具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1

本实施例提供了一种紫丁香中的薁类化合物，所述薁类化合物包括两个互为同分异构体的化合物1和化合物2，其化学名称为8-（1,2-二羟基丙烷-2-基）-2-羟基-1,10-二甲基-9-二氢薁-3,4-二酮，结构式如下：

。

上述紫丁香中的薁类化合物的制备方法为：

（1）取干燥的紫丁香茎药材，加入8倍量的70%（体积浓度）乙醇，加热回流提取3次，时间分别为2小时、2小时、1小时，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得提取物浸膏；

（2）取提取物浸膏，用水分散后，依次用二氯甲烷萃取5次、乙酸乙酯萃取5次，每次二氯甲烷、乙酸乙酯的用量为被萃取液体积的1/3，收集两种溶剂萃取液及水液，减压浓缩溶剂，干燥，即得二氯甲烷萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水部位；

（3）取步骤（2）得到的乙酸乙酯萃取部位，用甲醇完全溶解，加入100-200目硅胶干法拌样，上样至事先填充好的200-300目硅胶柱中，进行柱层析分离，用石油醚-丙酮（体积比5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、0：1）梯度洗脱，并用硅胶GF254和G薄层板鉴别，合并含近似斑点的流份，得到11个馏分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11；取馏分4，用甲醇溶解，并过滤，滤液经ODS中压制备色谱分离，用5%、15%、30%、50%、70%、100%甲醇-水梯度洗脱，硅胶GF254薄层板检视，合并含相似斑点的流份，浓缩，干燥，得到5个馏分A、B、C、D、E；取馏分B用50%乙腈溶解，过滤，经制备液相色谱分离，用13%乙腈-水洗脱，依据各色谱峰的出峰时间收集馏分，浓缩各馏分，分别得到纯化合物1（200mg）、2（450mg）晶体，两化合物的纯度经高效液相色谱面积归一化法检测，纯度均达98%以上。

其中，ODS中压制备色谱的色谱条件为：ODS-C18色谱柱，色谱柱尺寸800*25mm，粒度20-45μm，流速30ml/min，柱温25℃。

制备液相色谱的色谱条件为：YMC-Triart C18色谱柱，色谱柱尺寸250*20mm，粒度5µm，流速10ml/min。

实施例2

本实施例提供了一种紫丁香中的薁类化合物，其制备方法为：

（1）取干燥的紫丁香茎药材，加入15倍量的浓度80%乙醇，采用冷浸法提取，冷浸2次，每次24小时，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得提取物浸膏；

（2）取提取物浸膏，用水分散后，依次用二氯甲烷萃取4次、乙酸乙酯萃取4次，每次二氯甲烷、乙酸乙酯的用量为被萃取液体积的1/2，收集两种溶剂萃取液及水液，减压浓缩溶剂，干燥，即得二氯甲烷萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水部位；

（3）取步骤（2）得到的乙酸乙酯萃取部位，用甲醇完全溶解，加入100-200目硅胶干法拌样，上样至事先填充好的200-300目硅胶柱中，进行柱层析分离，用石油醚-丙酮（体积比5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、0：1）梯度洗脱，并用硅胶GF254和G薄层板鉴别，合并含近似斑点的流份，得到11个馏分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11；取馏分4，用甲醇溶解，并过滤，滤液经ODS中压制备色谱分离，用5%、15%、30%、50%、70%、100%甲醇-水梯度洗脱，硅胶GF254薄层板检视，合并含相似斑点的流份，浓缩，干燥，得到5个馏分A、B、C、D、E；取馏分B用50%乙腈溶解，过滤，经制备液相色谱分离，用13%乙腈-水洗脱，依据各色谱峰的出峰时间收集馏分，浓缩各馏分，分别得到纯化合物1、2晶体，两化合物的纯度经高效液相色谱面积归一化法检测，纯度均达98%以上。

其余与实施例1相同。

实施例3

本实施例提供了一种紫丁香中的薁类化合物，其制备方法为：

（1）取干燥的紫丁香茎药材，加入30倍量的浓度95%乙醇，采用渗漉法提取，渗漉1周，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得提取物浸膏；

