氧杂蒽酮类化合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 氧杂蒽酮类化合物及其制备方法和应用 (Xanthone compound and preparation method and application thereof ) 是由 谢赛赛 张志鹏 刘婧 程茂军 郭杰 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一系列氧杂蒽酮类化合物及其制备方法和应用,所述氧杂蒽酮类化合物具有下述式4或5所示结构,其中式4化合物由卤代烃中间体和芐胺类化合物以亚甲基偶联所得,式5化合物由式4化合物和异氰酸酯在催化剂存在下反应而得。申请人的试验表明,大部分目标化合物能透过血脑屏障,部分目标化合物具有较强的自由基清除能力且能够有效抑制乙酰胆碱酯酶,体内药效试验表明能够通过提高脑内胆碱酯酶的水平改善认知损伤。所述式4和式5结构如下：其中n＝1-12；R-1为H、Me、Et或正丙基；R-2为H、OH、OCH-3或N(CH-3)-2；R-3表示H、OH、OCH-3或N(CH-3)-2；R-4表示Et、氯乙基或环己基。(The invention discloses a series of xanthone compounds and a preparation method and application thereof, wherein the xanthone compounds have a structure shown in a formula 4 or 5, wherein the compound shown in the formula 4 is obtained by coupling a halogenated hydrocarbon intermediate and a benzylamine compound with methylene, and the compound shown in the formula 5 is obtained by reacting the compound shown in the formula 4 with isocyanate in the presence of a catalyst. The experiments of the applicant show that most target compounds can penetrate through a blood brain barrier, part of target compounds have strong free radical scavenging capacity and can effectively inhibit acetylcholinesterase, and in-vivo efficacy experiments show that cognitive impairment can be improved by improving the level of intracerebral cholinesterase. The structures of the formulas 4 and 5 are as follows: wherein n is 1-12; r 1 Is H, Me, Et or n-propyl; r 2 Is H, OH, OCH 3 Or N (CH) 3 ) 2 ；R 3 Represents H, OH, OCH 3 Or N (CH) 3 ) 2 ；R 4 Represents Et, chloroethyl or cyclohexyl.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及氧杂蒽酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是最严重、最普遍的神经退行性疾病之一，影响着全球范围内约4600万人，给家庭和社会造成了巨大的经济损失。根据国际阿尔茨海默病协会报告，到2030年，AD的人口将增加到6600万，到2050年将增加到1.15亿。临床证据表明，AD是一种以发展性记忆丧失，严重的行为异常，认知功能障碍和最终死亡为特征的复杂疾病。尽管AD的病因尚不完全清楚，但包括乙酰胆碱(ACh)缺失，β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积，氧化应激，生物金属代谢失调和神经炎症在内的多种因素已被公认为在AD的发作和发展中起着至关重要的作用。研究表明，在重度AD患者的大脑中，乙酰胆碱酯酶(AChE)的水平下降到正常水平的10-15％，而丁酰胆碱酯酶(BuChE)的水平已经超过了正常水平。
尽管已经提出了多种潜在的AD治疗策略，到目前为止，只有4种药物(利凡斯的明、加兰他敏、多奈哌齐和美金刚)被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床治疗。虽然它们仍然是治疗AD的最有效药物，但它们只能暂时地缓解症状。
氧杂蒽酮是一种异三环化合物，它是一种重要的有机合成中间体，其母体本身并不存在于植物体内，但其衍生物广泛存在于自然界中，是药用植物的有效成分之一。药理研究表明，在一些天然中草药物中，其含有的氧杂蒽酮类化合物具有非常广泛的药理活性，包括利尿、抗微生物、抗病毒、抗结核、抗癌、抗肝素等活性(连双双，氧杂蒽酮类化合物的研究进展，广东化工，2014年第2期p46-47)。目前尚未见有以甲基链偶联氧杂蒽酮和烷基苄胺并在氧杂蒽酮的邻位引入羟基形成的新化合物及其应用于AD治疗的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一系列结构新颖的氧杂蒽酮类化合物及其制备方法和应用。
本发明所述的氧杂蒽酮类化合物为具有下述式4或式5所示结构的氧杂蒽酮类化合物或其药学上可接受的盐：
其中，n＝1-12；R1表示H、Me、Et或n-propyl；R2表示H、OH、OCH3或N(CH3)2；R3表示H、OH、OCH3或N(CH3)2；R4表示Et、CH3CH2Cl或Cyclohexyl。
上述技术方案中，优选地，n＝3-8；R1表示H、Me或Et；R2表示H、OH或OCH3；R3表示H、OH或OCH3；R4表示Et、CH3CH2Cl或Cyclohexyl。
进一步优选地，上述式4所示结构的氧杂蒽酮类化合物具体为下述4a-n中的至少一种化合物，而上述式5所示结构的氧杂蒽酮类化合物具体为下述5a-f中的至少一种化合物：
上述技术方案中，氧杂蒽酮类化合物药学上可接受的盐具体可以是氧杂蒽酮类化合物的盐酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、硫酸盐、马来酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、乙磺酸盐、苯甲酸盐或对甲苯磺酸盐等。
本发明提供的上述式4或式5所示结构的氧杂蒽酮类化合物的制备方法分别如下：
所述式4所示化合物的制备方法包括：取下述式3所示卤代烃中间体和式A所示芐胺类化合物在第一有机溶剂中于加热条件下反应，反应结束后回收溶剂，得到式4所示化合物粗品；
上述式3和式A所示结构中，n＝1-12；R1表示H、Me、Et或n-propyl；R2表示H、OH、OCH3或N(CH3)2；R3表示H、OH、OCH3或N(CH3)2；
所述式5所示化合物的制备方法包括：取下述式4所示化合物和式B所示异氰酸酯在第二有机溶剂中，在催化剂存在的条件下反应，反应结束后回收溶剂，得到式5所示化合物粗品；其中，所述的催化剂为选自三乙胺、三乙烯二胺、二月桂酸二丁基锡和辛酸亚锡中的一种或两种以上的组合。
上述式4和式B所示结构中，n＝1-12；R1表示H、Me、Et或n-propyl；R2表示H、OH、OCH3或N(CH3)2；R3表示H、OH、OCH3或N(CH3)2；R4表示Et、CH3CH2Cl或Cyclohexyl。
