伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用
阅读说明：本技术 伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用 (Burkholderia ester synthetase, coding gene and application thereof ) 是由 李秀婷 赵静溶 徐友强 于 2021-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用,更具体涉及细菌属的Burkholderia anthina BJQ0011来源酯合成酶JFN94-03506及其基因在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯。同时,还公开了所述酯合成酶JFN94-03506在水相体系催化合成白酒风味物质己酸乙酯和辛酸乙酯中的应用。因此,本发明提供了一种在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的酶和编码基因,具有较大应用价值。(The invention discloses Burkholderia ester synthetase, a coding gene and application thereof, and particularly relates to Burkholderia anthina BJQ0011 source ester synthetase JFN94_03506 of bacterial and the catalytic synthesis of ethyl hexanoate and ethyl octanoate in an aqueous phase system by the gene thereof. Meanwhile, the application of the ester synthetase JFN94_03506 in the catalytic synthesis of ethyl caproate and ethyl caprylate serving as flavor substances of white spirit in an aqueous phase system is also disclosed. Therefore, the invention provides an enzyme and a coding gene for catalyzing and synthesizing ethyl caproate and ethyl caprylate in an aqueous phase system, and the enzyme and the coding gene have higher application values.)
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用，更具体涉及细菌属的Burkholderia anthina BJQ0011来源酯合成酶JFN94_03506及其基因在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的应用。
技术背景
浓香型白酒的主体物质是水和乙醇，以及少量风味物质如酯、酸、醇、醛、酮类化合物等。风味物质虽然含量仅占酒体总量的1％-3％，却决定产品的感官和风味，是白酒中十分重要的组成物质。其中，己酸乙酯和辛酸乙酯是决定浓香型白酒品质的重要酯类物质。然而，由于白酒的主要生产过程为延续传统的固态发酵过程，酿造体系复杂，酿造过程的物料转化和风味物质生成机制的科学基础仍然不明晰，导致酿造过程产酯生香慢，即己酸乙酯、辛酸乙酯和其他酯类的合成效率低，降低了高品质白酒的生产效率，制约了产业的发展。虽然通过勾调过程外加化学香精己酸乙酯等可以提高酯含量，但感官品评表明此类产品品质较差，与传统发酵方式生产产品相比香味不协调，刺激性更强，缺乏酿造酒产品的“香气协调，绵柔净爽”的特点，明显影响了产品品质。探究己酸乙酯和辛酸乙酯等重要酯类的生成机制，对于确保浓香型白酒的产品品质具有重要作用。已有的研究表明，浓香型白酒固态发酵的主要驱动力为微生物的代谢，其中微生物所产酯合成酶对己酸乙酯和辛酸乙酯的合成具有显著贡献。
白酒的固态发酵酿造过程有多种微生物参与，呈现出复杂而独特的白酒微生物酿造区系。研究发现白酒来源的多种微生物均可以产生酯合成酶。然而，仅有部分菌种被报道具有酯的催化合成能力，包括细菌属的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanguinis)，以及霉菌属的毛霉(Mucor sp.)、根霉(Rhizopussp.)、多枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)、曲霉(Aspergillus sp.)和红曲霉(Monascussp.)。然而由于白酒微生物的多样性和发酵过程物料转化的复杂性，到目前为止极少研究聚焦微生物来源催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的酯合成酶。因此，挖掘伯克霍尔德氏菌来源具有催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯能力的酯合成酶，有助于丰富白酒微生物源酯合成功能酶资源，相关酶资源的深入研究对于保障白酒中关键风味酯类的稳定合成，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种伯克霍尔德氏菌酯合成酶JFN94_03506及其基因在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯中的应用。
