阅读说明：本技术 新色原酮类化合物及其制备方法和用途 (Novel chromone compound and preparation method and application thereof ) 是由 路新华 郑智慧 张新 李业英 栗若兰 徐岩 任晓 崔晓兰 朱京童 沈文斌 张雪霞 于 2018-05-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一类结构新颖的色原酮类化合物及其制备方法和用途,该类化合物是通过弯头曲霉(<I>Aspergillus deflectus</I>)发酵制备的,所述弯头曲霉的保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号是CGMCC No.9095。本发明所制备的色原酮类化合物能够用于制备预防或治疗肌苷-5’-磷酸脱氢酶(IMPDH)所介导疾病的药物。(The invention provides a chromone compound with a novel structure and a preparation method and application thereof, the compound is prepared by fermenting aspergillus elbows ( Aspergillus deflectus ), the preservation unit of the aspergillus elbows is the common microorganism center of China Committee for culture Collection of microorganisms, and the preservation number is CGMCC No. 9095.)

新色原酮类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体地说涉及一类新色原酮类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

肌苷-5' -磷酸脱氢酶(IMPDH; EC1. 1. 1. 205) 是涉及鸟嘌呤核苷酸从头合成的一种酶。IMPDH催化肌苷-5'-磷酸(IMP) NAD-依赖性地氧化成黄苷-5' -磷酸(XMP)[Jackson R. C. 等人，Nature, 256, pp. 331-333，(1975)]。

IMPDH在真核生物、细菌和原生动物中普遍存在[Y. Natsumeda & S. F. Carr,Ann. N. Y. Acad., 696, pp. 88-93 (1993)]。原核生物形式与人体酶有30-40 %的序列同源性。已经鉴定了称为I型和II型的人IMPDH 的两种同种型，并已测定了其序列[F. R.Collart和E. Huberman, J. Biol. Chem., 263, pp. 15769-15772, (1988); Y.Natsumeda等人，J. Biol. Chem., 265, pp. 5292-5295, (1990)]。这两种同种型分别具有514个氨基酸，并具有84%的序列同源性。Ⅰ型和Ⅱ型IMPDH在溶液中形成具有分子量为56kDa 的亚单位的活性四聚体[Y. Yamada 等人，Biochemistry, 27, pp. 2737-2745(1988)]。

B和T-淋巴细胞的鸟苷核苷酸是从头合成，以及因此IMPDH的活性在中特别重要。这些细胞依靠从头合成而不是补救合成来满足细胞增殖所需要的核苷酸[A. C. Allison等人，LancetⅡ, 1179, (1975) 和A. C. Allison等人，Ciba Found.Symp., 48, 207,(1977)]。因此， IMPDH是选择性地抑制免疫系统而又不抑制其它细胞增殖的有吸引力的目标。美国专利5，380，879和5，444，072 以及PCT公开WO94/01105和WO94/12184描述了霉酚酸(MPA) 及其一些衍生物，它们是I型(Ki=33 nM) 和Ⅱ型(Ki=9 nM) 人IMPDH的强效、非竞争性、可逆抑制剂。MPA能阻断B和T-淋巴细胞对促细胞***剂或抗原的反应[A. C. Allison等人，Ann. N. Y. Acad. Sci., 696, 63, (1993)]。IMPDH抑制剂MPA已经是治疗免疫排斥反应和自身免疫性疾病的有用药物[R. E. Morris, Kidney Intl., 49, Suppl. 53, S-26, (1996)]。霉酚酸酯在体内迅速释放游离MPA的一种前药能阻止肾移植后的急性肾同种移植物排斥[L. M. Shaw，等人，Therapeutic Drug Monitoring, 17, pp. 690-699,(1995); H. W. Sollinger, Transplantation, 60, pp. 225-232 (1995)]。

近来，PCT公开WO 97/40028 和WO 98/40381 中已描述了不同种类的IMPDH抑制剂。还已知IMPDH在其它代谢事件中起作用。在迅速增殖的肿瘤细胞系中还观察到IMPDH活性的增加，这表明IMPDH抑制剂是具有抗癌价值[M.Nagai等人，Cancer Res., 51, pp.3886-3890, (1 991)]。

研究也表明IMPDH在平滑肌细胞的增殖中起作用，这表明IMPDH抑制剂例如MPA或雷帕霉素可用于预防再狭窄或其它高度增殖性血管疾病[C. R. Gregory等人，Transplantation, 59, pp. 655-61(1995); PCT公开WO 94/12184和PCT 公开WO94/01105]。