在式4所示化合物的制备方法中，式3所示卤代烃中间体可参考现有文献进行合成(Jie Liu,Cao Zhang,Huailing Wang,Lei Zhang,Zhenlei Jiang,Jianrun Zhang,ZhijunLiu,Heru Chen，Incorporation of nitric oxide donor into 1,3-dioxyxanthonesleads to synergistic anticancer activity,European Journal of MedicinalChemistry 151(2018)158-172.)，或者自行设计路线合成。式3所示卤代烃中间体和式A所示芐胺类化合物的摩尔比通常为化学计量比。所述的第一有机溶剂为选自乙腈、乙醇、甲醇、丙醇、四氢呋喃、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环和水中的一种或两种以上的组合，其用量可以根据需要进行确定，通常情况下，以1mmol的式3所示卤代烃中间体为基准计算，第一有机溶剂的用量一般为20-25mL。
在式4所示化合物的制备方法中，为了加快反应的速率，优选是在反应之前加入缚酸剂。所述的缚酸剂的选择及其用量与现有技术相同，具体的，缚酸剂可以是选自氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、三乙胺、吡啶和N,N-二异丙基乙胺中的一种或两种以上的组合，其加入量为式3所示卤代烃中间体物质的量的1-2倍。进一步的，为了进一步提高反应的速率并提高反应产率，优先是在反应之前加入催化剂，所述的催化剂具体为碘化钠和/或碘化钾；催化剂的加入量优选为式3所示卤代烃中间体物质的量的1-2倍。该方法中，反应优选是在50℃至第一有机溶剂的沸点温度范围内进行，更优选反应在60-80℃条件下进行。反应可采用薄层层析跟踪监测。
由上述式4所示化合物制备方法制得的是式4所示化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高式4所示化合物的纯度。通常是将制得的式4所示化合物粗品上硅胶柱层析以得到纯化后式4所示化合物。当将式4所示化合物粗品上硅胶柱层析进行纯化时，采用由二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂作为洗脱剂，其中二氯甲烷可以用石油醚、氯仿、环己烷、丙酮或四氯化碳替代；甲醇可以用正丁醇或水替代。在混合溶剂的组成中，二氯甲烷(或石油醚等)和甲醇(或正丁醇等)的体积比优选为20-50：1，更优选为20-40：1，最优选为30：1。
在式5所示化合物的制备方法中，式4所示化合物和式B所示异腈酸酯的摩尔比通常为化学计量比。所述的第二有机溶剂为选自甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的一种或两种以上的组合，其用量可以根据需要进行确定，通常情况下，以1mmol的式4所示化合物为基准计算，第二有机溶剂的用量一般为20-25mL。
在式5所示化合物的制备方法中，反应可以在加热或不加热的条件下进行。优选反应在不加热条件下进行，进一步优选反应在室温条件下进行。反应可以采用薄层层析跟踪监测。所述反应完成后回收溶剂得到目标产物粗品的操作也可以采用以下操作替代：将反应所得溶液倒入水中，搅拌后用萃取剂(如乙酸乙酯等)萃取，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压过滤收集滤液，浓缩后即为目标产物粗品。
由上述式5所示化合物制备方法制得的是式5所示化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高式5所示化合物的纯度。通常是将制得的式5所示化合物粗品上硅胶柱层析以得到纯化后式5所示化合物。当将式5所示化合物粗品上硅胶柱层析进行纯化时，采用由二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂作为洗脱剂，其中二氯甲烷可以用石油醚、氯仿、环己烷、丙酮或四氯化碳替代；甲醇可以用正丁醇或水替代。在混合溶剂的组成中，二氯甲烷(或石油醚等)和甲醇(或正丁醇等)的体积比优选为30-80：1，更优选为40-60：1，最优选为50：1。
本发明还包括上述式4或式5所示化合物或其药学上可接受的盐在制药中的应用，具体为：在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用，在制备治疗阿尔茨海默病的药物或者是在制备改善阿尔茨海默病的保健品中的应用。
本发明还包括一种抑制乙酰胆碱酯酶的药物，它含有治疗上有效剂量的式4或式5所示化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的辅料。
本发明进一步还包括一种治疗阿尔茨海默病的药物，它含有治疗上有效剂量的式4或式5所示化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的辅料。
上述药物的剂型可以是药学上可接受的任意剂型，具体可以是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊或注射剂等常规剂型。
与现有技术相比，本发明提供了一系列结构新颖的氧杂蒽酮类化合物及它们的制备方法，利用亚甲基链偶联氧杂蒽酮和烷基苄胺片段使所得化合物获得AChE和BuChE的双胆碱酯酶抑制能力；此外，通过在氧杂蒽酮的邻位引入羟基与其以分子内氢键作用形成六元环，这一结构为所得化合物带来了额外的抗氧化能力和金属离子螯合能力。申请人的试验结果表明，大部分氧杂蒽酮类化合物都能透过血脑屏障到达治疗靶点，部分氧杂蒽酮类化合物具有较强的自由基清除能力且能够有效抑制乙酰胆碱酯酶，体内药效试验表明能够通过提高脑内胆碱酯酶的水平改善认知损伤，具有很好的潜在药用价值，有望用于制备治疗阿尔茨海默病等病症的药物。
附图说明
图1为实验例4中小鼠口服不同剂量的化合物4j后对体重的影响曲线图。
图2为小鼠跳台实验图，其中A表示小鼠潜伏时间的柱状图，B表示小鼠错误次数的柱状图，图中，#p<0.05，###P<0.001：与对照组相相比；*P<0.05，**P<0.01：与模型组相比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
1)式2所示化合物的制备：
在单口烧瓶中加入适量ZnCl2(15eq)，加入POCl3溶液(25eq)溶解，升温至75℃。搅拌下加入适量间苯三酚(1.2eq)和水杨酸(1eq)于75℃下反应2小时。反应结束后冷却至室温，将溶液倒入冰水浴中搅拌10分钟后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压过滤得到滤液后拌样过硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝25：3，体积比)即得目标产物。
2)式3所示化合物的制备：
将式2所示化合物(1eq)，碳酸钾(2eq)和不同长度的二溴代烷(50eq)溶于适量DMF中室温下搅拌反应6小时。反应结束后，抽滤，滤液旋干过硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝30：1，体积比)即得目标产物3a-f，结构如下述表1所示。
表1式3所示化合物的具体结构
3)式4a-n所示化合物的制备：
其中，n＝3-8；R1表示H、Me或Et；R2表示H、OH或OCH3；R3表示H、OH或OCH3。
将3a-f所示化合物(1eq)溶于适量乙腈中，加入碘化钠(1.1eq)，三乙胺(1.5eq)和相对应的烷基苄胺(1.2eq)，升温至回流反应9-12小时。反应结束后冷却，减压蒸除溶剂，残余物过硅胶柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝30：1，体积比)，即得目标产物4a-n，结构如下述表2所示。
4)式5a-f的制备如下：
其中，R4表示Et、CH3CH2Cl或Cyclohexyl。
