阅读说明：本技术 含有重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的新型人工泪液 (Novel artificial tears containing recombinant human lysozyme and recombinant human epidermal growth factor ) 是由 史瑾 侯增淼 高恩 李晓颖 庞荣荣 杨小琳 赵金礼 于 2018-06-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种含有重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的新型人工泪液。该新型人工泪液包括主成分和辅料,所述主成分为重组人溶菌酶、重组人表皮生长因子和透明质酸钠,以新型人工泪液的总质量计,重组人溶菌酶、重组人表皮生长因子和透明质酸钠的含量分别为0.075％-0.300％、0.002％-0.004％、0.10％-0.30％。本发明将重组人溶菌酶、重组人表皮生长因子、透明质酸钠与辅料有效结合,经过眼部外用药物给药,对中、重度干眼症引起的眼部泪液分泌量下降,眼部干涩,轻微炎症,轻度角结膜损伤等有明显的治疗改善作用。(The invention provides a novel artificial tear containing recombinant human lysozyme and recombinant human epidermal growth factor. The novel artificial tear comprises a main component and an auxiliary material, wherein the main component comprises recombinant human lysozyme, recombinant human epidermal growth factor and sodium hyaluronate, and the contents of the recombinant human lysozyme, the recombinant human epidermal growth factor and the sodium hyaluronate are respectively 0.075-0.300%, 0.002-0.004% and 0.10-0.30% by total mass of the novel artificial tear. The invention effectively combines the recombinant human lysozyme, the recombinant human epidermal growth factor, the sodium hyaluronate and the auxiliary materials, and has obvious treatment and improvement effects on the reduction of eye tear secretion, eye dryness, slight inflammation, mild keratoconjunctival injury and the like caused by moderate and severe xerophthalmia through the administration of the externally-applied eye medicine.)

含有重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的新型人工泪液

技术领域

本发明涉及一种含有重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的新型人工泪液，属于医药技术领域。

背景技术

眼部炎症、眼部干涩、眼疲劳等症在人们的日常生活中最为常见，随着人们工作压力的增加，电子产品的日益更新，越来越长时间的使用电脑，手机；导致患上干眼及干眼综合症的几率在不断增加。据统计，近年来城市中干眼病人正以每年10％-20％的速度快速增加，人群发病率最高达到30％。研究发现，长期每天面对电脑荧光屏9小时以上的人士，眼部病患的几率是其他人的两倍；近视患者长期面对电脑，更是眼部干涩疾患的高危人士；人们在一般情况下1分钟眨眼约20次，使用电脑或手机时，因过于凝神注目，每分钟眨眼次数减少到6次，且不断调整焦距以保证视物清晰，长时间高强度的用眼，加之电子屏幕所发出的各种射线会严重刺激眼睛，导致泪分泌减少和泪成分变质，进而成为干眼症，伴有眼球表面干燥，出现充血、眼睛疲劳、视力降低、视物模糊等不适感觉。

干眼症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和/或眼表组织病变特征的多种疾病的总称。干眼的分级程度在临床上可分为轻度、中度、重度，虽然目前国内外尚无分级的金标准。但是，通常来说，轻度主要是有主观症状，检查主要是体征检查，询问病史；中度是有主观症状，主要检查泪膜破裂时间，角膜荧光素染色，有轻微的角结膜上皮损伤；重度主要是泪膜破裂时间小于5秒，泪液分泌量严重下降，角结膜荧光素染色着色明显，角膜上皮细胞损伤等。

人体天然泪液是有由人体泪腺等器官分泌的一种透明液体，由无机盐、多糖、蛋白、脂质等多种物质组成，具有屏障、抑菌、杀菌及免疫调节等多种功能，对于保护眼球、营养眼表组织及完善视觉功能等方面起着重要作用。目前市场上针对多种原因引起的泪液分泌不足型干眼症的人工泪液产品，以基本的补充液体，保湿为主，产品本身有成分单一、低渗等特点，这些产品虽然能暂时缓解眼睛干燥不适，但同时也会对干眼症眼表本身就偏低的多种泪液成分再次造成稀释，如泪液中的无机盐，脂质转运蛋白，溶菌酶，乳铁蛋白等，使眼球表面的泪膜更加不稳定，杀菌及免疫调节功能再次下降。

另一方面，市场上针对眼干、眼涩、眼疲劳等眼睛不适症状的人工泪液产品中，很多会添加化学抑菌剂，该类产品在短时间内使用效果良好，但长期接触抑菌剂可能引发过敏、干眼等刺激症状，损伤角膜或结膜并阻碍它们愈合，还可能引起医源性角膜炎等。众多的试验证明，眼药水中的抑菌剂有细胞毒性作用，它可影响细胞的功能和正常代谢，如果长期使用可造成眼表组织的损伤，并降低眼睛对眼药水的耐受性。有的还形成久治不愈的药物性结膜炎和药物性干眼症。一些临床调查显示：点用含抑菌剂的眼药水的患者，出现眼部异物感、刺痛感、灼热感等不适症状者，较点用不含抑菌剂的患者高了2.5倍，发生眼红、眼干涩症状的患者多达2倍以上。同样这些患者在换用不含抑菌剂的眼药水之后，症状则明显缓解或逆转。另外一项调查显示，由于眼药水中抑菌剂的刺激性使许多患者的治疗依从性降低，主动减少了点眼药水的次数，从而影响了临床治疗效果。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种治疗临床上常见的视频终端综合性中、重度干眼症的新型人工泪液。

为达到上述目的，本发明提供了一种含有重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的新型人工泪液，其包括主成分和辅料，所述主成分为重组人溶菌酶、重组人表皮生长因子和透明质酸钠，以新型人工泪液的总质量计，重组人溶菌酶、重组人表皮生长因子和透明质酸钠的含量分别为0.075％-0.300％、0.002％-0.004％、0.10％-0.30％。

根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述新型人工泪液中，所采用的重组人溶菌酶与人体天然溶菌酶的氨基酸序列是完全一致的。虽然当前已有将溶菌酶用于眼部药剂的报导，目前的溶菌酶多是蛋清提取的溶菌酶，是鸡溶菌酶，在氨基酸组成上和人的溶菌酶是有差异的，相对于人体来说是异源性的，将其用于人体往往会造成耐药性、免疫反应、过敏反应等副作用。本发明采用的重组人溶菌酶(recombinant human lysozyme，rhLYZ)是通过微生物发酵法获得，具体是通过表达人溶菌酶的毕赤酵母工程菌发酵纯化后获得，性状为白色冻干粉，分子量14700D，纯度大于98％，获得的重组人溶菌酶氨基酸序列与天然人溶菌酶氨基酸序列100％相同，对人体来说是同源性的。氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

1KVFERCELAR TLKRLGMDGY RGISLANWMC LAKWESGYNT RATNYNAGDR

51STDYGIFQIN SRYWCNDGKT PGAVNACHLS CSALLQDNIA DAVACAKRVV

101RDPQGIRAWV AWRNRCQNRD VRQYVQGCGV

本发明所采用的重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growthfactor，rhEGF)是通过微生物发酵法获得的，具体是通过表达人表皮生长因子的毕赤酵母工程菌发酵纯化后获得，性状为白色冻干粉，纯度大于95％，获得的重组人表皮生长因子氨基酸序列与天然人表皮生长因子氨基酸序列100％相同，氨基酸序列如下(SEQ ID NO:5)：

1NSDSECPLSH DGYCLHDGVC MYIEALDKYA CNCVVGYIGE RCQYRDLKWW

51ELR

根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述新型人工泪液中，以人工泪液的总质量计，所述重组人溶菌酶的含量为0.150％-0.300％。

根据本发明的具体实施方案，优选地，所述新型人工泪液的pH值为6.4-6.6，更优选为6.5。

根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述新型人工泪液中，所述辅料包括pH稳定剂；更优选地，所述pH稳定剂包括柠檬酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、枸橼酸钠或者由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠构成的缓冲液。当所述pH稳定剂为由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠构成的缓冲液时，可以将人工泪液的pH值稳定在6.5，保证人工泪液的最佳抑菌效果及配方的稳定，同时更接近天然泪液的pH值，对眼部无刺激。优选地，所述磷酸氢二钠为十二水合磷酸氢二钠，所述磷酸二氢钠为二水合磷酸二氢钠，更优选地，二者的质量比为20：9。

根据本发明的具体实施方案，优选地，所述新型人工泪液的渗透压摩尔浓度为285-310mOsmol/kg，与人体泪液等渗。高渗溶液在眼内可使眼角膜失去水分，加重眼部干涩症状，低渗溶液则能使角膜组织细胞胀大甚至破裂，而等渗的溶液体系可以有效保护眼部组织细胞的正常生理状态，减轻干眼的症状。对于重组人表皮生长因子，高渗或低渗的环境中细胞本身濒临衰亡，其促细胞增殖功能也无从发挥，在等渗的生理环境下作用于活力健康细胞方可充分发挥功效。

