一种含有重组人溶菌酶的新型人工泪液
阅读说明：本技术 一种含有重组人溶菌酶的新型人工泪液 (Novel artificial tear containing recombinant human lysozyme ) 是由 史瑾 侯增淼 高恩 李晓颖 杨小琳 赵金礼 于 2018-06-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种含有重组人溶菌酶的新型人工泪液。该新型人工泪液包括主成分和辅料,所述主成分为重组人溶菌酶和透明质酸钠,以新型人工泪液的总质量计,重组人溶菌酶和透明质酸钠的含量分别为0.075％-0.300％、0.10％-0.30％。本发明将重组人溶菌酶、透明质酸钠与辅料有效结合,经过眼部外用药物给药,对轻、中度干眼症引起的眼部泪液分泌量下降,眼部干涩,轻微炎症,轻度角结膜损伤等有明显的治疗改善作用。(The invention provides a novel artificial tear containing recombinant human lysozyme. The novel artificial tear comprises a main component and an auxiliary material, wherein the main component comprises recombinant human lysozyme and sodium hyaluronate, and the content of the recombinant human lysozyme and the content of the sodium hyaluronate are respectively 0.075-0.300% and 0.10-0.30% based on the total mass of the novel artificial tear. The invention effectively combines the recombinant human lysozyme, the sodium hyaluronate and the auxiliary materials, and has obvious treatment and improvement effects on eye tear secretion reduction, eye dryness, slight inflammation, mild keratoconjunctival injury and the like caused by light and moderate xerophthalmia through the administration of the eye external medicine.)
技术领域
本发明涉及一种含有重组人溶菌酶的新型人工泪液，属于医药技术领域。
背景技术
眼部炎症、眼部干涩、眼疲劳等症在人们的日常生活中最为常见，随着人们工作压力的增加，电子产品的日益更新，越来越长时间的使用电脑，手机，导致患上干眼及干眼综合症的几率在不断增加。据统计，近年来城市中干眼病人正以每年10％-20％的速度快速增加，人群发病率最高达到30％。研究发现，长期每天面对电脑荧光屏9小时以上的人士，眼部病患的几率是其他人的两倍；近视患者长期面对电脑，更是眼部干涩疾患的高危人士；人们在一般情况下1分钟眨眼约20次，使用电脑或手机时，因过于凝神注目，每分钟眨眼次数减少到6次，且不断调整焦距以保证视物清晰，长时间高强度的用眼，加之电子屏幕所发出的各种射线会严重刺激眼睛，导致泪分泌减少和泪成分变质，进而成为干眼症，伴有眼球表面干燥，出现充血、眼睛疲劳、视力降低、视物模糊等不适感觉。
干眼症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和/或眼表组织病变特征的多种疾病的总称。干眼的分级程度在临床上可分为轻度、中度、重度，虽然目前国内外尚无分级的金标准。但是，通常来说，轻度主要是有主观症状，检查主要是体征检查，询问病史；中度是有主观症状，主要检查泪膜破裂时间，角膜荧光素染色，有轻微的角结膜上皮损伤；重度主要是泪膜破裂时间小于5秒，泪液分泌量严重下降，角结膜荧光素染色着色明显，角膜上皮细胞损伤等。
人体天然泪液是由人体泪腺等器官分泌的一种透明液体，由无机盐、多糖、蛋白、脂质等多种物质组成，具有屏障、抑菌、杀菌及免疫调节等多种功能，对于保护眼球、营养眼表组织及完善视觉功能等方面起着重要作用。目前市场上针对多种原因引起的泪液分泌不足型干眼症的人工泪液产品，以基本的补充液体，保湿为主，产品本身有成分单一、低渗等特点，这些产品虽然能暂时缓解眼睛干燥不适，但同时也会对干眼症眼表本身就偏低的多种泪液成分再次造成稀释，如泪液中的无机盐，脂质转运蛋白，溶菌酶，乳铁蛋白等，使眼球表面的泪膜更加不稳定，杀菌及免疫调节功能再次下降。
另一方面，市场上针对眼干、眼涩、眼疲劳等眼睛不适症状的人工泪液产品中，很多会添加化学抑菌剂，该类产品在短时间内使用效果良好，但长期接触抑菌剂可能引发过敏、干眼等刺激症状，损伤角膜或结膜并阻碍它们愈合，还可能引起医源性角膜炎等。众多的试验证明，眼药水中的抑菌剂有细胞毒性作用，它可影响细胞的功能和正常代谢，如果长期使用可造成眼表组织的损伤，并降低眼睛对眼药水的耐受性。有的还形成久治不愈的药物性结膜炎和药物性干眼症。一些临床调查显示：点用含抑菌剂的眼药水的患者，出现眼部异物感、刺痛感、灼热感等不适症状者，较点用不含抑菌剂的患者高了2.5倍，发生眼红、眼干涩症状的患者多达2倍以上。同样这些患者在换用不含抑菌剂的眼药水之后，症状则明显缓解或逆转。另外一项调查显示，由于眼药水中抑菌剂的刺激性使许多患者的治疗依从性降低，主动减少了点眼药水的次数，从而影响了临床治疗效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种治疗临床上常见的视频终端综合性轻、中度干眼症的新型人工泪液。
为达到上述目的，本发明提供了一种含有重组人溶菌酶的新型人工泪液，其包括主成分和辅料，所述主成分为重组人溶菌酶和透明质酸钠，以新型人工泪液的总质量计，重组人溶菌酶和透明质酸钠的含量分别为0.075％-0.300％、0.10％-0.30％。
根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述新型人工泪液中，所采用的重组人溶菌酶与人体天然溶菌酶的氨基酸序列是完全一致的。虽然当前已有将溶菌酶用于眼部药剂的报导，目前的溶菌酶多是蛋清提取的溶菌酶，是鸡溶菌酶，在氨基酸组成上和人的溶菌酶是有差异的，相对于人体来说是异源性的，将其用于人体往往会造成耐药性、免疫反应、过敏反应等副作用。本发明采用的重组人溶菌酶(recombinant human lysozyme，rhLYZ)可以是通过微生物发酵法获得的，优选通过表达人溶菌酶的毕赤酵母工程菌发酵纯化后获得，性状为白色冻干粉，分子量14700D，纯度大于98％，获得的重组人溶菌酶氨基酸序列与天然人溶菌酶氨基酸序列100％相同，对人体来说是同源性的。氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述新型人工泪液中，以人工泪液的总质量计，所述重组人溶菌酶的含量为0.150％-0.300％。
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述新型人工泪液的pH值为6.4-6.6，更优选为6.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述新型人工泪液中，所述辅料包括pH稳定剂；更优选地，所述pH稳定剂包括柠檬酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、枸橼酸钠或者由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠构成的缓冲液。当所述pH稳定剂为由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠构成的缓冲液时，可以将人工泪液的pH值稳定在6.5，保证人工泪液的最佳抑菌效果及配方的稳定，同时更接近天然泪液的pH值，对眼部无刺激。优选地，磷酸氢二钠为十二水合磷酸氢二钠，所述磷酸二氢钠为二水合磷酸二氢钠，更优选地，二者的质量比为20：9。
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述新型人工泪液的渗透压摩尔浓度为285-310mOsmol/kg，与人体泪液等渗。高渗溶液在眼内可使眼角膜失去水分，加重眼部干涩症状，低渗溶液则能使角膜组织细胞胀大甚至破裂，而等渗的溶液体系可以有效保护眼部组织细胞的正常生理状态，减轻干眼的症状。