将化合物4j(1eq)或4n(1eq)溶于适量DMF中，加入三乙胺(2eq)和相对应的异氰酸酯(5eq)，氮气保护下室温搅拌36-48小时。反应结束后，将溶液倒入水中搅拌5分钟后用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压过滤得到滤液后拌样过硅胶柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1，体积比)，即得目标产物5a-f，结构如下述表2所示。
表2式4和式5所示化合物的具体结构
各目标产物及其表征如下：
化合物4a：产率69％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,1H),9.72(s,1H),8.17(d,J＝7.8Hz,1H),7.90(t,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(t,J＝7.8Hz,1H),7.27(s,1H),6.89(d,J＝28.2Hz,3H),6.66(s,1H),6.40(s,1H),4.36(s,1H),4.22(s,3H),3.18(s,2H),2.72(s,3H),2.18(s,2H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.68,165.99,163.08,158.09,157.78,155.96,136.54,130.41,125.82,125.15,121.94,120.33,118.27,117.00,103.74,98.01,93.79,66.31,59.10,55.41,52.51,27.02.HRMS:calcd forC24H24NO5[M+H]+406.1649,found 406.1604.
化合物4b：产率71％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.82(s,1H),9.72(s,1H),8.17(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.92–7.89(m,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),7.53–7.50(m,1H),7.26(t,J＝7.8Hz,1H),6.93–6.91(m,2H),6.86(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),6.66(d,J＝2.4Hz,1H),6.42(d,J＝2.4Hz,1H),4.33(d,J＝12.0Hz,1H),4.17(t,J＝6.0Hz,3H),3.21(s,1H),3.10–3.09(m,1H),2.69(s,3H),1.88–1.77(m,4H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.60,166.36,163.07,157.93,157.77,155.93,136.44,130.04,125.78,125.07,120.31,118.23,103.57,97.95,93.72,68.64,55.72,48.94,30.57,29.47.HRMS:calcd for C25H26NO5[M+H]+420.1805,found 420.1757.
化合物4c：产率65％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,1H),9.73(s,1H),8.17(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),7.91–7.88(m,1H),7.63(d,J＝8.3Hz,1H),7.52–7.50(m,1H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),6.93–6.86(m,3H),6.66(d,J＝2.4Hz,1H),6.42(d,J＝2.4Hz,1H),4.32(d,J＝12.0Hz,1H),4.15(t,J＝6.3Hz,3H),3.13–3.09(m,2H),2.65(s,3H),1.81–1.74(m,4H),1.47–1.42(m,2H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.61,166.44,163.09,158.08,157.79,155.94,136.47,131.77,130.44,125.79,125.10,121.98,120.32,118.26,118.23,116.98,103.57,97.94,93.73,68.72,58.94,55.21,46.22,28.23,23.40,23.01.HRMS:calcd for C26H28NO5[M+H]+434.1962,found 434.1902.
化合物4d：产率67％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,J＝7.8,1.8Hz,1H),9.72(s,1H),8.16(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),7.91–7.88(m,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.52–7.49(m,1H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),6.92–6.86(m,3H),6.65(d,J＝1.8Hz,1H),6.41(d,J＝2.4Hz,1H),4.31(d,J＝11.4Hz,1H),4.14(t,J＝6.0Hz,3H),3.12–3.09(m,1H),3.00(s,1H),2.67(s,3H),1.79–1.69(m,4H),1.47–1.43(m,2H),1.36–1.34(m,2H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.60,166.50,163.09,158.07,157.80,155.94,136.46,131.81,130.44,125.79,125.09,121.95,120.32,118.23,116.96,103.55,97.92,93.70,68.94,58.93,55.25,46.21,28.52,26.07,25.38,23.66.HRMS:calcd for C27H30NO5[M+H]+448.2118,found 448.2050.
化合物4e：产率68％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.80(s,1H),9.72(s,1H),8.16(d,J＝7.8Hz,1H),7.89(t,J＝8.4Hz,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(t,J＝7.8Hz,1H),7.26(t,J＝7.2Hz,1H),6.91–6.85(m,3H),6.65(s,1H),6.40(s,1H),4.29(s,1H),4.13(d,J＝6.0Hz,3H),3.04(d,J＝54.6Hz,2H),2.66(s,3H),1.42(d,J＝6.6Hz,2H),1.37–1.22(m,8H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.60,166.53,163.08,158.07,157.79,155.93,136.45,130.43,125.78,125.08,121.92,120.31,118.23,116.93,103.53,97.91,93.69,69.04,58.96,55.32,28.68,28.59,26.34,25.62.HRMS:calcd for C28H32NO5[M+H]+462.2275,found 462.2183.