本发明提供一种伯克霍尔德氏菌酯合成酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
相应地，本发明提供所述的伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因。优选方式中，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的伯克霍尔德氏菌酯合成酶是Burkholderia anthina BJQ0011来源酯合成酶JFN94_03506，具有在白酒酿造的水相体系环境中催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的性能，所述酯合成酶JFN94_03506的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体的其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供含有所述伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因的表达载体。优选地，所述伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因与启动子可操纵连接。
进一步，本发明还提供所述的表达载体的宿主细胞。尤其是大肠杆菌细胞。
更进一步地，本发明提供所述伯克霍尔德氏菌酯合成酶在制备己酸乙酯和/或辛酸乙酯中的应用。
在一个
具体实施方式
中，其是在水相体系中，以己酸和乙醇为催化底物，或者以辛酸和乙醇为催化底物，通过反应生成产物己酸乙酯或辛酸乙酯。优选地，所述的伯克霍尔德氏菌酯合成酶通过基因工作方法获得。更具体来说，所述的表达工程菌株的构建方法：提取伯克霍尔德氏菌总DNA，设计引物扩增基因，使用整合酶ClonExpress将基因整合到pET-28a(+)表达载体上。经测序验证后，将此质粒通过化学转化法转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，通过IPTG诱导表达，获得携带酯合成酶JFN94_03506的大肠杆菌细胞。破碎细胞获得粗酶液，在水相体系催化底物己酸和乙醇或者辛酸和乙醇生成对应的酯，经气相色谱检测到产物己酸乙酯和辛酸乙酯。
本发明所述酯合成酶JFN94_03506可通过大肠杆菌工程菌诱导表达获得，用于在水相体系中催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯。
实验证实：经大肠杆菌工程菌诱导表达的酯合成酶JFN94_03506粗酶制剂，可以在含有1M乙醇和0.01M己酸或者辛酸的水相体系，催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯，产量分别为14.2mg/L和25.1mg/L。
因此，本发明利用生物基因工程技术，克隆并诱导表达获得Burkholderiaanthina BJQ0011来源酯合成酶JFN94_03506及其编码基因，并构建含有酯合成酶JFN94_03506编码基因的大肠杆菌表达质粒，将该质粒转入大肠杆菌中，经过诱导表达获得该酶，并经催化体系验证具有在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的能力，己酸乙酯和辛酸乙酯的产量分别为14.2mg/L和25.1mg/L。本发明的酯合成酶JFN94_03506，可用于在白酒酿造的水相体系催化合成重要风味酯己酸乙酯和辛酸乙酯，因而可以用于白酒酿造中。
附图说明
图1酯合成酶JFN94_03506编码基因PCR扩增结果。
图2酯合成酶JFN94_03506编码基因诱导表达结果。
图3酯合成酶JFN94_03506催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯定量计算结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。
实施例1酯合成酶JFN94_03506编码基因的克隆
1、伯克霍尔德氏菌的培养
在无菌操作条件下，将伯克霍尔德氏菌BJQ0011接种含有100mL发酵培养基的300mL三角瓶，摇床30±1℃，200±10r/min培养48h。所述发酵培养基，其组成为高粱5g/L、蛋白胨10g/L、NH4HSO4 1g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4 0.8g/L、橄榄油10mL/L，调节pH为7.0，115℃灭菌20min。
2、伯克霍尔德氏菌DNA的提取
对上述培养48h的伯克霍尔德氏菌取样，采用BIOMIGA细菌DNA提取试剂盒提取总DNA。具体步骤如下：
(1)将细菌培养物在LB培养基中过夜培养
(2)取1-2mL细菌培养物到1.5mL或者2.0mL离心管中，室温下，12000rpm离心1min。弃去培养基。
(3)加入100μL TE Buffer，涡流悬浮菌泥。
(4)加入10μL Lysozyme，37℃温育10min。