根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述新型人工泪液中，所述辅料还包括氯化钠。本发明的新型人工泪液将氯化钠的含量优选控制为0.70％-0.76％(氯化钠的含量以纯固体计)，可以同时保证重组人溶菌酶在人工泪液中具有良好的溶解性、活性、稳定性以及人工泪液的渗透压摩尔浓度为285-310mOsmol/kg，与人体泪液等渗。
根据本发明的具体实施方案，优选地，按照新型人工泪液的总量为10000-20000重量份计，该新型人工泪液包括：重组人溶菌酶7.5-60.0份，透明质酸钠10.0-60.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0-40.0份，二水合磷酸二氢钠9.0-18.0份，氯化钠70.0-152.0份，注射用水9841.0-19755.0份。更优选地，按照新型人工泪液的总量为10000重量份计，该新型人工泪液包括：重组人溶菌酶15.0-30.0份，透明质酸钠10.0-30.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0份，二水合磷酸二氢钠9.0份，氯化钠70.0-75.0份，注射用水9841.0-9871.0份。
根据本发明的具体实施方案，优选地，所述新型人工泪液可以具有以下具体组成：
按照新型人工泪液的总量为10000重量份计，该新型人工泪液包括：重组人溶菌酶7.5份，透明质酸钠10.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0份，二水合磷酸二氢钠9.0份，氯化钠76.0份，注射用水9877.5份；
或者，按照新型人工泪液的总量为10000重量份计，该新型人工泪液包括：重组人溶菌酶15.0份，透明质酸钠10.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0份，二水合磷酸二氢钠9.0份，氯化钠75.0份，注射用水9871.0份；
或者，按照新型人工泪液的总量为10000重量份计，该新型人工泪液包括：重组人溶菌酶15.0份，透明质酸钠30.0份，十二水合磷酸氢二钠20.0份，二水合磷酸二氢钠9.0份，氯化钠72.0份，注射用水9854.0份；
或者，按照新型人工泪液的总量为20000重量份计，该新型人工泪液包括：重组人溶菌酶60.0份，透明质酸钠20.0份，十二水合磷酸氢二钠40.0份，二水合磷酸二氢钠18.0份，氯化钠148.0份，注射用水19714.0份；
或者，按照新型人工泪液的总量为20000重量份计，该新型人工泪液包括：重组人溶菌酶60.0份，透明质酸钠60.0份，十二水合磷酸氢二钠40.0份，二水合磷酸二氢钠18.0份，氯化钠140.0份，注射用水19682.0份。
针对近年来人们工作生活中大量使用电脑、手机等各类电子产品造成瞬目次数减少，泪液蒸发过强，从而引起的临床上常见的视频终端综合性轻、中度干眼症，本发明提供的新型人工泪液具有增强泪液分泌数量，改善泪液分泌性质，减轻干眼症状，促进角膜损伤细胞修复的优异功效，主要应用于治疗临床上常见的视频终端综合性轻、中度干眼症。本发明的新型人工泪液无菌，不含任何化学抑菌剂，无防腐剂，可以与人体泪液等渗，具有维持眼表生理环境、抑菌的功能，更接近人体天然泪液，可以采用日剂量包装，单支24小时内用完，使用安全，有效。
本发明提供的新型人工泪液可以是采用包括以下步骤的制备方法制备的：
(1)将透明质酸钠加入到注射用水中，使透明质酸钠完全溶解，获得透明质酸钠溶液；
(2)向透明质酸钠溶液中加入十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和氯化钠，使其完全溶解，获得辅料溶液；
(3)向辅料溶液中加入重组人溶菌酶冻干粉，使重组人溶菌酶冻干粉完全溶解，随后调节溶液pH值至6.5±0.1，获得新型人工泪液；
(4)将人工泪液过滤除菌。
上述制备方法可以按照以下具体操作步骤进行：
(1)制备透明质酸钠溶液
按照比例将透明质酸钠加入到注射用水中，搅拌(例如约3小时)使透明质酸钠完全溶解，获得透明质酸钠溶液。
(2)制备辅料溶液
按照比例向透明质酸钠溶液中加入十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和氯化钠，搅拌至其完全溶解，获得辅料溶液。
(3)制备人工泪液
按照比例向辅料溶液中加入重组人溶菌酶冻干粉，搅拌至重组人溶菌酶冻干粉完全溶解，随后调节溶液pH值至6.5±0.1(例如采用浓度为5％(W/W)的盐酸调节溶液pH)。采用冰点渗透压仪检测，搅拌均匀的人工泪液渗透压摩尔浓度应在285-310mOsmol/kg范围内。
(4)过滤除菌
采用过滤除菌法对人工泪液进行除菌，优选地，采用0.22μm除菌过滤器进行过滤除菌，并且，过滤除菌采用的过滤操作压力可以控制为0.35-0.40MPa。过滤除菌之后，将无菌的人工泪液输送至已灭过菌的物料储罐内。
(5)灌装
采用吹灌封三合一无菌灌装技术进行灌装。吹灌封三合一技术(Blow-Fill-Seal，BFS)是指：在无菌滴眼剂生产车间内，塑料粒子在注塑机内经挤压热融后(170-230℃、350bar(1bar＝0.1MPa))制成塑料容器，将配制好的无菌药液通过吹灌封一体机在A级层流保护下灌入容器中并封口，灌装规格可以由本领域技术人员根据实际需要来确定，例如灌装规格是0.8mL/支；瓶体吹塑、药液灌装、制剂封口都是在一套连续的无菌生产工序中完成。
上述各步骤中，所有用于物料输送的管道必须预先通过灭菌处理。
目前常用人工泪液多为大剂量包装，使用过程中反复开启，长时间使用易造成细菌等病原微生物的二次污染，所以都会添加相关的化学抑菌剂以保证使用过程中的产品质量。大量的临床数据和研究资料表明，眼科治疗过程中产生的不良反应很多时候是抑菌剂造成的，已有研究证实抑菌剂的确会造成角膜上皮细胞损伤，过敏及眼部干涩等症状。为保证本发明的人工泪液在使用过程中的安全性及实用性，可以灌装为日剂量包装，例如0.8mL/支，使用时即开即用，单支24小时内用完，通过日剂量包装使得人工泪液在使用过程中不易造成二次污染。
本发明的人工泪液为局部外用无菌制剂，重组人溶菌酶为活性蛋白，在原辅料配制好后选择终端过滤法除菌，无菌液进行无菌灌装，在保证人工泪液为无菌制剂的同时，可以保证重组人溶菌酶的活性，有效避免高温灭菌法易造成的溶菌酶失活。
相对于现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：
本发明的人工泪液采用重组人溶菌酶和透明质酸钠为主要成分，不含任何化学抑菌剂，长期使用不会对眼部造成任何损伤，无过敏反应，安全有效。
本发明将重组人溶菌酶，透明质酸钠与辅料有效结合，经过眼部外用药物给药，对轻、中度干眼症引起的眼部泪液分泌量下降，眼部干涩，轻微炎症，轻度角结膜损伤等有明显的治疗改善作用。
附图说明
图1a至图1d显示了本发明的人工泪液纸片扩散法的抑菌效果，其中，图1a是针对金黄色葡萄球菌的抑菌图，图1b是针对藤黄微球菌的抑菌图，图1c是针对枯草芽孢杆菌的抑菌图，图1d是针对大肠埃希菌的抑菌图。
图2显示了新西兰兔手术眼泪液蕨样结晶试验。
图3显示了新西兰兔手术眼角膜上皮荧光素钠染色结果。
图4显示了新西兰兔用药1周各组泪液蕨样结晶形态。
图5显示了新西兰兔用药2周各组泪液蕨样结晶形态。
图6显示了新西兰兔用药3周各组泪液蕨样结晶形态。
图7显示了新西兰兔用药4周各组泪液蕨样结晶形态。
图8显示了新西兰兔用药1周各组角膜上皮荧光素钠染色结果。
图9显示了新西兰兔用药2周各组角膜上皮荧光素钠染色结果。
图10显示了新西兰兔用药3周各组角膜上皮荧光素钠染色结果。
图11显示了新西兰兔用药4周各组角膜上皮荧光素钠染色结果。
图12显示了新西兰兔用药4周各组角膜上皮组织学显微照片(HE染色，200×)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明的人工泪液是发明人通过深入的理论、试验研究并付出创造性劳动而获得的，该人工泪液虽不能完全等同于人体天然泪液，但已具有泪液的基本特点，包括维持眼表生理环境(保湿，滋润眼球，等渗，稳定)，抑菌功能(实施例11抑菌试验显示对革兰氏阳性菌具有杀菌作用)，天然(无菌，无化学抑菌剂)等，可履行天然泪液的基本功能；人工泪液组方中各成分的选择及配比也具有良好的相互促进的协同作用。
首先，作为人工泪液的主成分之一的重组人溶菌酶为一种粘多糖溶解酶，是一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，是人眼免疫防御系统的重要组成部分，具有一定的抗菌消炎作用。外源性的滴加人溶菌酶可以更好的保护眼部，防止细菌感染及炎症的发生。并且，人溶菌酶为人体天然泪液中的固有物质，长期使用不会对人体产生任何毒副作用。经实施例13给出的人工泪液对家兔眼蒸发过强并伴有角膜上皮细胞损伤的干眼模型药效学试验表明，本发明的人工泪液疗效明显优于不含重组人溶菌酶，只含有透明质酸单一成分的市售人工泪液产品，并且还体现出最佳效果的重组人溶菌酶重量含量为0.150％-0.300％。
