降低纳豆激酶过敏性的组方及其应用
阅读说明：本技术 降低纳豆激酶过敏性的组方及其应用 (Formula for reducing nattokinase anaphylaxis and application thereof ) 是由 邓意辉 陈国良 梁凯帆 高�勋 傅凭平 冯瑞 宋艳志 刘欣荣 胡雅维 王硕 于 2018-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,提供了一种降低纳豆激酶过敏性的组方,所述的组方是将聚唾液酸、透明质酸与纳豆激酶形成静电复合物,达到降低纳豆激酶过敏性的目的。所述的静电复合物在微观结构上是一聚集体,将纳豆激酶进行包裹,减少纳豆激酶与生物环境的直接接触,并可逐渐释放纳豆激酶。所制备的静电复合物,提高了纳豆激酶在晚期肿瘤和陈旧性血栓等方面的疗效。(The invention belongs to the technical field of medicines, and provides a formula for reducing nattokinase anaphylaxis. The electrostatic compound is an aggregate on the microstructure, and encapsulates the nattokinase, so that the direct contact of the nattokinase and the biological environment is reduced, and the nattokinase can be gradually released. The prepared electrostatic compound improves the curative effect of the nattokinase on the aspects of late-stage tumor, old thrombus and the like.)
【技术领域】
本发明属于医药技术领域，涉及降低纳豆激酶过敏性的组方及其应用，具体涉及该组方在降低纳豆激酶过敏性、晚期肿瘤的联合治疗与溶解血栓中的应用。
【背景技术】
纳豆，作为东方传统食物，已有1000年的食用历史。20世纪80年代，在美国从事血栓研究的日本学者须见洋行(Dr.Hiroyuki Sumi)，从纳豆的粘性物质中分离出一种能够溶解血栓的丝氨酸蛋白酶，并将其命名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)(Sumi H,Hamada H,Tsushima H,et al.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetablecheese Natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia,1987,43(10):1110-1111.)。研究者进一步发现，NK是由275个氨基酸残基组成的、结构中不含二硫键的单链多肽酶，其分子量为27.782kDa，等电点为8.6±0.3。NK具有强大的溶解血栓作用。据研究表明，颈总动脉形成血栓的大鼠，在服用NK后，可恢复62％的动脉血流量，而可溶解纤维蛋白原和纤维蛋白的酶类却只能分别恢复15％及0％的血流量(Weng Y,Yao J,Sparks S,et al.Nattokinase:An Oral Antithrombotic Agent for thePrevention of Cardiovascular Disease[J].International Journal of MolecularSciences,2017,18(3):523.)。此外，NK还可以通过阻断血栓素形成，抑制血小板聚集，从而延迟氧化动脉壁损伤后的血栓形成，其抗血小板聚集的作用效果与阿司匹林相当(Jang JY,Kim T S,Cai J,et al.Nattokinase improves blood flow by inhibiting plateletaggregation and thrombus formation[J].Laboratory Animal Research,2013,29(4):221-225.)。NK的溶栓机理主要为：(1)直接溶解血栓块中的交联纤维蛋白；(2)激活血管内尿激酶原及内皮细胞产生内源性尿激酶和组织型纤溶酶原激活剂(tissue typeplasminogen activator，t-PA)；(3)降解纤溶酶原激活剂的抑制剂(plasminogenactivator inhibitor-1，PAI-1)，从而起到快速溶解血栓的效果(Feng R,Li J,Chen J,etal.Preparation and toxicity evaluation of a novel nattokinase-tauroursodeoxycholate complex[J].Asian Journal of Pharmaceutical Sciences,2017,13(2):173-182.)。对比于NK，尿激酶(Urokinase，UK)、链激酶(Streptokinase，SK)及t-PA等溶栓药物，只能通过激活纤溶酶原转化为纤溶酶的方式溶解血栓，对缺少纤溶酶原的陈旧性血栓无计可施。蚓激酶(Lumbrukinase，LK)，虽同为丝氨酸蛋白酶，但因其能直接降解血中的纤维蛋白原(滕文娇,孙晋民.蚓激酶的药学与临床研究进展[J].西北药学杂志,2011,(1):69-72.；Ji H,Wang L,H,Sun L,et al.Mechanisms of lumbrokinase inprotection of cerebral ischemia[J].European Journal of Pharmacology,2008,590(1):144-151.)，很有可能打破机体溶栓平衡而产生不良副作用。相较之下，NK作为众多溶栓药物中的“特优生”，可以通过直接作用于纤维蛋白，特别是作用于交联形式的纤维蛋白，直接溶解包括陈旧性血栓在内的栓块(李静,宋艳志,王梦静,et al.纳豆激酶与尿激酶的对比性研究[J].中国药剂学杂志:网络版,2016,(4):125-134)，并能维持机体纤溶系统稳定(Ji H,Wang L,Bi H,et al.Mechanisms of lumbrokinase in protection ofcerebral ischemia[J].European Journal of Pharmacology,2008,590(1):144-151.)。除此之外，NK还具有半衰期长、安全性高、制备工艺简单、生产成本低等优势(Xu J,Du M,Yang X,et al.Thrombolytic effects in vivo of nattokinase in a carrageenan-induced rat model of thrombosis[J].Acta Haematol,2014,132(2):247-253.)，被认为具有极其广阔的应用前景。由于NK在溶解血栓及抗血小板凝集方面具有独特优势，即可溶解包括陈旧性血栓在内的栓快，在***中，尤其是针对晚期恶性肿瘤，其具有值得期待的辅助效果。
在我们二十余年的相关研究中，我们发现动物灌胃(口服)给药，纳豆激酶的抗肿瘤和溶栓效果不佳、疗效不稳定，同时，临床上没有溶解陈旧性血栓的药物，针对脑梗、心梗、肺梗和肾梗等重要器官的疾病，在患者被送到医院进行治疗时，现有的溶栓药物效果有限，甚至是束手无策，从而导致脑梗、心梗患者无药可用，给患者、家庭、社会带来极大负担，迫切需要一种能够快速进入血液循环的纳豆激酶产品，如注射剂。在完成国家自然科学基金课题过程中，我们发现聚唾液酸和透明质酸是非常优秀的多阴离子化合物，可以与纳豆激酶通过静电复合，制备性质稳定的复合物，在保留溶栓效果的同时，极大降低纳豆激酶的过敏性，并提高抗肿瘤效果。“肿瘤免疫循环”(Cancer-Immunity Cycle)概念的提出(Daniel S.Chen，Ira Mellman，Oncology Meets Immunology:The Cancer-ImmunityCycle.Immunity 39,July 25,2013.)，将血栓与肿瘤有机地、紧密地结合在一起。让纳豆激酶在溶解血栓，特别是在溶解陈旧性血栓的同时，疏通“肿瘤免疫循环”，从而产生抗肿瘤效果。
聚唾液酸(Poly sialic acid，PSA)是SA单体以α-2,8-、α-2,9-、或α-2,8-/α-2,9-交替的酮苷键连接而成的无分支直链聚合物，其具有一定生物活性。在脊椎动物体内，PSA可以减弱神经黏附分子的黏附力，协助神经细胞迁移和再生(Suzuki,M.,et al.,Polysialic acid facilitates tumor invasion by glioma cells.Glycobiology,2005.15(9):p.887.)，而如导致脑膜炎的奈瑟球菌等微生物，通过利用PSA包裹自身，招募补体因子H并与C3片段相结合，抑制膜攻击复合物形成，进而阻止细胞或载体的降解，降低免疫系统对自身的识别(Gunawan,J.,et al.,Structural and mechanistic analysis ofsialic acid synthase NeuB from Neisseria meningitidis in complex with Mn2+,phosphoenolpyruvate,and N-acetylmannosaminitol.Journal of BiologicalChemistry,2005.280(5):p.3555-63.；Sanjay,R.,et al.,A Novel Sialic Acid BindingSite on Factor H Mediates Serum Resistance of SialylatedNeisseriagonorrhoeae.Journal of Experimental Medicine,1998.187(5):p.743-752.)。目前研究已表明，以α-2,8连接的、无免疫原性且可生物降解的PSA，可用于修饰蛋白分子，使蛋白分子表现出较好的长循环效果(Fernandes,A.I.,G.Gregoriadis,Polysialylatedasparaginase:preparation,activity and pharmacokinetics.Biochimica EtBiophysica Acta,1997.1341(1):p.26-34.；Fernandes,A.I.,G.Gregoriadis,The effectof polysialylation on the immunogenicity and antigenicity of asparaginase:implication in its pharmacokinetics.International Journal of Pharmaceutics,2001.217(2):p.215-224.)。引人关注的是，PSA与肿瘤的发生、发展也有着一定的关系。如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、Wilms瘤等多种恶性肿瘤细胞的表面有PSA的再表达，且表达量与肿瘤进展呈正相关([29]Suzuki M,Suzuki M,Nakayama J,et al.Polysialic acid facilitates tumor invasion by glioma cells[J].Glycobiology,2005,15(9):887.；Sato C,Kitajima K.Disialic,oligosialic andpolysialic acids:distribution,functions and related disease[J].Journal ofBiochemistry,2013,154(2):115-136.)。此外，PSA结构中的SA单体，可与表达在内皮细胞、白细胞及血小板上的选择素(E-/L-/P-selectin)相结合(Witz I P.The selectin-selectin ligand axis in tumor progression[J].Cancer&Metastasis Reviews,2008,27(1):19-30.)，一方面，PSA结构中的SA通过结合中性粒细胞等表面的L-selectin，可借助中性粒细胞趋于肿瘤部位的行为靶向至肿瘤(Powell D R,Huttenlocher A.Neutrophilsin the Tumor Microenvironment[J].Trends in Immunology,2016,37(1):41-52.；Smolen J E,Petersen T K,Koch C,et al.L-Selectin Signaling of NeutrophilAdhesion and Degranulation Involves p38Mitogen-activated Protein Kinase[J].Journal of Biological Chemistry,2000,275(21):15876-15884.；Li S,Zhang Y,WangJ,et al.Nanoparticle-mediated local depletion of tumour-associated plateletsdisrupts vascular barriers and augments drug accumulation in tumours[J].Nature Biomedical Engineering,2017,1(8):667-679)，另一方面，其可通过结合肿瘤处血小板上的P-selectin直接靶向至肿瘤(Zeisig R,Fichtner I.Effect of surfacemodified liposomes on the aggregation of platelets and tumor cells[J].Thrombosis&Haemostasis,2005,94(2):404-411.)。依据上述可知，具有免疫伪装性、肿瘤靶向性及无免疫原性等优点的PSA，可作为静电复合物的阴离子部分，修饰NK后制备成静电复合物纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物。值得注意的是，PSA可靶向至肿瘤处的血小板，这一特点正与NK的作用效果相契合。因此，将作为电负性生物材料的PSA与NK制备为静电复合物，通过利用PSA的免疫伪装及靶向肿瘤的作用，在NK处理非靶部位的血栓、增加血液循环的同时，较多的处理肿瘤***的血栓，增加制剂、细胞的进驻肿瘤效率，提高肿瘤的治疗效果。