（2）取提取物浸膏，用水分散后，依次用二氯甲烷萃取6次、乙酸乙酯萃取6次，每次二氯甲烷、乙酸乙酯的用量为被萃取液体积的1/4，收集两种溶剂萃取液及水液，减压浓缩溶剂，干燥，即得二氯甲烷萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水部位；

（3）取步骤（2）得到的乙酸乙酯萃取部位，用甲醇完全溶解，加入100-200目硅胶干法拌样，上样至事先填充好的200-300目硅胶柱中，进行柱层析分离，用石油醚-丙酮（体积比5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、0：1）梯度洗脱，并用硅胶GF254和G薄层板鉴别，合并含近似斑点的流份，得到11个馏分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11；取馏分4，用甲醇溶解，并过滤，滤液经ODS中压制备色谱分离，用5%、15%、30%、50%、70%、100%甲醇-水梯度洗脱，硅胶GF254薄层板检视，合并含相似斑点的流份，浓缩，干燥，得到5个馏分A、B、C、D、E；取馏分B用50%乙腈溶解，过滤，经制备液相色谱分离，用13%乙腈-水洗脱，依据各色谱峰的出峰时间收集馏分，浓缩各馏分，分别得到纯化合物1、2晶体，两化合物的纯度经高效液相色谱面积归一化法检测，纯度均达98%以上。

其余与实施例1相同。

实施例4

本实施例提供了一种紫丁香中的薁类化合物，其制备方法步骤（1）为：

取干燥的紫丁香茎药材，加入20倍量的5%（体积浓度）乙醇，加热回流提取3次，时间分别为3小时、2小时、1小时，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得提取物浸膏。

其余与实施例1相同。

一、本发明化合物的结构解析

主要利用波谱学技术，包括紫外、红外、质谱、核磁共振（¹H-NMR、¹³C-NMR、2D-NMR）等鉴定其结构，具体波谱图如附图2-18所示，其波谱数据及解析过程如下：

（1）取实施例1得到的化合物1、2进行结构分析，化合物1、2为淡黄色无定形粉末，高分辨率质谱ESI-TOF-MS m/z：301.1046[M+Na]⁺。

化合物1和化合物2分子式均为C₁₅H₁₈O₅，准确分子量为278.1154，不饱和度为7。且两化合物的¹H NMR、¹³C NMR、HMBC、DEPT和HSQC图谱基本一致。

综合分析¹H NMR、¹³C NMR，可以得出化合物结构中存在3个甲基 [δC 24.2，23.5和11.0 (分别对应C-11, C-15和C-12), δH 2.06 (s, Me-12), δH 1.38 (s, Me-15)和δH1.37 (s, Me-11)]，2个亚甲基[δC 69.1和38.6 (分别为C-14和C-9), δH 3.65 (d, J =11.3 Hz, H-14a)和δH 3.53 (d, J = 11.3 Hz, H-14b), δH 3.02 (d, J = 17.7 Hz, H-9a)和2.00 (dd, J = 2.0, 17.6 Hz, H-9b)]，2个次甲基[δC 126.2和125.5 (分别对应C-5和C-7), δH 6.78 (s, H-5), δH 6.49 (d, J = 2.4 Hz, H-7)]，还有8个季碳[δC189.3, 181.8, 171.2, 160.0, 147.0, 135.9, 76.6和45.7 (分别是C-3, C-4, C-8, C-6, C-2, C-1, C-13和C-10)]。

结合HMBC、DEPT和HSQC谱等二维核磁共振波谱数据，确定化合物的平面结构，其化学平面结构式如附图1所示，其化学命名为：8-（1,2-二羟基丙烷-2-基）-2-羟基-1,10-二甲基-9-二氢薁-3,4-二酮。该化合物存在两个手性中心，即是C-10与C-13，因此在这个平面结构中就有四种构型分别为：（10R，13S）、（10S，13R）、（10R，13R）、（10S，13S）。通过实测的电子圆二色谱图（ECD）与理论计算的ECD谱图（Gaussian 09W软件计算）比较确定化合物的绝对构型为（10R，13R）和（10R，13S），具体谱图如附图2所示。通过NOESY谱数据发现化合物1的C-11、C-12、C-15 甲基氢有相关信号，而化合物2只产生C-11与C-12甲基氢的相关信号，因此可以判断化合物1和化合物2的绝对构型，分别为（10R，13R）、（10 R，13S），结构式如实施例1中所示。