根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述新型人工泪液中，所述辅料还包括氯化钠。本发明的新型人工泪液将氯化钠的含量优选控制为0.70％-0.76％(氯化钠的含量以纯固体计)，可以同时保证重组人溶菌酶在人工泪液中具有良好的溶解性、活性、稳定性以及人工泪液的渗透压摩尔浓度为285-310mOsmol/kg，与人体泪液等渗。

根据本发明的具体实施方案，优选地，按照新型人工泪液的总量为10000-20000重量份计，所述新型人工泪液包括：重组人溶菌酶7.5-60.0份，重组人表皮生长因子0.2-0.8份，透明质酸钠10.0-60.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0-40.0份，二水合磷酸二氢钠9.0-18.0份，氯化钠70.0-152.0份，注射用水9840.6-19754.6份。更优选地，按照新型人工泪液的总量为10000重量份计，所述新型人工泪液包括：重组人溶菌酶15.0-30.0份，重组人表皮生长因子0.2-0.4份，透明质酸钠10.0-30.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0份，二水合磷酸二氢钠9.0份，氯化钠70.0-75.0份，注射用水9840.6-9870.8份。

根据本发明的具体实施方案，优选地，所述新型人工泪液可以具有以下具体组成：

按照新型人工泪液的总量为10000重量份计，所述新型人工泪液包括：重组人溶菌酶7.5份，重组人表皮生长因子0.2份，透明质酸钠10.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0份，二水合磷酸二氢钠9.0份，氯化钠76.0份，注射用水9877.3份；

或者，按照新型人工泪液的总量为10000重量份计，所述人工泪液包括：重组人溶菌酶15.0份，重组人表皮生长因子0.2份，透明质酸钠10.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0份，二水合磷酸二氢钠9.0份，氯化钠75.0份，注射用水9870.8份；

或者，按照新型人工泪液的总量为10000重量份计，所述人工泪液包括：重组人溶菌酶15.0份，重组人表皮生长因子0.2份，透明质酸钠30.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0份，二水合磷酸二氢钠9.0份，氯化钠72.0份，注射用水9853.8份；

或者，按照新型人工泪液的总量为20000重量份计，所述人工泪液包括：重组人溶菌酶60.0份，重组人表皮生长因子0.4份，透明质酸钠20.0份，十二水合磷酸氢二钠40.0份，二水合磷酸二氢钠18.0份，氯化钠148.0份，注射用水19713.6份；

或者，按照新型人工泪液的总量为20000重量份计，所述人工泪液包括：重组人溶菌酶60.0份，重组人表皮生长因子0.8份，透明质酸钠60.0份，十二水合磷酸氢二钠40.0份，二水合磷酸二氢钠18.0份，氯化钠140.0份，注射用水19681.2份。

针对近年来人们工作生活中大量使用电脑、手机等各类电子产品造成瞬目次数减少，泪液蒸发过强，从而引起的临床上常见的视频终端综合性干眼症，本发明提供的新型人工泪液具有增强泪液分泌数量，改善泪液分泌性质，减轻干眼症状，促进角膜损伤细胞修复的优异功效，主要应用于治疗临床上常见的视频终端综合性中、重度干眼症。本发明的新型人工泪液无菌，不含任何化学抑菌剂，无防腐剂，可以与人体泪液等渗，具有维持眼表生理环境、抑菌的功能，更接近人体天然泪液，可以采用日剂量包装，单支24小时内用完，使用安全，有效。

本发明提供的新型人工泪液可以是采用包括以下步骤的制备方法制备的：

(1)将透明质酸钠加入到注射用水中，使透明质酸钠完全溶解，获得透明质酸钠溶液；

(2)向透明质酸钠溶液中加入十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和氯化钠，使其完全溶解，获得辅料溶液；

(3)向辅料溶液中加入重组人溶菌酶冻干粉和重组人表皮生长因子冻干粉，使二者完全溶解，随后调节溶液pH值至6.5±0.1，获得人工泪液；

(4)将人工泪液过滤除菌。

优选地，本发明的制备方法进一步包括：(5)对经过过滤除菌的人工泪液进行灌装。

上述制备方法可以按照以下具体操作步骤进行：

(1)制备透明质酸钠溶液

按照上述比例将透明质酸钠加入到注射用水中，搅拌(例如约3小时)使透明质酸钠完全溶解，获得透明质酸钠溶液。

(2)制备辅料溶液

按照上述比例向透明质酸钠溶液中加入十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和氯化钠，搅拌至其完全溶解，获得辅料溶液。

(3)制备人工泪液

按照上述比例向辅料溶液中加入重组人溶菌酶冻干粉和重组人表皮生长因子冻干粉，搅拌至重组人溶菌酶冻干粉和重组人表皮生长因子冻干粉完全溶解，随后调节溶液pH值至6.5±0.1(例如采用浓度为5％(W/W)的盐酸调节溶液pH)。采用冰点渗透压仪检测，搅拌均匀的人工泪液渗透压摩尔浓度应在285-310mOsmol/kg范围内。

(4)过滤除菌

采用过滤除菌法对人工泪液进行除菌，优选地，采用0.22μm除菌过滤器进行过滤除菌，并且，过滤除菌采用的过滤操作压力可以控制为0.35-0.40MPa。过滤除菌之后，将无菌的人工泪液输送至已灭过菌的物料储罐内。

(5)灌装

采用吹灌封三合一无菌灌装技术进行灌装。吹灌封三合一技术(Blow-Fill-Seal，BFS)是指：在无菌滴眼剂生产车间内，塑料粒子在注塑机内经挤压热融后(170-230℃、350bar(1bar＝0.1MPa))制成塑料容器，将配制好的无菌药液通过吹灌封一体机在A级层流保护下灌入容器中并封口，灌装规格可以由本领域技术人员根据实际需要来确定，例如灌装规格是0.8mL/支；瓶体吹塑、药液灌装、制剂封口都是在一套连续的无菌生产工序中完成。

上述各步骤中，所有用于物料输送的管道必须预先通过灭菌处理。

目前常用人工泪液多为大剂量包装，使用过程中反复开启，长时间使用易造成细菌等病原微生物的二次污染，所以都会添加相关的化学抑菌剂以保证使用过程中的产品质量。大量的临床数据和研究资料表明，眼科治疗过程中产生的不良反应很多时候是抑菌剂造成的，已有研究证实抑菌剂的确会造成角膜上皮细胞损伤，过敏及眼部干涩等症状。为保证本发明的人工泪液在使用过程中的安全性及实用性，可以灌装为日剂量包装，例如0.8mL/支，使用时即开即用，单支24小时内用完，通过日剂量包装使得人工泪液在使用过程中不易造成二次污染。

本发明的人工泪液为局部外用无菌制剂，主成分重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子为活性蛋白，在原辅料配制好后选择终端过滤法除菌，无菌液进行无菌灌装，在保证滴眼液为无菌制剂的同时，可以保证重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的活性，有效避免高温灭菌法易造成的重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子失活。

相对于现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：

本发明的人工泪液采用重组人溶菌酶、重组人表皮生长因子和透明质酸钠为主要成分，不含任何化学抑菌剂，长期使用不会对眼部造成任何损伤，无过敏反应，安全有效。

本发明将重组人溶菌酶、重组人表皮生长因子、透明质酸钠与辅料有效结合，主要用于治疗中重度干眼症，经过眼部外用药物给药，对中度、重度干眼症引起的眼部泪液分泌量下降，眼部干涩，轻微炎症，角膜损伤等有明显的治疗改善作用。

附图说明

图1a显示了造模前透明质酸钠对照品组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图1b显示了造模前重组人溶菌酶对照品组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图1c显示了造模前重组人表皮生长因子对照品组的大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图1d显示了造模前人工泪液组的大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图2a显示了造模10天后透明质酸钠对照品组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图2b显示了造模10天后重组人溶菌酶对照品组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图2c显示了造模10天后重组人表皮生长因子对照品组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图2d显示了造模10天后人工泪液组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图3a显示了治疗5天后透明质酸钠对照品组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图3b显示了治疗5天后重组人溶菌酶对照品组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图3c显示了治疗5天后重组人表皮生长因子对照品组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图3d显示了治疗5天后人工泪液组大鼠角膜上皮荧光素钠染色结果。

图4a显示了治疗5天后透明质酸钠对照品组大鼠角膜上皮病理切片HE染色结果(400×)。

图4b显示了治疗5天后重组人溶菌酶对照品组大鼠角膜上皮病理切片HE染色结果(400×)。

图4c显示了治疗5天后重组人表皮生长因子对照品组大鼠角膜上皮病理切片HE染色结果(400×)。

图4d显示了治疗5天后人工泪液组大鼠角膜上皮病理切片HE染色结果(400×)。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

本发明的人工泪液是发明人通过深入的理论、试验研究并付出创造性劳动而获得的，本发明的新型人工泪液虽不能完全等同于人体天然泪液，但已具有泪液的基本特点，包括维持眼表生理环境(保湿、滋润眼球、等渗、稳定)、抑菌和促角膜上皮细胞增殖功能(实施例13试验显示人工泪液同时具有抑菌和促细胞增殖作用)，天然(无菌，无化学抑菌剂)等，可履行天然泪液的基本功能；本发明的新型人工泪液中的各成分的选择及配比具有良好的相互促进的协同作用。