其次，作为人工泪液的主成分之二的透明质酸钠是非牛顿流体，具有良好的生物相容性，在增加药物黏度的同时克服了眼睑不易眨动的缺点。并且，透明质酸钠具有良好的保湿及润滑的作用，能够使干眼症患者眼部湿润清爽感觉舒适。正常情况下，眼表自然存在的透明质酸形成一层膜覆盖于角膜上皮表面，角膜上皮具有与透明质酸特异性结合位点。本发明的人工泪液中含有的透明质酸钠会形成一层膜覆盖于角膜上皮表面，使重组人溶菌酶可以长时间存留于眼表，发挥抑菌作用，减少外界病原微生物对角膜上皮细胞的侵害，促进受损细胞的自我修复。经实施例13给出的家兔眼蒸发过强并伴有角膜上皮细胞损伤的干眼模型药效学试验验证，本发明的人工泪液疗效明显优于不含透明质酸，只含有重组人溶菌酶单一成分的对照品溶液。
再次，发明人在重组人溶菌酶的制备纯化及试验过程中惊奇的发现，重组人溶菌酶的活性和稳定性与溶液中的氯化钠含量有一定的比例关系，重组人溶菌酶在溶液中的含量越高，完全溶解所需氯化钠的比例越高，经实施例3中重组人溶菌酶溶解性与溶液中氯化钠含量的研究试验验证，重组人溶菌酶的重量含量在0.300％时，在0.6％以下的氯化钠溶液中随着盐浓度的降低，重组人溶菌酶的溶解稳定性下降，呈悬浊状态，相应的含量与活性呈下降趋势，在0.6％至6％的氯化钠溶液中重组人溶菌酶的溶解稳定性与活性基本保持恒定；本发明的人工泪液中氯化钠的重量含量可以控制为0.70％-0.76％，可以同时保证重组人溶菌酶在人工泪液中具有良好的溶解性、活性、稳定性以及人工泪液的渗透压摩尔浓度为285-310mOsmol/kg，与人体泪液等渗。
此外，pH是人工泪液中非常重要的技术控制指标，关系到眼用制剂的稳定性、有效性和眼部刺激性。活性成分重组人溶菌酶等电点为9.24，在pH 5.0-8.0之间均有抑菌活性，实施例4给出的重组人溶菌酶抑菌活性与pH的研究试验显示其最佳抑菌活性的pH为6.5，本发明选用的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠配比可稳定人工泪液的pH在6.5±0.1，保证了重组人溶菌酶的最适活性条件，距离重组人溶菌酶等电点9.24相差2个pH以上，保证了人工泪液的长期稳定性，同时该pH的人工泪液对人体眼部无刺激。
综上所述，本发明的人工泪液中各组分的良好配比及相互协同作用，从整体上保证了人工泪液的长期稳定性(实施例12给出的稳定性试验结果表明本人工泪液在25℃以下长期保存，稳定性良好)，重组人溶菌酶的最佳活性，提高了其在眼表的生物利用度，稳定眼表的生理环境，保护了角膜细胞，促进了受损细胞的修复；有效治疗缓解轻、中度干眼症引起的眼部泪液分泌量下降，眼部干涩，轻微炎症等。经实施例13给出的家兔眼蒸发过强并伴有角膜上皮细胞损伤的干眼模型药效学试验表明，本发明的人工泪液与目前市场上现有的产品相比，具有明确有效并更优效的增强泪液分泌数量，改善泪液分泌性质，促进角膜损伤细胞修复的优异功效。
实施例1：重组人溶菌酶的制备
1.重组人溶菌酶菌种构建
1.1表达载体的构建
根据GenBank公布的人溶菌酶(LYZ)的序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物(引物序列见表1)，上游引物添加限制性内切酶Xho I酶切位点CTCGAG，以及Kex2酶切位点AAAAGA，下游添加限制内切酶EcoR I位点GAATTC。引入前述位点后的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:2)：
1 CTCGAGAAAA GAAAGGTCTT TGAAAGGTGT GAGTTGGCCA GAACTCTGAA AAGATTGGGA
61 ATGGATGGCT ACAGGGGAAT CAGCCTAGCA AACTGGATGT GTTTGGCCAA ATGGGAGAGT
121 GGTTACAACA CACGAGCTAC AAACTACAAT GCTGGAGACA GAAGCACTGA TTATGGGATA
181 TTTCAGATCA ATAGCCGCTA CTGGTGTAAT GATGGCAAAA CCCCAGGAGC AGTTAATGCC
241 TGTCATTTAT CCTGCAGTGC TTTGCTGCAA GATAACATCG CTGATGCTGT AGCTTGTGCA
301 AAGAGGGTTG TCCGTGATCC ACAAGGCATT AGAGCATGGG TGGCATGGAG AAATCGTTGT
361 CAAAACAGAG ATGTCCGTCA GTATGTTCAA GGTTGTGGAG TGTAAGAATT C
表1引物序列及退火温度
以人皮肤cDNA为模板，以设计的LYZ-XU和LYZ-EL为引物，进行PCR，退火温度为56℃，PCR结果在预期位置处有特异性条带，利用DNA纯化回收试剂盒对目的条带回收，然后对回收的DNA产物与pPIC9K载体(购于Invitrogen公司)进行XhoⅠ(购于Thermo Fisher公司)和EcoRⅠ(购于Thermo Fisher公司)双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，测序鉴定，获得人溶菌酶表达载体，命名为pPIC9K-LYZ。
1.2毕赤酵母电转化
将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-LYZ质粒，与80μL毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4-10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD(13.4g/L无氨基酵母氮源(YNB)，20g/L葡萄糖(Dextrose)，0.4mg/L生物素(Biotin))培养基平板，30℃倒置培养3-4天，在MD培养基平板上长出菌落。
1.3多拷贝***重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的YPD(酵母提取物(Yeast Extract)1wt％，多聚蛋白胨(Polypepton)2wt％，葡萄糖(Dextrose)2wt％)平板上，30℃培养，并经摇瓶筛选获得转化子。
2.重组人溶菌酶发酵培养及诱导表达
2.1一级种子培养
将筛选到的转化子分别接种于4个各装有250mL的BMGY(1％酵母提取物(yeastextract)；2％蛋白胨(peptone)；100mmol/L磷酸钾溶液，pH 6.0；1.34％YNB(yeastnitrogen base)；1％甘油)培养基的三角瓶中，于恒温培养摇床中，在29℃、转速225转条件下培养60-70h后接入种子罐。
2.2二级种子培养
将一级种子转接于装有3L FBS培养基(1L中含甘油40g、K2SO4 18.2g、H3PO426.7mL、CaSO4·2H2O 0.93g、MgSO4 14.9g、KOH 4.13g混合制成)的种子罐中，控制罐温29.0±1.0℃，罐压0.050±0.010MPa、pH5.0培养，培养过程调节通气、搅拌转速使溶氧维持在30％左右。二级种子培养16h后观察溶氧，溶氧大幅上升(1.0min内升高10％)二级菌种培养结束。种子液培养时长一般为16-24小时。
2.3 150L发酵罐发酵
二级种子培养结束移种至装有90L FBS培养基的150L发酵罐，培养温度控制在29.0±1.0℃，罐压控制在0.050±0.010MPa，通过手动调节通气量、氧气量和转速控制DO在30％左右，pH控制在5.0，待培养15-20h时，底物消耗殆尽，此时溶氧会急剧上升，进入补料培养阶段。进入补料阶段后，迅速关闭氧气、降低搅拌转速使DO降至40％左右。启动自动补料系统，甘油溶液起始流速为1.7mL/min(1s/60s)，甘油补料流加速度根据具体发酵情况调节，泡敌视泡沫产生情况手动补入。待补料20h后，取样测发酵液湿菌重，当发酵液湿菌重达260g/L时停止甘油补料，开始饥饿。
停止甘油补料后，此时碳源供应不足，溶氧再次大幅上升。调节通气量、降搅拌转速以控制DO在30％-40％，此时饥饿阶段开始，控制饥饿状态1.0h。饥饿结束后，启动自动补料系统，补加起始流速为1.7mL/min(1s/60s)，3h后流速增加为3.4mL/min(2s/60s)，6h后流速增加为5.1mL/min(3s/60s)，9h后进入甲醇诱导阶段，根据DO实际情况增加甲醇流加速度。甲醇流加速度一般控制在13.6mL/min(8s/60s)以内，甲醇诱导时间一般控制在40-48h。甲醇诱导阶段应控制DO为20-35％，并确定该阶段甲醇未累积过量。诱导时间40-48h或甲醇补加体积20-30L时，甲醇诱导阶段结束，开始放罐。