化合物4f：产率65％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,1H),9.72(s,1H),8.16(d,J＝6.0Hz,1H),7.89(t,J＝8.4Hz,1H),7.62(d,J＝7.8Hz,1H),7.52–7.49(m,1H),7.27(t,J＝7.8Hz,1H),6.91–6.85(m,3H),6.65(d,J＝1.8Hz,1H),6.40(d,J＝1.2Hz,1H),4.29(s,1H),4.13(t,J＝6.0Hz,3H),3.08(s,1H),2.98(s,1H),2.66(s,3H),1.77–1.67(m,4H),1.43–1.40(m,2H),1.33–1.30(m,6H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.59,166.54,163.08,158.07,157.79,155.93,136.44,131.81,130.43,125.78,125.07,121.93,120.32,118.23,116.94,103.52,97.91,93.69,69.07,58.92,55.29,28.88,28.86,28.78,26.35,25.75,23.69.HRMS:calcd for C29H34NO5[M+H]+476.2431,found 476.2363.
化合物4g：产率61％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.82(s,1H),9.81(s,1H),8.17(d,J＝8.4Hz,1H),7.92–7.89(m,1H),7.64(d,J＝8.4Hz,1H),7.52(d,J＝7.2Hz,1H),7.33(d,J＝7.8Hz,2H),6.84(d,J＝9.0Hz,2H),6.66(s,1H),6.41(s,1H),4.32(s,1H),4.22(d,J＝6.0Hz,3H),3.29(s,2H),2.70(s,3H),2.18(s,2H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.67,165.95,163.07,158.97,157.77,155.95,136.54,133.21,125.81,125.15,120.31,118.27,116.01,103.74,98.00,93.79,66.27,58.79,52.02,46.23,23.85.HRMS:calcd for C24H24NO5[M+H]+406.1649,found 406.1608.
化合物4h：产率59％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.82(s,1H),9.80(s,1H),8.17(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.92–7.89(m,1H),7.64(d,J＝8.4Hz,1H),7.52(d,J＝7.2Hz,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),6.82(d,J＝8.4Hz,2H),6.67(d,J＝2.4Hz,1H),6.43(d,J＝1.8Hz,1H),4.28(d,J＝12.0Hz,1H),4.18–4.14(m,3H),3.18(s,1H),3.04(s,1H),2.66(s,3H),1.87–1.77(m,4H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.64,166.26,163.09,158.96,157.79,155.95,136.50,133.23,125.80,125.13,120.33,118.25,115.99,103.63,97.98,93.78,68.39,58.63,54.47,46.21,25.91,20.85.HRMS:calcd for C25H26NO5[M+H]+420.1805,found 420.1746.
化合物4i：产率63％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,1H),9.81(s,1H),8.16(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.91–7.88(m,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(d,J＝7.2Hz,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H),6.66(d,J＝2.4Hz,1H),6.41(d,J＝1.8Hz,1H),4.28(d,J＝12.6Hz,1H),4.15(d,J＝6.0Hz,2H),4.11(d,J＝9.0Hz,1H),3.10(d,J＝4.8Hz,1H),2.98(s,1H),2.65(s,3H),1.80–1.73(m,4H),1.46–1.42(m,2H).13CNMR(151MHz,DMSO)δ180.61,166.44,163.08,158.95,157.79,155.93,136.47,133.20,125.79,125.09,120.31,118.23,116.01,103.56,97.93,93.72,68.73,58.62,54.72,38.97,28.23,23.45,23.03.HRMS:calcd for C26H28NO5[M+H]+434.1962,found 434.1897.
化合物4j：产率70％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,1H),9.80(s,1H),8.17(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.91–7.88(m,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H),6.66(d,J＝2.4Hz,1H),6.41(d,J＝1.8Hz,1H),4.27(d,J＝12.6Hz,1H),4.15–4.10(m,3H),3.09(s,1H),2.95(s,1H),2.65(s,3H),1.78–1.68(m,4H),1.47–1.42(m,2H),1.37–1.33(m,2H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.61,166.51,163.09,158.94,157.80,155.94,136.47,133.18,125.79,125.09,120.32,118.24,116.01,103.55,97.93,93.71,68.94,58.62,54.79,46.21,28.52,26.09,25.37,23.71.HRMS:calcd for C27H30NO5[M+H]+448.2118,found 448.2060.
化合物4k：产率75％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,1H),9.79(s,1H),8.17(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.91–7.89(m,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),7.52–7.50(m,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H),6.66(d,J＝1.8Hz,1H),6.41(d,J＝1.8Hz,1H),4.26(d,J＝13.2Hz,1H),4.14(t,J＝6.6Hz,3H),3.00–2.95(m,2H),2.64(s,3H),1.77–1.70(m,4H),1.44–1.41(m,2H),1.37–1.35(m,2H),1.23(t,J＝4.8Hz,2H).13CNMR(151MHz,DMSO)δ180.62,166.55,163.09,158.94,157.82,155.94,136.48,133.19,125.79,125.10,120.40,120.33,118.25,116.00,103.55,97.94,93.72,69.06,58.59,54.83,53.15,28.68,28.57,26.33,25.61,25.51.HRMS:calcd for C28H31NO5[M+H]+462.2275,found 462.2193.