首先，作为人工泪液的主成分之一的重组人溶菌酶为一种粘多糖溶解酶，是一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，是人眼免疫防御系统的重要组成部分，具有一定的抗菌消炎作用。外源性的滴加人溶菌酶可以更好的保护眼部，防止细菌感染及炎症的发生。并且，人溶菌酶为人体天然泪液中的固有物质，长期使用不会对人体产生任何毒副作用。

本发明的新型人工泪液的另一种有效活性成分是重组人表皮生长因子。人表皮生长因子是人体内分泌的一种重要的生长因子，广泛存在人体多种组织，能促进表皮细胞的***和生长。表皮生长因子具有促进角化细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等细胞的生长作用，也是角膜上皮和基质损伤修复的重要细胞因子，能够有效修复角膜损伤。

透明质酸钠是非牛顿流体，具有良好的生物相容性，在增加药物黏度的同时克服了眼睑不易眨动的缺点。并且，透明质酸钠具有良好的保湿及润滑的作用，能够使干眼症患者眼部湿润清爽感觉舒适。正常情况下，眼表自然存在的透明质酸形成一层膜覆盖于角膜上皮表面，角膜上皮具有与透明质酸特异性结合位点。

本发明将以上三种主要物质优效组合，人工泪液中含有的透明质酸钠会形成一层膜覆盖于角膜上皮表面，使重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子可以长时间存留于眼表，重组人溶菌酶发挥抑菌作用，减少外界病原微生物对角膜上皮细胞的侵害，重组人表皮生长因子促进角膜上皮受损细胞的修复与再生。经实施例16人工泪液对苯扎氯铵诱导的大鼠干眼伴重度角膜损伤模型药效学试验表明，本发明的人工泪液疗效明显优于只含有单一成分的透明质酸对照品、单一成分的重组人溶菌酶对照品和单一成分表皮生长因子市售滴眼液产品。

其次，多种活性蛋白或主成分组合在一起时，主物质间可能会发生相互作用导致各自的功效降低，组合物的疗效反而不如单一成分，本发明的三种主要成分能够发挥优异的组合功效除了其各自的自身特性外，辅料的选择及配伍也具有重要作用。

发明人在重组人溶菌酶的制备纯化及试验过程中惊奇的发现，重组人溶菌酶的活性和稳定性与溶液中的氯化钠含量有一定的比例关系，重组人溶菌酶在溶液中的含量越高，完全溶解所需氯化钠的比例越高，经实施例5中重组人溶菌酶溶解性与溶液中氯化钠含量的研究试验验证，重组人溶菌酶的重量含量在0.300％时，在浓度0.6％以下的氯化钠溶液中随着盐浓度的降低，重组人溶菌酶的溶解稳定性下降，呈悬浊状态，相应的含量与活性呈下降趋势，在浓度0.6％至6％的氯化钠溶液中重组人溶菌酶的溶解稳定性与活性基本保持恒定；本发明的人工泪液中氯化钠的重量含量可以控制为0.70％-0.76％，该配比可同时保证重组人溶菌酶在人工泪液中具有良好的溶解性、活性、稳定性以及人工泪液的渗透压摩尔浓度为285-310mOsmol/kg，与人体泪液等渗。

pH是人工泪液中非常重要的技术控制指标，关系到眼用制剂的稳定性、有效性和眼部刺激性。活性成分重组人溶菌酶等电点为9.24，在pH 5.0-8.0之间均有抑菌活性，实施例6重组人溶菌酶抑菌活性与pH的研究试验显示其最佳抑菌活性的pH为6.5；活性成分重组人表皮生长因子等电点为4.67，其促细胞增殖功能作用于生理环境下活力健康细胞方可充分发挥功效。本发明选用的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠配比可稳定滴眼液的pH在6.5±0.1，基本接近人体生理pH，保证了重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的最适活性条件，距离重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的等电点均相差1.5个pH以上，保证了重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的长期稳定性，同时该pH的人工泪液对人体眼部无刺激。

以上三种无机盐的选择及配比组成辅料溶液，然后再与三种主成分组合而成的人工泪液，通过实施例13人工泪液中重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的配伍稳定性研究试验；实施例14人工泪液的强制高频振动试验；实施例15人工泪液长期稳定性及加速试验表明该组方稳定；各组分的功能相互协同，在实施例16人工泪液对苯扎氯铵诱导的大鼠干眼伴重度角膜损伤模型药效学试验中与各单一组分对照品相比，具有明确有效并更优效的增强泪液分泌数量，促进角膜损伤细胞修复的优异功效。

实施例1：重组人溶菌酶的制备

1.重组人溶菌酶菌种构建

1.1表达载体的构建

根据GenBank公布的人溶菌酶(LYZ)的序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物(引物序列见表1)，上游引物添加限制性内切酶Xho I酶切位点CTCGAG，以及Kex2酶切位点AAAAGA，下游添加限制内切酶EcoR I位点GAATTC。引入前述位点后的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

1 CTCGAGAAAA GAAAGGTCTT TGAAAGGTGT GAGTTGGCCA GAACTCTGAAAAGATTGGGA

61 ATGGATGGCT ACAGGGGAAT CAGCCTAGCA AACTGGATGT GTTTGGCCAAATGGGAGAGT

121GGTTACAACA CACGAGCTAC AAACTACAAT GCTGGAGACA GAAGCACTGATTATGGGATA

181 TTTCAGATCA ATAGCCGCTA CTGGTGTAAT GATGGCAAAA CCCCAGGAGCAGTTAATGCC

241 TGTCATTTAT CCTGCAGTGC TTTGCTGCAA GATAACATCG CTGATGCTGTAGCTTGTGCA

301 AAGAGGGTTG TCCGTGATCC ACAAGGCATT AGAGCATGGGTGGCATGGAG AAATCGTTGT

361 CAAAACAGAG ATGTCCGTCA GTATGTTCAA GGTTGTGGAG TGTAAGAATTC

表1引物序列及退火温度

以人皮肤cDNA为模板，以设计的LYZ-XU和LYZ-EL为引物，进行PCR，退火温度为56℃，PCR结果在预期位置处有特异性条带，利用DNA纯化回收试剂盒对目的条带回收，然后对回收的DNA产物与pPIC9K载体(购于Invitrogen公司)进行XhoⅠ(购于Thermo Fisher公司)和EcoRⅠ(购于Thermo Fisher公司)双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，测序鉴定，获得人溶菌酶表达载体，命名为pPIC9K-LYZ。

1.2毕赤酵母电转化

将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-LYZ质粒，与80μL毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4-10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD(13.4g/L无氨基酵母氮源(YNB)，20g/L葡萄糖(Dextrose)，0.4mg/L生物素(Biotin))培养基平板，30℃倒置培养3-4天，在MD培养基平板上长出菌落。

1.3多拷贝***重组子的筛选

将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的YPD(酵母提取物(Yeast Extract)1wt％，多聚蛋白胨(Polypepton)2wt％，葡萄糖(Dextrose)2wt％)平板上，30℃培养，并经摇瓶筛选获得转化子。

2.重组人溶菌酶发酵培养及诱导表达

2.1一级种子培养

将筛选到的转化子分别接种于4个各装有250mL的BMGY(1％酵母提取物(yeastextract)；2％蛋白胨(peptone)；100mmol/L磷酸钾溶液，pH 6.0；1.34％YNB(yeastnitrogen base)；1％甘油)培养基的三角瓶中，于恒温培养摇床中，在29℃、转速225转条件下培养60-70h后接入种子罐。

2.2二级种子培养

将一级种子转接于装有3L FBS培养基(1L中含甘油40g、K₂SO₄ 18.2g、H₃PO₄26.7mL、CaSO₄·2H₂O 0.93g、MgSO₄ 14.9g、KOH 4.13g混合制成)的种子罐中，控制罐温29.0±1.0℃，罐压0.050±0.010MPa、pH5.0培养，培养过程调节通气、搅拌转速使溶氧维持在30％左右。二级种子培养16h后观察溶氧，溶氧大幅上升(1.0min内升高10％)二级菌种培养结束。种子液培养时长一般为16-24小时。

2.3 150L发酵罐发酵

二级种子培养结束移种至装有90L FBS培养基的150L发酵罐，培养温度控制在29.0±1.0℃，罐压控制在0.050±0.010MPa，通过手动调节通气量、氧气量和转速控制DO在30％左右。待培养15-20h时，底物消耗殆尽，此时溶氧会急剧上升，进入补料培养阶段。进入补料阶段后，迅速关闭氧气、降低搅拌转速使DO降至40％左右。启动自动补料系统，甘油溶液起始流速为1.7mL/min(1s/60s)，甘油补料流加速度根据具体发酵情况调节，泡敌视泡沫产生情况手动补入。待补料20h后，取样测发酵液湿菌重，当发酵液湿菌重达260g/L时停止甘油补料，开始饥饿。

