阅读说明：本技术 一种固定化金属离子-磁性脂质体及其制备方法和应用 (Immobilized metal ion-magnetic liposome and preparation method and application thereof ) 是由 伍善广 陆苑 冯学珍 蒙华琳 陆玉婷 韦啟球 廖娜 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种固定化金属离子-磁性脂质体及其制备方法和应用。本发明的金属离子-磁性脂质体由磷脂、N-十六烷基亚氨基二乙酸包裹磁性纳米四氧化三铁,组成具有磷脂双层膜结构的大分子脂质体后,并在其表面负载、固定化过渡金属离子。与传统磁性脂质体制备方法不同,本发明采用原位反应法制备磁性脂质体,主要方法为将FeCl<Sub>3</Sub>·6H<Sub>2</Sub>O和FeCl<Sub>2</Sub>·4H<Sub>2</Sub>O溶液在一定温度、高速搅拌、氮气保护下,通过滴加氨水进行反应,然后加入磷脂-乙醇溶液获得磁性脂质体,再偶联过渡金属离子。本发明的固定化金属离子-磁性脂质体具备仿细胞膜亲和吸附及金属离子亲和吸附双重功能,制备方法简单,稳定性好。(The invention discloses an immobilized metal ion-magnetic liposome and a preparation method and application thereof. The metal ion-magnetic liposome is formed by wrapping magnetic nano ferroferric oxide with phospholipid and N-hexadecyl iminodiacetic acid, and then the macromolecular liposome with a phospholipid double-layer membrane structure is loaded and immobilized with transition metal ions on the surface. Different from the traditional preparation method of the magnetic liposome, the invention adopts an in-situ reaction method to prepare the magnetic liposome, and the main method is to use FeCl 3 ·6H 2 O and FeCl 2 ·4H 2 The O solution reacts by dripping ammonia water at a certain temperature under the protection of nitrogen gas and high-speed stirring, and then phospholipid-ethanol is addedThe solution is used to obtain magnetic liposome and then coupled with transition metal ions. The immobilized metal ion-magnetic liposome has the dual functions of imitating cell membrane affinity adsorption and metal ion affinity adsorption, and has simple preparation method and good stability.)

一种固定化金属离子-磁性脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及脂质体技术领域，具体涉及一种固定化金属离子-磁性脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

21世纪，随着生命科学的迅猛发展，利用新技术快速、高效地分离生物大分子越来越受到人们的关注。生物磁分离技术是一种在传统磁分离技术的基础上发展起来的新兴分离手段，以细胞、细菌、核酸和蛋白质等生物体为应用对象的高效分离技术，具有高效、快速、简易等优点；其是利用磁性或磁性标记生物体在外磁场作用下做定向运动这一特性，实现对目标生物体进行提取、富集、分离和纯化。

目前，固定化金属离子亲和技术易于制备、成本低，广泛应用于活性蛋白的分离，如分离组氨酸标记的重组多肽和重组蛋白质、磷酸化蛋白和细胞色素等。脂质体则是将磷脂分散在水中，在一定条件下，自动排列形成的类似于生物膜的磷脂双分子层结构。磁性粒子表面包覆一层脂质体可以作为一种模拟类生物膜功能粒子，可应用于生物磁分离。传统的活性蛋白的生物磁分离技术，须对样品液进行过滤、离心等复杂的前处理操作，分离效率低。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种固定化金属离子-磁性脂质体，由磷脂、N-烷基亚氨基二乙酸包裹磁性纳米四氧化三铁组成具有磷脂双层膜结构的大分子脂质体后，并在大分子脂质体表面负载、固定化过渡金属离子。

进一步的，所述固定化金属离子-磁性脂质体的磷脂含量为0-300μg/mg，过渡金属离子含量为0-100μmol/g。

进一步的，所述磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。

进一步的，所述N-烷基亚氨基二乙酸的烷基为C12-C18。

本发明所述的N-烷基亚氨基二乙酸可由本申请人申请的专利CN201711466648.8一种N-烷基亚氨基二乙酸的制备方法获得。

本发明的第二目的是提供上述固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤：原位反应法制备磁性脂质体，将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶液在氮气保护、高速搅拌下，通过滴加氨水进行反应，然后加入磷脂-乙醇溶液获得磁性脂质体；再融合N-烷基亚氨基二乙酸、偶联过渡金属离子，即可获得固定化金属离子-磁性脂质体。

