一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用
阅读说明：本技术 一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 (Diaminopimelic acid dehydrogenase mutant and application thereof ) 是由 徐建中 刘宁 吴慧雯 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用。本发明通过对来自C.glutamicum XQ-5的二氨基庚二酸脱氢酶进行突变,将36位Arg突变成Glu,酶以NADH为辅酶的活力大于以NADPH为辅酶的活力,一定程度上实现了辅酶偏好性转变。辅酶NAD(H)和NADP(H)相比而言,NAD(H)有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环再生方法等优势,可以推进该酶的工业化应用。(The invention discloses a diaminopimelate dehydrogenase mutant and application thereof. The invention mutates the diaminopimelate dehydrogenase from C.glutamcum XQ-5 to mutate 36-Arg to Glu, and the activity of the enzyme taking NADH as coenzyme is greater than that of the enzyme taking NADPH as coenzyme, thereby realizing the preferential conversion of the coenzyme to a certain extent. Compared with NADP (H), NAD (H) has the advantages of good stability, low price, wider coenzyme cyclic regeneration method and the like, and can promote the industrial application of the enzyme.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
二氨基庚二酸脱氢酶(diaminopimelate dehydrogenase)由基因ddh所编码。二氨基庚二酸脱氢酶催化氨、NADPH以及四氢吡啶二羧酸形成内消旋二氨基庚二酸的可逆反应，这是细菌赖氨酸生物合成途径中L-赖氨酸的直接前体。由于哺乳动物缺乏该代谢途径，该途径中酶的抑制剂可用作抗生素或除草剂。这种酶最早是在芽孢杆菌、球形杆菌、谷氨酸棒杆菌和短杆菌中发现。
二氨基庚二酸脱氢酶是一个二聚体，显示立体感meso-DAP异构体的特异性。它是结构不同的亚基的同型二聚体。每个亚基由三个域组成。N-末端结构域包含修饰的二核苷酸结合结构域，或者是Rossman折叠(213456拓扑结构中的六个中央β-链，被五个α-螺旋包围)。第二个结构域包含两个α-螺旋和三个β-链。该域被称为二聚化域，因为它参与形成二聚体的单体-单体界面。第三个结构域又称为C端结构域由六个β-链和五个α-螺旋组成。两个单体中N端和C端结构域的相对位置不同，定义了一个开放和一个封闭的构象，分别代表酶的结合和活性状态。
二氨基庚二酸脱氢酶与NADPH有很强的亲和性是因为其与辅酶NADPH的2’磷酸位置的相互作用。理论上来说，NADPH偏好性氧化还原酶与对应负电2’P作用，需要带正电残基的参与，通常为Arg和Lys(60％)，以及极性不带电Ser、Asn，能够与之形成氢键作用，稳定与NADPH结合。由于二氨基庚二酸脱氢酶利用的辅酶NADPH稳定性差，价格高，所以限制了此酶的应用。在实际生产应用上，多倾向于使用NAD(H)依赖型的脱氢酶。对DAPDH进行辅酶专一性改造，可以为DAPDH潜在的工业化应用提供支撑。到目前为止尚无谷氨酸棒状杆菌中二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性改造的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明首次将来自C.glutamicum XQ-5的二氨基庚二酸脱氢酶的36位Arg突变成Glu，并在E.coli BL21(DE3)中进行过表达。结果表明突变酶以NADH为辅酶的活力大于以NADPH为辅酶的活力，一定程度上实现了辅酶偏好性转变。
本发明的第一个目的是提供一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的二氨基庚二酸脱氢酶的第36位精氨酸突变为谷氨酸获得。
本发明的第二个目的是提供一种所述的二氨基庚二酸脱氢酶突变体的编码基因。
进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述编码基因的重组质粒。
进一步地，所述的重组质粒是以pET系列载体为表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述二氨基庚二酸脱氢酶突变体的基因工程菌。
进一步地，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。
本发明的第五个目的是提供所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)表达载体pET-28a-ddh的构建