停止甘油补料后，此时碳源供应不足，溶氧再次大幅上升。调节通气量、降搅拌转速以控制DO在30％-40％，此时饥饿阶段开始，控制饥饿状态1.0h。饥饿结束后，启动自动补料系统，补加起始流速为1.7mL/min(1s/60s)，3h后流速增加为3.4mL/min(2s/60s)，6h后流速增加为5.1mL/min(3s/60s)，9h后进入甲醇诱导阶段，根据DO实际情况增加甲醇流加速度。甲醇流加速度一般控制在13.6mL/min(8s/60s)以内，甲醇诱导时间一般控制在40-48h。甲醇诱导阶段应控制DO为20％-35％，并确定该阶段甲醇未累积过量。诱导时间40-48h或甲醇补加体积20-30L时，甲醇诱导阶段结束，开始放罐。

3.重组人溶菌酶纯化

3.1.重组人溶菌酶粗纯

发酵液经沉降式离心机转速2000转/分钟，离心90分钟进行固液分离；收集上清，上清液中加入终浓度为0.8M-1.0M氯化钠固体，完全溶解后经0.2μm中空纤维膜过滤系统，去除残余菌体、细胞碎片、尤其是毕赤酵母发酵液中的绿色色素；收集0.2μm滤出液上苯基疏水层析进行精细纯化。

3.2.重组人溶菌酶精细纯化

3.2.1.疏水层析纯化：配制流动相A：1M氯化钠溶液；B：纯化水加10％异丙醇，0.5M氢氧化钠溶液调节pH至8.0。A相平衡Phenyl Sepharose 6FF(美国GE公司)高流速苯基疏水琼脂糖凝胶层析柱，待平衡完成电导率达到80mS/cm时，将收集的0.2μm滤出液上柱，上柱完成后用A相流洗约3个柱体积，待紫外吸收降至500mV以下，用B相洗脱，收集洗脱液。

3.2.2.样品处理：将3.2.1.收集的洗脱液用1M磷酸二氢钠溶液，调节pH7.6-7.8，电导率6.0-7.0mS/cm。

3.2.3.CM阳离子交换层析纯化：配制流动相A：20mM磷酸盐缓冲液，pH7.6-7.8之间，电导率2.0-2.3mS/cm；流动相B：20mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl，pH7.6-7.8之间。将3.2.2.中的重组人溶菌酶样品上CM Sepharose FF(美国GE公司)高流速阳离子交换琼脂糖凝胶层析柱，全部上样完成后，A相平衡2-3个柱体积，阶梯梯度16％B相洗脱除去杂质后，调至梯度25％B相洗脱，收集洗脱液为重组人溶菌酶。

将洗脱液用Sephadex G25(美国GE公司)凝胶进行层析纯化，收集蛋白峰溶液后冷冻干燥，即可获得纯度98％以上的重组人溶菌酶冻干粉。

实施例2：重组人溶菌酶质量标准的检测

1.性状

实施例1中制备的重组人溶菌酶为白色或类白色的无定形粉末；无臭；遇碱易破坏，在0.6％以上的氯化钠水溶液中易溶，在丙酮或***中不溶。

2.鉴别

(1)取实施例1中制备的重组人溶菌酶约2mg，加生理盐水2滴使溶解，加10％氢氧化钠溶液5滴与10％硫酸铜溶液1滴，混匀后显***。

(2)取实施例1中制备的重组人溶菌酶约2mg，加醋酸-醋酸钠缓冲液(取无水醋酸钠6.7g，加水约900ml，振摇使溶解，用醋酸调节pH值至5.4，加水稀释至1000mL，摇匀)制成每1mL中含溶菌酶0.2mg的溶液，按照分光光度法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0401)测定，在280nm的波长处有最大吸收，吸收度为0.42-0.52。

(3)在纯度分析测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间一致。

(4)按照免疫印迹法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3401)测定，为阳性。

3.分子量

依质谱法测定(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0431)，MALDI-TOF检测重组人溶菌酶蛋白分子量14700D±100D。实施例1中制备的重组人溶菌酶蛋白分子量14700D。

4.等电点

依毛细管等电聚焦电泳法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0542毛细管电泳法)，重组人溶菌酶等电点为9.24。

5.肽图

依肽图检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3405第一法胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法)，与对照品图形一致。

6.N端氨基酸序列

重组人溶菌酶N端15个氨基酸序列为：

Lys-Val-Phe-Glu-Arg-Cys-Glu-Leu-Ala-Arg-Thr-Leu-Lys-Arg-Leu。

7.甲醇残留

依气相色谱法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0521气相色谱法)，甲醇含量不高于0.002％。

8.外源性DNA残留量

依外源性DNA残留量测定法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3407)，每100μg蛋白质应不高于10ng。

9.宿主菌蛋白残留量

依酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3414)，不高于总蛋白质0.1％。

10.pH值

取实施例1中制备的重组人溶菌酶0.1g，加生理盐水至10mL溶解后，依pH检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0631)，pH值为6.5-8.5。

11.干燥失重

取实施例1中制备的重组人溶菌酶0.2g，依水分检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0832)，不超过10.0％。

12.重金属(Pb)

依重金属检查二法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0821)，不大于百万分之十。

13.炽灼残渣

取实施例1中制备的重组人溶菌酶0.2g，依炽灼残渣检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0841)，遗留残渣不超过4.0％。

14.总蛋白量

取实施例1中制备的重组人溶菌酶，依蛋白量检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0731第二法福林酚法)，按干燥品计算，含总氮量不低于90％。

15.纯度

(1)按照非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0541第五法)，含重组人溶菌酶≥95.0％。

(2)按照《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0512反相高效液相色谱法面积归一法测定。上样量不低于5μg，于波长280nm处检测，以重组人溶菌酶色谱峰计算理论踏板数，不低于16000，按面积归一化法计算，重组人溶菌酶主峰面积不低于总面积的95％。

16.生物学活性-效价测定法

(1)试剂配制：磷酸盐缓冲液(0.02M/L pH6.5)：称取Na₂HPO₄·12H₂O 3.115g，称取NaH₂PO₄·2H₂O 1.763g，称取NaCl 6.0g，加入800mL蒸馏水溶解，再定容至1000mL。

底物悬浮液：称取溶壁微球菌菌粉20mg，加磷酸盐缓冲液0.5mL，浸泡1小时，再加磷酸盐缓冲液适量，使悬浮液于25℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.800±0.05(临用前配制)。

重组人溶菌酶溶液：精密称取重组人溶菌酶10mg，置于5mL容量瓶中，加磷酸盐缓冲液定容至5mL，再稀释成200ug/mL的重组人溶菌酶溶液。

(2)操作方法：

吸取0.1mL浓度为200μg/mL的重组人溶菌酶溶液，在室温25℃、pH值6.5时，加入含3mL底物悬浮液的比色皿中，置于紫外分光光度计，于波长450nm处测定吸收度，计算其效价。每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。设样品组和对照组，于25±0.1℃精密量取底物悬浮液3mL，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A₀和A’₀，然后精密量取0.1mL磷酸盐缓冲液和0.1mL200μg/mL的重组人溶菌酶溶液于比色皿中，迅速混匀，用秒表计时，至60秒测定吸收度值A₆₀和A’₆₀。按下式计算活性效价：

W为测定液中供试品的重量，单位μg。

重复测定3次，取平均值计算重组人溶菌酶活性单位，应不低于1.0×10⁵U/mg。

17.微生物限度

细菌总数(CFU/g)：取0.5g，依非无菌产品微生物限度检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1105)。细菌总数(CFU/g)＜100。

霉菌、酵母菌总数(CFU/g)：取0.5g，依非无菌产品微生物限度检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1105)。霉菌、酵母菌总数(CFU/g)＜10。

18.内毒素

依内毒素检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1143)，每1mg重组人溶菌酶冻干粉小于10EU。

通过检测，实施例1中制备的重组人溶菌酶符合各项标准，为合格品，可进一步用于制备人工泪液。

实施例3：重组人表皮生长因子的制备

1.重组人表皮生长因子菌种构建

1.1表达载体的构建

根据GenBank公布的人表皮生长因子氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，人工设计并合成核苷酸序列(上海生工生物)，同时在5’端添加限制性内切酶Xho I酶切位点CTCGAG，以及Kex2酶切位点AAAAGA，3’端添加限制内切酶Not I位点GCGGCCGC。引入前述位点后的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:6)：

1 CTCGAGAAAA GAAACTCTGA CTCTGAATGT CCATTGTCTC ACGACGGTTACTGTTTGCAC

61 GACGGTGTTT GTATGTACAT CGAAGCTTTG GACAAGTACG CTTGTAACTGTGTTGTTGGT

121 TACATCGGTG AAAGATGTCA ATACAGAGAC TTGAAGTGGT

GGGAATTGAGATAAGCGGCC

181 GC

然后对全基因合成人表皮生长因子基因及pPIC9K载体(购于Invitrogen公司)进行XhoⅠ(购于Thermo Fisher公司)和NotⅠ(购于Thermo Fisher公司)双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，测序鉴定，获得人表皮生长因子表达载体，命名为pPIC9K-EGF。

1.2毕赤酵母电转化

将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-EGF质粒，与80μL毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4-10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD(13.4g/L无氨基酵母氮源(YNB)B，20g/L葡萄糖(Dextrose)，0.4mg/L生物素(Biotin))培养基平板，30℃倒置培养3-4天，在MD培养基平板上长出菌落。