（2）化合物1、2的波谱数据归纳如下：

化合物1：¹H NMR (600 MHz, MeOD) δ 6.79 (s, 1H, H-5), 6.49 (d, J = 2.4Hz, 1H, H-7), 3.70 (d, J = 11.3 Hz, 1H, H-14a), 3.62 (d, J = 11.3 Hz, 1H, H-14b), 3.14 (d, J = 17.7 Hz, 1H, H-9a), 2.43 (dd, J = 17.6, 2.0 Hz, 1H, H-9b),2.07 (s, 3H, H-12), 1.38 (s, 3H, H-15), 1.36 (s, 3H, H-11)。

¹³C NMR (150 MHz, MeOD) δ 187.9 (C-3), 180.5 (C-4), 169.7 (C-8), 158.7(C-6), 145.6 (C-2), 134.6 (C-1), 124.7 (C-5), 124.1 (C-7), 74.9 (C-13), 68.1(C-14), 44.2 (C-10), 37.0 (C-9), 22.9 (C-11), 22.1 (C-15), 9.6 (C-12)。

化合物2：¹H NMR (600 MHz, MeOD) δ 6.79 (s, 1H, H-5), 6.51 (d, J = 2.4Hz, 1H, H-7), 3.68 (d, J = 11.3 Hz, 1H, H-14a), 3.56 (d, J = 11.3 Hz, 1H, H-14b), 3.05 (d, J = 17.7 Hz, 1H, H-9a), 2.47 (dd, J = 17.6, 2.0 Hz, 1H, H-9b),2.08 (s, 3H, H-12), 1.40 (s, 3H, H-15), 1.38 (s, 3H, H-11)。

¹³C NMR (150 MHz, MeOD) δ 187.9 (C-3), 180.4 (C-4), 169.8 (C-8), 158.6(C-6), 145.6 (C-2), 134.5 (C-1), 124.8 (C-5), 123.6 (C-7), 75.2 (C-13), 67.7(C-14), 44.2 (C-10), 37.2 (C-9), 22.8 (C-11), 22.1 (C-15), 9.6 (C-12)。

二、本发明化合物的抗炎作用研究

（一）实验材料与试剂

1、药物和试剂

实施例1制备的两个化合物1、2（自提，纯度98%以上）；小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7（上海晅科生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher/Gibco 公司）。CCK-8 试剂盒、IL-1β试剂盒、IL-6试剂盒、TNF-α试剂盒、DMEM培养基、青链霉素混合液（100×）（北京索莱宝科技有限公司）；DMSO、LPS （美国sigma 公司）；一氧化氮检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

2、实验仪器

BT 125D 型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；SPECTRO star Nano 全波长酶标仪(BMGLABTECH)；Form 311 型二氧化碳培养箱(Thermo Scientific 公司)。

3、受试药物及处理方法

分别精密称取化合物1 27.82mg，化合物2 27.79mg，置于5ml容量瓶中，先用少量DMSO 溶解后，再用DMEM 完全培养基稀释并定容至刻度，分别得到化合物浓度为20mmol/L，19.98 mmol/L的含药DMEM 培养基母液，实验时用DMEM 培养基稀释至所需的浓度。DMSO 体积比控制在千分之三以内。

（二）实验方法

1、细胞培养：RAW 264.7 细胞加入含10% FBS、1%青链霉素混合液的DMEM培养基，于含5% CO₂、37 ℃培养箱中传代培养，隔天传代。

2、两个化合物对RAW264.7 细胞活力影响的评价

取对数生长期的RAW264.7细胞，用含10% FBS培养液的DMEM培养基调整细胞密度到1×10⁴ ml^-1，接种于96孔板中，将含不同药物浓度化合物的细胞培养液以100 μL/孔加入96 孔板中，设计药物浓度分别为12.5、25、50、100、200、400 µmol/L的给药组，另设正常细胞对照组，在正常组中加入无药物的细胞培养液，每组6个复孔。于37 ℃、5% CO₂培养24 h后，弃去上清液加入10% 的CCK-8溶液，每孔100 μL，于酶标仪450 nm 处测定吸光度（OD值），计算细胞存活率。