3重组人溶菌酶纯化
3.1重组人溶菌酶粗纯
发酵液经沉降式离心机转速2000转/分钟，离心90分钟进行固液分离；收集上清，上清液中加入终浓度为0.8M-1.0M氯化钠固体，完全溶解后经0.2μm中空纤维膜过滤系统，去除残余菌体、细胞碎片、尤其是毕赤酵母发酵液中的绿色色素；收集0.2μm滤出液上苯基疏水层析进行精细纯化。
3.2重组人溶菌酶精细纯化
3.2.1疏水层析纯化：配制流动相A：1M氯化钠溶液；B：纯化水加10％异丙醇，0.5M氢氧化钠溶液调节pH至8.0。A相平衡Phenyl Sepharose 6FF(美国GE公司)高流速苯基疏水琼脂糖凝胶层析柱，待平衡完成电导率达到80mS/cm时，将收集的0.2μm滤出液上柱，上柱完成后用A相流洗约3个柱体积，待紫外吸收降至500mV以下，用B相洗脱，收集洗脱液。
3.2.2样品处理：将3.2.1.收集的洗脱液用1M磷酸二氢钠溶液，调节pH7.6-7.8，电导率6.0-7.0mS/cm。
3.2.3 CM阳离子交换层析纯化：配制流动相A：20mM磷酸盐缓冲液，pH7.6-7.8之间，电导率2.0-2.3mS/cm；流动相B：20mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl，pH7.6-7.8之间。将3.2.2.中的重组人溶菌酶样品上CM Sepharose FF(美国GE公司)高流速阳离子交换琼脂糖凝胶层析柱，全部上样完成后，A相平衡2-3个柱体积，阶梯梯度16％B相洗脱除去杂质后，调至梯度25％B相洗脱，收集洗脱液为重组人溶菌酶。
将洗脱液用Sephadex G25(美国GE公司)凝胶进行层析纯化，收集蛋白峰溶液后冷冻干燥，即可获得纯度98％以上的重组人溶菌酶冻干粉。
实施例2：重组人溶菌酶质量标准的检测
1.性状
实施例1中制备的重组人溶菌酶为白色或类白色的无定形粉末；无臭；遇碱易破坏，在0.6％以上的氯化钠水溶液中易溶，在丙酮或***中不溶。
2.鉴别
(1)取实施例1中制备的重组人溶菌酶约2mg，加生理盐水2滴使溶解，加10％氢氧化钠溶液5滴与10％硫酸铜溶液1滴，混匀后显***。
(2)取实施例1中制备的重组人溶菌酶约2mg，加醋酸-醋酸钠缓冲液(取无水醋酸钠6.7g，加水约900mL，振摇使溶解，用醋酸调节pH值至5.4，加水稀释至1000mL，摇匀)制成每1mL中含溶菌酶0.2mg的溶液，按照分光光度法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0401)测定，在280nm的波长处有最大吸收，吸收度为0.42-0.52。
(3)在纯度分析测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间一致。
(4)按照免疫印迹法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3401)测定，为阳性。
3.分子量
依质谱法测定(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0431)，MALDI-TOF检测重组人溶菌酶蛋白分子量14700D±100D。实施例1中制备的重组人溶菌酶蛋白分子量14700D。
4.等电点
依毛细管等电聚焦电泳法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0542毛细管电泳法)，重组人溶菌酶等电点为9.24。
5.肽图
依肽图检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3405第一法胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法)，与对照品图形一致。
6.N端氨基酸序列
重组人溶菌酶N端15个氨基酸序列为：
Lys-Val-Phe-Glu-Arg-Cys-Glu-Leu-Ala-Arg-Thr-Leu-Lys-Arg-Leu。
7.甲醇残留
依气相色谱法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0521气相色谱法)，甲醇含量不高于0.002％。
8.外源性DNA残留量
依外源性DNA残留量测定法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3407)，每100μg蛋白质应不高于10ng。
9.宿主菌蛋白残留量
依酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3414)，应不高于总蛋白质0.1％。
10.pH值
取实施例1中制备的重组人溶菌酶0.1g，加生理盐水至10mL溶解后，依pH检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0631)，pH值为6.5-8.5。
11.干燥失重
取实施例1中制备的重组人溶菌酶0.2g，依水分检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0832)，不超过10.0％。
12.重金属(Pb)
依重金属检查二法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0821)，不大于百万分之十。
13.炽灼残渣
取实施例1中制备的重组人溶菌酶0.2g，依炽灼残渣检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0841)，遗留残渣不超过4.0％。
14.总蛋白量
取实施例1中制备的重组人溶菌酶，依蛋白量检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0731第二法福林酚法)，按干燥品计算，含总氮量不低于90％。
15.纯度
(1)按照非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0541第五法)，含重组人溶菌酶≥95.0％。
(2)按照《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0512反相高效液相色谱法面积归一法测定。上样量不低于5μg，于波长280nm处检测，以重组人溶菌酶色谱峰计算理论踏板数，不低于16000，按面积归一化法计算，重组人溶菌酶主峰面积不低于总面积的95％。
16.生物学活性-效价测定法
(1)试剂配制：磷酸盐缓冲液(0.02M/L pH6.5)：称取Na2HPO4·12H2O 3.115g，称取NaH2PO4·2H2O 1.763g，称取NaCl 6.0g，加入800mL蒸馏水溶解，再定容至1000mL。
底物悬浮液：称取溶壁微球菌菌粉20mg，加磷酸盐缓冲液0.5mL，浸泡1小时，再加磷酸盐缓冲液适量，使悬浮液于25℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.800±0.05(临用前配制)。
重组人溶菌酶溶液：精密称取重组人溶菌酶10mg，置于5mL容量瓶中，加磷酸盐缓冲液定容至5mL，再稀释成200μg/mL的重组人溶菌酶溶液。
(2)操作方法：
吸取0.1mL浓度为200μg/mL的重组人溶菌酶溶液，在室温25℃、pH值6.5时，加入含3mL底物悬浮液的比色皿中，置于紫外分光光度计，于波长450nm处测定吸收度，计算其效价。每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。设样品组和对照组，于25±0.1℃精密量取底物悬浮液3mL，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A0和A’0，然后精密量取0.1mL磷酸盐缓冲液和0.1mL200μg/mL的重组人溶菌酶溶液于比色皿中，迅速混匀，用秒表计时，至60秒测定吸收度值A60和A’60。按下式计算活性效价：
W为测定液中供试品的重量，单位μg。
重复测定3次，取平均值计算重组人溶菌酶活性单位，应不低于1.0×105U/mg。
17.微生物限度
细菌总数(CFU/g)：取0.5g，依非无菌产品微生物限度检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1105)。细菌总数(CFU/g)＜100。
霉菌、酵母菌总数(CFU/g)：取0.5g，依非无菌产品微生物限度检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1105)。霉菌、酵母菌总数(CFU/g)＜10。
18.内毒素
依内毒素检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1143)，每1mg重组人溶菌酶冻干粉小于10EU。