1.3多拷贝***重组子的筛选

将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的YPD(酵母提取物(Yeast Extract)1％，多聚蛋白胨(Polypepton)2％，葡萄糖(Dextrose)2％)平板上，30℃培养，并经摇瓶筛选获得转化子。

2.重组人表皮生长因子发酵培养及诱导表达

2.1一级种子培养

将筛选到的转化子分别接种于4个各装有250mL的BMGY(1％酵母提取物(yeastextract)；2％蛋白胨(peptone)；100mmol/L磷酸钾溶液，pH6.0；1.34％YNB(yeastnitrogen base)；1％甘油)培养基的三角瓶中，于恒温培养摇床中，在29℃、转速225转条件下培养60-70h后接入种子罐。

2.2二级种子培养

将一级种子转接于装有3L FBS培养基(1L中含甘油40g、K₂SO₄ 18.2g、H₃PO₄26.7mL、CaSO₄.2H₂O 0.93g、MgSO₄ 14.9g、KOH 4.13g混合制成)的种子罐中，控制罐温29.0±1.0℃，罐压0.050±0.010MPa、pH5.5培养，培养过程调节通气、搅拌转速使溶氧维持在30％左右。二级种子培养16h后观察溶氧，溶氧大幅上升(1.0min内升高10％)二级菌种培养结束。种子液培养时长一般为16-24小时。

2.3 150L发酵罐发酵

二级种子培养结束移种至装有90L FBS培养基的150L发酵罐，培养温度控制在29.0±1.0℃，罐压控制在0.050±0.010MPa，通过手动调节通气量、氧气量和转速控制DO在30％左右，pH控制在5.5，待培养15-20h时，底物消耗殆尽，此时溶氧会急剧上升，进入补料培养阶段。进入补料阶段后，迅速关闭氧气、降低搅拌转速使DO降至40％左右。启动自动补料系统，甘油溶液起始流速为1.7mL/min(1s/60s)，甘油补料流加速度根据具体发酵情况调节，泡敌视泡沫产生情况手动补入。待补料20h后，取样测发酵液湿菌重，当发酵液湿菌重达300g/L时停止甘油补料，开始饥饿。

停止甘油补料后，此时碳源供应不足，溶氧再次大幅上升。调节通气量、降搅拌转速以控制DO在30％-40％，此时饥饿阶段开始，控制饥饿状态1.0h。饥饿结束后，启动自动补料系统，补加起始流速为1.7mL/min(1s/60s)，3h后流速增加为3.4mL/min(2s/60s)，6h后流速增加为5.1mL/min(3s/60s)，9h后进入甲醇诱导阶段，根据DO实际情况增加甲醇流加速度。甲醇流加速度一般控制在13.6mL/min(8s/60s)以内，甲醇诱导时间一般控制在40-48h。甲醇诱导阶段应控制DO为20％-35％，并确定该阶段甲醇未累积过量。诱导时间45-52h或甲醇补加体积25-30L时，甲醇诱导阶段结束，开始放罐。

3.重组人表皮生长因子纯化

3.1重组人表皮生长因子粗纯

发酵液经沉降式离心机转速2000转/分钟，离心90分钟进行固液分离；收集上清，离心上清经0.2μm中空纤维膜过滤系统，去除残余菌体、细胞碎片、色素；收集0.2μm滤出液，用1KD卷式超滤膜系统进行浓缩脱盐，浓缩至体积约3L，电导率0.6±0.1mS/cm时超滤结束，收集浓缩液进行精细纯化。

3.2重组人表皮生长因子精细纯化

3.2.1样品处理一：将3.1中收集的浓缩液用1M磷酸二氢钠溶液，0.5M氢氧化钠溶液调节pH5.4-5.6之间，电导率2.0mS/cm以下。

3.2.2CM阳离子交换层析纯化一：配制流动相A：20mM磷酸盐缓冲液，pH5.4-5.6，电导率1.3-1.5mS/cm；流动相B：20mM磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液，pH5.4-5.6。A相平衡CMSepharose FF(美国GE公司)高流速阳离子交换琼脂糖凝胶层析柱3-5个柱体积，待平衡完成将3.2.1的样品上柱，收集流穿液为重组人表皮生长因子，上柱完成后用A相流洗约3个柱体积，待紫外吸收降至200mV以下，用100％B相洗脱，洗脱液中为杂质蛋白。

3.2.3样品处理二：将3.2.2收集的流穿液用1M柠檬酸溶液，调节pH4.2-4.3，加入少量纯化水调节电导率1.5mS/cm以下。

3.2.4CM阳离子交换层析纯化二：配制流动相A:20mM柠檬酸钠缓冲液，pH4.2-4.3，电导1.3-1.5mS/cm；流动相B:20mM柠檬酸钠缓冲液，1M氯化钠溶液，pH4.2-4.3。A相平衡CMSepharose FF(美国GE公司)高流速阳离子交换琼脂糖凝胶层析柱3-5个柱体积，待平衡完成将3.2.3中的重组人表皮生长因子样品上柱，全部上样完成后，A相平衡2-3个柱体积，阶梯梯度5％B相洗脱除去杂质后，调至梯度16％B相洗脱，收集洗脱液为重组人表皮生长因子。

3.2.5将3.2.4中洗脱液用0.5M氢氧化钠溶液调节pH至6.3-6.5，再用SephadexG25(美国GE公司)凝胶进行层析纯化，收集蛋白峰溶液后冷冻干燥，即可获得纯度95％以上的重组人表皮生长因子冻干粉。

实施例4：重组人表皮生长因子质量标准的检测

1.性状

实施例3中制备的重组人表皮生长因子为白色或类白色的无定形粉末；无臭；水溶液遇碱易破坏。

2.鉴别

(1)取实施例3中制备的重组人表皮生长因子约2mg，加水2滴使溶解，加10％氢氧化钠溶液5滴与10％硫酸铜溶液1滴，混匀后显***。

(2)取实施例3中制备的重组人表皮生长因子约10mg，用水稀释至1.0mg/mL，照分光光度法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0401)测定，波长240-320nm下扫描，最大吸收峰波长应为276nm。

(3)照免疫印迹法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3401)测定，应为阳性。

3.分子量

依质谱法测定(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0431)，MALDI-TOF检测重组人表皮生长因子蛋白分子量6200D±50D。实施例3中制备的重组人表皮生长因子蛋白分子量6200D。

4.等电点

依毛细管等电聚焦电泳法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0542毛细管电泳法)，重组人表皮生长因子等电点为4.67。

5.肽图

依肽图检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3405第一法胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法)，应与对照品图形一致。

6.N端氨基酸序列

重组人表皮生长因子N端15个氨基酸序列为：

Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu。

7.甲醇残留

依气相色谱法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0521气相色谱法)，甲醇含量应不高于0.002％。

8.外源性DNA残留量

依外源性DNA残留量测定法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3407)，每100μg蛋白质应不高于10ng。

9.宿主菌蛋白残留量

依酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3414)，应不高于总蛋白质0.1％。

10.pH值

取实施例3中制备的重组人表皮生长因子0.1g，加水至10mL溶解后，依pH检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0631)，pH值应为5.0-7.0。

11.干燥失重

取实施例3中制备的重组人表皮生长因子0.2g，依水分检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0832)，不得过10.0％。

12.重金属(Pb)

依重金属检查二法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0821)，应不大于百万分之十。

13.炽灼残渣

取实施例3制备的重组人表皮生长因子0.2g，依炽灼残渣检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0841)，遗留残渣不得过4.0％。

14.总蛋白量

取实施例3制备的重组人表皮生长因子，依蛋白量检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0731第二法福林酚法)，含总氮量应为不低于90％。

15.纯度

(1)按照非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0541第五法)，含重组人表皮生长因子应≥95.0％。

(2)按照《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0512反相高效液相色谱法面积归一法测定。上样量不低于5μg，于波长280nm处检测，以重组人表皮生长因子色谱峰计算理论踏板数，应不低于1000，按面积归一化法计算，重组人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95％。

16.生物学活性-细胞增值法/MTT比色法

依据《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3528重组人表皮生长因子生物学活性测定法，重组人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/c 3T3细胞)的生长具有刺激作用，BALB/c3T3细胞的生长状况因重组人表皮生长因子生物学活性的不同而异，以此检测重组人表皮生长因子的生物学活性。

(1)试剂配制

RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000mL，加青霉素10⁵IU和链霉素10⁵IU，再加碳酸氢钠2.lg，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。

维持培养液量取新生牛血清4mL，加RPMI 1640培养液至1000mL。

完全培养液量取新生牛血清100mL，加RPMI 1640培养液至1000mL。

PBS称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000mL，经121℃、15分钟灭菌。

噻唑蓝(MTT)溶液称取MTT粉末0.10g，加PBS 20mL使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

标准品溶液的制备取重组人表皮生长因子标准品，按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每l mL含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。

供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每l mL约含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。