化合物4l：产率81％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,1H),9.80(s,1H),8.16(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.91–7.88(m,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H),6.65(d,J＝1.8Hz,1H),6.40(d,J＝2.4Hz,1H),4.25(d,J＝12.6Hz,1H),4.14–4.10(m,3H),3.06(s,1H),2.94(s,1H),2.64(s,3H),1.77–1.72(m,2H),1.68–1.64(m,2H),1.43–1.39(m,2H),1.35–1.30(m,6H).13CNMR(151MHz,DMSO)δ180.62,166.56,163.10,158.95,157.81,155.95,136.47,133.18,125.79,125.09,120.33,118.25,116.01,103.54,97.93,93.71,69.08,58.62,54.83,46.22,28.88,28.85,28.78,26.36,25.74,23.74.HRMS:calcd for C29H34NO5[M+H]+476.2431,found 476.2357.
化合物4m：产率69％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.88(s,1H),8.27(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),7.74–7.71(m,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,1H),7.41–7.38(m,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),6.88(d,J＝9.0Hz,2H),6.44(d,J＝2.4Hz,1H),6.36(d,J＝2.4Hz,1H),4.06(t,J＝6.0Hz,2H),3.82(s,3H),3.49(s,2H),2.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.23(s,3H),1.86–1.82(m,2H),1.62–1.57(m,2H),1.52–1.47(m,2H),1.43–1.40(m,2H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ180.78,166.34,163.52,158.73,157.74,156.04,134.96,130.38,125.87,123.98,120.66,117.58,113.61,103.83,97.46,93.24,68.62,61.51,56.96,55.25,41.93,28.91,27.09,27.05,25.86.HRMS:calcd for C28H32NO5[M+H]+462.2275,found 462.2187.
化合物4n：产率74％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.74(s,1H),9.26(s,1H),8.15(d,J＝7.8Hz,1H),7.88(t,J＝7.8Hz,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(t,J＝7.2Hz,1H),7.07(d,J＝8.4Hz,2H),6.68(d,J＝8.4Hz,2H),6.63(s,1H),6.39(s,1H),4.10(t,J＝6.6Hz,2H),2.42–2.39(m,2H),2.34(t,J＝7.2Hz,2H),1.71(t,J＝7.2Hz,2H),1.42(t,J＝7.2Hz,2H),1.38(t,J＝7.8Hz,2H),1.30(t,J＝6.6Hz,4H),0.95(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ180.58,166.56,163.08,157.79,156.52,155.93,136.40,130.13,125.76,125.03,120.32,118.23,115.25,103.51,97.93,93.67,69.05,57.28,52.52,46.84,28.83,26.97,25.69,22.56,11.98.HRMS:calcd for C28H32NO5[M+H]+462.2275,found 462.2198.
化合物5a：产率48％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.88(s,1H),8.26(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.74–7.71(m,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.40–7.38(m,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.07(d,J＝8.4Hz,2H),6.44(d,J＝1.8Hz,1H),6.36(d,J＝2.4Hz,1H),5.19(s,1H),4.04(t,J＝6.6Hz,2H),3.47(s,2H),3.34–3.29(m,2H),2.37(t,J＝7.8Hz,2H),2.21(s,3H),1.83–1.81(m,2H),1.58–1.53(m,2H),1.47–1.45(m,2H),1.42–1.39(m,2H),1.24–1.21(m,3H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ180.81,166.40,163.45,158.45,157.74,156.05,149.92,134.99,129.81,125.83,123.99,121.29,120.63,117.60,103.81,97.50,93.28,68.68,61.78,59.01,57.00,42.26,36.12,28.91,27.19,26.98,25.79,15.11.HRMS:calcd for C30H35N2O6[M+H]+519.2489,found 519.2392.
化合物5b：产率45％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.88(br s,1H),8.27(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.74–7.71(m,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.41–7.36(m,3H),7.12(d,J＝8.4Hz,2H),6.44(d,J＝2.4Hz,1H),6.36(d,J＝1.8Hz,1H),5.09(s,1H),4.05(d,J＝6.0Hz,2H),δ3.70(t,J＝5.4Hz,2H),3.65–3.62(m,3H),3.56(t,J＝6.0Hz,1H),2.47(t,J＝7.2Hz,2H),2.29(s,3H),1.85–1.80(m,2H),1.65–1.60(m,2H),1.50–1.45(m,2H),1.43–1.39(m,2H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ180.80,166.35,163.47,157.74,157.37,156.05,150.11,134.99,130.27,125.86,123.99,121.44,120.64,117.60,103.83,97.49,93.27,68.60,61.36,56.68,43.89,42.99,41.84,28.87,26.89,26.66,25.74.HRMS:calcdfor C30H34ClN2O6[M+H]+553.2099,found 553.1986.
化合物5c：产率44％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.89(s,1H),8.27(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.74–7.71(m,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.41–7.38(m,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.09(d,J＝8.4Hz,2H),6.44(d,J＝2.4Hz,1H),6.37(d,J＝1.8Hz,1H),4.97(d,J＝7.8Hz,1H),4.05(t,J＝6.0Hz,2H),3.59–3.54(m,1H),3.49(s,2H),2.38(t,J＝7.2Hz,2H),2.22(s,3H),2.02(d,J＝9.0Hz,2H),1.85–1.73(m,8H),1.65–1.53(m,4H),1.48–1.46(m,2H),1.42–1.40(m,2H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ180.79,166.39,163.49,157.73,156.05,153.77,150.01,134.96,129.83,125.86,123.97,121.30,120.65,117.59,103.82,97.50,93.27,68.67,61.75,56.96,50.11,42.23,33.26,28.92,27.16,27.00,25.81,25.46,24.76.HRMS:calcd for C34H40N2O6[M+H]+573.2959,found 573.2837.
化合物5d：产率45％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.89(s,1H),8.27(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.74–7.72(m,1H),7.45(d,J＝7.8Hz,1H),7.39(d,J＝7.8Hz,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),7.07(d,J＝7.8Hz,2H),6.44(d,J＝2.4Hz,1H),6.37(d,J＝2.4Hz,1H),5.08(s,1H),4.03(d,J＝6.6Hz,2H),3.55(s,2H),3.33–3.31(m,2H),2.55–2.51(m,2H),2.44(t,J＝7.2Hz,2H),1.81(d,J＝6.6Hz,2H),1.51(t,J＝7.8Hz,2H),1.45–1.42(m,2H),1.39–1.37(m,2H),1.23(t,J＝7.2Hz,3H),1.05(d,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ180.80,166.42,163.48,157.73,156.06,154.62,149.78,134.97,129.58,125.86,123.97,121.22,120.65,117.59,103.81,97.50,93.29,68.69,57.50,52.75,47.27,36.12,28.93,26.99,25.75,15.14,11.72.HRMS:calcd for C31H37N2O6[M+H]+533.2646,found533.2527.