(5)加入100μL BTL Buffer和20μL Proteinase K溶液。涡旋混匀。在55℃水浴摇床中培养，时间不超过1h。
(6)加入5μL RNase A。将管倒置混混匀数次。在室温下培养5min。10000离心2min。将上述上清液转移至新的1.5mL的离心管。
(7)加入220μL BDL Buffer，涡旋混匀。在65℃培养10min。
(8)加入220μL 100％乙醇。最大转速涡旋20s混匀。
(9)转移以上混合液于一个带有收集管的吸附柱中(包括可能生成的任何沉淀)。室温下，10000rpm离心1min。弃去滤液和收集管。将吸附柱插入新的2mL的离心管。
(10)加入500μL HBC Buffer，室温下，10000rpm离心1min。弃去滤液并重复使用收集管。
(11)加入700μL DNA Wash Buffer，室温下10000rpm离心1min。弃去滤液并重复使用收集管。
(12)再次加入700μL DNA Wash Buffer，室温下10000rpm离心1min。弃去滤液并重复使用收集管。
(13)室温下，13000rpm离心2min，去除残留的乙醇。
注意：乙醇的残留将会降低洗脱效果和影响下游实验，开盖离心或者适当延长离心时间，将有助于乙醇的去除。
(14)将吸附柱放入一个新的nuclease-free的1.5mL收集管中，加入50-100μL的DEPC-treated ddH2O，室温放置3-5min，10,000rpm离心1min洗脱DNA。提取到的DNA可直接用于后续实验或者-20℃存放。
3、PCR扩增酯合成酶JFN94_03506编码基因
通过克隆Burkholderia anthina BJQ0011来源的多个alpha/beta水解酶编码基因，异源表达并进行酶学性质测定，初次发现JFN94_03506具有酯合成能力，以该酶为例，具体的编码基因克隆、表达和性质测定如下。
通过PCR扩增伯克霍尔德氏菌来源的酯合成酶JFN94_03506的编码基因。引物设计如下：
正向引物:TAAGAAGGAGATATACCATGATGGACGCTTCTGAATTC
反向引物:GGTGGTGCTCGAGTGCGATTTCGGAACGGTTCGGCTG
PCR反应体系见下表。
表3 PCR反应体系扩增JFN94_03506的编码基因
试剂组成
使用量(μl)
ddH<sub>2</sub>O
21.0
dNTP Mixture(2.5mM each)
3.0
10×Ex Taq Buffer
3.0
正向引物(10μM)
0.6
反向引物(10μM)
0.6
模板DNA
0.8
Ex Taq(5U/μl)
1.0
Total
30.0
PCR扩增循环
基因扩增结果通过凝胶电泳检测，结果如图1所示。
实施例2构建表达酯合成酶JFN94_03506的大肠杆菌工程菌株
1、pET-28a(+)载体的线性化
设计引物通过PCR进行pET-28a(+)载体的线性化。引物设计如下：
正向引物：5'-CTGAGATCCGGCTGCTAA-3'
反向引物：5'-ACTTCCTCTTGGCACCAGGCCGCTGCT-3'
PCR反应体系见表4。
表4 线性化载体pET-28a(+)的PCR反应体系
试剂
体积(μl)
ddH<sub>2</sub>O
21.0
dNTP Mixture(2.5mM each)
3.0
10×Ex Taq Buffer
3.0
正向引物(10μM)
0.6
反向引物(10μM)
0.6
pET-28a(+)载体
0.8
Q5 DNA Polymerase(5U/μl)
1.0
Total
30.0
PCR扩增循环
扩增DNA条带通过DNA纯化后，用于质粒的构建。
2、质粒构建
通过II进行质粒构建。引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15-20bp)。基于此原则设计基因扩增的引物进行重组反应，于冰水浴中配制如下反应体系。反应体系组成见表5。
表5 质粒连接反应体系
体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分。置于37±1℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。
3、质粒的转化
取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45-90s，冰水浴孵育2min。加入600μl的LB培养基，37±1℃摇菌60min充分复苏。取100μl菌液均匀涂布在含有适当卡纳抗生素的LB培养基平板上。将平板倒置，于37±1℃过夜培养。所述LB培养基配方：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，固体添加2％的琼脂粉，调节pH为7.0，121℃灭菌20min。
实施例3酯合成酶JFN94_03506粗酶液水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯
1、酯合成酶JFN94_03506的诱导表达
挑取经验证正确的转化子，转接含有适当卡那抗生素的LB液体试管，37±1℃过夜培养，然后以1％(v/v)的接种量接种含有100mL LB培养基的300mL三角瓶，摇床37±1℃、200±10rpm培养3h，然后加入终浓度0.5mM的诱导剂IPTG，20±1℃、200±10rpm培养20h。
2、酯合成酶JFN94_03506粗酶液的制备
