一种从伯克霍尔德菌发酵液提取fr901464的方法
阅读说明：本技术 一种从伯克霍尔德菌发酵液提取fr901464的方法 (Method for extracting FR901464 from Burkholderia fermentation broth ) 是由 朱进伟 陈世敏 郑玲辉 彭湘屏 张敏 石磊 高祥 汪超 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种从发酵液提取FR901464的方法,发酵液由伯克霍尔德菌发酵得到。发酵方法包括：将大孔树脂加入发酵液,混合吸附后过滤；将过滤得到的大孔树脂用有机溶剂浸泡分离,并将分离后的有机溶剂浓缩；浓缩后产物用正己烷与乙酸乙酯混合溶剂溶解,用硅胶进行色谱分离后,用乙酸乙酯洗脱得到洗脱液；浓缩洗脱液至膏状,随后配制成上柱液,上柱液用高压液相色谱仪进行分离纯化,填料为C18填料,用液相洗脱剂洗脱得到洗脱液；洗脱液经萃取后收集有机相,蒸干后形成固体粉末。(The invention provides a method for extracting FR901464 from fermentation liquor, wherein the fermentation liquor is obtained by fermenting Burkholderia. The fermentation method comprises the following steps: adding the macroporous resin into the fermentation liquor, mixing, adsorbing and filtering; soaking and separating the macroporous resin obtained by filtering with an organic solvent, and concentrating the separated organic solvent; dissolving the concentrated product with a mixed solvent of n-hexane and ethyl acetate, performing chromatographic separation by using silica gel, and eluting with ethyl acetate to obtain an eluent; concentrating the eluent to paste, preparing a column loading solution, separating and purifying the column loading solution by using a high-pressure liquid chromatograph, wherein the packing is C18 packing, and eluting by using a liquid-phase eluent to obtain an eluent; and extracting the eluent, collecting an organic phase, and evaporating to dryness to form solid powder.)
技术领域
本发明涉及发酵液纯化技术领域，具体涉及一种从伯克霍尔德菌发酵液提取FR901464的方法。
背景技术
FR901464是一种具有高效抗肿瘤活性的天然化合物，最初由Nakajima等人于1996年通过发酵从假单孢菌Pseudomonas sp.中分离纯化得到(Nakajima,H.；Sato,B.；Fujita,T.；Takase,S.；Terano,H.；Okuhara,M.Antitumor substances,FR901463,FR901464andFR901465.I.taxonomy,fermentation,isolation,physico-chemical properties andbiological activities[J].J.Antibiot.,1996,49:1196-1203.)，其中，文中所述的假单孢菌Pseudomonas sp.No.2663发酵产量约360mg/L。其化学结构式如式1所示。
