阅读说明：本技术 源于草酸青霉的iso-Penicillixanthone A及抗顺铂耐药的应用 (iso-Penicillium xanthone A from Penicillium oxalicum and application of anti-cisplatin drug resistance ) 是由 郑秋红 陈立 刘沁颖 李欣欣 程苗苗 王思远 于 2018-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种源于草酸青霉的iso-Penicillixanthone A及其抗顺铂耐药方面的应用。该化合物结构特征是：<Image he="255" wi="309" file="DEST_PATH_IMAGE002.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>,与已知物青霉蒽酮A(Penicillixanthone A)互为对映体。经实验证实,所述蒽醌类化合物对顺铂耐药细胞具有较好的抑制活性。可作为制备顺铂耐药细胞增殖抑制药物或抗顺铂耐药药物用于抗肿瘤的研究。(The invention relates to iso-Penicillium xanthene A from Penicillium oxalicum and application thereof in the aspect of cisplatin resistance. The compound is characterized by comprising the following structural characteristics: in the form of an enantiomer with the known substance Penicillium anthrone A (Penicillium xanthone A). Experiments prove that the anthraquinone compound has better inhibitory activity on cisplatin-resistant cells. Can be used for preparing cisplatin-resistant cell proliferation inhibiting drugs or cisplatin-resistant drugs for antitumor research.)

源于草酸青霉的iso-Penicillixanthone A及抗顺铂耐药的 应用

技术领域

本发明涉及一种源于草酸青霉的iso-Penicillixanthone A及其抗顺铂耐药方面的应用，属于生物医药领域。

背景技术

目前临床治疗中，许多肿瘤经过初次药物治疗取得较好的效果，但最终常出现肿瘤复发，复发后对抗肿瘤药物的敏感性明显降低，严重影响患者的生存质量和时间。顺铂（cisplatin，DDP）是在1844年最先被都灵年轻的化学家米歇尔•派伦（Michele Peyrone）合成出来。但直到1892年，才由苏黎世科学家阿尔弗雷德•维尔纳（Alfred Werner）搞清楚其结构。该品能与DNA结合，引起交叉联结，从而破坏DNA的功能，并抑制细胞有丝***，为一种细胞非特异性药物。该品抗瘤谱较广（如：肺癌、卵巢癌、***癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤等多种实体肿瘤）。顺铂是临床常用的化疗药物之一，但其副作用大且化疗常常受到内在的和获得性的耐药性的限制。

青霉蒽酮是一类由真菌次级代谢产生的蒽醌类有机化合物，自2002年青霉蒽酮A首次从Penicillium thomii中发现至今，已经过去了十多年。该类化合物至今被报道了2个，分别是青霉蒽酮A、B且都是2-4’连接。该类化合物对肿瘤细胞抑制明显，是开发抗肿瘤药物或者肿瘤细胞增殖抑制剂的理想原料。但是对于他们对映体的抗肿瘤活性研究还是空白。

本发明人研究得知，草酸青霉 (Penicillium oxalicum) IBPT-6， (已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M2013714) 的发酵产物的粗提取物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现所示青霉蒽酮类化合物具有抗人顺铂耐药细胞株活性，目前尚未见该化合物对人顺铂耐药细胞的增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种源于草酸青霉的iso-Penicillixanthone A及其抗顺铂耐药方面的应用。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

源于草酸青霉的iso-Penicillixanthone A，该化合物具有抑制顺铂耐药细胞增殖作用，具有抗人顺铂耐药活性。其结构式为：

。

该化合物的制备方法，是通过发酵培养草酸青霉 (Penicillium oxalicum)IBPT-6，获取发酵菌丝体，然后从菌丝体中分离纯化出该化合物。具体步骤如下：

1发酵生产

培养微生物的常规方法，取草酸青霉 (Penicillium oxalicum) IBPT-6接种到平板固体培养基上在28 ℃培养箱中培养2-3 d，然后接种到真菌培养基中，28 ℃静止培养30 d后，经多层纱布过滤获得菌丝体和发酵液；所述真菌培养基成分：葡萄糖10.0 g、麦芽糖20.0 g、甘露醇20.0 g、味精10.0 g、酵母膏3.0 g、NaCl 15.0 g、KH₂PO₄ 0.5 g、MgSO₄·7H₂O 0.3 g、超纯水定容至1 L。

2 浸膏的获得

用纱布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用丙酮溶液（含20%~30%水）连续超声破壁3次，过滤去除残渣，得到含丙酮和水的菌丝体的粗提物。减压浓缩去除丙酮，得到粗体物的水溶液，再以水溶液与乙酸乙酯体积比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，浓缩蒸干获得菌丝体浸膏36.5 g。

3 化合物的分离精制

菌丝体浸膏通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析、合并、分离成组分A-E。组分C (12.7 g) 以二氯甲烷：甲醇=1:2为梯度洗脱剂，进行凝胶柱层析（Sephadex LH-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分C₁-C₄。亚组分C₃ (4.9 g) 通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250 mm，5 μm)：分离流速为5 mL/min，流动相为55%乙腈含0.1% TFA，得到所示化合物 (510mg，t_R 22.8 min)。