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸单糖构成的连续重复的线性分子,自从Meyer和Palmer于1934年首次从牛眼玻璃体分离得到以来，相关的研究报道非常多,目前主要用于化妆品和制药行业。百万级分子量的HA具有很好的黏弹性、保湿性、延缓药物释放、抑制炎性反应和润滑等功能,主要用于化妆品、皮肤烧伤愈合、缓释药物给药系统、眼科手术和骨关节腔内注射治疗。相对分子质量小于8×10 4的HA具有抗肿瘤、促进血管生成和免疫调节等作用,主要用于肿瘤靶向治疗(Choi KY,Jeon EJ,Yoon HY,et al.Theranostic nanoparticles based on PEGylated hyaluronic acidfor the diagnosis,therapy and monitoring of colon cancer[J].Biomaterials,2012,33:6186-6193.Choi KY,Yoon HY,Kim JH,et al.Smart nanocarrier based onPEGylated hyaluronic acid for cancer therapy[J].ACS Nano,2011,5:8591-8599.)。另外，还有许多相关专利，如CN200610042808-透明质酸钠***脂肪乳制剂及其应用、CN200680034187-通过间接化学轭合获得的透明质酸或其衍生物的抗肿瘤生物轭合物、CN200880101357-透明质酸结合物在局部治疗过度增殖皮肤病中的应用、CN200680044541-阳离子化透明质酸和CN201310068913-一种基于透明质酸的双靶向纳米复合物药物制备及其应用。
肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。肿瘤发展过程中产生的微环境的变化，可能直接影响到治疗方案的有效实施。血栓疾病是晚期癌症患者常见的并发症且已成为第二死亡原因(张江津.晚期恶性肿瘤患者并发血栓症的彩超诊断及肿瘤与血栓形成的关系[J].海南医学,2008,19(8):148-149)。临床研究表明，肺癌、结肠直肠癌、肾上腺皮质癌、肝癌、胰腺癌及胃癌患者体内多数伴有血栓的形成，且这些研究结果均指明，血栓的出现与癌症的不良预后有着密切的关系(Rymaszewski A L,Tate E,Yimbesalu J P,et al.The Role of Neutrophil Myeloperoxidase in Models of Lung TumorDevelopment[J].Cancers,2014,6(2):1111.；Otani K,Ishihara S,Hata K,etal.Colorectal cancer with venous tumor thrombosis[J].Asian Journal ofSurgery,2016,41(3):197-202.；Matsumoto J,Kojima T,Hiraguchi E,et al.Portalvein tumor thrombus from colorectal cancer with no definite metastaticnodules in liver parenchyma[J].Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Sciences,2009,16(5):688-691.)。据研究报道，在肿瘤的生长、转移过程中，肿瘤细胞可透过血管释放表达有促凝血蛋白组织因子的微粒，诱发血小板的凝集(Owens A P,MackmanN.Microparticles in Hemostasis and Thrombosis[J].Circulation Research,2011,108(10):1284-1297.；Young A,Chapman O,Connor C,et al.Thrombosis and cancer[J].Nature Reviews Clinical Oncology,2004,9(8):437-449.)。当血小板以及凝血途径被激活后，凝血酶丝氨酸蛋白酶将会使纤维蛋白原变成纤维蛋白，形成似一个筛网结构的微血栓，使肿瘤细胞吸附并坚实的被捕获在内皮细胞上，为进一步完成侵袭行为打下基础(Menter D G,Tucker S C,Kopetz S,et al.Platelets and cancer:a casual or causalrelationship:revisited[J].Cancer and Metastasis Reviews,2014,33(1):231-269.)。在肿瘤病灶附近的血小板，还可通过粘附在中性粒细胞所诱导的血管破坏处，削弱中性粒细胞对肿瘤血管的破坏作用，阻止纳米药物扩散到实体肿瘤中(Li,S.,et al.,Nanoparticle-mediated local depletion of tumour-associated platelets disruptsvascular barriers and augments drug accumulation in tumours[J].NatureBiomedical Engineering,2017,1(8):667-679.)。此外，被激活的血小板和纤维蛋白，还可成为肿瘤细胞的“保护壳”，使肿瘤细胞能逃离免疫系统的识别，从而减少免疫细胞、免疫因子(包括自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)、细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxiclymphocyte，CTL)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)等)对瘤细胞介导的杀伤作用，并且削弱肿瘤细胞在血管壁上承受的流体切变力，最终极大程度地降低肿瘤细胞在生理、物理上受到的伤害(Menter D G,Tucker S C,Kopetz S,et al.Platelets andcancer:a casual or causal relationship:revisited[J].Cancer and MetastasisReviews,2014,33(1):231-269.；Sierko E,Wojtukiewicz M Z.Platelets andangiogenesis in malignancy.[J].Seminars in Thrombosis and Hemostasis,2004,30(1):95-108.)。血栓与肿瘤之间作用关系可以客观地反映出，在肿瘤病灶及非病灶处所引发的血小板聚集和血管内栓块的堆积，不仅直接导致了肿瘤的恶化，还会通过堵塞免疫细胞及药物制剂等的运输途径，影响高渗透长滞留效应(Enhanced permeability andretention effect，EPR效应)的利用效果(李洁,佘振南,邓意辉.高渗透长滞留效应理论在肿瘤靶向药物传递系统设计中的应用进展[J].沈阳药科大学学报,2013,v.30；No.205(2):150-159.)并最终导致对肿瘤的治疗过程无法顺利、有效地进行。这种有限的瘤内“灌注”成为了药物递送系统发挥作用的主要瓶颈。目前，已有利用凝血酶抑制剂或纤维蛋白溶解剂进行辅助***的报道(Costantini V,Zacharski L R.The role of fibrin in tumormetastasis[J].Cancer Metastasis Reviews,1992,11(3-4):283-290.；Rachidi S,Metelli A,Riesenberg B,et al.Platelets Subvert T Cell Immunity Against Cancervia GARP-TGFβAxis[J].Science Immunology,2017,2(11):.doi:10.1126/sciimmunol.aai7911.)。因此，通过对血栓进行清除，借助畅通血液、增加免疫细胞的有效循环次数、直接剿灭肿瘤侵袭的“工具”，以及瓦解肿瘤外部“屏障”等作用，能为高效***提供新的机遇。然而，我们却不能忽视这样一个事实，即多数癌症患者在被确诊时病情已达晚期，说明伴随肿瘤恶化形成的血栓极有可能已累积到一定程度，肿瘤内部微环境中存在大量陈旧性血栓，想要将其瓦解并非一件易事。
值得注意的是，常用于被动靶向的PEG化长循环制剂，在本发明的设计中显得优势不再。由于PEG化制剂逃脱免疫识别是其发挥被动靶向作用的设计基础，但在面对维护机体健康中起到重大作用的免疫系统时，PEG化制剂的“短板”在免疫系统面前暴露无遗。例如，约1/3使用PEG化门冬酰氨酶(PEG-asparaginase，商品名)的患者出现了免疫反应(Armstrong J K,Hempel G,Koling S,et al.Antibody against poly(ethylene glycol)adversely affects PEG‐asparaginase therapy in acute lymphoblastic leukemiapatients[J].Cancer,2007,110(1):103-111.；Fuertges,F.,A.Abuchowski,The clinicalefficacy of poly(ethylene glycol)-modified proteins.Journal of ControlledRelease,1990.11(1):139-148.)；PEG化尿酸酶(Pegloticase，商品名)由于抗-PEG抗体的产生导致58％的患者不能得到治疗(R P Garay,J P Labaune.Immunogenicityof Polyethylene Glycol(PEG).European Journal of Chemistry,2011.2(1):228-231.)；Dams等研究表明，在大鼠体内重复注射PEG化脂质体时，会引起二次注射PEG化脂质体的血液清除加快，以及在肝脏、脾脏聚集量增加(Dams E T,Laverman P,Oyen W J,etal.Accelerated Blood Clearance and Altered Biodistribution of RepeatedInjections of Sterically Stabilized Liposomes[J].Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics,2000,292(3):1071-1079.)。重新审视PEG化制剂，发现其并不是***的优秀制剂。具有9个碳原子的神经氨酸衍生物唾液酸，由于其受体selectin和唾液酸结合免疫球蛋白(Sialic acid binding Ig-like lectins，Siglec)相识别表达于肿瘤、免疫系统及造血系统等处，其可直接靶向肿瘤细胞，或通过靶向TAN、TAM间接靶向肿瘤的方式，实现递送药物至肿瘤的效果(Sun J,Song Y,Lu M,et al.Evaluation of theantitumor effect of dexamethasone palmitate and doxorubicin co-loadedliposomes modified with a sialic acid-octadecylamine conjugate.[J].EuropeanJournal of Pharmaceutical Sciences,2016:177-183.；She Z,Zhang T,Wang X,etal.The anticancer efficacy of pixantrone-loaded liposomes decorated withsialic acid-octadecylamine conjugate.[J].Biomaterials,2014,35(19):5216-5225.)。