作为真核细胞中前体mRNA的剪接抑制剂，FR901464对肿瘤细胞生长有很强的抑制作用，活性测试表明，FR901464对人类实体肿瘤细胞产生了十分显著的抑制作用，实验测试得IC50值在0.3-3.4nM。由于FR901464在抗肿瘤方面表现了极高的活性，且其生理活性独特，刚发现就引起了科学家们的广泛关注。
Nakajima H等虽然在《New antitumor substances,FR901463,FR901464andFR901465 I.Taxonomy,fermentation,isolation,physico-chemical properties andbiological activities》中公开了提纯方法，该方法需要消耗大量的乙酸乙酯进行提取，并且经申请人尝试并不能获得高纯度的FR901464。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种从发酵液提取FR901464的方法，其特征在于：
所述发酵液由伯克霍尔德菌发酵得到，提取方法包括以下步骤：
步骤1：将大孔树脂加入发酵液，混合吸附后过滤；
步骤2：将过滤得到的大孔树脂用有机溶剂浸泡并分离，将分离后的有机溶剂浓缩；
步骤3：用混合溶剂溶解步骤2浓缩后的产物，在硅胶柱中分离过滤，经洗脱剂A淋洗得到洗脱液；
步骤4：浓缩洗脱液至膏状，随后配制成上柱液，并用洗脱剂B经高压液相色谱仪分离纯化。
优选地，在步骤4后面为步骤5：步骤4中的洗脱液经萃取后收集有机相，蒸干后形成固体粉末。
优选地，高压液相色谱仪的填料为C18填料。
优选地，步骤1中，将大孔树脂加入发酵液后搅拌。
优选地，步骤1中，吸附时间不低于3h，或4h。
优选地，步骤2中，浸泡时间不低于1h，或2h。
优选地，步骤2中，大孔树脂分别用有机溶剂浸泡2次或更多。
优选地，所述混合溶剂由极性溶剂和非极性溶剂混合而成。
优选地，所述极性溶剂选自醇、酸、脂、腈、水，优选地选自为异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、氯仿、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸，更优选地为乙酸乙酯；所述非极性溶剂选自饱和烃类、苯，优选地为正己烷。
优选地，正己烷与乙酸乙酯混合形成所述混合溶剂，其中乙酸乙酯的体积分数不大于70％。
优选地，步骤4中，用30％体积分数的乙腈配制成上柱液。
优选地，步骤2中的有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿。
优选地，洗脱剂A为乙酸乙酯，洗脱剂B选自乙腈或甲醇的水溶液。
优选地，洗脱剂B为乙腈溶液，体积浓度为30％-45％，或者为30％-40％。
优选地，步骤3和步骤4之间包括步骤3.1：将步骤3得到的洗脱液浓缩至膏状，重复步骤3得到洗脱液。
优选地，硅胶柱中硅胶填料规格为100-200目，孔径
优选地，步骤4中，上柱液在高压液相色谱仪中的流速为50-70ml/min,优选70ml/min。
优选地，步骤5中，收集的有机相经过无水硫酸镁脱水处理，过滤后蒸干形成固体粉末。
本发明适用于市面上可获得的任何一种伯克霍尔德菌发酵得到的发酵液，优选地，所述伯克霍尔德菌为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.22290，保藏日期为2021年05月08日。
有益效果：
1、采用本发明的提纯方法，最终产物中FR901464的纯度高；
2、本发明的提纯方法的操作步骤简单。适合工业化生产；
3、利用高压制备液相色谱仪以及特定溶剂和浓度的流动相能够有效地除去结构相似、难以分离的FR901464类似物；
4、通过硅胶填料可以除去大部分极性较大的以及色素类杂质。
附图说明
图1为发酵液的液相色谱图；
图2为实施例8中FR901464成品粉末液相图谱。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