(2)测定法

BALB/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每l mL含1.0×10⁵-5.0×10⁵个细胞，传代后24-36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1mL含5.0×10⁴-8.0×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加人标准品溶液和供试品溶液，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养64-72小时。每孔加人MTT溶液20μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加人二甲基亚讽100μL，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：供试品生物学活性(IU/mL)＝Pr×Ds×Es/Dr/Er

式中Pr为标准品生物学活性，IU/mL；

Ds为供试品预稀释倍数；

Dr为标准品预稀释倍数；

Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半效量的稀释倍数。

重复测定3次，取平均值经计算，为生物学活性与蛋白质含量之比，每lmg蛋白质应不低于5.0×10⁵IU。

17.微生物限度

细菌总数(CFU/g)：取0.5g，依非无菌产品微生物限度检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1105)。细菌总数(CFU/g)＜100。

霉菌、酵母菌总数(CFU/g)：取0.5g，依非无菌产品微生物限度检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1105)。霉菌、酵母菌总数(CFU/g)＜10。

18.内毒素

依内毒素检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1143)，每1mg重组人表皮生长因子冻干粉应小于10EU。

通过检测，实施例3中制备的重组人表皮生长因子符合各项标准，为合格品，可进一步用于制备人工泪液。

实施例5:重组人溶菌酶溶解性与溶液中氯化钠含量的研究

1.材料与仪器

1.1试验材料按实施例1制备的重组人溶菌酶冻干粉

1.2试验仪器紫外分光光度计，精度万分之一克的电子天平

2.试验方法

用电子天平准确称取9份0.0300g的重组人溶菌酶冻干粉；分别置于9个10mL量瓶中，每个量瓶中分别加入注射用水及质量含量分别为0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1.0％，2.0％，4.0％，6.0％的氯化钠溶液定容至刻度，获得9份理论上含量均为3.0mg/mL重组人溶菌酶溶液，混匀放置1小时使充分溶解，观察溶液状态，9份溶液均取适量，0.22μm滤器过滤，取滤液适量，用实施例2中总蛋白量检查法，生物学活性-效价测定法测定9个样品的蛋白含量及抑菌活性。

3.试验结果

重组人溶菌酶溶解性与溶液中氯化钠含量的试验检测统计结果见表2。从试验数据可以看出，0.6％氯化钠含量以下的溶液中(0.4％、0.2％、注射用水)，溶液为非澄清透明液体，整体状态为悬浊液，随着盐浓度的下降，重组人溶菌酶悬浊状态逐渐增加，纯水中的重组人溶菌酶悬浊状态最为明显，同时，蛋白含量及抑菌活性也呈递减趋势，主要是由于重组人溶菌酶在低于0.6％氯化钠含量溶液中的溶解不完全，氯化钠含量越低，溶解度越低，在检测时经0.22μm滤器过滤，不溶的蛋白被过滤掉，滤液中测得的只是溶解的蛋白含量及对应的抑菌数据；该结果也显示重组人溶菌酶在纯水中可少量溶解，溶解度有限；在0.6％氯化钠含量以上的溶液中，3.0mg/mL的重组人溶菌酶是可以完全溶解的，蛋白含量及抑菌活性稳定一致。

表2重组人溶菌酶溶解性与溶液中氯化钠含量的统计结果

实施例6:重组人溶菌酶抑菌活性与pH的关系

1.材料与仪器

1.1试验材料按实施例1制备的重组人溶菌酶冻干粉

1.2试验仪器紫外分光光度计，精度万分之一克的电子天平

2.试验方法

用电子天平准确称取7份0.0300g的重组人溶菌酶冻干粉；分别置于7个10mL量瓶中，每个量瓶中分别加入pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸盐缓冲液(0.02M磷酸盐0.10M的氯化钠溶液)定容至刻度，获得7个不同pH、含量均为3.0mg/mL重组人溶菌酶溶液，再将这7份溶液用相对应pH的磷酸盐缓冲液分别稀释成含量为1.5mg/mL、0.75mg/mL的重组人溶菌酶溶液，由此获得3种含量，每种含量对应7个不同pH的重组人溶菌酶溶液，用实施例2中生物学活性-效价测定法(测定法中的磷酸盐缓冲液按本试验中不同的pH称取相应的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠进行配制)测定21个样品的抑菌活性。

3.试验结果

不同pH条件下的重组人溶菌酶抑菌活性统计结果见表3。从试验数据可以看出，相同pH条件下重组人溶菌酶含量0.75mg/mL、1.5mg/mL、3.0mg/mL与抑菌活性呈对应的比例关系；同一含量不同pH条件下均显示在pH6.5时重组人溶菌酶的抑菌活性最好，pH6.0抑菌活性次之，大于或小于pH6.5，随着pH的变化其抑菌活性均成下降趋势，随着pH增加越接近重组人溶菌酶的等电点9.24，溶解性及稳定性越低，抑菌活性下降更为明显。

表3重组人溶菌酶抑菌活性与pH的统计结果

下述实施例7至实施例11中采用的各原料的来源如下：

重组人溶菌酶为实施例1中制备的重组人溶菌酶；

重组人表皮生长因子为实施例3中制备的重组人表皮生长因子；

透明质酸钠购于华熙福瑞达生物医药有限公司，滴眼液级玻璃酸钠原料药，国药准字H20113379。

十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠均购于国药集团。

注射用水，申请人自制，常规方法。

实施例7

本实施例中的人工泪液的组成如表4所示。

本实施例中的人工泪液的制备方法是：

(1)称取10.0g透明质酸钠，加入到9870.8g注射用水中，搅拌约3小时至透明质酸钠完全溶解，得到透明质酸钠溶液，备用。

(2)分别称取20.0g十二水合磷酸氢二钠、9.0g二水合磷酸二氢钠和75.0g氯化钠，加入到透明质酸钠溶液中，搅拌至辅料全部溶解，得到辅料溶液，备用。

(3)称取15.0g重组人溶菌酶冻干粉和0.2g重组人表皮生长因子冻干粉，加入到辅料溶液中，搅拌至全部溶解，用浓度为5％(W/W)的盐酸调节溶液pH至6.5±0.1；冰点渗透压仪检测，搅拌均匀的人工泪液渗透压应在285-310mOsmol/kg范围内。

(4)将人工泪液用0.22μm除菌过滤器在过滤操作压力为0.35-0.40MPa的条件下过滤除菌，随后将无菌药液输送至已灭过菌的物料储罐内。

(5)在无菌滴眼液生产车间内，塑料粒子在注塑机内经挤压热融后(170-230℃、350bar(1bar＝0.1MPa))制成塑料容器，将步骤(4)中配制好的无菌药液通过吹灌封一体机在A级层流保护下灌入容器中并封口，灌装规格为0.8mL/支。随后，将无菌灌装好的产品，检验，包装，入库。

本实施例的人工泪液为日剂量包装，使用时即开即用，单支24小时内用完。

实施例8至实施例11

实施例8至实施例11的人工泪液的组成如表4所示。

实施例8至实施例11的人工泪液的制备方法与实施例7相同，区别仅在于按照表4中的组成对各组分的量进行相应调整。

表4(单位：g)

	实施例7	实施例8	实施例9	实施例10	实施例11
						重组人溶菌酶	15.0	60.0	7.5	15.0	60.0
重组人表皮生长因子	0.2	0.8	0.2	0.2	0.4
						透明质酸钠	10.0	60.0	10.0	30.0	20.0
十二水合磷酸氢二钠	20.0	40.0	20.0	20.0	40.0
						二水合磷酸二氢钠	9.0	18.0	9.0	9.0	18.0
氯化钠	75.0	140.0	76.0	72.0	148.0
						注射用水	9870.8	19681.2	9877.3	9853.8	19713.6

实施例12：人工泪液质量标准检测

1.性状：实施例7至实施例11制备的人工泪液为无色澄清液体。

2.pH值：分别取各实施例的样品10mL，照《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0631中pH值检查法测定，pH为6.5±0.1。

3.渗透压摩尔浓度：分别取各实施例的样品1mL，照《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0632中渗透压摩尔浓度测定法，冰点渗透压仪测定，结果为285-310mOsmol/kg。

4.可见异物：依可见异物检查法(第一法灯检法)测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0904)，符合眼用液体制剂规定。

5.装量：标示量0.8mL/支，平均装量不少于标示装量，每个容器装量均不少于标示装量。依法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0105，取供试品10个，将内容物分别倒入经标化的量筒内，检视，每个装量与标示量相比较均不少于标示装量。

6.重组人溶菌酶生物学活性：采用实施例2中记载的方法进行测定，人工泪液的重组人溶菌酶生物学活性检查为标示量的70％-200％。

7.重组人表皮生长因子生物学活性：采用实施例4中记载的方法进行测定，人工泪液的重组人表皮生长因子生物学活性检查均为标示量的70％-200％。

8.透明质酸钠含量测定：

(1)对照品溶液的制备取经60℃减压干燥至恒重的葡萄糖醛酸对照品60mg，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10mL，置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

(2)供试品溶液的制备取人工泪液1-2支，精密量取0.7mL，置10mL量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀。