【
发明内容
】本发明的目的是提供降低纳豆激酶过敏性的组方，该组方能够明显降低纳豆激酶过敏性，可以用于制备抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗血栓及免疫治疗药物。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明所述的降低纳豆激酶过敏性的组方包含纳豆激酶和阴离子化合物组成的静电复合物，所述的阴离子化合物包括小分子和大分子，可以选自去氧胆酸、十二烷基硫酸钠、EDTA、肝素、聚谷氨酸、聚唾液酸或透明质酸，优选为聚唾液酸、透明质酸或两者的组合物。
本发明所述的组方中，纳豆激酶与阴离子化合物的质量比是1:1-32，优选1:1～1:16，更优选1:2～1:8。
当阴离子化合物为聚唾液酸、透明质酸或它们的组合物时，制备的组方能明显降低纳豆激酶的过敏性，提高药物的抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗血栓、免疫治疗的活性。
本发明所述的组方中，当阴离子化合物为聚唾液酸时，所述的聚唾液酸具有2-600个唾液酸单元，平均分子量为600-100000道尔顿；优选：3000～30000道尔顿。
当阴离子化合物为透明质酸时，所述的透明质酸具有2-260个D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺组成的二糖单元，平均分子量为380-100000道尔顿；优选：1000～50000道尔顿。
本发明进一步提供了所述静电复合物的制备方法包括：
(1)将纳豆激酶(NK)用纯水溶解，得溶液A(浓度1mg/mL～100mg/mL)；
(2)将阴离子化合物溶于纯水，得溶液B(浓度1mg/mL～200mg/mL)；
(3)将溶液A与溶液B混合，得到NK与阴离子化合物的组合物。
本发明所述的组合物可以加入渗透压调节剂、冻干保护剂、pH调节剂等制备成注射剂，所述的冻干保护剂为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油或氯化钠；所述的渗透压调节剂为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油、氯化钠；所述的pH调节剂为盐酸、氢氧化钠、枸橼酸及其盐、磷酸及其盐、醋酸及其盐、乳酸及其盐、氨基酸。还可以加入EDTA(二钠盐、钙钠盐)、泊洛沙姆、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、多糖类物质(如人参多糖、黄芪多糖、香菇多糖)等。并可进行冷冻干燥或者喷雾干燥，获得固体产品。
本发明的组合物，可以进一步制成注射剂、口服制剂、外用制剂、脂质体、纳米粒、乳剂、微乳等剂型，可以制成黏膜给药制剂，包括眼用制剂、鼻用制剂、口腔给药、肺部给药、直肠用药、***用药。
本发明的组合物可以单独使用，也可与其他治疗药物、方法、手段、技术联合应用，特别是与抗肿瘤、抗炎症、抗凝血、血栓溶解药物的联合，用于陈旧性血栓、晚期肿瘤、以及相关的免疫治疗。
联合使用本发明的组合物，能够明显提高抗肿瘤纳米制剂药效的作用，该种药物治疗并没有化疗和放射治疗的毒副作用。
我们曾经将各种各样的阴离子化合物(小分子和大分子，如去氧胆酸、十二烷基硫酸钠、EDTA、肝素、聚谷氨酸等等)与纳米激酶制备得到纳豆激酶与阴离子化合物的组合物，系统性的研究结果表明，聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)和透明质酸(Hyaluronic acid，HA)可以赋予纳豆激酶更优秀的特点，扩大纳豆激酶的应用范围。
本发明中，将纳豆激酶与聚唾液酸或透明质酸组合，在于利用纳豆激酶清除体内微血栓的作用，畅通血管、增加体内血液流通量，进而实现高效运输药物制剂、免疫细胞杀伤肿瘤的效果。
联合应用试验结果表明：纳豆激酶-聚唾液酸组合物和SA修饰的靶向制剂进行肿瘤的治疗时，NK-PSA静电复合物在抗肿瘤中的作用效果，尤其是针对晚期肿瘤的治疗效果，极为显著，即通过畅通血管、高效运输药物制剂、免疫细胞，并增加游走免疫细胞的循环度，提升靶向制剂与免疫细胞碰撞几率，与此同时，将纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物可更多地溶解肿瘤内部血栓，提升制剂及细胞等通过高渗透长滞留效应进驻入肿瘤内部，加强对肿瘤的杀伤效果。
本发明中，非常意外地发现，聚唾液酸和透明质酸可以降低纳豆激酶的过敏性，在与SA修饰的靶向制剂联用时，可以极大提高抗肿瘤效果，预示着在免疫疗法中的广阔应用前景。
综合以上，本发明具有如下优点：①降低纳豆激酶的过敏性，可以通过注射途径、黏膜给药途径、口服途径给药，特别是注射给药途径，用于严重疾病的治疗；②纳豆激酶与PSA或HA所形成的组合物，可以极大提高抗肿瘤效果；③意外地发现，PSA、HA组合物，在晚期肿瘤模型中，抗肿瘤效果优于SA靶向脂质体。
【附图说明】
图1不同比例NK/PSA组成的静电复合物的粒径大小及相对酶活性变化率(％)(n＝3)；
图2NK(A),PSA(B),NK-PSA(C)及NK与PSA混合物(D)的DSC测定曲线；
图3NK(A)、PSA(B)、NK-PSA(C)及三者叠加(D)的红外谱图；
图4透射电镜下(A)NK、(B)PSA、(C)NK-PSA(标尺，100nm)的样品形态；
图5NK-PSA冻干三次后的相对酶活性(n＝3)；
图6透射电镜下(A)多柔比星普通脂质体、(B)多柔比星PEG化脂质体及(C)多柔比星唾液酸脂质体(标尺，200nm)的样品形态；
图7多柔比星溶液及三种脂质体的释放(n＝3)；
图8包载多柔比星的普通脂质体联合纳豆激酶在Wistar大鼠体内的药动学行为(A：普通脂质体；B各组药时曲线下面积)；
图9包载多柔比星的PEG化脂质体联合纳豆激酶在Wistar大鼠体内的药动学行为(A：PEG化脂质体；B：各组药时曲线下面积)；
图10包载多柔比星的脂质体联合纳豆激酶(或纳豆激酶-聚唾液酸离子复合物)在Wistar大鼠体内的药动学行为(A：唾液酸修饰脂质体；B：各组药时曲线下面积)；
图11多柔比星溶液联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图12多柔比星溶液联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图13包载多柔比星普通脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图14包载多柔比星普通脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图15包载多柔比星PEG化脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图16包载多柔比星PEG化脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图17包载多柔比星唾液酸化脂质体联合尿激酶抗S180早期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图18包载多柔比星唾液酸化脂质体联合尿激酶抗S180早期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图19包载多柔比星唾液酸化脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图20包载多柔比星唾液酸化脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图21包载多柔比星唾液酸化脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180早期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图22包载多柔比星唾液酸化脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180早期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图23包载多柔比星唾液酸化脂质体联合不同药物的抗S180早期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图24包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合尿激酶抗S180中期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图25包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合尿激酶抗S180中期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图26包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶抗S180中期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图27包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶抗S180中期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图28包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180中期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图29包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180中期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图30包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合不同药物抗S180中期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图31包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合不同药物治疗S180中期肿瘤小鼠的体貌；
图32包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合尿激酶抗S180晚期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图33包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合尿激酶抗S180晚期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图34包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶抗S180晚期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图35包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶抗S180晚期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图36包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180晚期肿瘤的生长曲线(n＝6)；
图37包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180晚期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图38包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合不同药物抗S180晚期肿瘤的抑瘤指数(n＝6)；