化合物5e：产率45％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.89(br s,1H),8.26(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.74–7.71(m,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.40–7.38(m,3H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.44(d,J＝2.4Hz,1H),6.36(d,J＝2.4Hz,1H),5.15(s,1H),4.03(d,J＝6.0Hz,2H),3.70(t,J＝5.4Hz,2H),3.64–3.62(m,3H),3.56(t,J＝6.0Hz,1H),2.61(s,2H),2.51(s,2H),1.82–1.80(m,2H),1.57(s,2H),1.47–1.42(m,2H),1.40–1.37(m,2H),1.11(s,3H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ180.82,166.38,163.48,157.74,157.45,156.06,154.63,135.00,130.01,125.87,124.00,121.35,120.65,117.60,103.83,97.50,93.29,68.63,64.33,57.24,52.51,43.00,42.14,28.89,26.91,25.70,11.30.HRMS:calcd forC31H36ClN2O6[M+H]+567.2256,found 567.2134.
化合物5f：产率43％，黄色固体粉末。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.89(s,1H),8.27(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),7.74–7.72(m,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.41–7.38(m,1H),7.33(t,J＝7.8Hz,2H),7.07(d,J＝7.8Hz,2H),6.44(d,J＝2.4Hz,1H),6.37(d,J＝2.4Hz,1H),4.98(d,J＝7.8Hz,1H),4.03(t,J＝6.6Hz,2H),3.53(s,1H),3.50(s,2H),2.55–2.51(m,2H),2.45–2.43(m,2H),1.82–1.79(m,2H),1.65–1.60(m,4H),1.54–1.49(m,2H),1.38–1.35(m,6H),1.23(d,J＝10.2Hz,3H),1.07–1.04(m,4H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ180.80,166.41,163.49,157.73,156.76,156.06,149.82,134.96,129.99,129.57,129.41,125.86,123.97,121.21,120.66,117.60,115.08,103.81,97.50,93.29,68.69,57.49,52.75,50.10,47.25,33.96,28.93,27.00,26.85,25.62,24.95,11.84.HRMS:calcd for C35H43N2O6[M+H]+587.3115,found 587.2982.
实施例2：式4a-n所示化合物的制备：
其中，n＝3-8；R1表示H、Me或Et；R2表示H、OH或OCH3；R3表示H、OH或OCH3。
将3a-f所示化合物(1eq)溶于适量第一有机溶剂(目标化合物3a-b采用的溶剂为乙醇，目标化合物3c采用的溶剂为水，目标化合物3d采用的溶剂为丙酮，目标化合物3e采用的溶剂为四氢呋喃，目标化合物3f采用的溶剂为DMF)中，加入碘化钾(1eq)，缚酸剂(1.5eq，目标化合物3a-c采用的缚酸剂为碳酸钾，目标化合物3d采用的缚酸剂为吡啶，目标化合物3e采用的缚酸剂为氢氧化钠，目标化合物3f采用的缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺)和相对应的烷基苄胺(1.2eq)，升温至70℃反应至完全。反应结束后冷却，减压蒸除溶剂，残余物过硅胶柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝30：1，体积比)，对所得化合物分别进行结构表征(核磁共振氢谱、碳谱、高分辩质谱)，确定所得化合物分别为目标产物4a-n。
实施例3：式4a所示化合物的制备：
化合物3a(1eq)溶于适量乙腈中，加入三乙胺(1.5eq)和3-[(甲氨基)甲基]苯酚(1.2eq)，升温至回流反应至完全。反应结束后冷却，减压蒸除溶剂，过硅胶柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝30：1，体积比)得到黄色固体，经结构表征(核磁共振氢谱、碳谱、高分辩质谱)，确定为目标产物4a。
实施例4：式5a-f的制备：
其中，R4表示Et、CH3CH2Cl或Cyclohexyl。
将化合物4j(1eq)或4n(1eq)溶于适量第二有机溶剂(目标化合物5a-b采用的溶剂为乙醇，目标化合物5c-d采用的溶剂为甲醇，目标化合物5e-f采用的溶剂为四氢呋喃)中，加入催化剂(2eq，目标化合物5a-b采用的催化剂为三乙烯二胺，目标化合物5c-d采用的催化剂为二月桂酸二丁基锡，目标化合物5e-f采用的催化剂为辛酸亚锡)和相对应的异氰酸酯(5eq)，氮气保护下室温搅拌36-48小时。反应结束后，将溶液倒入水中搅拌5分钟后用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压过滤得到滤液后拌样过硅胶柱纯化(石油醚：正丁醇＝50：1，体积比)，对所得化合物分别进行结构表征(核磁共振氢谱、碳谱、高分辩质谱)，确定所得化合物分别为目标产物5a-f。
