阅读说明：本技术 一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素a的方法 (Method for purifying sheep crispin A from sheep crispin root bark by column chromatography-high-speed countercurrent chromatography ) 是由 周天北 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法,包括如下步骤：步骤A、取适量羊脆木根皮粉末,用乙醇水溶液热回流提取,提取液过滤,浓缩至无醇味,乙酸乙酯等体积萃取,乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；步骤B、取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解,脱脂棉过滤,上样于D101大孔吸附树脂柱,先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂,再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱,收集第6个柱体积的洗脱液,减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A。本发明提供了的方法不依赖于硅胶柱层析和凝胶柱层析,易于操作和工业化应用。(The invention discloses a method for purifying sheep crispin A from sheep crispin root bark by using column chromatography-high-speed countercurrent chromatography, which comprises the following steps: step A, taking a proper amount of wood fern root bark powder, performing hot reflux extraction by using an ethanol water solution, filtering an extracting solution, concentrating until no alcohol smell exists, performing isovolumetric extraction on ethyl acetate, and concentrating the ethyl acetate part under reduced pressure to obtain an ethyl acetate extract; b, adding a proper amount of ethanol water solution into the ethyl acetate extract to dissolve, filtering absorbent cotton, loading the mixture into a D101 macroporous adsorption resin column, eluting by using 10 times of column volume of 30% ethanol water solution for removing impurities, eluting by using 65% ethanol water solution, collecting 6 th column volume of eluent, recovering ethanol under reduced pressure, and freeze-drying to obtain a sheep brittle wood element A enrichment; and step C, purifying the sheep brittle lignin A by high-speed counter-current chromatography. The method provided by the invention does not depend on silica gel column chromatography and gel column chromatography, and is easy to operate and industrially apply.)

一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A 的方法

技术领域

本发明属于化学领域，涉及天然化合物的制备方法，具体涉及一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法。

背景技术

羊脆木Pittosporum kerrii Craib为海桐花属Pittosporum Bank植物，其根、茎、皮作为民间草药使用已有数千年的历史。有报道从羊脆木的根、茎、皮等部位的提取物中陆续分离出多种化学成分，按结构类型主要有三萜及其苷、倍半萜、类胡萝卜素、甾醇等化合物。这些化学成分具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒和抗微生物等药理活性。

羊脆木素A即为一种从羊脆木根皮中分离得到的异苯并呋喃内脂化合物(化学结构如下)，其对多种肿瘤细胞具有细胞毒活性，对NB4、SH-SY5Y、PC3、A549和MCF-7细胞的IC50值分别为3.6、5.2、8.8、5.7和6.0μmol/L(文献：羊脆木根皮中1个新的异苯并呋喃内脂类化合物及其细胞毒活性，中草药，第47卷第23期2016年12月)。

目前，羊脆木素A的制备方法研究较少。

发明内容

本发明旨在提供一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法。

本发明目的通过以下方案实现：

一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，包括如下步骤：

步骤A、总提取物提取和乙酸乙酯萃取

取适量羊脆木根皮粉末，用乙醇水溶液热回流提取，提取液过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取，乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；

步骤B、柱色谱富集羊脆木素A

取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；

步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A

以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂；设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入适量流动相使体系充分平衡；将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成样品溶液，取适量从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。

优选地，步骤A中，羊脆木根皮粉末用体积百分浓度为70～80％的乙醇水溶液热回流提取。

优选地，热回流提取的料液比为1:5。

优选地，热回流提取3次，每次2h。

优选地，步骤A中，乙酸乙酯等体积萃取3次。

优选地，步骤B中，取乙酸乙酯萃取物加适量体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解。

优选地，步骤C中，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱。

优选地，步骤C中，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。

优选地，步骤C中，将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路。

有益效果：

本发明提供了一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，不依赖于硅胶柱层析和凝胶柱层析，易于操作和工业化应用。

附图说明

图1为羊脆木素A富集物与羊脆木素A对照品的HPLC色谱图比对；

图2为高速逆流色谱分离色谱图；

图3为高速逆流色谱纯化产物与羊脆木素A对照品的HPLC色谱图比对。

具体实施方式

实施例1：羊脆木素A的制备

一、实验材料

干燥的羊脆木根皮购自中药材市场，粉碎过40目筛，阴凉处保存备用。

乙醇为工业无水乙醇，根据需要加水制成不同体积百分浓度的乙醇水溶液。

二氯甲烷和乙酸乙酯为化学纯，为南京化学试剂股份有限公司产品。

羊脆木素A对照品由云南民族大学馈赠，纯度≥98％。

C18色谱柱为安捷伦公司产品，型号为Agilent TC-C18，规格为250mm×4.6mm、5μm。

色谱纯乙腈、三氟乙酸为TEDIA公司产品。

水为色谱用水，采用制水机自制。

二、实验方法和结果

1、HPLC分析条件

色谱柱为Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈(A)-0.05％三氟乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5min，25％A；5～35min，25％～75％A；35～40min，75％～100％A)；流动相流速1mL/min；检测波长272nm；进样量10μL。