此外，病毒复制过程是DNA和RNA的从头合成， IMPDH在病毒感染复制过程中起至关重要作用[S. F. Ca，J. Biol. Chem., 268, pp. 27286-27290(1993)]。MPA以及核苷类似物如利巴韦林可以通过抑制IMPDH，具有抗病毒作用[L.Hedstrom，等人，Biochemistry,29, pp. 849-854(1990)]。

因此， IMPDH抑制剂具有作为免疫抑制剂、抗癌剂、抗血管过度增殖剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗牛皮癣剂和抗病毒剂的药用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有IMPDH抑制作用的色原酮类化合物，以及该类化合物的制备方法和医药用途。

为实现本发明目的，本发明提供了新色原酮类化合物，其结构如式(1)-(5)：

其中R1为H或COCH₃，R2为H或Cl

本发明所提供的色原酮类化合物为弯头曲霉的发酵代谢产物，产生菌株为弯头曲霉(Aspergillus deflectus)NCC0415，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏日期2014年4月25日，保藏编号为CGMCC No.9095，保藏地址为：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明提供了上述色原酮类化合物的制备方法，该方法是采用上述弯头曲霉（Aspergillus deflectus）发酵制备所述色原酮类化合物。具体地说，包括以下步骤：

a、制备弯头曲霉（Aspergillus deflectus）NCC0415的发酵产物：

将弯头曲霉（Aspergillus deflectus）接种于发酵培养基中，于22-30℃，培养5-8天，得到发酵液。

所述弯头曲霉(Aspergillus deflectus)的保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏号是CGMCC No.9095。

所述发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖10.0-50.0克、可溶性淀粉10.0-50.0克、热榨黄豆饼粉4.0-20.0克、棉籽粉4.0-20.0克、磷酸二氢钾1.0-10.0克、氯化钠0.5-2.0克、七水硫酸镁0.5-2.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

b、将上述发酵液进行过滤或离心，弃去上清液，获得菌丝体；

c、用有机溶剂对菌丝体浸提2-4次，每次2-4小时，合并浸提液，减压浓缩，除去有机溶剂，得到粗浸膏；

所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯；

d、 将粗浸膏过硅胶柱层析，氯仿：甲醇（10:0～7:3）梯度洗脱，收集洗脱液，HPLC检测，HPLC检测，合并峰相似的组分，减压蒸干，记作S1-S9；S1、S3、S9没有目的成分，弃去；S2部分通过HPLC制备（流动相为65%乙腈，YMC C18色谱柱，21.2*250，10 μm，流速16mL/min）得到化合物1(Rt=10.0min)和2(Rt=15.6min )；S4部分依次进行Sephadex LH-20柱色谱（柱子：2.6*70cm, 甲醇为洗脱剂）和HPLC制备（流动相为55%乙腈，纳微C18色谱柱21.2*150, 10 μm, 流速16mL/min）获得化合物3(Rt=9.2min)和4(Rt=11.5min)；S5部分依次进行SephadexLH-20柱色谱（柱子：2.6*70cm, 甲醇为洗脱剂）、HPLC制备（流动相为35%乙腈，纳微C18色谱柱21.2*150, 10μm, 流速16mL/min）获得化合物5（Rt=11.6min）、6（Rt=15.2min）和7(Rt=21.5min)；S6部分通过HPLC制备（流动相：50%乙腈，纳微C18色谱柱，21.2*150mm,10μm,16ml/min）获得化合物8 (Rt=6.2min) 和9(Rt=10.5min)；S7部分进行HPLC制备（30%乙腈，纳微色谱柱，21.2*250, C18，10μm,16ml/min）获得化合物10 (Rt=6.5min)；

除上述制备方法外，本发明所述新色原酮类化合物还可以按照常规方法，通过合成、半合成或生物转化的方式获得。

本发明还提供了上述新色原酮类化合物的一种医药用途：将该化合物用于制备预防或治疗IMPDH所介导疾病的药物。

本发明所述IMPDH所介导疾病，具体地说是免疫排斥、自身免疫性疾病、病毒感染、炎症、肿瘤、寄生虫感染、血管过度增殖性疾病等。

本发明方法可用于在哺乳动物中抑制免疫反应。这样的方法可用于治疗或预防疾病，包括移植排斥(例如肾、肝脏、心脏、肺、胰腺（胰岛细胞)、骨髓、角膜、小肠和皮肤同种异体移植物以及心脏瓣膜异种移植物) ，移植物对宿主疾病，和自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎、多发性硬化、青少年糖尿病、哮喘、支性肠病〈局限性回肠炎、溃疡性结肠炎)、狼疮、糖尿病、重症肌无力、牛皮癣、皮炎、湿疹、皮脂溢、肺炎眼色素层炎、肝炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、贝赫切特或斯耶格伦综合征(眼睛/口腔于燥)、恶性或免疫血液性贫血、自发性肾上腺机能不全、多腺自身免疫性综合征、和肾小球性肾炎、硬皮病、扁平苔癣、白斑(viteligo) (皮肤脱色素)、自身免疫性甲状腺炎、和牙糟炎。