大肠杆菌诱导表达后13000rpm离心5min收集菌体，用pH 7.5的0.05MTris-HCl缓冲液悬浮洗涤菌体2次，然后悬浮菌体。超声波细胞破碎仪破细胞，13000rpm离心5min，上清液作为粗酶液，首先进行SDS-PAGE电泳，确定目标蛋白表达(图2)，然后进行酯化酶JFN94_03506的酯合成特性检测。
3、JFN94_03506粗酶液的酯合成催化
10mL反应体系如下：
粗酶液，1mL；柠檬酸缓冲液(pH 4.0)，9mL(加乙醇至1M)；己酸和辛酸，终浓度均为10mM。30±1℃，150±10rpm水浴摇床反应12h。3mL正己烷萃取，通过气相色谱定量检测酯的合成量。
4、气相色谱定量检测
色谱柱：Agilent 19091N-213I
检测条件：40℃，保持5min；以8℃/min的速度升至170℃，保持10min；以8℃/min的速度升至240℃，保持5min。进样量1μl，不分流。载气为氮气，流速为1mL/min，FID检测器。
结果证实，本发明构建的表达酯合成酶JFN94_03506的大肠杆菌工程菌的粗酶液具有在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的能力(图3)，产量分别为14.2mg/L和25.1mg/L。
序列表
<110> 北京工商大学
<120>伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用
<160> 6
<170> Patent-In 3.3
<210> 1
<211> 286
<212> PRT
<213> 伯克霍尔德氏菌酯合成酶JFN94_03506
<220>
<223>
<400> 1
MDASEFSKFL KAALPAAATA GAALTVAEVE IPGYAQDIAL RLYRRADKTG LPVVLYFHGG 60
GFVRGTLEDA DFAARFLAER LPALVVSVDY SLAPAFPFPA APEDAYRAAV WAATRARAFG 120
GNPKKIGVAG HDAGGQLANC LAFIARDRGE VSIAAQALFG PMLDPSMTRI GDAERLSSDI 180
TARECAACYR AYLPQAAQRM HPYAAPLESV RLAGLPPTLV VTAQNDVLHV EAEKYAGCLI 240
SSGVLTQVIR YPDVTHAALA THEAALEEAV RFFQCRFQAR QPNRSE 286
<210> 2
<211> 861
<212>DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌酯合成酶JFN94_03506编码基因
<220>
<223>
<400>2
atggacgctt ctgaattcag caaattcctg aaagccgcat tgcccgccgc ggccacggcc 60
ggcgcggcat tgacggtcgc ggaggtggaa atccccggct acgcgcagga catcgcgctg 120
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gcgccggagg atgcgtatcg cgccgccgtg tgggccgcga cgcgcgcccg cgcgttcggc 360
ggcaacccga agaagatcgg cgtcgcgggc cacgacgcgg gcggccagct cgcgaactgc 420
ctcgcgttca tcgcgcgcga tcgcggtgaa gtgtcgatcg ccgcgcaggc gctgttcggg 480
ccgatgctcg atccgagcat gacgcgcatc ggcgacgccg agcgcctgtc gtcggacatt 540
accgcgcgcg aatgcgcggc ctgttatcgc gcgtatctgc cgcaggcggc gcagcgcatg 600
cacccgtacg cggcgccgct cgaatcggtg cgactcgcgg gcctgccgcc gacgctcgtc 660
gtcaccgcgc agaacgacgt gctgcacgtc gaagcggaga aatatgcggg ctgcctgatt 720
tcgtcgggcg tgctcacgca ggtgatccgc tacccggacg tcacgcacgc ggcgctcgcg 780
acgcacgaag cggcgctgga ggaagccgtg cgcttcttcc agtgccgctt ccaggcgcgc 840
cagccgaacc gttccgaata a 861
<210> 3
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
taagaaggag atataccatg atggacgctt ctgaattc 38
<210> 4
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
ggtggtgctc gagtgcgatt tcggaacggt tcggctg 37
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
ctgagatccg gctgctaa 18
<210> 6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
acttcctctt ggcaccaggc cgctgct 27