图39包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合不同药物治疗S180晚期肿瘤小鼠的体貌；
图40肿瘤的H&E染色组织切片：(A)5％Glu、(B)DOX-SAL i.v.、(C)NK i.g.+DOX-SAL i.v.、(D)NK i.v.+DOX-SAL i.v.、(E)NK-PSA i.v.+DOX-SAL i.v.、(F)UK i.v.+DOX-(标尺20μm)；
图41(A)不同给药组荷S180肿瘤小鼠在静注包载DiR唾液酸修饰脂质体后的不同时间点(3、5、7、9、24h)的活体成像；(B)不同给药组荷S180肿瘤小鼠在静注包载DiR唾液酸修饰脂质体24h后的离体脏器成像(1：胸腺；2：心；3：肝；4：脾；5：脑；6：肺；7：肾；8：肿瘤)；
图42不同给药组荷S180肿瘤小鼠静注包载DiR唾液酸修饰脂质体24后各脏器中DiR浓度(n＝3)。
【
具体实施方式
】
材料来源：纳豆激酶(广东双骏生物科技有限公司、实验室纯化为单条电泳带，每毫克大于9000IU)。所用PSA的聚合度分别为2、3、4、5、6、10、16、32、100、130～170、200～270，对应分子量分别为644.50、957.73、1270.97、1584.21、1897.45以及平均分子量为3000、5000、4～5万与6～8万道尔顿。聚合度2、3、4、5、6的PSA购买自美国Nacalai公司；聚合度为7至10的PSA购买自日本Nacalai tesque公司；PSA(平均分子量11.0kDa，多分散系数(p.d.)1.17；平均分子量22.7kDa，多分散指数(p.d.)1.34；平均分子量39.0kDa，多分散系数(p.d.)1.40)购买自爱尔兰Camida公司；平均分子量30kDa购自英国carbosynth公司(卡博森斯化学科技(苏州)有限公司)；其余分子量的PSA从江南大学获取或者自制。透明质酸(HA)的分子量380、760、1140、1520、1900、2280、2660、3040、3420、6276、8000、2万、4.4万、6.1万、9.8万、20万，主要来源于华熙福瑞达生物医药有限公司和上海源叶生物科技有限公司。由于20万分子量的溶液黏度非常大，因此，不参与相关研究，仅仅采用10万道尔顿分子量以下的HA。
为了更清楚的理解本发明，以下结合发明人给出的依本发明的技术方案所完成的实施例对本发明做进一步的详细说明。
以下是本发明人给出的实施例，应当理解为，本发明并不局限于这些实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变，都将落入本发明的保护范围。
实施例1纳豆激酶-聚唾液酸组合物的制备
前期预实验结果显示，NK水溶液的pH值为6.89±0.02，即在水环境中NK带正电，因此，选择以水为介质制备纳豆激酶聚唾液酸组合物(NK-PSA)。基本制备工艺为：取NK粉末适量，用少量、一定浓度的PSA(30kDa)水溶液溶解并稀释至NK浓度为40mg/mL，于冰水浴下，搅拌10min后，再用适量灭菌注射用水稀释上述溶液至NK浓度为20mg/mL，过0.22μm微孔滤膜，即得NK-PSA溶液。将所得的NK-PSA溶液分装于10mL的西林瓶中，每瓶2.5mL，冷冻干燥，即得NK-PSA静电复合物冻干粉。
按照上述基本制备工艺，通过对不同质量比的NK与PSA所制备得到的静电复合物进行粒径(采用Nicomp-380粒径测定)及酶活性的变化情况为指标，筛选NK-PSA静电复合物中最佳的NK与PSA的质量比范围，其中不同NK与PSA的比例下制备的NK-PSA及其对应的粒径及相对酶活性变化率(NK-PSA的酶活性大小/NK的酶活性大小×100％)的结果见表1及附图1。
表1不同质量比NK/PSA组成的复合物的粒径大小及相对酶活性变化率(％)(n＝3)
从粒径均值所表现的宏观结果中发现，随着PSA比例的升高，粒径变小且变化逐渐趋于平缓，此时的质量比拐点为NK：PSA＝1:1。综合考虑，选择NK：PSA＝1:1-1:32，优选1:1～1:16，更优选1:2～1:8。
实施例2实施例1的纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物的表征
(1)Zeta电位的测定
取制备好的纳豆激酶(NK)、聚唾液酸(PSA)及纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物(NK-PSA＝1：2)样品适量，以灭菌注射用水进行稀释后，放入样品池内，***电极，采用Nicomp-380Zeta激光粒度测定仪测定制剂粒径。测定条件为：电场强度为10V·cm-1，平衡时间设置为3min，结果见表2。
表2.NK、PSA及NK-PSA的Zeta电位.
通过测定的Zeta电位结果，可以发现在灭菌注射用水中的NK-PSA，NK的电位下降，PSA的电位略上升，可以初步判定NK-PSA中的NK与PSA产生了静电吸附作用。
(2)DSC测定
采用DSC来表征NK、PSA及NK-PSA的热力学性质。将一定量的NK、PSA的单独样品、物理混合物样品及NK-PSA静电复合物样品放置于带盖铝锅中，从30℃开始，在40mg/mL的氮气流下以10℃/min的速度升温至300℃，记录升温得到的吸热曲线，结果见附图2。
从DSC结果中可以得出，NK的吸热峰分别在48.85、88.16及164.59℃处；PSA的吸热峰在58.83℃处；NK-PSA的吸热峰在53.27℃处；NK与PSA混合物的吸热峰分别在50.06、64.02、169.99℃处。综合各物质吸热峰的出现温度可知NK-PSA出现单一的吸热峰，而NK与PSA的混合物则表现出与NK及PSA吸热峰相近的特征峰，因此认为，NK-PSA为NK与PSA发生静电复合后得到的化合物，而非混合物。
(3)傅里叶红外光谱测定
采用KBr压片法分别测定NK、PSA与NK-PSA的红外吸收，扫描范围在4000～450cm-1。结果见附图3，NK-PSA的红外谱图中具有NK及PSA的特征吸收峰，其中，与NK相比，NK-PSA在2929.0cm-1处的碳氢伸缩振动峰强度减小，在1125.6、1035.7cm-1处出现C-O-C伸缩振动峰(与PSA相似)；与PSA相比，NK-PSA在1125.6～1035.7cm-1处的C-O-C伸缩振动峰强度减小，在833.8～618.6cm-1处的N-H伸缩振动峰强度减小，在1320.8cm-1、1212.8cm-1处的N-H伸缩振动峰强度减小，在833.8～618.6cm-1处的C-H弯曲振动峰强度减小。从红外测定结果初步证明，NK-PSA已被成功制备。
(4)形态学鉴定
采用透射电镜研究NK-PSA的形态学，同时对组成NK-PSA的两部分，即NK及PSA也进行形态学上的对比。吸取NK、PSA及NK-PSA的水溶液滴加在覆盖碳膜的铜网上，用1.0％(w/v)磷钨酸进行负染2min，用滤纸吸走多余液体，室温自然挥干后，置于透射电镜下观察NK、PSA及NK-PSA的形态并拍照，结果见附图4。
NK呈现团聚体的不规则类实心短柱状，PSA与NK-PSA均呈现实心球形，大小均一，且PSA经过与NK复合后明显粒径增大。
实施例3纳豆激酶与纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物的冻干稳定性考察
使用灭菌注射用水复溶纳豆激酶(NK)或纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物(NK-PSA)粉末，随后进行冻干操作，在整个冻干稳定性考察的实验中，该重复3次冻干操作，并分别测定冻干0、1、2、3次的酶活性。统一以第0次冻干操作下所测得的酶活性作为100％，按照公式：相对酶活性％＝冻干n次酶活性/未冻干酶活性×100％，计算相对酶活百分数，结果见附图5。
根据实验结果可知，NK-PSA经过1次冻干后，相对酶活百分数约为92％；在经过复溶后的第2次冻干时，相对酶活百分数约为87％；在经过第3次冻干后，相对酶活百分数约为86％。NK-PSA具有一定的冻干稳定性。
实施例4包载多柔比星的普通脂质体、PEG化脂质体及唾液酸修饰脂质体的制备
按表3处方，称取脂质体膜材与药物置于10mL西林瓶中，加入400μL无水乙醇于60℃水浴搅拌。待膜材完全溶解后，敞开体系，挥除大部分无水乙醇。以4mL·min-1的速度将4mL预热至60℃的柠檬酸-缓冲溶液(200mM,pH 4.0)注入西林瓶中。60℃下继续搅拌20min，得到脂质体初品。将初品超声分散处理(200W×2min+400W×4min，工作1s，间歇1s)后，依次通过0.80、0.45、0.22μm微孔滤膜，即得空白脂质体(磷脂浓度：50mg/mL)。
表3多柔比星脂质体膜材处方
取空白脂质体混悬液0.5mL，加入一定量的磷酸钠溶液(500mM)调节外水相pH，混合均匀，即得pH梯度脂质体。按照药比1:10(w/w)将上述梯度脂质体与4.0mg·mL-1的多柔比星药物溶液(DOX-S)混合，60℃水浴搅拌孵育20min后取出，置于冰水浴中2min终止载药，即得多柔比星脂质体。
实施例5包载多柔比星的普通脂质体、PEG化脂质体及唾液酸修饰脂质体的表征
(1)粒径及Zeta电位的测定
取制备好的脂质体样品适量，以灭菌注射用水进行稀释后，采用Nicomp-380粒径及Zeta电位仪对粒径和Zeta电位进行测定。Nicomp-380Zeta激光粒度测定仪测定制剂Zeta电位的测定条件为：电场强度为10V·cm-1，平衡时间设置为3min。结果见表4。
表4多柔比星脂质体的粒径及Zeta电位
由表4中的结果可知，多柔比星的三种脂质体的粒径约为120nm。其中，随着处方中DSPE-PEG2000的加入，制剂粒径的均一程度提高，PDI变小，但多柔比星普通脂质体与多柔比星PEG化脂质体无显著区别。
(2)形态学鉴定
采用透射电镜研究多柔比星普通脂质体、PEG化脂质体及唾液酸修饰脂质体的形态学。分别吸取三种脂质体溶液滴加在覆盖碳膜的铜网上，用1.0％(w/v)磷钨酸进行负染2min，用滤纸吸走多余液体，室温自然挥干后，置于透射电镜下观察比星普通脂质体、PEG化脂质体及唾液酸修饰脂质体的形态并拍照，结果见附图6，三种脂质体均是具有双分子层结构、粒径均匀的类球体。
(3)多柔比星脂脂质体的体外释放考察
分别精密吸取1.0mL多柔比星溶液(DOX-S)、多柔比星普通脂质体(DOX-CL)、多柔比星PEG化脂质体(DOX-PL)及多柔比星唾液酸脂质体(DOX-SAL)，加入预处理过的透析袋中，置于100mL磷酸盐缓冲液(500mM，pH 7.4)中，避光，37℃±2℃恒温，50rpm搅拌，于第0.5、1、2、4、8、12、24、48h分别吸取1.0mL透析液，并补加等量空白释放介质。将取出的1.0mL透析液采用酶标仪在激发472nm、发射588nm下测定并计算透析液中药物浓度，按照下列公式计算药物的累计释放量Rn％。
其中，V0为释放介质体积，Cn为第n次取样时浓度，V为取样体积，Mt为总的药物浓度。
将Rn％与释放时间进行作图，结果见附图7。多柔比星溶液组在中性条件下均快速释放，在8h内达到100％；三种多柔比星脂质体均可在pH 7.4的条件下缓慢释放多柔比星药物，在48h内，多柔比星在DOX-CL、DOX-PL及DOX-SAL的累积释放量分别为29.8±2.3％、18.1±0.9％和21.1±0.9％。
实施例6包载多柔比星的普通脂质体联合纳豆激酶的Wistar大鼠体内药动学行为
将体重180～220g的Wistar大鼠随机分组，每组3只，即包载多柔比星普通脂质体组(DOX-CL i.v.)、包载多柔比星普通脂质体联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DOX-CL i.v.)及包载多柔比星普通脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-CL i.v.)。DOX-CL i.v.组的给药方式为单次大鼠尾静脉注射DOX-CL；NK i.g.+DOX-CL i.v.组的方式为，在一次口服纳豆激酶30min后，进行大鼠尾静脉注射DOX-CL。其中，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为35kIU/kg，纳豆激酶单次口服给药剂量为120kIU/kg。于给药后0.017、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h分别于眼眶静脉丛取血并置于肝素抗凝管中，5000rpm离心10min分离血浆，取100μL血浆，加入900μL甲醇/水(v/v，50/50)，涡旋5分钟，10000rpm离心5分钟，取200μL上清液采用酶标仪在激发波长472nm、发射波长588nm下测定多柔比星浓度，药动学行为的结果见附图8及表5。
表5包载多柔比星的普通脂质体联合纳豆激酶在Wistar大鼠体内的药动学参数
*AUC index＝AUC(NK+DOX-CL)/AUC(DOX-CL)×100％