实验例1：本发明所述化合物的胆碱酯酶抑制能力实验
乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)抑制活性的测试方法参考Ellman法。将化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO),依次稀释成5个所需浓度。依次往96孔板中加入160μL的5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)溶液，50μL的AChE和10μL相应浓度的化合物于37℃下孵育5分钟，然后快速加入30μL的碘化乙酰胆碱底物。用酶标仪在405nm条件下测0,60,120和180秒的吸光度。丁酰胆碱酯酶的测试方法同上。结果如下述表3所示。
表3本发明所述化合物对AChE和BuChE的抑制活性
注：aAChE来源于电鳗，结果数值表示为至少三次独立测量的平均值±SD。
bBuChE来源于马血清，结果数值表示为至少三次独立测量的平均值±SD。
由表3可知,本发明所述氧杂蒽酮类化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶都具有一定的抑制活性。构效关系表明，胆碱酯酶抑制能力的变化随着化合物4a-l的亚甲基链长变化而变化。具体来说，化合物的亚甲基链碳原子个数为3时，其对胆碱酯酶的抑制能力较弱。当延长化合物的亚甲基链至4时，其胆碱酯酶的抑制能力有显著的提高，例如与4a相比，化合物4b对乙酰胆碱酯酶的抑制能力增加了8.8倍；与4g相比，化合物4h对丁酰胆碱酯酶的抑制能力增加了41倍。继续延长化合物的亚甲基链长至碳原子个数为7时，结果表明亚甲基链碳原子数为偶数的化合物的胆碱酯酶抑制能力优于相应的奇数化合物。进一步延长亚甲基链长至碳原子个数为8时，化合物对胆碱酯酶的抑制活性大幅下降，例如4e和4k的乙酰胆碱酯酶的抑制活性都降到了化合物100μM浓度下的42.6％的抑制率，而对丁酰胆碱酯酶的抑制能力则分别减弱了12倍和5.3倍。当化合物的亚甲基链碳原子个数为6时，化合物4j表现出最优的双靶点抑制能力，对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制能力分别为IC50＝0.85μM和IC50＝0.59μM。为了进一步加强化合物的胆碱酯酶抑制能力，在化合物4j的末端苯环羟基基础上接上甲基和氨基甲酸酯进行再优化得到化合物4m和5a-f。但从结果来看，氨基甲酸酯类化合物对胆碱酯酶的抑制能力反而减弱了。本申请人发明推测，末端苯环上的羟基可能会和胆碱酯酶相互作用形成氢键而起到抑制作用。因此，化合物4j有望对轻度及重度阿尔茨海默症有较好疗效。
实验例2：本发明所述化合物的抗氧化能力实验
采用DPPH、ABTS、ORAC法用来考察目标化合物的自由基清除能力，具体方法如下，结果如下述表4所示。
DPPH法。将DPPH和目标化合物溶解于DMSO制成储备液，用甲醇稀释成所需要浓度的工作液。分别取100μL DPPH工作液和5个不同浓度100μL的样品于96孔板中，摇晃混匀后于室温避光反应30min，用酶标仪在517nm条件下测量各孔的OD值，Trolox作为阳性药。该实验设置两个对照组，分别为不含目标化合物的对照组(DPPH溶液+甲醇溶液)和不含DPPH的对照组(甲醇溶液+样品溶液)。DPPH自由基清除率％＝1-(A1-A2)/A0,其中A1为DPPH溶液+样品溶液，A2为甲醇溶液+样品溶液，A0为DPPH溶液+甲醇溶液。实验重复三次取平均值，利用GraphPad软件计算化合物对DPPH的半数清除浓度(IC50)。
ABTS法。ABTS法使用碧云天S0119试剂盒按照说明书进行操作。先用等体积ABTS储备液和氧化剂储备液按1:1室温避光12-16小时反应，配制成ABTS工作母液。将目标化合物稀释成5个不同浓度的工作液。在96孔板的中加入190μL ABTS工作液，空白对照孔中加入10μL80％乙醇溶液，样品检测孔内加入10μL不同浓度的样品溶液，轻轻混匀。室温孵育5分钟后在405nm的酶标仪下检测，Trolox作为阳性药。该实验设置两组对照，分别为不含样品的对照组(ABTS溶液+乙醇溶液)和不含ABTS的对照组(乙醇溶液+样品溶液)。ABTS自由基清除率％＝1-(A1-A2)/A0,其中A1为样品溶液+ABTS工作液，A0为ABTS工作液+乙醇溶液，A2为样品溶液+乙醇溶液。实验重复三次取平均值，利用GraphPad软件计算化合物对ABTS的半数清除浓度(IC50)。
ORAC法。将自由基产生剂2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)和荧光素钠(FL)溶于pH＝7.4的10mM磷酸盐缓冲液，低温避光保存。将目标化合物溶解于DMSO配制成储备液，用50％丙酮的缓冲液稀释成所需浓度的工作液。在黑色96孔板中加入20μL的不同浓渡的样品工作液，120μL的FL工作液于37℃孵育5min，再在每孔中加入60μL的AAPH工作液启动反应，迅速放入酶标仪中检测。酶标仪设置37℃，激发波长485nm,发射波长538nm,每5min测一次荧光强度，测试90min，Trolox作为阳性药。ORAC实验设置不含抗氧化剂条件下的自由基清除作用的对照组(+AAPH)。各微孔的不同时间点的绝对荧光强度值与各起始荧光强度相比，折算成相对荧光强度f来计算荧光熄灭曲线下面积(AUC)，公式表达为AUC＝0.5×[2×(f0+f1+...+fn-1+fn)-f0-fn]×△t,其中△t表示测试间隔为5min，fn代表第n个测定点时的相对荧光强度。在抗氧化剂存在下的荧光衰退曲线下面积与无抗氧化剂存在下的荧光衰退曲线下面积之差，为抗氧化剂的保护面积即Net AUC。样品的抗氧化能力以Trolox的当量即ORAC表达，如1μM样品的Net AUC相当于3μM的Trolox的Net AUC，ORAC值为3。