将核酸序列如SEQ ID NO.1所示的ddh片段与经相同限制性内切酶酶切后的E.coli的表达质粒pET-28a相连构建重组质粒pET-28a-ddh；
(2)重组菌株E.coli BL21(DE3)pET-28a-ddh 36位突变子的构建
将质粒pET-28a-ddh转化至E.coli BL21(DE3)，再进行突变并筛选得到重组菌E.coli BL21(DE3)pET-28a-ddhArg36Glu。
本发明的第六个目的是提供所述二氨基庚二酸脱氢酶突变体在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。
进一步地，所述的应用具体是以四氢吡啶为底物，催化还原胺化反应生成产物L-赖氨酸。
本发明的有益效果是：
本发明通过对来自C.glutamicum XQ-5的二氨基庚二酸脱氢酶进行突变，将36位Arg突变成Glu，酶以NADH为辅酶的活力大于以NADPH为辅酶的活力，一定程度上实现了辅酶偏好性转变。辅酶NAD(H)和NADP(H)相比而言，NAD(H)有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环再生方法等优势，可以推进该酶的工业化应用。
附图说明
：图1是ddh在E.coli BL21(DE3)中的表达，泳道说明：M泳道为蛋白质分子量标准Marker；1-2号泳道为E.coli BL21(DE3)pET-28a-ddh；3-4号泳道为E.coli BL21(DE3)pET-28a(空白对照)；
图2是突变酶酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
在本发明中，出发菌E.coli BL21(DE3)是野生型E.coli，由本实验室保藏。底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD600。辅酶NADPH在340nm处有吸光值，采用酶标仪测定吸光值，并参照标准曲线来测定其含量。L-赖氨酸含量可以通过生物传感仪进行测定。由于粗酶液根据pET-28a上带有His标签，所以可以通过亲和层析柱纯化。
实施例1：表达质粒pET-28a-ddh的构建
来源于C.glutamicum XQ-5二氨基庚二酸脱氢DAPDH扩增得到，将其通过限制性酶切位点EcoRI和XholI连接在pET-28a质粒上。
实施例2：将质粒转化至E.coli BL21(DE3)进行表达
重组表达质粒pET-28a-ddh化转至E.coli BL21(DE3)，37℃培养条件下经LB+Kan固体培养基培养筛选出重组表达菌株。出发菌株与重组菌株接种首先接种于LB 10ml液体小瓶进行一级种子液培养10-12h，然后以2％接种量转接至液体TB培养基，在37℃摇床内培养至OD600在0.5～0.6之间，加入终浓度为0.5mM IPTG，在16℃诱导表达20h。表达过后收集菌体，用PBS缓冲液(PH 7.4)洗涤两次，将菌体悬浮并控制在相同OD600，然后用超声破碎仪破碎菌体，离心取上清获得粗酶液。如图1，对粗酶液进行SDS-PAGE，发现在35kDa处明显加粗，说明二氨基庚二酸脱氢酶(蛋白大小约为35kDa)在质粒pET-28a中成功表达。
实施例3：将突变质粒转化至E.coli BL21(DE3)测突变后酶活和酶的动力学参数
设计引物将酶DAPDH的36位精氨酸突变。以pET-28a-ddh为模板通过点突变试剂盒进行突变(Arg36Ala、Arg36Glu、Arg36Leu、Arg36Phe、Arg36Cys、Arg36Tyr)。将获得的含有突变基因的质粒转化进入E.coli BL21(DE3)。将重组菌E.coli BL21(DE3)pET-28a-ddhArg36Ala等分别接种于LB 10ml液体小瓶进行一级种子液培养10-12h，然后以2％接种量转接至液体TB培养基，在37℃摇床内培养至OD600在0.5～0.6之间，加入终浓度为0.5mM IPTG，在16℃诱导表达20h。表达过后收集菌体，用PBS缓冲液(PH 7.4)洗涤两次，将菌体悬浮并控制在相同OD600，然后用超声破碎仪破碎菌体，离心取上清获得粗酶液。
酶活检测方法：以cgDAPDH的天然底物内消旋-二氨基庚二酸(meso-DAP)为底物，以NAD(P)+为辅酶，通过检测340nm下辅酶NAD(P)H生成时吸光值的变化来表征突变体的活性，辅酶的摩尔吸光系数为6.22mmol/(L·cm)。酶活测定体系为：200mM KOH-Glycine(PH10.5)，0.5mM NADP+/NAD+,5mM meso-DAP，10μL粗酶液，总体积为200μL。酶活单位(U)定义为30℃下每分钟生成1μmol NAD(P)H所需要的酶量。
实施例4：将酶进行纯化，并测定其动力学参数
将上述突变酶表达获得的粗酶液用亲和层析柱纯化。将重组菌株诱导完之后需要在在100mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM DTT和1mM EDTA中进行细胞的裂解。将破碎后的细胞进行冷冻离心机离心取上清，将可溶性蛋白用滤头(直径0.45μm)过滤得到纯化的样品，其需要在低温下保存。配置蛋白纯化结合液：1mM DTT、1mM EDTA，10mM咪唑和含有30％甘油的100mM Tris-HCl(pH 8.0)。蛋白纯化洗脱液：1mM DTT、1mM EDTA，300Mm咪唑和含有30％甘油的100mM Tris-HCl(pH 8.0)。将纯化的蛋白根据上述方法进行进一步的酶活检测。