(3)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置25mL具塞试管中，依次分别加水至1.0mL，混匀，冰浴中冷却，并在不断振摇下缓缓滴加0.025mol/L硼砂硫酸溶液5.0mL，密塞，沸水浴加热10分钟(中间振摇一次)，迅速冷却，加0.125％咔唑无水乙醇溶液0.2mL，摇匀，沸水浴中加热15分钟(中间振摇一次)，冷却。照紫外-可见分光光度法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0401)，以0管为空白，在530nm的波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的μg数对相应的吸光度计算回归方程。

(4)测定法精密量取供试品溶液1mL，置25mL具塞试管中，自“冰浴中冷却”起照标准曲线制备项下的方法测定，由回归方程计算葡萄糖醛酸的含量，乘以2.0675，即得。

重复测定3次，取平均值计算透明质酸钠含量。透明质酸钠含量应为标示量的90％-110％。

9.无菌检查：经薄膜过滤法处理，依无菌检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1101)，应无菌。

通过检测，实施例7至实施例11制备的人工泪液均为合格品。

实施例13：人工泪液中重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的配伍稳定性研究试验

1.试验材料

供试品1：按实施例7制备，不添加重组人溶菌酶及重组人表皮生长因子的空白基础液；

供试品2：按实施例7制备，仅添加重组人溶菌酶，不添加重组人表皮生长因子；

供试品3：按实施例7制备，仅添加重组人表皮生长因子，不添加重组人溶菌酶；

供试品4：按实施例7制备。

2.试验方法

根据人工泪液质量标准对供试品1-4分别进行性状、pH、渗透压、无菌、抑菌活性及促细胞增值活性检测，统计结果见表5。

表5各供试品抑菌活性及促增值活性试验结果

3.结果

结果显示，供试品1-4的性状、pH、渗透压、无菌几项检测合格且无差异；供试品1无抑菌活性，无促细胞增殖活性；供试品2的抑菌活性与供试品4无明显差异；供试品3的促细胞增殖活性与供试品4无明显差异。即重组人溶菌酶与重组人表皮生长因子在本发明条件下组成的复方制剂中，两种生物活性蛋白的配伍稳定性良好。

实施例14：人工泪液的强制高频振动试验

通过强制破坏性试验，考察人工泪液在高频次振动过程中的两种活性蛋白的稳定性特征。将实施例7制备的人工泪液样品，置于25℃，200转/min的恒温摇床内持续摇晃振动，定期每周取样进行性状、pH、渗透压、无菌、抑菌活性及促细胞增值活性检测。统计结果见表6。

表6人工泪液振动稳定性试验结果

经过8周的强制破坏性高频振动试验，人工泪液中重组人溶菌酶抑菌活性6周开始呈下降趋势，重组人表皮生长因子促细胞增殖活性5周开始呈下降趋势；其余检测项无明显变化。因此，本品在运输过程中应避免长时间高频振动；总体评价在高频振动的4周以内本人工泪液中重组人溶菌酶及重组人表皮生长因子的配伍稳定性良好。

实施例15：人工泪液的长期稳定性及加速试验

人工泪液在上市规定的贮存条件下进行稳定性试验，考察人工泪液在保存过程中的稳定性特征，从而作为确定有效期和贮存条件的依据。将实施例7制备的人工泪液样品，分别置于4℃，25℃，37℃，湿度45％-65％，避光条件下贮存。定期取样进行性状、pH、渗透压、无菌、抑菌活性及促细胞增值活性检测。长期稳定性试验样品第一年内前6个月每月检测一次，后6个月每3个月检测一次，第二年内每6个月检测一次。37℃加速试验样品每月检测。4℃，25℃和37℃稳定性试验统计结果分别如表7、表8和表9所示。

表7人工泪液长期稳定性试验结果统计(4℃)

表8人工泪液长期稳定性试验结果统计(25℃)

表9人工泪液加速试验稳定性结果统计(37℃)

结果：经长期稳定性24个月的试验，结果显示4℃放置的24个月样品与0月的相比，各项指标无明显变化；25℃放置的样品24个月与0月的相比，重组人表皮生长因子促细胞增殖活性略微下降，但仍在合格范围之内。加速试验12个月结果显示37℃放置的样品与0月相比，8个月后重组人溶菌酶抑菌活性开始下降，渗透压开始升高，6个月后重组人表皮生长因子促细胞增殖活性开始下降；总体到9个月不合格；因此本人工泪液在25℃以下24个月稳定性良好，在以上所述条件下生产、运输、长期储存不会对本品的质量产生不利影响，可保证临床用药的安全性及有效性。

实施例16：人工泪液在苯扎氯铵诱导的大鼠干眼伴重度角膜损伤模型上的药效学试验

1.材料与试剂

1.1试验材料

1.1.1透明质酸钠对照品溶液(按实施例7制备，不添加重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子)

名称：透明质酸钠对照品溶液

规格：0.8mL/支

重组人溶菌酶：0mg；

重组人表皮生长因子：0mg；

透明质酸钠：0.8mg；

外观：无色透明澄清液体。

储存条件：室温(25℃以下)保存。

1.1.2重组人溶菌酶对照品溶液(按实施例7制备，不添加透明质酸和重组人表皮生长因子)

名称：重组人溶菌酶对照品溶液：

规格：0.8mL/支

重组人溶菌酶：1.2mg:120000U；

重组人表皮生长因子：0mg/mL；

透明质酸钠：0mg；

外观：无色透明澄清液体。

储存条件：室温(25℃以下)保存。

1.1.3重组人表皮生长因子滴眼液(商品名：易贝)

生产厂家：桂林华诺威基因药业有限公司

规格：20000IU(40微克)/2毫升/支；

储存条件：4℃-25℃保存。

1.1.4按实施例7制备的人工泪液。

规格：0.8mL/支

重组人溶菌酶：1.2mg:120000U

重组人表皮生长因子：16μg:8000IU

透明质酸钠：0.8mg；

外观：无色透明澄清液体。

储存条件：室温(25℃以下)保存。

1.2试验动物：SD大鼠，体重193g-235g，雌雄兼用，购于第四军医大学动物实验中心。

2.试验设计及方法

2.1干眼并伴有重度角膜损伤动物模型的建立及评价

2.1.1模型的建立

构建化学抑菌剂造成的大鼠干眼及角膜损伤模型，用0.1％苯扎氯铵点眼，双眼均点药造模，一天3次，每只眼每次1滴(约35μL)，连续点眼10天。

2.1.2模型的评价

24只SD大鼠分别于建模前，建模10天进行泪液分泌试验、裂隙灯下荧光素钠染色观察。

2.1.2.1泪液分泌试验

将大鼠眼表先滴入表麻，计时一分钟后用泪液试纸(将5mm×35mm的泪液检测试纸用裁纸刀裁剪成2.0mm×35mm)，将一端折弯5mm，***大鼠下眼睑的中外三分之一处，其余部分自然悬垂，计时五分钟，测量滤纸被泪水渗湿的长度。10mm/5min以上为正常分泌，低于5mm/5min为干眼。

2.1.2.2角膜上皮荧光素钠染色

用移液枪吸取10微升1％的荧光素钠滴至大鼠结膜囊，手动令大鼠瞬目使得荧光素均匀分布于大鼠眼表面，固定眼睑，于钴蓝灯下拍照记录，观察角膜上皮着染情况。评分方法参考干眼症临床诊疗规范专家共识(2013年)采用12分法：角膜分为4个象限，每个象限0-3分，无染色为0分，1-30个点状着色为1分，＞30个点状着色但染色未融合为2分，3分为出现角膜点状着色融合、丝状物及溃疡等。

2.2人工泪液药效评价

2.2.1试验分组

建模成功后，将SD大鼠分为透明质酸钠对照品组、重组人溶菌酶对照品组、重组人表皮生长因子对照品组、人工泪液组，每组6只，共24只。

2.2.2治疗方案

所有试验组SD大鼠左眼自然恢复，各组右眼对应滴加透明质酸钠对照品、重组人溶菌酶对照品、重组人表皮生长因子对照品、人工泪液；

途径：眼眶内滴入。

频率：3次/日。

体积：1滴(约35μL)/只眼。

周期：连续给药5天。

2.2.3检测指标

在连续给药5天后，进行泪液分泌试验、裂隙灯下荧光素钠染色观察(方法同上)。试验结束后脱椎处死大鼠，摘取眼球后在视网膜部位扎孔，于固定液中固定2小时后，去除角膜巩膜缘后眼球后半部分，继续固定24小时后，进行常规脱水，石蜡包埋，切片制作，并进行HE染色，显微镜下进行组织学观察。

2.3统计分析

计量数据按组别计算平均值和标准差，再进行方差分析。

3.结果

3.1化学抑菌剂造成的大鼠干眼及角膜损伤模型的评价

3.1.1泪液分泌试验

大鼠双眼造模前与造模后相比，泪液滤纸被泪水浸湿的长度比较差异非常显著(p<0.01)(如表10所示)。

3.1.2角膜上皮荧光素钠染色

造模前荧光素钠染色及拍照，如图1a至图1d所示，所有大鼠左右眼均无明显着色，角膜均正常。造模10天后，荧光素钠染色及拍照，如图2a至图2d所示，所有大鼠左右眼角膜均出现明显损伤。根据评分标准，大鼠双眼造模前与造模后相比等级评分差异非常显著(p<0.01)(如表11所示)。