Wistar大鼠药动学结果表明，联用纳豆激酶的普通脂质体，其药物清除速度加快(药时曲线下面积减少)。其中，联用后的普通脂质体清除加快效果并未体现出显著性，由于纳豆激酶作用于体内，溶解大鼠生长过程中形成的微血栓，使得血液流通顺畅，血液运输的免疫细胞游走循环增多，识别机体内的外来物质几率增加。普通脂质体虽会被免疫细胞识别清除，但因缺少靶向作用，致使NK的联用效果导致的加快清除并没有显著的体现在普通脂质体联用组上。
实施例7包载多柔比星的PEG化脂质体联合纳豆激酶的Wistar大鼠体内药动学行为
将体重180～220g的Wistar大鼠随机分组，每组3只，即包载多柔比星的PEG化脂质体组(DOX-PL i.v.)、包载多柔比星的PEG化脂质体联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DOX-PLi.v.)及包载多柔比星的PEG化脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-PL i.v.)。DOX-PL i.v.组的给药方式为单次大鼠尾静脉注射DOX-PL；NK i.g.+DOX-PL i.v.组的方式为，在一次口服纳豆激酶30min后，进行大鼠尾静脉注射DOX-PL。其中，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为35kIU/kg，纳豆激酶单次口服给药剂量为120kIU/kg。于给药后0.017、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h分别于眼眶静脉丛取血并置于肝素抗凝管中，，5000rpm离心10min分离血浆，取100μL血浆，加入900μL甲醇/水(v/v，50/50)，涡旋5分钟，10000rpm离心5分钟，取200μL上清液采用酶标仪在激发波长472nm、发射波长588nm下测定多柔比星浓度，药动学行为结果见附图9及表6。
表6包载多柔比星的PEG化脂质体联合纳豆激酶在Wistar大鼠体内的药动学参数
*AUC index＝AUC(NK+DOX-PL)/AUC(DOX-PL)×100％
Wistar大鼠药动学结果表明，联用纳豆激酶的PEG化脂质体，其药物清除速度加快(药时曲线下面积减少)。其中，包载多柔比星的PEG化脂质体联合纳豆激酶后，对比于未联用时，制剂清除速度有显著性地加快(P<0.05)。由于纳豆激酶溶解体内微血栓，使得血液流通顺畅，增加免疫细胞的游走程度，然而，PEG化脂质体的长循环方式是躲避免疫细胞的识别，NK的效果增加了识别检查的几率，减弱制剂在机体的循环时间。
实施例8包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶或纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物(PSA分子量3万，PSA：NK＝1：2)的Wistar大鼠体内药动学行为
将体重180～220g的Wistar大鼠随机分组，每组3只，即包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体组(DOX-SAL i.v.)、包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合口服纳豆激酶组(NKi.g.+DOX-SAL i.v.)、包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-SAL i.v.)。DOX-SAL i.v.组的给药方式为单次大鼠尾静脉注射DOX-SAL；NK i.g.+DOX-SAL i.v.组的方式为，在一次口服纳豆激酶30min后，进行大鼠尾静脉注射DOX-SAL。其中，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为35kIU/kg，纳豆激酶单次口服给药剂量为120kIU/kg。于给药后0.017、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h分别于眼眶静脉丛取血并置于肝素抗凝管中，，5000rpm离心10min分离血浆，取100μL血浆，加入900μL甲醇/水(v/v，50/50)，涡旋5分钟，10000rpm离心5分钟，取200μL上清液采用酶标仪在激发波长472nm、发射波长588nm下测定多柔比星浓度，药动学行为结果见附图10及表7。
表7包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶(或纳豆激酶-聚唾液酸离子复合物)在Wistar大鼠体内的药动学参数
*AUC index＝AUC(NK+DOX-SAL)/AUC(DOX-SAL)×100％
Wistar大鼠药动学结果表明，纳豆激酶(或纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物)可加速唾液酸修饰脂质体的血液药物清除速度。这可能是由于，唾液酸修饰制剂，其可介导免疫细胞的吞噬，实现靶向作用，NK/NK-PSA的联用则使制剂遇到靶向目标的几率增加，加速免疫细胞吞噬，并带到肝脏等处被清除，相比较于非靶头修饰的普通脂质体，NK/NK-PSA的联用效果导致的加快清除显著的体现在唾液酸修饰脂质体联用组上。其中，在大鼠模型上，NK-PSA靶向血小板聚集的能力体现的不显著，并且PSA的包裹作用使NK的作用效果变缓慢，在24h内未展现出极显著增加制剂清除速度的效果。
实施例9多柔比星溶液联合纳豆激酶的早期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
液氮中取出保种的S180细胞冻存管，迅速置于37℃温水中复苏30min。将复苏的S180细胞悬液接种于小鼠腹腔内(0.2mL/只)，7天后，无菌条件下抽取乳白色粘稠腹水，在倒置显微镜下计数，肿瘤细胞活度>95％，加生理盐水稀释后调整瘤细胞数为1.8×107cells/mL。将肿瘤细胞混悬液接种于正常昆明小鼠右前腋下的皮下组织，0.2mL/只，共接种36只。随机分为6组，每组6只，即对照组(5％Glu)、口服纳豆激酶组(NK i.g.)、静注纳豆激酶组(NK i.v.)、多柔比星溶液(DOX-S i.v.)组、多柔比星溶液联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DOX-S i.v.)、多柔比星溶液联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-S i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后4天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后4、7、10、13与16天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg(Feng,R.,et al.,Preparation and toxicity evaluation of anovel nattokinase-tauroursodeoxycholate complex.Asian Journal ofPharmaceutical Sciences,2017,13(2):173-182.)，纳豆激酶单次口服给药剂量为240kIU/kg(Lampe B J,English J C.Toxicological assessment of nattokinasederived from Bacillus subtilis var.natto.[J].Food and Chemical Toxicology,2016:87-99.)，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算“抑瘤指数(Tumor-inhibition index,TI index)”，即体重/瘤重(LuoX,Hu L,Zheng H,et al.Neutrophil-mediated delivery of pixantrone-loadedliposomes decorated with poly(sialic acid)-octadecylamine conjugate for lungcancer treatment[J].Drug Deliv,2018,25(1):1200-1212.)。在20天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图11、12及表8。
表8多柔比星溶液联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
从上述的药效结果可以分析得出，联合纳豆激酶的多柔比星的抗肿瘤效果有所提升。然而，由于肿瘤的减小并不能客观代表小鼠的健康状况，治疗的目的应不仅仅在于缩小肿瘤体积，还应保证机体其它功能的正常，因此，有必要从抑瘤指数上看各组的效果。从可以体现出小鼠生存状态的抑瘤指数(体重/瘤重)上看，各组给药方案并没有真正的改善肿瘤小鼠的健康状态。分析原因，NK的作用在于可以溶解机体内的微血栓，增加机体血液的循环量，有助于制剂的运输，但是因多柔比星溶液具有较强的毒性，因此并不能恢复机体健康，可见多柔比星溶液并不能作为***的优良药物。
实施例10包载多柔比星的普通脂质体联合纳豆激酶的早期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将36只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为6组，每组6只，即对照组(5％Glu)、口服纳豆激酶组(i.g.)、静注纳豆激酶组(i.v.)、多柔比星普通脂质体(DOX-CLi.v.)组、多柔比星普通脂质体联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DOX-CL i.v.)、多柔比星普通脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-CL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后4天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后4、7、10、13与16天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg，纳豆激酶单次口服给药剂量为240kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在20天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图13、14及表9。
表9包载多柔比星普通脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
从结果可知，联合纳豆激酶后的包载多柔比星的普通脂质体，抗S180肿瘤抑瘤率有些许提高，然而，抑瘤指数并没有显著的提高。该结果说明，NK的作用，使普通脂质体在血液的流动增多，但对比与普通脂质体较好的抗肿瘤药效来说，其提高程度并未被显著放大。
实施例11包载多柔比星的PEG化脂质体联合纳豆激酶的早期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将36只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为6组，每组6只，即对照组(5％Glu)、口服纳豆激酶组(NK i.g.)、静注纳豆激酶组(NK i.v.)、多柔比星PEG化脂质体(DOX-PL i.v.)组、多柔比星PEG化脂质体联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DOX-PL i.v.)、多柔比星PEG化脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-PL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后4天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后4、7、10、13与16天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg，纳豆激酶单次口服给药剂量为240kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在20天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图15、16及表10。