本发明方法可用于哺乳动物中抑制病毒复制。这样的方法可用于治疗或预防由于感染下述病毒所致的疾病：正粘病毒(A和B型流感病毒)、副粘病毒(呼吸道合胞体病毒(RSV) 、亚急性硬化全脑炎(SSPE) 病毒)麻疹和副流感3型)、疱疹病毒(HSV-1、HSV-2、HHV-6、HHV-7、HHV-8、EB病毒(EBV) 、巨细胞病毒(HCMV) 和水痘带状疱疹病毒(VZV) )、逆转录病毒(HIV-l 、HIV-2 、HTLV-l 、HTLV-2)、黄和瘟病毒(黄热病毒(YFV)、丙肝病毒(HCV) 、登革热病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、嗜肝病毒(甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、D型肝炎病毒(HDV)、E型肝炎病毒(HEV)、G型肝炎病毒(HGV)、克里米亚-刚果出血热病毒(CCHF)、布尼病毒(Punta Toro病毒、山谷热病毒(RVFV)、和白蛉热Sicilian病毒)、汉坦病毒、Caraparu病毒)、人***状瘤病毒、脑炎病毒(La Crosse 病毒)、沙粒病毒(Junin和Tacaribe病毒)、呼肠病毒、水疱性口炎病毒、鼻病毒、肠道病毒(脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、脑心肌炎病毒(EMC) )、拉沙热病毒、和披膜病毒(新培斯和塞姆利基(semlike)森林病毒)和痘病毒（牛症病毒)、腺病毒、rubiola、和风疹。

本发明方法可用于抑制哺乳动物中的血管细胞过度增殖。这样的方法可用于治疗或预防疾病，包括再狭窄、狭窄、动脉粥样硬化和其它过度增生性血管疾病。

本发明方法可用于抑制哺乳动物中的肿瘤和癌症。这样的方法可用于治疗或预防疾病，包括肿瘤和恶性肿瘤例如实体瘤、淋巴瘤、白血病和其它形式的癌症。

本发明方法可用于抑制哺乳动物中的炎症和炎性疾病。这样的方法可用于治疗或预防疾病，包括骨关节炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、哮喘和成人呼吸窘迫综合征。

涉及上述医药用途时，根据本领域技术人员的公知常识，不仅是本发明所述新色原酮类化合物本身，其药学上可接受的盐、异构体、酯或前体药物都可以具有与其相同或相近的医药用途。上述药学上可接受的盐包括钠、钾、钙盐，以及胺盐；所述胺包括氨、烷基胺、苯胺和氨基酸；所述氨基酸包括精氨酸、赖氨酸。上述药学上可接受的盐还可以形成溶剂化物，并具有与之相同或相近的医药用途；所述溶剂化物包括水合物、醇合物。上述前药在体内代谢变化后能够释放出本发明所述色原酮类化合物。

本发明组合物包含本发明化合物或其盐，也包括选自其他免疫抑制剂、抗癌剂、抗病毒剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗生素、或抗血管过度增殖化合物或药物。另外本发明组合物包含本发明化合物或其盐及可药用载体、辅料或赋形剂。这样的组合物可任选包含选自免疫抑制剂、抗癌剂、抗病毒剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗生素、或抗血管过度增殖化合物的另外的活性剂。

本发明药物组合物可包含的免疫抑制剂包括但不限于环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素、来氟米特、脱氧精胍素、强的松、硫唑嘌呤、霉酚酸和咪唑立宾。

本发明药物组合物可包含的抗癌剂包括但不限于顺铂、放线菌素D、阿霉素、长春新碱、长春碱、依托泊苷、安吖啶、米托蒽醌、替尼泊苷、紫杉醇、秋水仙碱和干扰素。

本发明药物组合物可包含的抗病毒剂包括但不限于更昔洛韦、丙氧鸟苷、膦酰基甲酸三钠、利巴韦林、d4T、ddI、 AZT和阿昔洛韦。

本发明药物组合物可包含的抗血管过度增殖剂包括但不限于HMG CoA还原酶抑制剂例如洛伐他丁、血栓烷A2合成酶抑制剂、二十碳五烯酸、西前列烯、曲匹地尔、ACE抑制剂、低分子量肝素、霉酚酸、雷帕霉素和5- (3'-吡啶基甲基)苯并呋喃-2-甲酸。