进一步的，所述固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)以FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O为原料，通过化学共沉淀法制备磁性Fe₃O₄纳米颗粒；加入磷脂-乙醇溶液进行反应，得到磁性脂质体备用；

(2)磁性脂质体偶联过渡金属离子：

称取0.5-15g的N-烷基亚氨基二乙酸，用50-100mL 0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，得到N-烷基亚氨基二乙酸溶液，称取0.5-2.5g的磁性脂质体加入到N-烷基亚氨基二乙酸溶液中，50-55℃磁力搅拌80-90min；在外加磁场的作用下，取出磁性脂质体，用大量的去离子水清洗磁性脂质体；将清洗后的磁性脂质体置于离心管，加入50-200mL 0.005-0.2mol/L的NiSO₄溶液，在室温下振摇50-70min后，在外加磁场的作用下将磁性脂质体分离，并用大量的去离子水洗涤，即得固定化金属离子-磁性脂质体。

进一步的，步骤(1)的具体操作步骤如下：

称取1.3661g FeCl₃·6H₂O和0.5334g FeCl₂·4H₂O，溶解在100ml去离子水中，充分搅拌混匀，置于30℃恒温水浴中，在氮气保护、强力机械搅拌下，逐滴加入NH₃·H₂O，使溶液pH为8.5，反应30min后加入50-70mL0.5-1.5％(w/v)的磷脂-乙醇溶液，此时溶液中生成大量黑色颗粒，再升温至90℃，滴加1mol/L的NaOH，调节pH至12，强力搅拌30min，反应结束后，在外加磁场的作用下，将制得的黑色颗粒分离，并用大量的去离子水洗涤，即为磁性脂质体。

本发明的固定化金属离子-磁性脂质体是在磁性脂质体表面偶联过渡金属离子，兼具仿细胞膜亲和吸附及金属离子亲和吸附双重功能。

本发明的第三目的是提供上述固定化金属离子-磁性脂质体的应用，具体是用于活性蛋白的生物磁分离。

本发明具有以下优点和技术效果：

本发明的固定化金属离子-磁性脂质体是在磁性脂质体表面负载、固定化过渡金属离子，因此可以称之为固定化金属离子-磁性脂质体。固定化金属离子-磁性脂质体是将脂质体、磁分离和固定化金属离子亲和技术相结合所开发的一种生物磁分离材料，具有更优良的特性。本发明的固定化金属离子-磁性脂质体具备仿细胞膜亲和吸附及金属离子亲和吸附双重功能，稳定性好。本发明的制备原料易得，方法简单，条件温和，成本低廉，可成功制备固定化金属离子-磁性脂质体，易于放大生产。

本发明结合脂质体、磁分离和固定化金属离子亲和等多项技术，得到高稳定性、高选择性的表面偶联过渡金属离子的磁性脂质体。应用于活性蛋白的生物磁分离，无须对样品液进行过滤、离心等复杂的前处理操作，只需将固定化金属离子-磁性脂质体直接放入含有目标蛋白质的混合溶液中，目标蛋白质与固定化金属离子-磁性脂质体紧密结合，然后利用外部磁场的辅助作用迅速进行分离，大大提高了分离效率。

附图说明

图1为实施例1制备的固定化金属离子-磁性脂质体电镜扫描图(×60000)；

图2为实施例1制备的固定化金属离子-磁性脂质体粒径分布图。

具体实施方式

下面结合附图及具体的实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种固定化金属离子-磁性脂质体，由磷脂、N-烷基亚氨基二乙酸包裹磁性纳米四氧化三铁组成具有磷脂双层膜结构的大分子脂质体后，并在大分子脂质体表面负载、固定化过渡金属离子。

所述固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤：

分别称取1.3661g FeCl₃·6H₂O和0.5334g FeCl₂·4H₂O(Fe³⁺与Fe²⁺摩尔比为2：1)，溶解在100ml去离子水中，充分搅拌使之混匀，转移至500ml的三口烧瓶中。随后置于30℃恒温水浴中，氮气保护，强力机械搅拌，逐滴加入10mL NH₃·H₂O，使溶液pH约为8.5，反应30min后加入50mL0.5％(w/v)卵磷脂-乙醇溶液。此时溶液中生成大量黑色颗粒，再升温至至90℃。滴加1mol/L的NaOH，调节pH至12，搅拌30min。结束后，在外加磁场的作用下，将制得的黑色颗粒分离，并用大量的去离子水洗涤，即磁性脂质体备用。