表10包载多柔比星PEG化脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
从结果可知，联合纳豆激酶后的包载多柔比星的PEG化脂质体，其抗S180肿瘤抑瘤率没有显著增强效果，并且联合静脉注射纳豆激酶的组别，其质量抑瘤率降低(P<0.05)，且从抑瘤指数上看PEG化脂质体联合纳豆激酶后并没有提高PEG化脂质体改善小鼠健康的效果。该结果说明，PEG化脂质体的应用，对于希望通过联合NK达到协同的目的存在一定的问题。这是由于PEG的使用本身是为了逃避免疫监视而存在的，但NK相当于加强了免疫的巡视，使得PEG化脂质体的效果大打折扣，该结果也暴露了PEG化制剂的通病，其设计之初是想逃避免疫系统，但却忽视了免疫系统的作用又是疾病治疗的关键之一。
实施例12包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合尿激酶的早期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将24只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为4组，每组6只，即对照组(5％Glu)、静注尿激酶(UK i.v)、多柔比星唾液酸修饰脂质体(DOX-SAL i.v.)组、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合尿激酶组(UK i.v.+DOX-SAL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后4天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后4、7、10、13与16天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，尿激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在20天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图17、18及表11。
表11包载多柔比星唾液酸化脂质体联合尿激酶抗S180早期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
从结果可知，联合尿激酶后的包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体，其抗S180肿瘤抑瘤率有增强效果，并且联合尿激酶的组别，其质量抑瘤率有显著性提高(P<0.05)，且从抑瘤指数上看唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶后并增强了唾液酸修饰脂质体的治疗作用，改善了小鼠的健康状态。
实施例13包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶的早期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将36只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为6组，每组6只，即对照组(5％Glu)、口服纳豆激酶组(NK i.g.)、静注纳豆激酶组(NK i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体组(DOX-SAL i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DOX-SALi.g.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-SAL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后4天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后4、7、10、13与16天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg，纳豆激酶单次口服给药剂量为240kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在20天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图19、20及表12。
表12包载多柔比星唾液酸化脂质体联合纳豆激酶抗S180早期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
从结果可知，联合纳豆激酶后的包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体，其抗S180肿瘤抑瘤率有增强效果，并且联合静脉注射纳豆激酶的组别，其质量抑瘤率有显著性提高(P<0.05)，且从抑瘤指数上看唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶后并增强了唾液酸修饰脂质体的治疗作用，改善了小鼠的健康状态。分析原因，唾液酸修饰脂质体的作用特点就是基于其可以靶向单核巨噬细胞等的免疫细胞，进而直接或间接靶向肿瘤。此时联用NK，可通过其溶解机体内的微血栓，通过畅通机体的血液流通，使得循环的制剂、免疫细胞(包括运载制剂的免疫细胞)的流量增多，增加到达肿瘤部位，完成抑制、杀伤肿瘤细胞的作用。此外，纳豆激酶可通过清除“修复”肿瘤部位受损血管的血栓，协助制剂能够更加顺畅的穿过肿瘤血管壁，提高制剂的抑制肿瘤的效果。
实施例14包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物的早期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将24只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为4组，每组6只，即对照组(5％Glu)、静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物组(NK-PSA i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体(DOX-SAL i.v.)组、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物组(NK-PSA i.v.+DOX-SAL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后4天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后4、7、10、13与16天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物单次静注给药剂量为70kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在20天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图21、22及表13。
表13包载多柔比星唾液酸化脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180早期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
表14 DOX-SAL联合静注NK、NK-PSA或UK给药组于抗S180早期肿瘤第20天的抑瘤指数(n＝6)
从结果可知，联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物后的包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体，其抗S180肿瘤抑瘤率有显著增强效果(P<0.05)，且该联用明显改善了小鼠的健康状态。通过与联合纳豆激酶及尿激酶的组别进行对比(见附图23及表14)，可以看出各种联合效果的优劣顺序为：联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物>联合纳豆激酶>联合尿激酶。
聚唾液酸具有靶向中性粒细胞及血小板处的能力，且其可通过与纳豆激酶形成复合物的方式包裹、保护进入体内的纳豆激酶，使得更多的纳豆激酶可以高效到达肿瘤部位。当有效清除“修复”肿瘤部位受损血管的血栓后，中性粒细胞等损伤血管的作用被放大，制剂得以易加容易地穿过肿瘤血管壁，同时，进入体内的纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物还可以通过增加血液流通、增加免疫细胞的循环量，从疏通递送道路、增加制剂靶向至免疫细胞的方式提高制剂运输至肿瘤的效率。
实施例15包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合尿激酶的中期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将24只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为4组，每组6只，即对照组(5％Glu)、静注尿激酶组(UK i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体(DOX-SAL i.v.)组、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注尿激酶组(UK i.v.+DOX-SAL)。各组小鼠均于肿瘤体积到达500mm3后(接种后7天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后7、10、13、16与19天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，尿激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在23天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图24、25及表15。
表15包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶抗S180中期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
通过实验结果可以看出，联合给予尿激酶并不能提高中期肿瘤的抑制效果，并且，无论从质量抑瘤率和抑瘤指数上看，联合尿激酶显著降低包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体的药效(P<0.05)。分析原因，S180中期肿瘤中形成的血栓时间较为长久，然而，尿激酶没有溶解陈旧性血栓(血栓形成时间超过3个月、其中的纤溶酶原含量较少的血栓)的作用，然而，在中期的肿瘤模型中，肿瘤、机体内血管等处的血栓形成时间较早期模型中的长，程度较重，尿激酶的应用不能达到联合给予溶栓药物进而提高制剂抗肿瘤药效的设计目的。此外，尿激酶被证明是肿瘤转移的帮凶，在中期肿瘤中，当不能通过有效的溶解血栓、畅通血液来达到提高制剂的抗肿瘤效果时，尿激酶通过降解胞外基质介导肿瘤侵袭、转移的缺点开始暴露出来(张用书,李秀珍,尿激酶分子系统与肿瘤.军事医学,1996(3):p.220-223.)，直接导致了减低包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体的抗肿瘤药效。
实施例16包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶的中期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将36只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为6组，每组6只，即对照组(5％Glu)、口服纳豆激酶组(NK i.g.)、静注纳豆激酶组(NK i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体(DOX-SAL i.v.)组、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DOX-SALi.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-SAL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达500mm3后(接种后7天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后7、10、13、16与19天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg，纳豆激酶单次口服给药剂量为240kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在23天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图26、27及表16。