本发明所述色原酮类化合物的医药用途，具体来说是通过以下方法实现的：

按照常规方法制备药物组合物，其包含上述色原酮类化合物和可药用载体。其中，所述色原酮类化合物的质量百分含量为0.1-99%，优选5-75%。该药物组合物按照给药途径不同，可分为口服制剂、舌下或颊给药制剂、吸入制剂、注射剂、直肠给药制剂、经皮给药制剂等。其中，优选口服制剂。

当制备口服制剂时，单位剂型中所述色原酮类化合物的含量为1-500mg，优选1-250mg。可选择的剂型包括片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬液等。其中，优选片剂、胶囊剂。可药用载体包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸、藻酸钠、滑石粉、硬脂酸镁、微粉硅胶、脂肪油、液体石蜡、液体聚乙二醇等。

当制备舌下或颊给药制剂时，可以采取片剂或糖锭剂的形式，按照常规方法配制。

当制备吸入制剂时，可以采取加压气雾剂的形式。适合的推进剂包括二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳。可药用载体包括乳糖、淀粉。

当制备注射剂时，单位剂型中所述色原酮类化合物的含量为0.1-100mg，优选0.1-25mg。可选择的剂型包括油性注射液、水性注射液或冻干粉针剂。可药用载体包括脂肪油、油酸乙酯、甘油三酯、脂质体、羧甲基纤维素钠、葡聚糖、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸、藻酸钠。

当制备直肠给药制剂时，可以采取栓剂或灌肠剂的形式。可药用载体包括可可脂、甘油酯。

当制备经皮给药制剂时，可以采取贴剂的形式。可药用载体包括聚丙烯酸钠、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。

上述药物组合物在应用时，应达到有效治疗剂量，并根据疾病的性质、患者的年龄、体重进行合理调整。通常，所述色原酮类化合物的给药剂量为0.01-100mg/kg体重，优选为0.1-10mg/kg体重，更优选的是1-5mg/kg体重。给药剂量和频率最终应由医生决定。

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

下列实施例所涉及的部分原材料的规格型号如下：

核磁共振仪：BrukerAvance Ⅲ 500，TMS为内标

高分辨质谱： LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Scientific, Germany)

高压液相系统（分析）：Waters公司，2个515型泵，996 检测器

高压液相系统（制备）：创新通恒P3000双泵，UV3000检测器

酶标仪：Perkin Elmer公司 Victor2 1420 Multilabel Counter

层析硅胶：300~400目，青岛海洋化工厂

分析型色谱柱：苏州纳微 ODS column (4.6×150 mm, 10 μm)

色谱级甲醇和乙腈购自Honeywell公司，其他试剂均为分析纯，购自北京化学试剂厂。

实施例1 色原酮类化合物的制备

按照以下步骤制备色原酮类化合物：

（a）制备弯头曲霉（Aspergillus deflectus）NCC0415的种子液

将弯头曲霉（Aspergillus deflectus）真菌NCC0415接种于种子培养基，25℃、转速200rpm培养72h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉30.0克、葡萄糖10.0克，热榨黄豆饼粉4.0克、麦芽粉5.0克、酵母粉3.0克，氯化钠2.0克，七水硫酸镁1.0克，加自来水溶解定容至1000ml，pH值6.5，121℃灭菌30min。

（b）制备弯头曲霉（Aspergillus deflectus）NCC0415的发酵培养物

将种子液以3%的接种量接种于装有150 mL液体发酵培养基的1000mL三角瓶中，于26℃、220rpm振摇培养144h，得到发酵培养物。发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖30克、可溶性淀粉30克、热榨黄豆饼粉10克、棉籽粉10克、磷酸二氢钾5克、氯化钠1克、七水硫酸镁0.5克，碳酸钙2 克，加自来水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