3.1.3小结

通过泪液分泌试验、荧光素染色观察、大鼠双眼造模前后差异非常显著，均有统计学意义，造模成功。

3.2人工泪液药效评价

3.2.1泪液分泌试验

透明质酸钠对照品组、人工泪液组右眼用药5天后泪液滤纸被泪液浸湿的长度均显著延长，与本组自然恢复的左眼比较有显著差异(p<0.05)；重组人溶菌酶对照品组、重组人表皮生长因子对照品组左右眼泪液滤纸被泪液浸湿的长度无明显差异；治疗的右眼，人工泪液组泪液滤纸被泪液浸湿的长度显著增长，与其它三组比较有显著差异(p<0.05)(如表12所示)。

3.2.2角膜上皮荧光素钠染色

如图3a至图3d所示，经过5天的治疗，透明质酸钠对照品组、重组人溶菌酶对照品组、重组人表皮生长因子对照品组的大鼠右眼仍有一定面积的片状荧光素钠着染；人工泪液组大鼠右眼角膜染色基本无明显着色，裂隙灯下检测为少量点状损伤，然而人工泪液组大鼠右眼角膜仍可见白色混浊、透光度差(对比造模前拍照结果)。根据评分标准，透明质酸钠对照品组、重组人表皮生长因子对照品组、人工泪液组右眼用药后与本组自然恢复的左眼比较有显著差异(p<0.05)；人工泪液组右眼与其它三组右眼比较有显著差异(p<0.05)(如表13所示)。

3.2.3组织学检查

治疗5天后，病理组织切片可见各组自然恢复的左眼，角膜荧光素钠着染处(大部分位于角膜中央处)上皮细胞层变薄或完全缺失，基质层皱缩、规则的弹性纤维结构变紊乱，甚至有炎性细胞浸润；如图4a至图4d所示，治疗的透明质酸钠对照品组、重组人溶菌酶对照品组、重组人表皮生长因子对照品组右眼角膜荧光素钠着染处上皮细胞层有一定恢复，但仍旧较薄；而人工泪液组大鼠右眼角膜上皮细胞层虽仍有紊乱趋势，但细胞数量及角膜上皮厚度恢复较好；然而人工泪液组大鼠右眼角膜基质层纤维排列错乱、结构不规则的现象仍能观察。

4.结论

以上结果说明：(1)滴眼液中常用的化学抑菌剂苯扎氯铵(浓度0.1％)在眼部长时间使用会造成干眼，并且对角膜上皮细胞造成损伤；(2)5天的治疗周期人工泪液对苯扎氯铵诱导的角膜损伤虽无法完全治愈，但相对于透明质酸钠对照品组、重组人溶菌酶对照品组、重组人表皮生长因子对照品组，该人工泪液对0.1％苯扎氯铵造成的大鼠干眼及重度角膜损伤模型，具有改善其泪液分泌数量、促进角膜上皮细胞修复显著有效并更优效的效果。

表10造模前与造模后泪液滤纸被泪水浸湿的长度(mm)

组别	n	造模前	造模10天后
				左眼	24	12.86±2.65	3.55±1.37<sup>**</sup>
右眼	24	12.41±3.08	3.38±1.63<sup>**</sup>

注：造模前与造模后进行比较，^**p<0.01

表11造模前与造模后角膜上皮荧光素钠染色等级评分

组别	n	造模前	造模10天后
				左眼	24	1.11±0.33	12.00±0.00<sup>**</sup>
右眼	24	1.17±0.38	12.00±0.00<sup>**</sup>

注：造模前与造模后进行比较，^**p<0.01

表12治疗5天后泪液分泌试验结果(mm)

注：n＝6。与同组左眼比较，^*p<0.05；与透明质酸钠对照组右眼比较，^#p<0.05；

与重组人溶菌酶对照品组右眼比较，^△p<0.05；与重组人表皮生长因子对照品组右眼比较，⁺p<0.05。

表13治疗5天后角膜上皮荧光素钠染色等级评分

注：n＝6。与同组左眼比较，^*p<0.05；与透明质酸钠对照组右眼比较，^#p<0.05；

与重组人溶菌酶对照品组右眼比较，^△p<0.05；与重组人表皮生长因子对照品组右眼比较，⁺p<0.05。

实施例17：人工泪液人体干眼药效学试验

1.试验材料

对照品：

重组人表皮生长因子滴眼液(商品名：易贝)

生产厂家：桂林华诺威基因药业有限公司

规格：20000IU(40微克)/2毫升/支；

储存条件：4℃-25℃保存。

供试品：按实施例7制备的人工泪液。

规格：0.8mL

重组人溶菌酶：1.2mg:120000U

重组人表皮生长因子：16μg:8000IU

透明质酸钠：0.8mg；

外观：无色透明澄清液体。

储存条件：室温(25℃以下)保存。

2.试验设计及方法

2.1试验对象

选择试验人员44名，其中男14名，女30名，年龄37-50岁，入选标准为：①长期面对电脑工作、用眼过度的工作岗位职员，如财务、法务、办公行政、质检岗位灯检人员等；②眼部有明显的发痒，眼干涩，畏光，眼疲劳，异物感，烧灼感，酸胀感，眼阵痛、眼睛发红、眼睑及眼球结膜充血等自觉不适症状的人员。③排除对象：患有全身性疾病，应用过糖皮脂激素类药，非类固醇类抗炎药及免疫抑制剂的人员。

2.2试验方法

44名试验人员左眼用重组人表皮生长因子滴眼液治疗15天，4次/天，1滴/次；右眼用人工泪液治疗15天，4次/天，1滴/次。用药后的第5、10、15天对试验人员进行观察及自觉症状进行统计。

2.3数据统计

44名试验人员治疗前后进行干眼症状问卷计分调查，问卷计分项包括发痒，眼干涩，畏光，眼疲劳，异物感，烧灼感，酸胀感，眼阵痛、眼睛发红、眼睑及眼球结膜充血等10项，均以其严重程度及持续时间从轻到重以0-4分分别对左右眼进行计算，所有数据采用SPSS20软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，采用t检验进行比较，p<0.05为差异具有统计学意义。

3.试验结果

在本试验条件下，治疗前44名试验人员左右眼自觉症状计分统计无明显差异；治疗5天、10天、15天试验人员自觉主诉左右眼均有明显差异，数据统计结果右眼相对于左眼差异明显(结果如表14所示)，具有统计学意义。

相对于对照品重组人表皮生长因子滴眼液，供试品人工泪液可以明显有效并更优效的改善由于人们工作生活中用眼过度，瞬目次数下降导致的泪液分泌不足型干眼症的相关症状，促进角膜损伤细胞的修复。

表14自觉干眼症状问卷计分统计结果

	治疗前	治疗5天	治疗10天	治疗15天
					左眼	23.6±2.83	21.7±3.66	18.6±4.03	15.5±3.73
右眼	24.1±2.04	16.7±3.92<sup>*</sup>	10.1±3.33<sup>*</sup>	8.66±2.25<sup>*</sup>

注：n＝44。右眼与左眼比较，^*p<0.05。

序列表

<110> 陕西慧康生物科技有限责任公司

<120> 含有重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的新型人工泪液

<130> GAI18CN3411

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> 人溶菌酶()

<400> 1

Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly

1 5 10 15

Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala

20 25 30

Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly

35 40 45

Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp

50 55 60

Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser

65 70 75 80

Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala

85 90 95

Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp

100 105 110

Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys

115 120 125

Gly Val

130

<210> 2

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ctcgagaaaa gaaaggtctt tgaaaggtgt gagttggcca gaactctgaa aagattggga 60

atggatggct acaggggaat cagcctagca aactggatgt gtttggccaa atgggagagt 120

ggttacaaca cacgagctac aaactacaat gctggagaca gaagcactga ttatgggata 180

tttcagatca atagccgcta ctggtgtaat gatggcaaaa ccccaggagc agttaatgcc 240

tgtcatttat cctgcagtgc tttgctgcaa gataacatcg ctgatgctgt agcttgtgca 300

aagagggttg tccgtgatcc acaaggcatt agagcatggg tggcatggag aaatcgttgt 360

caaaacagag atgtccgtca gtatgttcaa ggttgtggag tgtaagaatt c 411

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gcctcgagaa aagaaaggtc tttgaaaggt gtga 34

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cggaattctt acactccaca accttgaa 28

<210> 5

<211> 53

<212> PRT

<213> 人表皮生长因子()

<400> 5

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1 5 10 15

Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn

20 25 30

Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Arg

50

<210> 6

<211> 182

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ctcgagaaaa gaaactctga ctctgaatgt ccattgtctc acgacggtta ctgtttgcac 60

gacggtgttt gtatgtacat cgaagctttg gacaagtacg cttgtaactg tgttgttggt 120

tacatcggtg aaagatgtca atacagagac ttgaagtggt gggaattgag ataagcggcc 180

gc 182