表16包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶抗S180中期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
通过实验结果可以看出，联合给予纳豆激酶会提高中期肿瘤的抑制效果。此外，从抑瘤指数上看，联合给予纳豆激酶会提高小鼠的存活质量，整体健康状态优于单独给予唾液酸修饰脂质体的。分析原因，纳豆激酶可以溶解包括陈旧性血栓在内的微血栓，在中期抗肿瘤模型中，纳豆激酶协助抗肿瘤的作用依旧可以发挥出来。值得注意的是，虽然联合口服纳豆激酶的效果稍逊色于直接静注纳豆激酶的，但仍能看出口服纳豆激酶在中期抗肿瘤总的作用效果。
实施例17包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物的中期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将24只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为4组，每组6只，即对照组(5％Glu)、静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物组(NK-PSA i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体(DOX-SAL i.v.)组、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物组(NK-PSA i.v.+DOX-SAL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达500mm3后(接种后7天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后7、10、13、16与19天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物单次静注给药剂量为70kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在23天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图28、29及表17。
表17包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180中期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
通过实验结果可以看出，联合给予纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物会提高中期肿瘤的抑制效果，并且，从抑瘤指数上看，对于单独给予唾液酸修饰脂质体***的效果，小鼠的存活质量显著提高(P<0.05)。
表18 DOX-SAL联合静注NK、NK-PSA或UK给药组于抗S180中期肿瘤第23天的抑瘤指数(n＝6)
综合联合纳豆激酶、纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物及尿激酶的抗S180中期肿瘤的抑瘤指数上看(见附图30及表18)，可以看出各种联合效果的优劣顺序为：联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物>联合纳豆激酶>联合尿激酶。此外，S180中期肿瘤的小鼠经过不同给药后，其毛发等体貌特征有了区别，体貌特征也能侧面反映小鼠的健康状态，可用于进一步评价给药组别治疗S180肿瘤的效果(见附图31)，其中毛发的健康程度优劣顺序为：联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物>联合纳豆激酶>联合尿激酶>未联合组。上述结果均表明，联合纳豆激酶后，特别是静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物，可改善唾液酸修饰脂质体在治疗S180中期肿瘤过程中对小鼠机体健康造成的损伤。即UK的联用并没有起到改善DOX-SAL治疗状况的效果，且与联合静注NK、NK-PSA相比产生极显著性差异(P<0.01)；联合静注NK-PSA时，改善效果最为显著(P<0.05)。
实施例18包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合尿激酶的晚期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将24只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为4组，每组6只，即对照组(5％Glu)、静注尿激酶组(UK i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体(DOX-SAL i.v.)组、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注尿激酶组(UK i.v.+DOX-SAL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达1200mm3后(接种后11天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后11、14、17、20与23天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，尿激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在27天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图32、33及表19。
表19包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶抗S180晚期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
通过实验结果可以得出，联合尿激酶后，包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体的抗S180晚期肿瘤药效被降低。分析原因，S180晚期肿瘤中形成的血栓时间长久，即陈旧性血栓，而尿激酶没有办法溶解陈旧性血栓，无法发挥通畅血管的作用，此外，联合注射的尿激酶会通过降解胞外基质介导肿瘤侵袭、转移，从而加重了肿瘤的生长。
实施例19包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶的晚期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将36只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为6组，每组6只，即对照组(5％Glu)、口服纳豆激酶组(NK i.g.)、静注纳豆激酶组(NK i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体(DOX-SAL i.v.)组、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合口服纳豆激酶(NK i.g.+DOX-SALi.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-SAL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达1200mm3后(接种后11天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后11、14、17、20与23天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶单次静注给药剂量为70kIU/kg，纳豆激酶单次口服给药剂量为240KIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在27天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图34、35及表20。
表20包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶抗S180晚期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
通过实验结果可以得出，联合给予纳豆激酶有助于提高抗肿瘤效果，且从抑瘤指数上看，联合给予纳豆激酶可提升小鼠健康状态。其中，联合静注纳豆激酶产生了显著的提高包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体的药效(P<0.05)。分析原因，纳豆激酶可溶解晚期肿瘤中形成的陈旧性血栓，疏通正常组织以及肿瘤部位的血管，增加血流量并顺利运输唾液酸修饰脂质体进入到肿瘤部位。
实施例20包载多柔比星的唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物的晚期S180荷瘤昆明鼠抗肿瘤药效
将24只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分为4组，每组6只，即对照组(5％Glu)、静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物(NK-PSA i.v.)多柔比星唾液酸修饰脂质体(DOX-SAL i.v.)组、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物组(NK-PSA i.v.+DOX-SAL i.v.)。各组小鼠均于肿瘤体积到达1200mm3后(接种后11天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后11、14、17、20与23天)，各组的多柔比星单次给药剂量均为2.5mg/kg，纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物单次静注给药剂量为70kIU/kg，对照组5％Glu的给予量为10mL/kg。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)。在27天结束观察后剥离肿瘤，进行质量抑瘤率的计算。结果见附图36、37及表21。
表21包载多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物抗S180晚期肿瘤的质量抑瘤率(n＝6)
表22 DOX-SAL联合静注NK、NK-PSA或UK给药组于抗S180晚期肿瘤第27天的抑瘤指数(n＝3～6)
通过实验结果可以得出，联合静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物后，包载多柔比星唾液酸修饰脂质体的药效有显著性的提高(P<0.05)，并且从抑瘤指数上看，联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物改善S180晚期荷瘤小鼠的健康状态。
综合联合纳豆激酶、纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物及尿激酶的抗S180晚期肿瘤的抑瘤指数上看(见附图38及表22)，可以看出各种联合效果的优劣顺序为：联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物>联合纳豆激酶>联合尿激酶。此外，S180晚期肿瘤的小鼠经过不同给药后，毛发的健康程度优劣顺序为(见附图39)：联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物>联合纳豆激酶>联合尿激酶>未联合组。联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物后，唾液酸修饰脂质体在治疗S180晚期肿瘤过程中对小鼠机体健康造成的损伤有所改善。其中，联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物的改善效果尤为明显，甚至与联合纳豆激酶相比出现了极显著性差异(P<0.01)，毛发也最为顺滑。