（C）色原酮类化合物的制备

上述发酵培养物10L，3000 rpm离心15 min，收集菌体，上清液弃去。菌体用等体积乙醇浸泡两次（2.0小时/次），过滤，滤液减压浓缩得到粗浸膏45g；将粗浸膏过硅胶柱(49x310mm)层析，氯仿：甲醇（10:0～7:3）梯度洗脱，流速80 mL/min, 以50ml/份收集洗脱液。HPLC检测，合并峰相似的组分，减压蒸干，记作S1-S9；S1、S3、S9没有目的成分，弃去；S2部分通过HPLC制备（流动相为65%乙腈，YMC C18色谱柱，21.2*250，10 μm，流速16mL/min）得到化合物1(36mg, Rt=10.0min)和2(52mg, Rt=15.6min )；S4部分依次进行Sephadex LH-20柱色谱（柱子：2.6*70cm, 甲醇为洗脱剂）和HPLC制备（流动相为55%乙腈，纳微C18色谱柱21.2*150, 10 μm, 流速16mL/min）获得化合物3(48.0mg, Rt=9.2min)和4(22.0mg, Rt=11.5min)；S5部分依次进行Sephadex LH-20柱色谱（柱子：2.6*70cm, 甲醇为洗脱剂）、HPLC制备（流动相为35%乙腈，纳微C18色谱柱21.2*150, 10μm, 流速16mL/min）获得化合物5（48.0mg, Rt=11.6min）、6（69.0mg, Rt=15.2min）和7(21.0mg, Rt=21.5min)；S6部分通过HPLC制备（流动相：50%乙腈，纳微C18色谱柱，21.2*150mm, 10μm, 16mL/min）获得化合物8(32.0mg, Rt=6.2min) 和9(25.2mg, Rt=10.5min)；S7部分进行HPLC制备（30%乙腈，纳微色谱柱，21.2*250, C18, 10μm, 16ml/min）获得化合物10 (15.2mg, Rt=6.5min)；

所得上述各化合物的化学结构和核磁数据如下：

（1）化合物1：

淡黄色结晶性粉末，HRMS给出m/z: 359.1488[M+1]⁺，分子式：C₂₀H₂₂O₆，¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ12.60 (s, 1H), 7.59 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.91 (dd,J = 8.4, 1.0 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 5.07 (d, J = 5.2 Hz,2H), 4.40 (s, 1H), 4.13 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.48 (s, 4H), 2.11 (t, J = 6.6Hz, 2H), 1.37 (s, 6H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ184.39, 161.85, 155.65,154.09, 152.76, 142.33, 136.89, 134.06, 119.66, 118.05, 110.57, 109.13,106.56, 72.95, 70.24, 56.97, 42.61, 29.78, 29.78, 17.78.

（2）化合物2：

淡黄色结晶性粉末，HRMS给出m/z: 401.15945[M+1]⁺，分子式：C₂₂H₂₄O₇，¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ12.55 (s, 1H), 7.54 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.83 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 3.97 (t, J = 7.1 Hz,2H), 2.41(s, 3H) , 2.39 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.57 (s, 6H). ¹³CNMR (126 MHz, CDCl₃) δ184.14, 170.40, 161.65, 155.41, 153.78, 152.63, 142.34,136.68, 133.95, 119.41, 117.74, 110.36, 108.87, 106.41, 80.63, 71.63, 56.74,40.22, 26.62, 26.62, 22.30, 17.47.

（3）化合物3：

淡黄色粉末，HRMS给出m/z: 719.2342[M+1]⁺，分子式：C₃₈H₃₈O₁₄，¹H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ 12.01(1H, s), 8.62(1H, s), 6.96(1H, s), 6.78(1H, t, J=8.1Hz), 6.61(1H, s), 6.52(1H, s), 6.50(1H,d, J=8.1Hz), 6.11(1H, s), 6.04(1H, d, J=8.1Hz),5.93(1H, d, J=6.1Hz), 5.49(1H, t, J=5.7Hz), 4.53(2H, m), 4.17(1H, d, J=8.0Hz), 4.14(1H, m), 4.12(1H, m), 3.96(1H, m), 3.68(3H, brs), 3.53(1H, d, J=10.4Hz), 2.67(1H, dd, J=6.0, 8.0Hz), 2.27(2H, t, J=7.0Hz), 2.16(3H, s), 1.97(3H, s), 1.52(3H, s), 1.51(3H, s). ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 179.72,172.56, 169.83, 164.99, 158.68, 156.18, 155.15, 154.26, 151.79, 145.50,141.80, 137.76, 131.40, 129.62, 128.97, 118.89, 116.66, 109.38, 107.48,107.22, 106.71, 105.63, 104.17, 95.91, 80.55, 75.97, 69.63, 69.10, 62.23,51.57, 48.36, 46.98, 43.61, 40.14, 26.33, 26.22, 22.18, 15.77.