通过检测，实施例1中制备的重组人溶菌酶符合各项标准，为合格品，可进一步用于制备人工泪液。
实施例3:重组人溶菌酶溶解性与溶液中氯化钠含量的研究
1.材料与仪器
1.1试验材料按实施例1制备的重组人溶菌酶冻干粉
1.2试验仪器紫外分光光度计，精度万分之一克的电子天平
2.试验方法
用电子天平准确称取9份0.0300g的重组人溶菌酶冻干粉；分别置于9个10mL量瓶中，每个量瓶中分别加入注射用水及质量含量分别为0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1.0％，2.0％，4.0％，6.0％的氯化钠溶液定容至刻度，获得9份理论上含量均为3.0mg/mL重组人溶菌酶溶液，混匀放置1小时使充分溶解，观察溶液状态，9份溶液均取适量，0.22μm滤器过滤，取滤液适量，用实施例2中总蛋白量检查法，生物学活性-效价测定法测定9个样品的蛋白含量及抑菌活性。
3.试验结果
重组人溶菌酶溶解性与溶液中氯化钠含量的试验检测统计结果见表2。从试验数据可以看出，0.6％氯化钠含量以下的溶液中(0.4％，0.2％，注射用水)，溶液为非澄清透明液体，整体状态为悬浊液，随着盐浓度的下降，重组人溶菌酶悬浊状态逐渐增加，纯水中的重组人溶菌酶悬浊状态最为明显，同时，蛋白含量及抑菌活性也呈递减趋势，主要是由于重组人溶菌酶在低于0.6％氯化钠含量溶液中的溶解不完全，氯化钠含量越低，溶解度越低，在检测时经0.22μm滤器过滤，不溶的蛋白被过滤掉，滤液中测得的只是溶解的蛋白含量及对应的抑菌数据；该结果也显示重组人溶菌酶在纯水中可少量溶解，溶解度有限；在0.6％氯化钠含量以上的溶液中，3.0mg/mL的重组人溶菌酶是可以完全溶解的，蛋白含量及抑菌活性稳定一致。
表2重组人溶菌酶溶解性与溶液中氯化钠含量的统计结果
实施例4:重组人溶菌酶抑菌活性与pH的关系
1.材料与仪器
1.1试验材料按实施例1制备的重组人溶菌酶冻干粉
1.2试验仪器紫外分光光度计，精度万分之一克的电子天平
2.试验方法
用电子天平准确称取7份0.0300g的重组人溶菌酶冻干粉；分别置于7个10mL量瓶中，每个量瓶中分别加入pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸盐缓冲液(0.02M磷酸盐0.10M的氯化钠溶液)定容至刻度，获得7个不同pH、含量均为3.0mg/mL重组人溶菌酶溶液，再将这7份溶液用相对应pH的磷酸盐缓冲液分别稀释成含量为1.5mg/mL、0.75mg/mL的重组人溶菌酶溶液，由此获得3种含量，每种含量对应7个不同pH的重组人溶菌酶溶液，用实施例2中生物学活性-效价测定法(测定法中的磷酸盐缓冲液按本试验中不同的pH称取相应的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠进行配制)测定21个样品的抑菌活性。
3.试验结果
不同pH条件下的重组人溶菌酶抑菌活性统计结果见表3。从试验数据可以看出，相同pH条件下重组人溶菌酶含量0.75mg/mL，1.5mg/mL，3.0mg/mL与抑菌活性呈对应的比例关系；同一含量不同pH条件下均显示在pH6.5时重组人溶菌酶的抑菌活性最好，pH6.0抑菌活性次之，大于或小于pH6.5，随着pH的变化其抑菌活性均成下降趋势，随着pH增加越接近重组人溶菌酶的等电点9.24，溶解性及稳定性越低，抑菌活性下降更为明显。
表3重组人溶菌酶抑菌活性与pH的统计结果
下述实施例5至实施例9中采用的各原料的来源如下：
重组人溶菌酶为实施例1中制备的重组人溶菌酶；
透明质酸钠购于华熙福瑞达生物医药有限公司，人工泪液级玻璃酸钠原料药，国药准字H20113379。
十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠均购于国药集团。
注射用水，申请人自制，常规方法。
实施例5
本实施例中的人工泪液的组成如表4所示。
本实施例中的人工泪液的制备方法是：
(1)称取10.0g透明质酸钠，加入到9871.0g注射用水中，搅拌约3小时至透明质酸钠完全溶解，得到透明质酸钠溶液，备用。
(2)分别称取20.0g十二水合磷酸氢二钠、9.0g二水合磷酸二氢钠和75.0g氯化钠，加入到透明质酸钠溶液中，搅拌至辅料全部溶解，得到辅料溶液，备用。
(3)称取15.0g重组人溶菌酶冻干粉，加入到辅料溶液中，搅拌至全部溶解，用5％(W/W)盐酸调节溶液pH至6.5±0.1；冰点渗透压仪检测，搅拌均匀的人工泪液渗透压应在285-310mOsmol/kg范围内。
(4)将人工泪液用0.22μm除菌过滤器在过滤操作压力为0.35-0.40MPa的条件下过滤除菌，随后将无菌药液输送至已灭过菌的物料储罐内。
(5)在无菌人工泪液生产车间内，塑料粒子在注塑机内经挤压热融后(170-230℃、350bar(1bar＝0.1MPa))制成塑料容器，将步骤(4)中配制好的无菌药液通过吹灌封一体机在A级层流保护下灌入容器中并封口，灌装规格为0.8mL/支。随后，将无菌灌装好的产品，检验，包装，入库。
本实施例的人工泪液为日剂量包装，使用时即开即用，单支24小时内用完。
实施例6至实施例9
实施例6至实施例9的人工泪液的组成如表4所示。
实施例6至实施例9的人工泪液的制备方法与实施例5相同，区别仅在于按照表4中的组成对各组分的量进行相应调整。
表4(单位：g)
实施例5
实施例6
实施例7
实施例8
实施例9
重组人溶菌酶
15.0
60.0
7.5
15.0
60.0
透明质酸钠
10.0
60.0
10.0
30.0
20.0
十二水合磷酸氢二钠
20.0
40.0
20.0
20.0
40.0
二水合磷酸二氢钠
9.0
18.0
9.0
9.0
18.0
氯化钠
75.0
140.0
76.0
72.0
148.0
注射用水
9871.0
19682.0
9877.5
9854.0
19714.0
实施例10：人工泪液质量标准的检测
1.性状
实施例5至实施例9的人工泪液均为无色澄清液体。
2.鉴别
(1)分别取各实施例的样品1mL，加10％氢氧化钠溶液5滴与10％硫酸铜溶液1滴，混匀后显***。
(2)分别取各实施例的样品1mL，加醋酸-醋酸钠缓冲液(取无水醋酸钠6.7g，加水约900mL，振摇使溶解，用醋酸调节pH值至5.4，加水稀释至1000mL，摇匀)制成每1mL中含溶菌酶0.2mg的溶液，按照分光光度法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0401)测定，在280nm的波长处有最大吸收，吸收度为0.42-0.52。
(3)按照免疫印迹法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3401)测定，为阳性。
3.pH值
分别取各实施例的样品10mL，按照《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0631中pH值检查法测定，pH为6.5±0.1。
4.渗透压摩尔浓度
分别取各实施例的样品1mL，按照《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0632中渗透压摩尔浓度测定法，冰点渗透压仪测定，为285-310mOsmol/kg。
5.可见异物
依可见异物检查法(第一法灯检法)测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0904)，符合眼用液体制剂规定。
6.装量
标示量0.8mL/支，平均装量不少于标示装量，每个容器装量均不少于标示装量。依法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0105)，分别取各实施例的供试品10个，将内容物分别倒入经标化的量筒内，检视，每个装量与标示量相比较均不少于标示装量。
7.生物学活性-效价测定法
(1)试剂配制：磷酸盐缓冲液(0.02M/L pH6.5)：称取Na2HPO4·12H2O 3.115g，称取NaH2PO4·2H2O 1.763g，称取NaCl 6.0g，加入800mL蒸馏水溶解，再定容至1000mL。
底物悬浮液：称取溶壁微球菌菌粉20mg，加磷酸盐缓冲液0.5mL，浸泡1小时，再加磷酸盐缓冲液适量，使悬浮液于25℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.800±0.05(临用前配制)。
重组人溶菌酶溶液：分别取各实施例的样品，置于5mL容量瓶中，加磷酸盐缓冲液定容至5mL，再稀释成200μg/mL的重组人溶菌酶溶液。
(2)操作方法：