提纯中所使用的乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、正己烷、甲醇的纯度为工业级。
以下实施例所涉及的发酵液根据申请号为CN202110681279.4的专利申请得到，采用的菌株为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)。具体发酵方法为：
(1)斜面菌种的制备与培养：
斜面培养基配方(g/L)：酵母抽提粉4.0g/L，麦芽抽提物10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，琼脂20.0g/L，消前pH 7.2～7.4，试管30×200mm，装量15mL，经121℃灭菌20min，冷却至55-60℃左右摆斜面，待冷却凝固后，接种至斜面，28±1℃培养3天后，菌种成熟。
(2)种子液的制备与培养：
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖30g/L、山梨醇5g/L、棉籽饼粉10g/L、酵母抽提粉20g/L、氯化钙10g/L，硫酸镁10g/L，磷酸二氢钾1g/L，消前pH 7.0；250mL规格的三角摇瓶，装量50mL，121℃灭菌20min。接种107～108cfu/mL至种子培养基中，28±1℃，250rpm振荡培养24小时，此时培养液pH 6.8-7.2，菌体OD600为15-20。
(3)发酵培养基的制备与培养：
玉米淀粉20g/L、葡萄糖30g/L、山梨醇10g/L、甘露醇10g/L、酵母抽提粉6g/L、黄豆饼粉8g/L、棉籽饼粉7g/L、硫酸镁3g/L、磷酸二氢钾6g/L、氯化钾3g/L、氯化钙3g/L。消前pH6.0。250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在26±1℃，250rpm振荡培养96小时。
实施例1大孔树脂吸附
取四组发酵液，分别按照下表加入不同规格的大孔树脂，经搅拌吸附后，取发酵上清液，经HPLC方法检测上清液中FR901464的效价。
吸附率(％)＝100％-上清液效价/发酵放罐效价*100％
实施例2溶剂浸提
按照上述实施例1中第1组的吸附方式得到发酵液和大孔树脂LX-30的混合物，通过振荡筛分离得到大孔树脂LX-30，按照下表的方式将浸提溶剂加入大孔树脂LX-30中搅拌2h后分离收集浸提液。通过HPLC检测浸提液中FR901464的效价。
浸提收率＝浸提液效价*浸提液体积/(树脂重量*树脂效价)*100％
实施例3硅胶分离
参照实施例2，在1.27kg吸附后的大孔树脂LX-30中，加入2.5L的乙酸乙酯浸提，搅拌2h后分离浸提液，共浸提两次，得到混合浸提液4.7L，静置分液后分离得到有机相4.5L。在40℃条件下，将有机相通过旋转蒸发器浓缩至膏状。
取上述膏状物，分别按照下表的正己烷与乙酸乙酯混合溶剂溶解并过滤，将膏状物用混合溶剂配制成3g/L左右，溶液用硅胶填料(100-200目，孔径)进行色谱分离。
正己烷：乙酸乙酯(v:v)
吸附率(％)
30:70
98.9
40:60
100
50:50
100
结果表明，层析过程中，当上柱液中乙酸乙酯比例升高，硅胶吸附率下降，当比例为30：70时，上柱过滤中有FR901464漏出。
通过该步骤，极性小的杂质随液体流出，FR901464及极性大的物质会吸附在硅胶中。
实施例4硅胶分离
参照实施例3，用正己烷：乙酸乙酯(v:v)为50：50的混合溶剂溶解膏状物，过滤后用硅胶填料进行色谱分离，随后用乙酸乙酯将吸附在硅胶上的FR901464洗脱下来，而极性更大的杂质以及色素则吸附在硅胶上。通过HPLC的峰面积分布测量洗脱液中FR901464的纯度(即FR901464的峰面积占总峰面积的百分比，以下实施例中的纯度均通过该方法获得)，结果为58.25％。洗脱液在40℃条件下，通过旋转蒸发器浓缩至膏状。重复上述步骤，得到纯度为75.68％的洗脱液，并浓缩至膏状，用30％体积分数的乙腈配制成上柱液。
实施例5高压液相色谱仪分离纯化
用实施例4中的上柱液，进行高压液相色谱仪分离纯化，填料为华谱C18填料，液相洗脱剂分别用乙腈和甲醇，洗脱剂中溶剂体积浓度为35％，流速为70ml/min，柱温为室温。实验数据如下表，表中洗脱剂用量为填料体积的倍数。