（4）化合物4：

淡黄色粉末，HRMS给出m/z: 753.1952，分子式：C₃₈H₃₇ClO₁₄，¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.00(1H, s), 11.45(1H, s), 9.18(1H, s), 8.76(1H, s), 6.94(1H, s), 6.94(1H, d, J=8.8Hz), 6.63(1H, s), 6.49(1H, s), 6.49(1H, d, J=8.8Hz), 6.11(1H,s), 5.93(1H, brs), 4.53(2H, dd), 4.23(1H, dd, J=8.0, 0.8Hz), 4.14(1H, m),4.13(1H, m,18-H), 3.94(1H, m), 3.68(3H, brs), 3.54(1H, d, J=10.2Hz), 2.67(1H,dd, J=6.0, 8.0Hz), 2.26(2H, t, J=7.0Hz), 2.15(3H, s), 1.96(3H, s), 1.51(3H,s), 1.50(3H, s). ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 180.22, 170.32, 165.33, 159.24,155.62, 154.69, 152.49, 151.79, 146.31, 142.14, 138.31, 131.97, 130.02,128.75, 119.22, 117.36, 111.84, 108.13, 107.80, 107.80, 107.73, 104.52,95.90, 81.04, 76.73, 70.01, 69.59, 62.74, 52.07, 48.67, 47.39, 44.00, 40.63,26.82, 26.71, 22.67, 16.29

（5）化合物5：

淡黄色粉末，HRMS给出m/z: 663.2075[M+1]⁺，分子式：C₃₅H₃₄O₁₃，¹H NMR (500 MHz,DMSO-d₆) δ12.22（1H, s）, 10.59(1H, s), 8.55(1H, s), 8.52(1H, s),7.03(1H, t, J=8.1Hz), 6.68(1H, brs), 6.66(1H, brs), 6.62(1H, d, J=7.8Hz), 6.45(1H, s), 6.26(1H, s), 6.16(1H, d, J=7.8Hz), 6.05(1H, s), 5.48(1H, t, J=5.6Hz), 4.54(1H, d,J=7.2Hz), 4.51(2H, d, J=5.6Hz), 4.32(1H, s), 4.00(2H, m), 3.62(3H, s), 2.95(1H, d, J=7.2Hz), 2.13(3H, s), 1.86(2H, m), 1.17(3H, s), 1.15(3H, s). ¹³C NMR(126 MHz, DMSO-d6) δ179.31, 173.24, 168.74, 159.71, 156.75, 156.64, 156.22,152.16, 145.97, 142.42, 136.09, 131.17, 129.51, 129.33, 123.77, 118.60,108.82, 108.49, 107.94, 106.41, 106.27, 104.15, 90.40, 76.80, 76.56, 70.37,67.82, 62.02, 55.18, 52.62, 52.18, 43.06, 29.76, 29.53, 15.92.

（6）化合物6：

淡黄色粉末，HRMS给出m/z: 677.2230[M+1]⁺，分子式：C₃₆H₃₆O₁₃，¹H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ12.00(1H,s), 11.58(1H,brs）, 8.84(1H,brs), 8.61(1H,s), 6.94（1H,s),6.76(1H,t,J=8.1Hz), 6.59(1H,s), 6.50(1H,s), 6.48(1H,d, J=8.1Hz), 6.09(1H,s),6.03(1H,d, J=8.1Hz), 5.85(1H,d, J=5.8Hz), 5.47(1H,t, J=5.7Hz), 4.52(2H,m),4.35(1H,s), 4.15(1H,d, J=8.0Hz), 4.09(1H,m), 4.09(1H,m), 4.01(1H,m), 3.66(3H,s), 3.51(1H,d, J=10.4Hz), 2.65(1H,dd,J=6.0,8.0Hz), 2.15(3H,s), 1.89(2H,t,J=7.0Hz), 1.19(3H,s), 1.18(3H,s). ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 179.69, 171.21,164.97, 158.65, 156.16, 155.12, 154.19, 151.76, 145.33, 142.00, 137.73,131.45, 129.58, 128.94, 118.86, 116.60, 109.36, 107.45, 107.19, 106.68,105.62, 104.15, 95.94, 75.99, 70.07, 69.60, 68.07, 62.21, 51.54, 48.35,46.87, 43.36, 43.36, 29.83, 29.66, 15.81.