吸取0.1mL浓度为200μg/mL的重组人溶菌酶溶液，在室温25℃、pH值6.5时，加入含3mL底物悬浮液的比色皿中，置紫外分光光度计，于波长450nm处测定吸收度，计算其效价。每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。设样品组和对照组，于25±0.1℃精密量取底物悬浮液3mL，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A0和A’0，然后精密量取0.1mL磷酸盐缓冲液和0.1mL200μg/mL的重组人溶菌酶溶液于比色皿中，迅速混匀，用秒表计时，至60秒测定吸收度值A60和A’60。按下式计算活性效价：
W为测定液中供试品的重量，单位μg。
重复测定3次，取平均值计算重组人溶菌酶活性单位。生物学活性检查为标示量的70％-200％。
8.透明质酸钠含量测定
(1)对照品溶液的制备：取经60℃减压干燥至恒重的葡萄糖醛酸对照品60mg，精密称定，置100mL量瓶中，加注射用水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10mL，置100mL量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀。
(2)供试品溶液的制备：取人工泪液1-2支，精密量取0.7mL，置10mL量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀。
(3)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置25mL具塞试管中，依次分别加水至1.0mL，混匀，冰浴中冷却，并在不断振摇下缓缓滴加0.025mol/L硼砂硫酸溶液5.0mL，密塞，沸水浴加热10分钟(中间振摇一次)，迅速冷却，加0.125％咔唑无水乙醇溶液0.2mL，摇匀，沸水浴中加热15分钟(中间振摇一次)，冷却。照紫外-可见分光光度法(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0401)，以0管为空白，在530nm的波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的μg数对相应的吸光度计算回归方程。
(4)测定法：精密量取供试品溶液1mL，置25mL具塞试管中，自“冰浴中冷却”起照标准曲线制备项下的方法测定，由回归方程计算葡萄糖醛酸的含量，乘以2.0675，即得。
重复测定3次，取平均值计算透明质酸钠含量。透明质酸钠含量应为标示量的90％-110％。
9.无菌检查
经薄膜过滤法处理，依无菌检查法测定(《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1101)，应无菌。
通过检测，实施例5至实施例9的人工泪液均为合格品。
实施例11：人工泪液抑菌活性研究试验
1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验菌：金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌。
1.1.2对照品：0.1％玻璃酸钠滴眼液(商品名：爱丽)；参天制药株式会社能登工厂(日本)(参天制药(中国)有限公司分装)
空白对照品：按实施例5制备但不加重组人溶菌酶的制剂；
供试品：人工泪液，按实施例5制备，活性为2.19×105U/mL；
1.1.3菌体制备：LB培养基，称取酵母提取物0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠1.0g，溶于100mL去离子水中，121℃灭菌30分钟，将试验菌接种至LB培养基中，37℃200rpm培养过夜。
1.1.4培养板制备：称取酵母提取物0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠1.0g，琼脂1.5g，溶于100mL去离子水中，121℃灭菌30分钟，冷却至50℃时倒入无菌表面皿中自然冷却，制成LB琼脂糖培养板备用。
2.试验方法
取各试验菌100μL均匀涂布于LB琼脂糖培养板上，将直径6mm的圆形无菌滤纸放于涂好的培养基上，分别取对照品，空白对照品，供试品各5μL滴于滤纸上，37℃培养24h，测量抑菌圈的直径。
3.结果
LB琼脂糖培养板纸片扩散抑菌法的抑菌作用试验；抑菌效果如图1a至图1d所示，统计结果见表5。从抑菌圈的大小可以看出，对照品，空白对照品，供试品对革兰氏阴性菌大肠埃希菌均无明显抑菌作用；相对于0.1％玻璃酸钠滴眼液及空白对照品，人工泪液对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果。
表5人工泪液纸片扩散法的抑菌效果-抑菌圈(直径单位：mm)
实施例12：人工泪液的长期稳定性及加速试验
人工泪液在上市规定的贮存条件下进行稳定性试验，考察人工泪液在运输、保存过程中的稳定性特征，从而作为确定有效期和贮存条件的依据。
将实施例5制备的人工泪液样品，活性为2.19×105U/mL，分别置于4℃，25℃，37℃，湿度45％-65％，避光条件下贮存。定期取样进行性状、pH、渗透压、无菌、活性检测。长期稳定性试验样品第一年内前6个月每月检测一次，后6个月每3个月检测一次，第二年内每6个月检测一次。37℃加速试验样品每月检测。4℃、25℃和37℃条件下的稳定性试验统计结果分别见表6、表7和表8。
表6人工泪液稳定性试验结果统计(4℃)
表7人工泪液稳定性试验结果统计(25℃)
时间
温度
性状
pH
渗透压(mOsmol/kg)
无菌
活性(U/mL)
0月
-
无色澄清液体
6.50
299.2
无菌
2.19×10<sup>5</sup>
1月
25℃
无色澄清液体
6.52
301.6
无菌
2.18×10<sup>5</sup>
2月
25℃
无色澄清液体
6.48
300.0
无菌
2.18×10<sup>5</sup>
3月
25℃
无色澄清液体
6.48
299.2
无菌
2.19×10<sup>5</sup>
4月
25℃
无色澄清液体
6.52
300.0
无菌
2.20×10<sup>5</sup>
5月
25℃
无色澄清液体
6.48
300.0
无菌
2.19×10<sup>5</sup>
6月
25℃
无色澄清液体
6.48
299.2
无菌
2.18×10<sup>5</sup>
9月
25℃
无色澄清液体
6.50
300.0
无菌
2.19×10<sup>5</sup>
12月
25℃
无色澄清液体
6.52
300.0
无菌
2.20×10<sup>5</sup>
18月
25℃
无色澄清液体
6.52
299.2
无菌
2.17×10<sup>5</sup>
24月
25℃
无色澄清液体
6.52
300.0
无菌
2.18×10<sup>5</sup>
表8人工泪液加速试验结果统计(37℃)
时间
温度
性状
pH
渗透压(mOsmol/kg)
无菌
活性(U/mL)
0月
-
无色澄清液体
6.50
299.2
无菌
2.19×10<sup>5</sup>
1月
37℃
无色澄清液体
6.48
300.0
无菌
2.20×10<sup>5</sup>
2月
37℃
无色澄清液体
6.48
299.2
无菌
2.18×10<sup>5</sup>
3月
37℃
无色澄清液体
6.50
298.4
无菌
2.19×10<sup>5</sup>
4月
37℃
无色澄清液体
6.52
300.0
无菌
2.17×10<sup>5</sup>
5月
37℃
无色澄清液体
6.48
299.2
无菌
2.18×10<sup>5</sup>
6月
37℃
无色澄清液体
6.52
298.4
无菌
2.17×10<sup>5</sup>
7月
37℃
无色澄清液体
6.50
301.6
无菌
2.16×10<sup>5</sup>
8月
37℃
无色澄清液体
6.48
305.0
无菌
2.08×10<sup>5</sup>
9月
37℃
无色澄清液体
6.48
308.0
无菌
1.78×10<sup>5</sup>
10月
37℃
无色澄清液体
6.48
310.2
无菌
1.56×10<sup>5</sup>
11月
37℃
无色澄清液体
6.46
322.6
无菌
1.03×10<sup>5</sup>
12月
37℃
无色澄清液体
6.46
345.6
无菌
1.01×10<sup>5</sup>
结果：经长期稳定性24个月的试验，结果显示4℃和25℃放置的24个月样品与0月的相比，各项指标无明显变化；加速试验结果显示37℃放置的12个月样品与0月相比，8个月重组人溶菌酶活性开始下降，渗透压开始升高，到11个月产品不合格；因此实施例5制备的人工泪液样品在25℃以下，稳定性良好，在该条件下生产、运输、长期储存不会对本品的质量产生不利影响，可保证临床用药的安全性及有效性。
实施例13：人工泪液在家兔眼蒸发过强并伴有角膜上皮细胞损伤的干眼模型上的药效学试验