称取5克N-烷基亚氨基二乙酸(烷基为C12)，用50mL 0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，再加入0.5g磁性脂质体，50℃磁力搅拌90min。在外加磁场的作用下，取出磁性脂质体，用大量的去离子水将磁性脂质体清洗。将清洗后的磁性脂质体粒子于离心管，加入50mL0.005mol/L NiSO₄。室温下，在振摇60min后，在外加磁场的作用下将磁性脂质体分离，并用大量的去离子水洗涤，即得固定化金属离子-磁性脂质体。

如图1所示，电子扫描显微镜显示实施例1所获得的固定化金属离子-磁性脂质体体形类似圆形，大小相近，分散性好。如图2所示，为激光纳米粒度分析仪测定实施例1所得的固定化金属离子-磁性脂质体粒径在300-700nm，平均粒径在600nm左右。

实施例2

一种固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤：

分别称取1.3661g FeCl₃·6H₂O和0.5334g FeCl₂·4H₂O(Fe³⁺与Fe²⁺摩尔比为2:1)，溶解在100ml去离子水中，充分搅拌使之混匀，转移至500ml的三口烧瓶中。随后置于30℃恒温水浴中，氮气保护，强力机械搅拌，逐滴加入10mL NH₃·H₂O，使溶液pH约为8.5，反应30min后加入70mL 1％(w/v)卵磷脂-乙醇溶液。此时溶液中生成大量黑色颗粒，再升温至至90℃。滴加1mol/L的NaOH，调节pH至12，搅拌30min。结束后，在外加磁场的作用下，将制得的黑色颗粒分离，并用大量的去离子水洗涤，即磁性脂质体备用。

称取10克N-烷基亚氨基二乙酸(烷基为C13)，用100mL 0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，再加入2g磁性脂质体，50℃磁力搅拌90min。在外加磁场的作用下，取出磁性脂质体，用大量去离子水将磁性脂质体清洗。将清洗后的磁性脂质体粒子于离心管，加入100mL0.1mol/L NiSO₄。室温下，振摇60min后，在外加磁场的作用下将磁性脂质体分离，并用大量的去离子水洗涤，即得固定化金属离子-磁性脂质体。

实施例3

一种固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤：

分别称取1.3661g FeCl₃·6H₂O和0.5334g FeCl₂·4H₂O(Fe³⁺与Fe²⁺摩尔比为2:1)，溶解在100ml去离子水中，充分搅拌使之混匀，转移至500ml的三口烧瓶中。随后置于30℃恒温水浴中，氮气保护，强力机械搅拌，逐滴加入10mL NH₃·H₂O，使溶液pH约为8.5，反应30min后加入60mL 1.5％(w/v)卵磷脂-乙醇溶液。此时溶液中生成大量黑色颗粒，再升温至至90℃。滴加加入1mol/L的NaOH，调节pH至12，搅拌30min。结束后，在外加磁场的作用下，将制得的黑色颗粒分离，并用大量的去离子水洗涤，即磁性脂质体备用。

称取15克N-烷基亚氨基二乙酸(烷基为C14)，用100mL 0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，再加入2.5g磁性脂质体，50℃磁力搅拌90min。在外加磁场的作用下，取出磁性脂质体，用大量的去离子水将磁性脂质体清洗。将清洗后的磁性脂质体粒子于离心管，加入200mL0.2mol/L NiSO₄。室温下，振摇60min后，在外加磁场的作用下将磁性脂质体分离，并用大量的去离子水洗涤，即得固定化金属离子-磁性脂质体。

实施例4

一种固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤：

分别称取1.3661g FeCl₃·6H₂O和0.5334g FeCl₂·4H₂O(Fe³⁺与Fe²⁺摩尔比为2:1)，溶解在100ml去离子水中，充分搅拌使之混匀，转移至500ml的三口烧瓶中。随后置于30℃恒温水浴中，氮气保护，强力机械搅拌，逐滴加入10mL NH₃·H₂O，使溶液pH约为8.5，反应30min后加入55mL 1.2％(w/v)大豆磷脂-乙醇溶液。此时溶液中生成大量黑色颗粒，再升温至至90℃。滴加加入1mol/L的NaOH，调节pH至12，搅拌30min。结束后，在外加磁场的作用下，将制得的黑色颗粒分离，并用大量的去离子水洗涤，即磁性脂质体备用。