（7）化合物7：

淡黄色粉末，HRMS给出m/z: 711.1840，分子式：C₃₆H₃₅ClO₁₃，¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.00(1H,s), 11.44(1H,s), 9.18(1H,s), 8.71(1H,s), 6.94(1H,s), 6.94(1H,d,J=8.7Hz), 6.62(1H,s), 6.49(1H,s), 6.49(1H,d, J=8.7Hz), 6.10(1H,s), 5.86(1H,d,J=5.5Hz), 5.47(1H,brs), 4.53(2H,dd), 4.22(1H,d, J=8.2Hz), 4.11(1H,m), 4.11(1H,m,18-H), 4.01(1H,m), 3.67(3H,br), 3.53(1H,d, J=10.1Hz), 2.66(1H,dd,J=6.0,8.0Hz), 2.15(3H,s), 1.89(2H,t,J=7.3Hz), 1.20(3H,s), 1.19(3H,s). ¹³C NMR (126MHz, DMSO-d6) δ180.22, 170.88, 165.22, 159.24, 155.62, 154.66, 152.49,151.79, 146.16, 142.36, 138.28, 132.04, 130.01, 128.75, 119.21, 117.33,111.85, 108.13, 107.82, 107.81, 107.73, 104.52, 95.94, 76.79, 70.57, 70.03,68.59, 62.74, 52.07, 48.69, 47.31, 43.87, 43.87, 30.35, 30.18, 16.31.

（8）化合物8：

淡黄色粉末，HRMS给出m/z: 609.1241[M+1]⁺，分子式：C₃₀H₂₄O₁₄，¹H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ12.54(1H,s), 12.20(1H,s), 7.78(1H,s), 7.01(1H,s), 6.89(1H,s), 6.82(1H,s), 6.76(1H,s), 5.50(1H,t,J=5.5Hz), 5.42(1H,q,J=5.5Hz), 5.01(1H,d,J=9.0Hz), 4.58(2H,t,J=5.5Hz), 4.51(2H,t,J=5.5Hz), 3.80(1H,t,J=9.0Hz), 3.75(3H,s), 3.71(3H,s), 3.13(1H,m), 2.70(2H,m). ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ179.58,178.93, 170.79, 169.47, 169.38, 168.11, 159.98, 159.58, 156.84, 155.59,152.33, 152.33, 119.24, 111.74, 109.03, 108.78, 108.42, 108.31, 105.70,104.88, 104.23, 88.23, 62.18, 62.02, 52.76, 52.27, 46.80, 42.56, 36.93,26.22.

（9）化合物9：

淡黄色粉末，HRMS给出m/z: 705.2185[M+1]⁺，分子式：C₃₇H₃₆O₁₄，¹H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ12.22(1H,s), 10.57(1H,s), 8.56(1H,s), 8.51(1H,s), 7.03(1H, t, J=8.1Hz), 6.68(1H, brs), 6.66(1H,brs), 6.62(1H, d, J=8.0Hz), 6.46(1H, s), 6.27(1H, s), 6.16(1H, d, J=8.0Hz), 6.06(1H, s), 5.47(1H, dd, J=4.7, 6.3Hz), 4.54(1H, d, J=7.2Hz), 4.51(2H, d, J=4.7Hz), 4.00(2H, m), 3.62(3H, s), 2.95(1H, d,J=7.2Hz), 2.25(2H, m), 2.13(3H, s), 1.96(3H, s), 1.48(6H, s). ¹³C NMR (126MHz, DMSO-d6) δ179.32, 173.24, 169.80, 168.71, 159.72, 156.76, 156.64,156.23, 152.15, 146.11, 142.19, 136.01, 131.05, 129.50, 129.29, 123.76,118.66, 108.82, 108.50, 107.95, 106.41, 106.27, 104.16, 90.36, 80.33, 76.78,76.51, 69.24, 62.04, 55.13, 52.58, 52.24, 39.95, 26.15, 26.14, 22.09, 15.83.

（10）化合物10：

白色粉末，HRMS给出m/z: 247.0599[M+1]⁺，分子式：C₁₃H₁₀O₅，¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.41 (1H, s), 7.11 (1H, s), 6.85 (1H, s), 5.54 (1H, t, J = 5.8 Hz),4.59 (2H, d, J = 5.6 Hz), 3.22 – 3.07 (2H, m), 2.64 – 2.57 (2H, m). ¹³C NMR(126 MHz, DMSO-d6) δ198.13, 192.20, 178.51, 161.47, 156.61, 153.46, 117.63,110.37, 109.40, 105.33, 62.58, 34.39, 26.45.

实施例2 NCC0415的发酵和含新色原酮类化合物粗提取物的制备

（a）制备弯头曲霉（Aspergillus deflectus）NCC0415的种子液

同实施例1。

（b）制备弯头曲霉（Aspergillus deflectus）NCC0415的发酵培养物

将种子液以3%的接种量接种于装有150 mL液体发酵培养基的1000mL三角瓶中，于22℃、220rpm振摇培养192h，得到发酵培养物。发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖10克、可溶性淀粉50克、热榨黄豆饼粉20克、棉籽粉4克、磷酸二氢钾10克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，碳酸钙2 克，加自来水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