对辅酶动力学参数的测定：200mM KOH-Glycine(PH 10.5)，0.5mM NADP+/NAD+,5mMmeso-DAP，10μL粗酶液。每个NADP+浓度做3-4次平行反应取平均值，利用Lineweaver-Burk双倒数法作图计算野生型酶和各突变体酶对NADP+以及NAD+的表观Km和Vmax值。结果如表1所示，与野生酶相比，大部分突变都导致了酶对NAD+和NADP+的kcat差异的变化，其中以Arg36Glu选择NAD+作为辅因子最有效。从表中可以看出除了Arg36Glu突变体，其余的突变酶对NAD+的Km值都没有降低，说明只有Arg36Glu突变酶提高了对NAD+的亲和性，同时还降低了对NADP+的亲和性，完成了辅酶偏好性的转变。
表1二氨基庚二酸脱氢酶的动力学参数
对野生型酶，突变体酶进行酶活检测，结果如图2所示，结果显示当36位Arg突变成Ala时酶活降低，说明36位对于辅酶催化活性有重要的作用。野生型酶对于NADP+有较高的催化能力，但是对于NAD+的催化效率很低。将野生型酶的36位氨基酸突变成其他氨基酸，结果显示当Arg突变为Leu和Cys时，突变酶不仅没有发生辅酶偏好性转变，反而降低了对辅酶NADP+的比酶活；当Arg突变为Phe时，突变酶与野生酶的酶活基本没变；当Arg突变为Tyr时，对NADP+的酶活一定程度的下降而且对NAD+的比酶活很低；当36位Arg突变为Glu时，酶对于NADP+的催化活性下降，对NAD+的催化活性上升，说明突变酶对于辅酶的偏好性发生了改变。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 320
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
85 90 95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
115 120 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145 150 155 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Glu Ala Leu
165 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
180 185 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
195 200 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ala Glu His Thr
225 230 235 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305 310 315 320
<210> 2
<211> 963
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtaggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60
cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcggagcg ggccaccctc 120
gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga cgacgtggac 180
gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gacatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240
cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300
gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgttgcac tggtctctac cggctgggat 360
ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420
cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcatccct 480
ggcgttcaaa aggccgtcca gtacaccctc ccatccgaag aagccctgga aaaggcccgc 540
cgtggcgaag ccggcgacct caccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600
gccgacgcgg ccgaccacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc tgattacttc 660
gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgacgc cgagcacacc 720
ggcatgccac acggcggaca cgtgatcacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780
gtggaataca tcctgaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcttc acagatcgct 840
ttcggccgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggtgcctt caccgtcctc 900
gaagttgctc catacttgct ctccccggag aacttggatg atctgatcgc acgcgacgtc 960
taa 963
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