3、 两个化合物对LPS 诱导RAW264.7 细胞脂质过氧化反应影响的评价

（1）标准曲线的绘制：标准品稀释成浓度为0，1.56，3.125，6.25，12.5，25，50，100mM 的溶液，加入等量的Griess试剂，用酶标仪在波长550nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）采用Griess法测定化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的抑制作用。取对数生长期的RAW264.7细胞接种于 96 孔板中（5×10⁴个细胞/孔），37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h，弃去旧培养基，给药组每孔加入100μL含药（低剂量50μmol/L、中剂量100μmol/L、高剂量200μmol/L）DMEM培养基，模型组和空白组每孔加入100μL空白培养基，培养1h后，除空白组外，其余各组加入100μL的LPS（2μg/ml）溶液，继续培养24h后，每孔吸取50μL上清液于新的96孔板中，先后加入GriessⅠ液50 μL与GriessⅡ液50 μL，用酶标仪在550 nm处测其OD值，计算NO抑制率。

4、 ELISA法检测炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量

试验分组、建模及给药流程同步骤3(2)，收集细胞上清液，按照细胞因子检测试剂盒操作说明，测定各试验组在3、6、12、24h时RAW264.7细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量。

5、数据处理与分析

数据采用excel 软件进行t 检验分析，结果以 “x±s”表示。用Graph Pad Prism8.0.2 软件绘制柱状图。

（三）实验结果

1、 两个化合物对RAW264.7 细胞活力影响的评价结果

CCK-8 法检测结果如图19、20所示，400 μmol/L 时两种化合物在24 h 内对RAW264.7 巨噬细胞生长无明显影响。

2、 两个化合物对LPS 诱导RAW264.7 细胞脂质过氧化反应影响的评价

两种化合物对LPS 诱导RAW264.7 细胞NO释放的影响结果如下表1及图21、22。

分析可知，化合物1、2的模型组与对照组比较具有极显著性差异（P＜0.01），说明LPS 刺激显著增加RAW264.7 细胞中NO的产生，造模成功。给药组与模型组比较，化合物1、2的高、中剂量组具有极显著性差异（P＜0.01），低剂量组有显著差异（P＜0.05），说明化合物1、2对LPS 刺激后RAW264.7 细胞中NO的产生具有明显的抑制作用。

表1 两个化合物对LPS 诱导RAW264.7 细胞脂质过氧化反应影响

3、 ELISA法检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量

实验结果如表2、3所示，模型组与空白组相比，LPS刺激后，模型组细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均呈极显著上升，说明造模成功。给药组与模型组相比，化合物1、2的高剂量组、化合物2的中剂量组中IL-1β含量在4个时间点上均呈极显著下降趋势，而化合物1的中剂量组IL-1β也显示出一定的下降趋势，且在相同时间点两化合物均呈剂量依赖关系；化合物1高剂量组中IL-6含量在4个时间点均呈现极显著下降，化合物1中剂量组及化合物2高、中剂量组也显示下降趋势。化合物1、2高剂量组TNF-α含量均呈极显著降低，而化合物1、2中、低剂量组对TNF-α含量也有一定的抑制效果；说明化合物1、2在一定程度上可以明显抑制LPS诱导条件下RAW264.7细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的过度分泌，表明化合物1、2具有明显的抗炎作用。

表2 化合物1对LPS诱导下RAW264.7细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影响

表3 化合物2对LPS诱导下RAW264.7细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影响

备注：上述表1、2、3和图21、22中， ^#是指模型组与空白组比较，^#表示P＜0.05，^##表示P＜0.01； ^*是指化合物（高、中、低）剂量组与模型组比较，^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01。

最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。