所述草酸青霉 (Penicillium oxalicum) IBPT-6，已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M 2013714。

本发明还包括了所述的化合物在制备抑制人顺铂耐药细胞增殖药物中的应用，及该化合物在制备抗人顺铂耐药药物中的应用。

本发明的显著优点在于：

研究所示该青霉蒽酮化合物具有显著的抑制人顺铂耐药细胞增殖活性，目前尚未见该化合物对人顺铂耐药细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。

附图说明

图1 Iso-Penicillixanthone A主要的COSY，HMBC和NOE信号。

具体实施方式

在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：

实施例1该化合物的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取草酸青霉 (Penicillium oxalicum)IBPT-6 (已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M 2013714) 适量，接种到平板固体培养基上在28 ℃培养箱中培养2-3 d。

取平板培养2-3 d的草酸青霉 (Penicillium oxalicum) IBPT-6适量，接种到装有400 mL培养液 [培养液组成（克/升）：葡萄糖10.0、麦芽糖20.0、甘露醇20.0、味精10.0、酵母膏3.0、NaCl 15.0、KH₂PO₄ 0.5、MgSO₄·7H₂O 0.3，超纯水定容至1 L，28 ℃静止培养30d后，获得菌丝体和发酵液。

2 浸膏的获得

用纱布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用丙酮溶液（含20%~30%水）连续超声破壁3次，过滤去除残渣，得到含丙酮和水的菌丝体的粗提物。减压浓缩去除丙酮，得到粗体物的水溶液，再以水溶液与乙酸乙酯体积比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，减压浓缩至近干得菌丝体浸膏36.5 g。

3 化合物的分离精制

菌丝体浸膏通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析，合并，分离成组分A-E。组分C (12.7 g) 以二氯甲烷：甲醇=1:2为梯度洗脱剂，进行凝胶柱层析（Sephadex LH-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分C₁-C₄。亚组分C₃ (4.9 g) 通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250 mm，5 μm)：分离流速为5 mL/min，流动相为55%乙腈含0.1% TFA，得到所示化合物 (510mg，t_R 22.8 min)。

化合物：常温下为黄色粉末，[α]²⁰ _D + 105.6° (c 1, pyridine); [α]²⁰ _D + 3.1°(c 1, Me₂CO);高分辨电喷雾质谱HRESI-MS在m/z：661.1550处给出分子离子峰 [M + Na]⁺（calcd for C₃₂H₃₀NaO₁₄，661.1533）；提示分子量为638，结合波谱信息推测分子式为C₃₂H₃₀O₁₄。¹H和¹³C-NMR数据见表1，主要的COSY，HMBC和NOE信号见图1。

表1 化合物的¹H和¹³C-NMR数据（500 MHz ¹H and 126 MHz ¹³C, in DMSO-d ₆ ）

实施例2 体外抗肿瘤活性的测试

1 实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成100 mM的母液，滤膜过滤除菌，保存于-20 ℃备用。DMSO比例控制在1‰以下。

从液氮中取出冻存的细胞株，在37 ℃水浴锅中迅速溶化，1200 rpm离心5 min，弃去冻存液，加入1 mL培养基吹打后吸入培养瓶中，加入5 mL新鲜DMEM或RPMI 1640培养基，轻轻摇动使细胞在培养基中均匀悬浮，置37℃、5% CO₂的培养箱中培养。当细胞密度达到90%左右时进行传代，去旧培养基，PBS洗2遍，加入300 μL胰酶（确保胰酶能覆盖瓶底），在37℃培养箱中消化至细胞变圆即将脱落时，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化，吹打混匀后分至2-3个新的培养瓶中，补充培养基使细胞在培养箱中继续生长。

细胞增殖抑制活性测试方法（WST-1法）

抗肿瘤细胞活性评价采用WST-1试剂盒检测法，取对数生长期的肿瘤细胞消化后调整细胞浓度为3×10⁴/mL的单细胞悬液，将细胞悬液混匀后取100 μL接种于96孔板中，每个浓度设置5个复孔。然后置于37℃、5% CO₂培养箱内培养过夜。去上清液，用培养基将药物稀释成不同的浓度加到相应的96孔板内，对照组加入含有相同量DMSO的培养基。培养72 h后，每孔加入10 μL的WST-1溶液37 ℃孵育2 h后，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定其在450 nm吸光值。计算5孔的平均OD值并按照公式：细胞增殖抑制率=（OD对照组-OD空白组）/（OD实验组-OD空白组）×100%算出每个浓度的药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，采用Graphpad Prism5.0软件计算出半数抑制率IC₅₀。

2 实验结果

细胞增殖抑制活性测试结果见表2。

表2 化合物对人顺铂耐药细胞增殖的抑制活性

3 结论

该化合物对人顺铂耐药细胞具有较好的抗肿瘤活性。可作为制备顺铂耐药细胞增殖抑制药物或抗肿瘤药物用于顺铂耐药的研究。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。