2、总提取物提取和乙酸乙酯萃取

取5kg羊脆木根皮粉末，用体积百分浓度为75％的乙醇水溶液按照料液比1:5(1kg:5L)热回流提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。

3、柱色谱富集羊脆木素A

取乙酸乙酯萃取物250g加体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物(HPLC图见图1)。

4、高速逆流色谱纯化羊脆木素A

以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂。设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图(图2)收集羊脆木素A对应的色谱峰(即120～140min)，浓缩干燥。

纯化产物的HPLC图见图3，与羊脆木素A对照品具有相同的HPLC保留时间，HPLC归一化纯度为98.2％。¹³C-NMR(125MHz,C₅D₅N):δ126.2(C-1,s),159.3(C-2,s),111.3(C-3,d),144.8(C-4,s),116.6(C-5,s),130.4(C-6,d),27.3(C-7,t),124.4(C-8,d),133.4(C-9,s),17.7(C-10,q),25.8(C-11,q),69.0(C-1’,t),168.8(C-2’,s).HR-ESI-MS m/z:241.0845[M+Na]+,C₁₃H₁₄NaO₃,误差为4ppm.

实施例2：羊脆木素A的制备

一、实验材料

干燥的羊脆木根皮购自中药材市场，粉碎过40目筛，阴凉处保存备用。

乙醇为工业无水乙醇，根据需要加水制成不同体积百分浓度的乙醇水溶液。

二氯甲烷和乙酸乙酯为化学纯，为南京化学试剂股份有限公司产品。

羊脆木素A对照品由云南民族大学馈赠，纯度≥98％。

C18色谱柱为安捷伦公司产品，型号为Agilent TC-C18，规格为250mm×4.6mm、5μm。

色谱纯乙腈、三氟乙酸为TEDIA公司产品。

水为色谱用水，采用制水机自制。

二、实验方法和结果

1、HPLC分析条件

色谱柱为Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈(A)-0.05％三氟乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5min，25％A；5～35min，25％～75％A；35～40min，75％～100％A)；流动相流速1mL/min；检测波长272nm；进样量10μL。

2、总提取物提取和乙酸乙酯萃取

取5kg羊脆木根皮粉末，用体积百分浓度为70％的乙醇水溶液按照料液比1:5(1kg:5L)热回流提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。

3、柱色谱富集羊脆木素A

取乙酸乙酯萃取物250g加体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物。

4、高速逆流色谱纯化羊脆木素A

以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂。设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。纯化产物与羊脆木素A对照品具有相同的HPLC保留时间，HPLC归一化纯度为98.5％。核磁和质谱确证信息与实施例1一致。

实施例3：羊脆木素A的制备

一、实验材料

干燥的羊脆木根皮购自中药材市场，粉碎过40目筛，阴凉处保存备用。

乙醇为工业无水乙醇，根据需要加水制成不同体积百分浓度的乙醇水溶液。

二氯甲烷和乙酸乙酯为化学纯，为南京化学试剂股份有限公司产品。

羊脆木素A对照品由云南民族大学馈赠，纯度≥98％。

C18色谱柱为安捷伦公司产品，型号为Agilent TC-C18，规格为250mm×4.6mm、5μm。

色谱纯乙腈、三氟乙酸为TEDIA公司产品。

水为色谱用水，采用制水机自制。

二、实验方法和结果

1、HPLC分析条件

色谱柱为Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈(A)-0.05％三氟乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5min，25％A；5～35min，25％～75％A；35～40min，75％～100％A)；流动相流速1mL/min；检测波长272nm；进样量10μL。

2、总提取物提取和乙酸乙酯萃取

取5kg羊脆木根皮粉末，用体积百分浓度为80％的乙醇水溶液按照料液比1:5(1kg:5L)热回流提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。

3、柱色谱富集羊脆木素A

取乙酸乙酯萃取物250g加体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物。

4、高速逆流色谱纯化羊脆木素A

以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂。设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。纯化产物与羊脆木素A对照品具有相同的HPLC保留时间，HPLC归一化纯度为98.0％。核磁和质谱确证信息与实施例1一致。

本发明提供了一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，不依赖于硅胶柱层析和凝胶柱层析，易于操作和工业化应用。