实施例6高压液相色谱仪分离纯化
用实施例4中的上柱液，进行高压液相色谱仪分离纯化，填料为华谱C18填料，分别用4种不同体积浓度的乙腈作为洗脱剂，流速为70ml/min，柱温为室温。结果表明乙腈浓度30％-40％，效果较好。实验结果如下表：
乙腈浓度(％)
合格组份纯度(％)
收率(％)
30
97.08
74.34
35
95.91
69.74
40
95.44
62.73
45
92.01
40.36
实施例7高压液相色谱仪分离纯化
用实施例4中的上柱液，进行高压液相色谱仪分离纯化，洗脱液为35％乙腈，分别用3种C18填料(纳微C18填料、华谱C18填料、Kromasil C18填料)进行分离纯化实验，流速为70ml/min，柱温为室温，实验结果如下表：
填料型号
合格组份纯度(％)
收率(％)
纳微C18填料
95.55
65.81
华谱C18填料
95.91
69.74
Kromasil C18填料
96.03
63.18
实施例8高压液相色谱仪分离纯化
用实施例4中的上柱液，进行高压液相色谱仪分离纯化，洗脱液为35％乙腈，填料为华谱C18填料，流速为70ml/min，柱温为室温，得到纯度为96.14％的洗脱液。洗脱液用乙酸乙酯进行萃取，静置分液得到有机相。有机相用无水硫酸镁进行脱水、过滤。脱水后的有机相，在40℃条件下，用旋转蒸发器浓缩至固体粉末，纯度为96.75％，总收率为26.6％。
实施例9
步骤1：取25L的FR901464发酵液，加入2.5kg大孔树脂HP20，搅拌12h后，取样检测发酵液中FR901464含量为11.34ug/ml。然后用振荡筛分离发酵液和大孔树脂，得到2.3kg大孔树脂HP20。
步骤2：在分离得到的2.3kg大孔树脂HP20中加入4.2L的氯仿浸提，浸提时间4h，浸提两次，得到混合浸提液8.2L。
步骤3：混合浸提液静置分液，得到有机相8L。将有机相在40℃条件下，通过旋转蒸发器进行浓缩，将混合浸提液浓缩至膏状。
步骤4：用正己烷与乙酸乙酯混合溶剂(体积比50:50)溶解膏状物并过滤，滤液用硅胶填料进行色谱分离，得到纯度为57.22％的洗脱液。洗脱液在40℃条件下，通过旋转蒸发器进行浓缩，将洗脱液浓缩至膏状。
步骤5：重复步骤4得到纯度为68.68％的洗脱液。洗脱液在40℃条件下，通过旋转蒸发器进行浓缩，将洗脱液浓缩至膏状。
步骤6：上述膏状物用30％体积浓度的乙腈配制成上柱液。上柱液用高压液相色谱仪进行分离纯化，填料为Kromasil C18填料。用40％体积浓度的乙腈水溶液进行洗脱，得到纯度为95.68％。
步骤7：步骤6中的洗脱液用乙酸乙酯进行萃取，静置分液得到有机相。有机相用无水硫酸镁进行脱水、过滤。脱水后的有机相，在40℃条件下，用旋转蒸发器浓缩至固体粉末，纯度为95.66％，总收率为25.1％。
实施例10：
步骤1：取25L的FR901464发酵液，加入2kg大孔树脂HZ818，搅拌8h后，取样检测发酵液中FR901464含量为126ug/ml。然后用振荡筛分离发酵液和大孔树脂，得到1.8kg大孔树脂HZ818。
步骤2：在1.8kg大孔树脂HZ818中加入3.6L的二氯甲烷浸提，浸提时间2h，浸提两次，得到混合浸提液7.1L。
步骤3：混合浸提液静置分液，得到有机相7L。将有机相在40℃条件下，通过旋转蒸发器进行浓缩，将混合浸提液浓缩至膏状。
步骤4：用正己烷与乙酸乙酯混合溶剂(体积比40:60)溶解膏状物并过滤。滤液用硅胶填料进行色谱分离，得到纯度为52.23％的洗脱液。洗脱液在40℃条件下，通过旋转蒸发器进行浓缩，将洗脱液浓缩至膏状。
步骤5：重复步骤4得到纯度为68.37％的洗脱液。洗脱液在40℃条件下，通过旋转蒸发器进行浓缩，将洗脱液浓缩至膏状。
步骤6：上述膏状物用30％体积分数的乙腈配制成上柱液。上柱液用高压液相色谱仪进行分离纯化，填料为纳微C18填料。用35％体积浓度的乙腈水溶液进行洗脱，得到纯度为96.30％。
步骤7：步骤6中的洗脱液用乙酸乙酯进行萃取，静置分液得到有机相。有机相用无水硫酸镁进行脱水、过滤。脱水后的有机相，在40℃条件下，用旋转蒸发器浓缩至固体粉末，纯度为96.02％，总收率为27.2％。