称取8克N-烷基亚氨基二乙酸(烷基为C15)，用60mL 0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，再加入1g磁性脂质体，55℃磁力搅拌80min。在外加磁场的作用下，取出磁性脂质体，用大量的去离子水将磁性脂质体清洗。将清洗后的磁性脂质体粒子于离心管，加入80mL0.08mol/L NiSO₄。室温下，振摇50min后，在外加磁场的作用下将磁性脂质体分离，并用大量的去离子水洗涤，即得固定化金属离子-磁性脂质体。

实施例5

一种固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤：

分别称取1.3661g FeCl₃·6H₂O和0.5334g FeCl₂·4H₂O(Fe³⁺与Fe²⁺摩尔比为2:1)，溶解在100ml去离子水中，充分搅拌使之混匀，转移至500ml的三口烧瓶中。随后置于30℃恒温水浴中，氮气保护，强力机械搅拌，逐滴加入10mL NH₃·H₂O，使溶液pH约为8.5，反应30min后加入65mL 0.8％(w/v)二硬脂酰磷脂酰胆碱-乙醇溶液。此时溶液中生成大量黑色颗粒，再升温至至90℃。滴加加入1mol/L的NaOH，调节pH至12，搅拌30min。结束后，在外加磁场的作用下，将制得的黑色颗粒分离，并用大量的去离子水洗涤，即磁性脂质体备用。

称取11克N-烷基亚氨基二乙酸(烷基为C16)，用50mL 0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，再加入0.7g磁性脂质体，50℃磁力搅拌90min。在外加磁场的作用下，取出磁性脂质体，用大量的去离子水将磁性脂质体清洗。将清洗后的磁性脂质体粒子于离心管，加入60mL0.01mol/L NiSO₄。室温下，振摇60min后，在外加磁场的作用下将磁性脂质体分离，并用大量的去离子水洗涤，即得固定化金属离子-磁性脂质体。

实施例6

一种固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤：

分别称取1.3661g FeCl₃·6H₂O和0.5334g FeCl₂·4H₂O(Fe³⁺与Fe²⁺摩尔比为2:1)，溶解在100ml去离子水中，充分搅拌使之混匀，转移至500ml的三口烧瓶中。随后置于30℃恒温水浴中，氮气保护，强力机械搅拌，逐滴加入10mL NH₃·H₂O，使溶液pH约为8.5，反应30min后加入60mL 1.5％(w/v)棕榈酰油酰磷脂酰胆碱-乙醇溶液。此时溶液中生成大量黑色颗粒，再升温至至90℃。滴加加入1mol/L的NaOH，调节pH至12，搅拌30min。结束后，在外加磁场的作用下，将制得的黑色颗粒分离，并用大量的去离子水洗涤，即磁性脂质体备用。

称取9克N-烷基亚氨基二乙酸(烷基为C17)，用100mL 0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，再加入2.1g磁性脂质体，50℃磁力搅拌90min。在外加磁场的作用下，取出磁性脂质体，用大量的去离子水将磁性脂质体清洗。将清洗后的磁性脂质体粒子于离心管，加入150mL0.2mol/L NiSO₄。室温下，振摇70min后，在外加磁场的作用下将磁性脂质体分离，并用大量的去离子水洗涤，即得固定化金属离子-磁性脂质体。

实施例7

一种固定化金属离子-磁性脂质体的制备方法，包括如下步骤：

分别称取1.3661g FeCl₃·6H₂O和0.5334g FeCl₂·4H₂O(Fe³⁺与Fe²⁺摩尔比为2:1)，溶解在100ml去离子水中，充分搅拌使之混匀，转移至500ml的三口烧瓶中。随后置于30℃恒温水浴中，氮气保护，强力机械搅拌，逐滴加入10mL NH₃·H₂O，使溶液pH约为8.5，反应30min后加入60mL 1.5％(w/v)棕榈酰油酰磷脂酰胆碱-乙醇溶液。此时溶液中生成大量黑色颗粒，再升温至至90℃。滴加加入1mol/L的NaOH，调节pH至12，搅拌30min。结束后，在外加磁场的作用下，将制得的黑色颗粒分离，并用大量的去离子水洗涤，即磁性脂质体备用。

称取12克N-烷基亚氨基二乙酸(烷基为C18)，用100mL 0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解，再加入2.1g磁性脂质体，50℃磁力搅拌90min。在外加磁场的作用下，取出磁性脂质体，用大量的去离子水将磁性脂质体清洗。将清洗后的磁性脂质体粒子于离心管，加入150mL0.2mol/L NiSO₄。室温下，振摇70min后，在外加磁场的作用下将磁性脂质体分离，并用大量的去离子水洗涤，即得固定化金属离子-磁性脂质体。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。