（c）含色原酮类化合物的粗浸膏的制备

上述发酵培养物10L，3000 rpm离心15 min，收集菌体，上清液弃去。菌体用等体积丙酮浸泡三次（2.0小时/次），过滤，滤液减压浓缩得到粗浸膏42g。

实施例 3 NCC0415的发酵和含新色原酮类化合物粗提取物的制备

（a）制备弯头曲霉（Aspergillus deflectus）NCC0415的种子液

同实施例1。

（b）制备弯头曲霉（Aspergillus deflectus）NCC0415的发酵培养物

将种子液以3%的接种量接种于装有150 mL液体发酵培养基的1000mL三角瓶中，于30℃、220rpm振摇培养120h，得到发酵培养物。发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖50克、可溶性淀粉10克、热榨黄豆饼粉4克、棉籽粉20克、磷酸二氢钾1.0克、氯化钠0.5克、七水硫酸镁2.0克，碳酸钙2 克，加自来水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

（c）含色原酮类化合物的粗浸膏的制备

上述发酵培养物10L，3000 rpm离心15 min，收集菌体，上清液弃去。菌体用等体积乙酸乙酯浸泡四次（2.0小时/次），过滤，滤液减压浓缩得到粗浸膏48g。

实施例4. 化合物1-10对 IMPDH的抑制活性

利用体外重组表达II 型人IMPDH, 并采用改进后的Magasanik报道的IMPDH酶测定方法（Magasanik等人，J. Bio1. Chem., 226, p. 339 (1957)，通过在340 nm监测由于形成NADH所致的吸收度增加来以分光光度法测定酶活性。该反应混合物含有0.1M Tris、0.1 MKcl、3 mM EDTA、5mM IMP和浓度为15-50nM的酶（Ⅱ型人IMPDH）。将该溶液在37℃培养15分钟。通过加入终浓度为5mM的NAD来开始反应，并通过在340 nm的吸收度线性增加(30分钟)来测定初始速度。

化合物抑制活性的测定：即将测试化合物溶于DMSO中，并1-2微升加入到96孔板中，再加入含有酶的反应混合物中，先预培养15分钟。然后加入NAD来开始反应，30分钟后，测定340nm处的光吸收，并计算抑制率。IC₅₀值为抑制酶活性一半时的抑制剂浓度。

表1 化合物1-10对IMPDH抑制活性

实施例5. 化合物1-10的抗HBV病毒复制活性

实验材料: 细胞：HepG2 2.15 细胞，HepG2, 含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基，和含2%FBS、1%双抗的DMEM培养基，96孔板细胞培养板，HBsAg、HBeAg的ELISA 试剂盒。

细胞培养与活性测定：HepG2.2.15细胞培养在T25培养瓶中，待细胞长满后，胰酶消化，用10%血清DMEM培养基铺至96孔板中，每孔细胞量为100ul，等细胞贴壁完全后，开始换用含有药物的2%FBS的100ul培养基，隔天换药一次，在第8-12天，收集上清，采用ELISA试剂盒检测细胞上清中的HBsAg、HBeAg含量，并计算药物对HBsAg、HBeAg的抑制情况。

表2 化合物1-10抗HBV增殖的IC₅₀ (μg/mL)

实施例6. 化合物1-10的抗肿瘤细胞增殖活性

将肿瘤细胞在T25培养瓶中培养到长满，然后对肿瘤细胞进行胰酶消化、计数，以每孔约为1-2×10⁴细胞数铺至96孔板，待细胞贴壁后加入不同稀释浓度的测试样品，5%CO2、37℃条件下孵育48 h后,每孔加入MTT 溶液20μL(5 mg/L),继续孵育6 h,取出吸取培养基,每孔加入DMSO 100μL,振荡5 min,在570 nm波长条件下测量吸光度值,按以下公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(1-实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)×100%。

表3 化合物1-10抗肿瘤细胞增殖的IC₅₀ (μg/mL)

实施例7. 化合物1-10对小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制活性

按常规方法制备脾淋巴细胞悬液，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液重悬，调整细胞浓度1×10⁶，加入96孔细胞培养板100μl/孔，同时根据实验设计加入待测药液。利用ConA诱导小鼠脾T淋巴细胞增殖，阴性对照用相应培养液代之，阳性对照霉酚酸（MYC），平行设3个复孔。置5%CO₂，37℃培养箱培养48h后，MTT法染色，37℃湿盒过夜，用Victor2 1420多标记数仪检测各孔光吸收( OD)值，检测波长λ=570nm，参考波长λ=630nm。并计算脾淋巴细胞增殖抑制率IC₅₀(μg/mL)。

表4 化合物1-10对小鼠脾细胞的增殖抑制IC₅₀ (μg/mL)