32(4)。该化合物的绝对构型通过对比实验测定的ECD图谱和采用TDDFT(时间密度泛函理论)方法计算得到的对映异构体的ECD图谱确定。该化合物的绝对构型确定为2S，3R，4R，ECD图谱见图33(D)。

表1化合物1和2的¹H和¹³C NMR数据(DMSO-d₆)

表2化合物3和4的¹H和¹³C NMR数据(DMSO-d₆)

实验例2

新化合物1～4的抗炎活性测试

采用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞产生NO、IL-6和TNF-α模型，通过检测加入受试化合物后RAW264.7细胞中三种炎症介质的表达水平来评价其抗炎活性，从而发现抗炎以及治疗缺血性心脑血管疾病的潜在药物。

1.受试化合物溶液的配制方法

受试化合物用DMSO溶解，配成母液，浓度为50mM，-20℃下储存。测试时用DMEM培养液依次稀释为10mM、5mM、3mM、1mM、0.1mM、0.01mM。

2.小鼠RAW264.7巨噬细胞的培养

以DMEM培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清及1％双抗(青霉素：链霉素＝1∶1)细胞培养液，37℃，5％CO₂培养箱培养，2～3天换液一次，至细胞铺满培养瓶底，用于测试。

3.受试化合物的细胞毒性

将对数生长期的细胞，调整细胞密度至1×10⁵个/mL，接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中，培养24小时后，加不同浓度的受试化合物，20小时后，观察细胞的存活情况，并用MTT法定量检测化合物对细胞的毒性，以确定受试化合物的测试浓度。

4.NO抑制活性检测

将处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度接种于96孔板(1×10⁴个/孔)，培养24小时，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的待处理化合物，预处理30min后，加入LPS至终浓度为1.0μg/mL，继续培养24小时。取细胞培养上清液160μL，加入80μL Griess试剂，按Griess法，于550nm波长下测定吸光度，根据吸光度值和标准曲线计算各化合物对NO的抑制率。

5.IL-6和TNF-α抑制活性检测

将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板(1×10⁵个/孔)，培养24小时，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的待处理化合物，预处理30min后，加入LPS至终浓度为10ng/mL，继续培养24小时。用测定IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，用实时定量PCR方法进行IL-6和TNF-α的mRNA表达水平检测以确定各化合物对LPS诱导的炎症反应的抑制作用。

6.统计方法

全部数据采用SPSS(V17.0)统计软件包进行处理和分析。结果用平均值标准误差表示。将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算各化合物的IC₅₀值。

表3新化合物1～4抑制NO生成和IL-6，TNF-α分泌的IC₅₀值(μM)

^a***(dexamethasone)为阳性对照药物。

表3数据表明，新化合物1～4能显著抑制脂多糖(LSP)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中NO的产生和/或IL-6，TNF-αmRNA的表达水平，且多呈剂量依赖关系，表明本发明所述化合物均具有明显的抗炎活性，可用于制备新的抗炎活性药物。

本发明并不局限于上述实施例，很多细节的变化是可能的，但这并不因此违背本发明的范围和精神。