表4本发明所述化合物对自由基的清除能力
注：a半数抑制浓度或1mM药物浓度下的DPPH自由基清除率。
b半数抑制浓度或100μM药物浓度下的ABTS自由基清除率。
cTrolox当量。
由表4可知，化合物对DPPH和ABTS自由基的清除能力浮动范围比较大，清除能力最好的是化合物4c。构效关系表明，化合物自由基清除能力的变化与化合物的亚甲基链长的长度和末端苯环上羟基的位置有关。例如4a-f和4g-l，化合物的自由基清除能力随着亚甲基链长度的增加而增加，然而末端苯环上带有间位羟基的化合物活性要优于带有对位羟基的化合物，这与上述对胆碱酯酶的活性规律是相反的。当把末端羟基置换成其它基团得到化合物5a-f后,化合物对DPPH和ABTS自由基清除能力急剧下降。同样，化合物在ORAC法下测得的自由基清除能力宽泛。其中，化合物4a-d,4h,4j,4n和5e的自由基淬灭能力强于阳性药Trolox(ORAC>1),淬灭能力最强的是化合物4b，接近于强自由基清除剂槲皮素。化合物结构变化对自由基淬灭能力与DPPH和ABTS方法测得的规律基本一致。
实验例3：本发明所述化合物的血脑屏障透过性实验
采用PAMPA-BBB人工膜法测定。采用猪脑磷脂构建体外透膜模型。通过测定9个具有不同血脑屏障透过性的市售药物，建立血脑屏障透过性曲线。
具体方法：PAMPA模型实验在96孔滤板中进行，配制浓度为2％的猪脑磷脂/十二烷(V/V)的溶液，超声溶解直至混合均匀。取该溶液5μL均匀加在PAMPA供给板各孔中的亲脂性滤膜上，静止5min,对照孔加入5μL的十二烷溶液。在接收板各孔中加入300μL的缓冲液(PBS/EtOH＝70:30,pH＝7.4)，在供给板各孔中加入150μL事先配置好的市售药或目标化合物(每个药物设三个复孔)，整个加药过程在10min内完成。将供给板放在接收板上，盖上盖子，将整个96孔滤板装置放置于25℃恒温培养箱中孵育16h。孵育结束后，收集供体板和接收板的溶液，测定浓度，依照公式：Pe＝{-VdVa/[(Vd+Va)At]}ln(1-drugacceptor/drugequilibrium)，计算透过率Pe，其中Vd为供体孔体积(mL)，Va为接收孔体积(mL)，A为滤膜面积(cm2)，t为渗透时间(s)，drugacceptor为t时间接收板溶液浓度，drugequilibrium为理论平衡吸收浓度。通过将已知标准药物的文献Pe值和实测Pe值比较建立的标准曲线，求出此次血脑屏障透过Pe值范围，判定化合物的透过性。市售的9个药物的血脑屏障渗透系数和本发明所述化合物的血脑屏障渗透系数分别如下述表5和6所示。
表5市售的9个药物的血脑屏障渗透系数
注：a数据来源于文献Eur.J.Med.Chem.2003,38:223–232。
b三次独立实验平均值，表示为平均值±SD。
表6目标化合物的血脑屏障渗透系数
注：a三次独立实验平均值，表示为平均值±SD。
bCNS+表示化合物可以透过血脑屏障,CNS－表示化合物不能透过血脑屏障，CNS±表示不能确定化合物是否可以透过血脑屏障。
实验结果表明，除了4f和5b不能明确是否可以透过血脑屏障，其余18个化合物都能透过血脑屏障到达治疗靶点。
实验例4：本发明所述化合物4j的急性毒性研究
具体实验方法：取健康昆明种18-20g的小鼠40只，随机分成4组，每组10只，雌雄各半，设置剂量2500mg/Kg、1250mg/Kg、625mg/Kg和溶媒组(0.5％的羧甲基纤维素钠溶液)。实验前12小时禁食不禁水，按30mL/Kg(最大灌胃体积)单次灌胃给药。给药后4小时内观察小鼠是否出现异常情况如呕吐、腹泻、摇晃、震颤或死亡。观察期为14天，每天记录小鼠的体重、排便、死亡等情况，第14天处死小鼠，取心、肝、肺、肾、脑器官，观察组织器官的病理变化。
不同剂量的4j口服后对小鼠体重的影响如图1所示。
实验结果表明，高浓度的化合物4j没有对小鼠造成异常行为或死亡，给药组小鼠的体重与溶媒组情况基本保持一致。表明化合物4j没有急毒，且耐受剂量达到2500mg/Kg。
实验例5：本发明所述化合物4j的体内药效研究
具体实验方法：取健康雄性昆明种18-20g的小鼠36只，随机分成六组，每组6只。将小鼠放入跳台箱内熟悉内部环境5min,设置跳台箱底部电流为0.4mA(24V)后打开装置开关通电，对小鼠进行训练，正常小鼠受到电击之后会跳上绝缘的平台躲避，训练期内不跳下平台的小鼠弃去不用。24小时后再进行实验。设置剂量为100mg/Kg、50mg/Kg、25mg/Kg和溶媒组、阳性药多奈哌齐组(10mg/Kg)、模型组(3mg/Kg的东莨菪碱)。实验前1小时通过口服灌胃的方式给予化合物4j的CMC-Na溶液和多奈哌齐溶液(10mg/kg),溶媒组给予相同剂量的CMC-Na溶液，30分钟后腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液进行造模，将训练后的动物重新放入跳台箱，熟悉5分钟后再次进行电流刺激，记录5分钟内小鼠第一次跳下跳台的时间(潜伏期,latency)和5分钟内小鼠跳下平台的次数(错误次数，number of errors)，根据潜伏期及错误次数评价药物体内药效。结果如图2所示。
实验结果表明，与溶媒组相比，注射了东莨菪碱的模型组有更短的潜伏时间和更多的错误次数，表明记忆损伤模型建造成功。经化合物4j治疗后，潜伏时间和错误次数在一定程度上以剂量依赖性方式逆转。比如，高剂量(100mg/Kg)和中等剂量(50mg/Kg)组延长了潜伏时间，接近于阳性药多奈哌齐。高剂量组的错误次数好于多奈哌齐，但是中剂量和低剂量(25mg/Kg)组不如多奈哌齐。综上所述，化合物4j能通过提高脑内胆碱酯酶的水平改善认知损伤。
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