1.材料与方法
1.1供试品
1.1.1重组人溶菌酶对照品
名称：1.5mg/mL重组人溶菌酶溶液(按实施例5制备，不添加透明质酸钠)
含量：重组人溶菌酶1.5mg/mL；透明质酸钠0mg/mL；
规格：0.8mL:1.2mg:120000U
外观：无色透明澄清液体。
储存条件：室温(25℃以下)保存。
1.1.2含0.075％重组人溶菌酶的人工泪液
名称：实施例7的人工泪液(低剂量组)
含量：重组人溶菌酶0.75mg/mL；透明质酸钠1.0mg/mL；
规格：0.8mL:0.6mg:60000U
外观：无色透明澄清液体。
储存条件：室温(25℃以下)保存。
1.1.3含0.15％重组人溶菌酶的人工泪液
名称：实施例5的人工泪液(中剂量组)
含量：重组人溶菌酶1.5mg/mL；透明质酸钠1.0mg/mL；
规格：0.8mL:1.2mg:120000U
外观：无色透明澄清液体。
储存条件：室温(25℃以下)保存。
1.1.4含0.30％重组人溶菌酶的人工泪液
名称：实施例9的人工泪液(高剂量组)
含量：重组人溶菌酶3.0mg/mL；透明质酸钠1.0mg/mL；
规格：0.8mL:2.4mg:240000U
外观：无色透明澄清液体。
储存条件：室温(25℃以下)保存。
1.2对照品
名称：玻璃酸钠滴眼液；
生产厂家：URSAPHARM Arzneimittel GmbH(德国)
含量：0.1％；即透明质酸钠1.0mg/mL；
规格：10mL/支
外观：无色透明澄清液体。
储存条件：室温(25℃以下)保存。
1.3供试品及对照品说明
所提供的供试品和对照品直接使用，不需要配制。
2.试验系统
2.1动物使用管理与保护
国家北京药物安全评价研究中心已通过美国AAALAC(Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International，国际试验动物评估和认可管理委员会)国际认证，本发明的相关研究中所有动物均按照国际试验室动物伦理行为准则“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”要求进行试验动物使用与管理。
2.2试验系统及选择理由
兔眼便于进行裂隙灯显微镜检查，是常用的研究干燥性角结膜炎(KCS)的动物模型。建立兔KCS的常见方式是手术切除泪腺、哈氏腺及第三眼睑，并用30％三氯乙酸灼烧新西兰兔球结膜。
2.3试验动物
种属：新西兰兔
动物等级：普通级
性别和数量：雌性18只，雄性18只。
动物体重范围：2-2.5kg
动物来源：北京兴隆试验动物养殖厂。
动物许可证号及发证单位：SCXK(京)2016-0003，北京市科学技术委员会。
动物合格证号：11805800001595
动物到达及接收日期：2017年06月23日
2.4试验动物的饲养与管理及其环境条件
室温控制在20-25℃，湿度40-70％。12h照明，12h黑暗。新西兰兔饲养于不锈钢笼具内，每笼1只，每日清洁笼具1次。
2.5饲料及饮用水
饲喂北京科澳协力饲料有限公司生产的标准饲料，饲料合格证号：SCXK(京)2009-0012。自由摄食，用饮水瓶供应SJD动物饮水机生产的纯净水，由动物自由饮用。
2.6检疫过程
所有动物进行一周的适应性饲养，期间观察动物的活动、饮食等表现，动物未见异常症状，并采学进行血液学检查，未发现明显异常。
2.7试验动物的识别方法
采用随机数字法将动物分组，剔除多余动物，分组时为每只动物指定一个单一的试验动物号。原始资料中使用试验动物号来识别。笼卡上标明动物号、剂量组别及性别。
3.试验设计及方法
3.1干眼动物模型的建立及评价
3.1.1模型的建立
采用手术切除泪腺、哈氏腺及第三眼睑，并用30％三氯乙酸灼烧新西兰兔球结膜建立模型。每只兔左眼进行手术建立模型，右眼作为自身对照。
3.1.2模型的评价
36只动物分别于术前、术后一周、术后两周，进行泪液分泌试验、泪液蕨样结晶试验、裂隙灯下荧光素钠染色观察。
3.1.2.1泪液分泌试验(Schirmer I test)
用一条5mm×35mm的滤纸，将一端折弯5mm，置于兔眼下睑内侧1/3结膜囊内，其余部分悬垂于皮肤表面，轻闭合兔眼，5min后测量滤纸被泪水渗湿的长度。低于10mm/5min为低分泌，低于5mm/5min为干眼。
3.1.2.2泪液蕨样结晶试验(tear ferning test，TFT)
TFT检查每次操作均由同一人完成，取泪液及涂片操作时采用双盲法进行。检查时间均为每天10:00-12:00，用内径0.5mm的玻璃毛细管以虹吸方法在下睑结膜囊泪阜处吸取泪液标本，操作中避免接触眼表。将泪液标本吹入载玻片，注意气流均匀，避免产生气泡影响结晶效果，20℃室温下干燥20min，双目光学显微镜下观察(100×)评级。按照Rolando等的图形分级方法，按泪液羊齿状结晶的完整性、均匀性和分支状态分为4级。
3.1.2.3角膜上皮荧光素钠染色(corneal fluorescein staining，FL)
采用100g/L荧光素钠溶液滴入结膜囊内，裂隙灯钴蓝光下检查，观察角膜上皮着染情况。评分方法参考干眼症临床诊疗规范专家共识(2013年)采用12分法：角膜分为4个象限，每个象限0-3分，无染色为0分，1-30个点状着色为1分，＞30个点状着色但染色未融合为2分，3分为出现角膜点状着色融合、丝状物及溃疡等。
3.2人工泪液药效评价
3.2.1试验分组
建模成功后，对动物进行随机分组。试验设6组，分别为空白对照组、重组人溶菌酶对照品组、人工泪液低剂量组(0.75mg/mL)、中剂量组(1.50mg/mL)、高剂量组(3.00mg/mL)和玻璃酸钠滴眼液对照组，每组雌雄动物各3只，共36只。
3.2.2供试品的给予
途径：眼眶内滴入。
频率：每日8时、12时和16时给药，共3次/日。
周期：连续给药4周。
体积：2滴(约70μL)/只眼。
3.2.3检测指标
在连续给药的4周中，分别于用药前、用药一周、两周、三周和四周，进行泪液分泌试验、泪液蕨样结晶试验、裂隙灯下荧光素钠染色观察(方法同上)。试验结束时取角膜和结膜进行HE染色，显微镜下进行组织学观察。
3.3统计分析
计量数据按组别计算平均值和标准差，再进行方差分析。
4.结果
4.1泪液分泌不足型动物模型的建立及评价
4.1.1泪液分泌试验(Schirmer I test)
术前手术眼和对照眼滤纸被泪水渗湿的长度无显著差异，术后一周和两周，手术眼滤纸被泪水渗湿的长度显著缩短，与对照眼的滤纸被泪水渗湿的长度比较差异非常显著(p<0.01)(结果如表9所示)。
4.1.2泪液蕨样结晶试验(tear ferning test，TFT)
根据评分标准，术前手术眼和对照眼等级评分无显著差异，术后一周和两周，手术眼等级评分增大，与对照眼的等级评分比较差异非常显著(p<0.01)(结果如表10和图2所示，图2中的a-c依次为术前、术后1周、术后2周的图)。
4.1.3角膜上皮荧光素钠染色(corneal fluorescein staining，FL)
根据评分标准，术前手术眼和对照眼等级评分无显著差异，术后一周和两周，手术眼等级评分增大，与对照眼的等级评分比较差异非常显著(p<0.01)(结果如表11和图3所示，图3中的a-c依次为术前、术后1周、术后2周的图)。
4.1.4小结
通过泪液分泌试验、泪液蕨样结晶试验、荧光素染色观察、模型组和对照组差异非常显著，均有统计学意义，表明造模成功。
4.2人工泪液药效评价
4.2.1泪液分泌试验(Schirmer I test)
高浓度组、中浓度组、低浓度组用药后滤纸被泪液浸湿的长度均显著延长，用药1、2、3、4周时与重组人溶菌酶对照品组有显著差异(p<0.05)，具有统计学意义，用药1、3、4周时与空白组比较有显著差异(p<0.05)，具有统计学意义，用药1、4周时与玻璃酸钠滴眼液对照组比较有显著差异(p<0.05)，具有统计学意义(结果如表12所示)。
4.2.2泪液蕨样结晶试验(tear ferning test，TFT)
高浓度组、中浓度组、低浓度组和玻璃酸钠滴眼液对照组用药后1-4周蕨样结晶逐渐增多，与空白对照组比较有显著差异(p<0.05)，具有统计学意义；高、中浓度组与玻璃酸钠滴眼液对照组恢复程度有显著差异(p<0.05)，具有统计学意义；低浓度组与玻璃酸钠滴眼液对照组恢复程度基本一致；重组人溶菌酶对照品组恢复较差，与用药的各组相比，差异显著(p<0.05)(结果如表13以及图4至图7所示，图4至图7中的a-f依次为高浓度组、中浓度组、低浓度组、重组人溶菌酶对照品组、空白对照组、玻璃酸钠滴眼液对照组)。
4.2.3角膜上皮荧光素钠染色(corneal fluorescein staining，FL)
根据评分标准，用药1、2、3、4周，高、中、低浓度组与空白对照组比较有显著差异(p<0.05)，具有统计学意义；高、中、低浓度组与重组人溶菌酶对照品组比较有显著差异(p<0.05)，具有统计学意义；用药3、4周，高、中、低浓度组与玻璃酸钠滴眼液对照组比较有显著差异(p<0.05)，具有统计学意义；尤其是用药2、3、4周，高、中浓度组与玻璃酸钠滴眼液对照组恢复程度有显著差异(p<0.05)，(结果如表14以及图8至图11所示，图8至图11中的a-f依次为高浓度组、中浓度组、低浓度组、重组人溶菌酶对照品组、空白对照组、玻璃酸钠滴眼液对照组)。
4.2.4组织学检查
治疗及恢复4周后，新西兰兔角膜上皮HE染色后在光学显微镜下观察，空白组角膜上皮变薄，细胞排列紊乱；低浓度组，重组人溶菌酶对照品组和玻璃酸钠滴眼液对照组角膜上皮变薄，细胞数目较少，无显著差异；高浓度及中浓度组角膜上皮厚度及细胞数量恢复较好，与玻璃酸钠滴眼液对照组，重组人溶菌酶对照品组比较有显著差异(结果如图12所示，图12中的a-f依次为高浓度组、中浓度组、低浓度组、重组人溶菌酶对照品组、空白对照组、玻璃酸钠滴眼液对照组)。
5结论
在本试验条件下，相对于空白对照组，人工泪液可以明显有效改善泪液分泌不足型干眼症新西兰兔模型的泪液分泌数量，泪液分泌性质，减轻角膜损伤程度，保护角膜上皮；相对于玻璃酸钠滴眼液对照组及重组人溶菌酶对照品组，人工泪液尤其是高浓度组(3.00mg/mL)、中浓度组(1.50mg/mL)可以更优效性的改善泪液分泌不足型干眼症新西兰兔模型的泪液分泌数量，泪液分泌性质，减轻角膜损伤，促进角膜损伤细胞的修复。
表9手术眼与对照眼滤纸被泪水渗湿的长度(mm)
组别
n
术前
术后1周
术后2周
手术眼
36
19.67±3.70
9.94±2.37**
3.44±1.05**
对照眼
36
19.41±3.05
19.97±3.00
18.46±2.22
注：手术眼与对照眼进行比较，**p<0.01
表10手术眼与对照眼泪液蕨样结晶试验等级评分
注：手术眼与对照眼进行比较，**p<0.01
表11手术眼与对照眼角膜上皮荧光素钠染色等级评分
组别
n
术前
术后1周
术后2周
手术眼
36
2.39±1.02
6.92±2.49**
9.52±1.56**
对照眼
36
2.52±1.75
3.03±1.25
3.39±1.24
注：手术眼与对照眼进行比较，**p<0.01
表12人工泪液分泌试验结果(mm)
注：n＝6。与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与玻璃酸钠滴眼液对照组比较，#p<0.05；与重组人溶菌酶对照品组比较，△p<0.05。
表13人工泪液泪液蕨样结晶试验评分
注：n＝6。与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与玻璃酸钠滴眼液对照组比较，#p<0.05；与重组人溶菌酶对照品组比较，△p<0.05。
表14人工泪液角膜上皮荧光素钠染色评分
注：n＝6。与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；与玻璃酸钠滴眼液对照组比较，#p<0.05；与重组人溶菌酶对照品组比较，△p<0.05。
实施例14：人工泪液人体干眼药效学试验
1.试验材料
对照品：
名称：玻璃酸钠滴眼液；
生产厂家：URSAPHARM Arzneimittel GmbH(德国)
含量：0.1％；即透明质酸钠1.0mg/mL；
规格：10mL/支
外观：无色透明澄清液体。
储存条件：室温(25℃以下)保存。
供试品：人工泪液
名称：实施例5的人工泪液
含量：重组人溶菌酶1.5mg/mL；透明质酸钠1.0mg/mL；
规格：0.8mL:1.2mg:120000U
外观：无色透明澄清液体。
储存条件：室温(25℃以下)保存。
2.试验设计及方法
2.1试验对象
选择试验人员64名，其中，男28名，女36名，年龄23-50岁，入选标准为：①长期面对电脑工作、用眼过度的工作岗位职员，如财务、法务、办公行政、质检岗位灯检人员等；长时间使用电脑、手机的年轻员工等；②眼部有明显的眼睛发红，发痒，眼干涩，畏光，眼疲劳，异物感，烧灼感，酸胀感，眼阵痛等自觉不适症状的人员。③排除对象：患有全身性疾病，应用过糖皮脂激素类药，非类固醇类抗炎药及免疫抑制剂的人员。
2.2试验方法
64名试验人员左眼用玻璃酸钠滴眼液治疗14天，4次/天，2滴(约70μL)/次；右眼用人工泪液治疗14天，4次/天，2滴(约70μL)/次。用药后的第3、7、14天对试验人员进行观察及自觉症状进行统计。
2.3数据统计
64名试验人员治疗前后进行干眼症状问卷计分调查，问卷计分项包括眼睛发红，发痒，眼干涩，畏光，眼疲劳，异物感，烧灼感，酸胀感，眼阵痛9项，均以其严重程度及持续时间从轻到重以0-4分分别对左右眼进行计算，所有数据采用SPSS20软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，采用t检验进行比较，p<0.05为差异具有统计学意义。
3.试验结果
在本试验条件下，治疗前64名试验人员左右眼自觉症状计分统计无明显差异；治疗3天试验人员自觉主诉左右眼感觉不同，但数据统计无明显差异；治疗7到14天，试验人员主诉左右眼感觉差异很明显，数据统计结果右眼相对于左眼差异明显(结果如表15所示)，具有统计学意义。
相对于对照品-玻璃酸钠滴眼液，供试品人工泪液可以明显有效并更优效的改善由于人们工作生活中用眼过度，瞬目次数下降导致的泪液分泌不足型干眼症的相关症状，促进角膜损伤细胞的修复。
表15自觉干眼症状问卷计分统计结果
治疗前
治疗3天
治疗7天
治疗14天
左眼
18.3±3.46
18.6±2.87
16.6±3.55
13.6±2.76
右眼
19.5±2.16
15.6±3.75
11.7±3.25<sup>*</sup>
9.68±4.14<sup>*</sup>
注：n＝64。右眼与左眼比较，*p<0.05。
序列表
<110> 陕西慧康生物科技有限责任公司
<120> 一种含有重组人溶菌酶的新型人工泪液
<130> GAI18CN3410
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 130
<212> PRT
<213> 人溶菌酶()
<400> 1
Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly
1 5 10 15
Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala
20 25 30
Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly
35 40 45
Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp
50 55 60
Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala
85 90 95
Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp
100 105 110
Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys
115 120 125
Gly Val
130
<210> 2
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctcgagaaaa gaaaggtctt tgaaaggtgt gagttggcca gaactctgaa aagattggga 60
atggatggct acaggggaat cagcctagca aactggatgt gtttggccaa atgggagagt 120
ggttacaaca cacgagctac aaactacaat gctggagaca gaagcactga ttatgggata 180
tttcagatca atagccgcta ctggtgtaat gatggcaaaa ccccaggagc agttaatgcc 240
tgtcatttat cctgcagtgc tttgctgcaa gataacatcg ctgatgctgt agcttgtgca 300
aagagggttg tccgtgatcc acaaggcatt agagcatggg tggcatggag aaatcgttgt 360
caaaacagag atgtccgtca gtatgttcaa ggttgtggag tgtaagaatt c 411
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gcctcgagaa aagaaaggtc tttgaaaggt gtga 34
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cggaattctt acactccaca accttgaa 28