综合S180早、中及晚期的治疗效果上看，纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物在抗肿瘤中的效果均最佳，其不但发挥了纳豆激酶本身的作用效果，还将聚唾液酸的靶向性与免疫伪装特点放大在对肿瘤的治疗当中，尤其针对陈旧性血栓较多的晚期肿瘤治疗，纳豆激酶－聚唾液酸静电复合物展现了极优的效果。
综合上述研究结果，我们惊喜地发现，早期肿瘤模型中，NK-PSA的抑瘤率远大于NK，即PSA可以提高NK抗早期肿瘤的效果。晚期肿瘤模型中，NK抗肿瘤效果优于阿霉素脂质体(特别是抑瘤指数，即阿霉素对晚期肿瘤模型动物的毒性更大)。见下表：
实施例21 S180荷瘤昆明鼠肿瘤的H&E染色病理学组织切片
目前抗肿瘤药物的实验研究主要以瘤体积、瘤重、抑瘤率及抑瘤指数这四个指标，来评价抗肿瘤疗效。然而，在本试验中，多个实验组抑瘤率的差别只停留在数字高低上，之间的显著性差异却并不明显，因此我们认为可以考虑用病理学上的改变，来找各组抗肿瘤效果之间的差别。在试验时取对照组(5％Glu)、单独给药多柔比星唾液酸修饰脂质体组(DOX-SAL i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DOX-SALi.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DOX-SAL i.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物组(NK-PSA i.v.+DOX-SALi.v.)、多柔比星唾液酸修饰脂质体联合尿激酶组(UK i.v.+DOX-SAL i.v.)荷瘤小鼠的肿瘤组织，进行如下步骤的HE染色组织病理切片的制作。
(1)组织固定：将新鲜剥离的肿瘤组织用PBS(pH 7.4)洗净后用4％多聚甲醛固定24h以上，固定结束后将组织从固定液取出，用手术刀将组织修平整。
(2)冲洗：将修整好的组织块放入包埋盒，将包埋盒置于蒸馏水下，用较低的流水速度冲洗组织，冲洗12～24h。
(3)脱水：将包埋盒置于脱水机内，用不同梯度的乙醇进行脱水，依次用75％乙醇作用4h，85％乙醇、90％乙醇各作用2h，95％乙醇作用1h，再用无水乙醇作用2次进行脱水。
(4)透明与浸蜡：将各组织转移至密闭容器内，二甲苯:乙醇(1:1，v/v)作用5～10min，二甲苯I作用5～10min，二甲苯II作用5～10min。透明结束后将各组织块浸没在完全融化的石蜡中(60℃恒温箱)1h，再将组织块转移到新的石蜡液中进行二次浸蜡1h。
(5)包埋：将浸好蜡的组织置于包埋机中进行包埋。将组织从脱水盒内取出，放入含预先融化蜡的包埋框内，在-20℃冻台冷却，待蜡凝固后，将蜡块从包埋框中取出并对蜡块进行修整。
(6)切片：将蜡块置于石蜡切片机上连续切片，片厚5μm，将切片漂浮于摊片机上，40℃温水将组织展平，用防脱载玻片将组织捞起，并于60℃烘箱内烤片。待水烤干、蜡烤化后，将载玻片取出，常温保存备用。
(7)H&E染色。
(8)石蜡切片脱蜡至水：将组织切片放入二甲苯I、二甲苯II溶液中各浸泡20min，100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各浸泡5min，最后用蒸馏水冲洗10min。
(9)染核：切片入苏木素染液染8min，用蒸馏水冲洗去浮色，再用1％的盐酸酒精分化数20s，最后用蒸馏水冲洗返蓝。
(10)染质：切片入伊红染液中染色3min，再用蒸馏水冲洗20s。
(11)脱水封片：将切片依次用95％酒精I、95％酒精II各浸泡5min，再用无水乙醇I、无水乙醇II各浸泡5min，然后在二甲苯I、二甲苯II中各浸泡5min脱水透明，最后将切片从二甲苯中拿出晾干，用中性树胶封片。
(12)镜检拍照：待封片干燥完毕后，将载玻片置于倒置显微镜下观察。结果如附图40所示。
由H&E染色病理组织切片的结果可知，对照组(A)昆明小鼠的瘤内发现众多核大深染的肿瘤细胞，DOX-SAL i.v.组(B)的瘤内也存在众多核大深染的肿瘤细胞，但较对照组少，而NK-PSA i.v.+DOX-SAL i.v.组(E)的瘤内可见大部分肿瘤细胞核碎裂区域(肿瘤坏死区)，其余各组均有不同程度的肿瘤坏死区(细胞核碎裂)及肿瘤生长区。肿瘤细胞的坏死程度排序为：NK-PSA i.v.+DOX-SAL i.v.组>NK i.v.+DOX-SAL i.v.组>NK i.g.+DOX-SALi.v.组>UK i.v.+DOX-SAL i.v.组>DOX-SAL i.v.组>对照组。即联合NK及NK-PSA的肿瘤杀伤效果优于联合UK及未联合组的，且与静注NK相比，联合静注NK-PSA可更多地提升DOX-SAL杀伤肿瘤细胞程度，其协助杀伤肿瘤细胞效果最为显著，即PSA可极显著地增强NK在晚期肿瘤中的作用效果，与药效结果一致。
实施例22 DiR脂质体在S180荷瘤小鼠体内的活体成像及组织分布实验
液氮中取出保种的S180细胞冻存管，迅速置于37℃温水中复苏30min。将复苏的S180细胞悬液接种于小鼠腹腔内(0.2mL/只)，7天后，无菌条件下抽取乳白色粘稠腹水，在倒置显微镜下计数，肿瘤细胞活度>95％，加生理盐水稀释后调整瘤细胞数为1.8×107cells/mL。将肿瘤细胞混悬液接种于正常昆明小鼠右前腋下的皮下组织，0.2mL/只。
将15只接种了S180肿瘤细胞的昆明小鼠，随机分成5组，每组3只，分别为包载DiR的唾液酸修饰脂质体组(DiR-SAL i.v.)、包载DiR的唾液酸修饰脂质体联合静注尿激酶组(UK i.v.+DiR-SAL i.v.)、包载DiR的唾液酸修饰脂质体联合口服纳豆激酶组(NK i.g.+DiR-SAL i.v.)、包载DiR的唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶组(NK i.v.+DiR-SALi.v.)和包载DiR的唾液酸修饰脂质体联合静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物组(NK-PSAi.v.+DiR-SAL i.v.)。各联合给药组，在注射包载DiR的唾液酸修饰脂质体前，开始进行三日一次、共两次的预先给药，即分别预静注尿激酶、口服纳豆激酶、静注纳豆激酶及静注纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物，其中，口服纳豆激酶的剂量为240kIU/kg，静注尿激酶、纳豆激酶或纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物的给药剂量为70kIU/kg。于荷瘤后的第18天(肿瘤大小约为4800mm3)，按2mg DiR/kg的剂量尾静脉注射包载DiR的唾液酸修饰脂质体，分别于3、5、7、9和24h应用IVIS Lumina III小动物活体成像进行观察并拍摄荧光和白光照片，24h后将小鼠处死，取出心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺和肿瘤，生理盐水清洗后用滤纸吸干，并拍摄荧光和白光照片。荧光照片的拍摄条件为：激发波长750nm，发射波长790mm，曝光时间为10s，结果见附图41。
取上述给药组及空白的荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺和肿瘤称重，随后将组织样品放于7mL EP管中，加入1.0mL生理盐水，进行高速分散匀浆。精密移取组织匀浆液100μL于1.5mL EP管中，加入无水乙醇900μL，涡旋5min，沉淀组织匀浆中的蛋白及提取其中DiR，12000rpm离心10min后，取200μL上清液，使用多功能酶标仪在激发波长750nm、发射波长790nm下测定荧光值(F值)，样品F值减去空白组织样品F值得ΔF值，由标准曲线计算各组织样品中的DiR浓度，并计算组织中的DiR含量，结果见附图42。
从活体成像及组织分布结果可知，联合给药后，包载DiR的唾液酸脂质体在肿瘤中的累积量有所提高。其中，联合纳豆激酶可显著提高脂质体在肿瘤中的累积量(P<0.05)，特别是联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物。然而，联合尿激酶后，虽脂质体在肿瘤部位的聚集量有些许的提高，但与未联合相比，没有显著性的差异。分析原因，肿瘤生长较大的昆明小鼠，其肿瘤及机体其它部位形成的血栓多数已成为陈旧性血栓，纳豆激酶可以不通过激活纤溶蛋白原，直接溶解陈旧性血栓，同时，纳豆激酶还可以通过提高机体内t-PA的含量，增强抗血栓性能，然而，相较于纳豆激酶的溶栓特性，尿激酶的功能局限了很多。此时，因肿瘤内外的运输通路被打通，唾液酸修饰的脂质体即可更加容易的到达肿瘤部位。于此同时，机体循环的血液增加，唾液酸修饰脂质体被单核巨噬细胞等免疫细胞吞噬很可能增加，最终也使得靶向肿瘤的量有所增加。其中，因PSA具有靶向肿瘤、逃避免疫监视等的作用，纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物可能更多的作用于肿瘤部位的血栓，从而使更多的脂质体到达肿瘤部位，因此，联合纳豆激酶-聚唾液酸静电复合物展现出最佳协助脂质体到达肿瘤部位的效果。
实施例23联合SA-阿霉素(DOX-SAL)脂质体，抗MCF-7肿瘤
建立乳腺癌MCF-7异种移植肿瘤模型。将接种MCF-7后10天，瘤体积长至250～300mm3的30只荷瘤裸鼠定为晚期肿瘤小鼠，随机分为6组，每组5只。
分组情况：NS组(阴性对照)、SA-阿霉素脂质体(阳性对照)、NK-PSA组、NK-HA组、NK-PSA联合SA-阿霉素脂质体组、NK-HA联合SA-阿霉素脂质体组。
给药方案：阿霉素剂量5mg/kg，第10、13、16、19、22d尾静脉注射给药，共给药5次。
结果见表23。
表23抗MCF-7肿瘤实验结果
通过实验结果可以得出，联合组的抗肿瘤效果最好。
实施例24 NK与NK-PSA、NK-HA的过敏试验
依据《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》可知，过敏性是指药物制剂经皮肤、粘膜、腔道、血管等非口服途径给药，对用药局部产生的毒性和/或对全身产生的毒性，为临床前安全性评价的组成部分。一般来说，药物本身以及其代谢产物、制剂所用的辅料、有关物质等均有可能引起过敏反应的发生，因此，药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，为后续的在体应用、甚至是临床应用作出指导。
一动物豚鼠(Hartley系豚鼠(250～350g，♂及♀，沈阳药科大学实验动物中心)
二方法与结果
1生物样品的制备
前期预实验结果显示，NK水溶液的pH值为6.89±0.02，即在水环境中NK带正电，因此，选择以水为介质制备NK-PSA静电复合物(以下均简称为NK-PSA)。基本制备工艺为：取NK粉末适量，用少量、一定浓度的PSA水溶液溶解并稀释至NK浓度为40mg/mL，于冰水浴下，搅拌5min后，再用适量灭菌注射用水稀释上述溶液至NK浓度为20mg/mL，过0.22μm微孔滤膜，即得NK-PSA溶液。将所得的NK-PSA溶液分装于10mL的西林瓶中，每瓶2.5mL，冷冻干燥，即得NK-PSA静电复合物粉末。按照上述基本制备工艺，制备NK与PSA在不同质量比例下的静电复合物。按照上述相同制备工艺，制备NK与HA在不同质量比例下的静电复合物。
2豚鼠过敏试验
2.1动物分组
将48只豚鼠，雌雄各半，随机分成8组，即NK：PSA(w/w)1:0组、1:2组、1:4组、1:8组、1:16组、1:32组，每组6只；NK:HA(w/w)1:5(高分子量，6.1万)、1:10(低分子量，6276)，每组6只。
表24动物分组情况
2.2给药方法
致敏阶段采用腹腔给药方式，激发阶段采用足静脉给药方式。
致敏接触：各组豚鼠分别隔日腹腔注射(i.p.)相应制剂共3次，每日观察每只动物的症状。
激发接触：致敏接触后，再将每组豚鼠均分成2组，每组3只。第一组于末次腹腔注射(i.p.)后第14天，第二组于末次腹腔注射(i.p.)后第21天，分别由脚背中足静脉注射(i.v.)相应制剂进行激发攻击。
给药频率：致敏阶段隔日给药1次，共3次；激发阶段给药2次，分别为末次致敏后的第14天和第21天。
2.3给药容积
致敏给药容积：各制剂组均注射0.5mL/动物；
激发给药容积：各制剂组均注射1mL/动物。
动物标识：本试验动物采用苦味酸背毛标记编号，饲养笼上进行笼卡标识。
2.4临床观察
静脉注射后即刻观察动物反应至30分钟，包括症状的出现及消失时间，一般应观察至3小时。按表2症状详细观察每只动物的反应，症状的出现及消失时间。观察第一次激发攻击和第二次激发攻击后豚鼠有无搔鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、休克甚至死亡等过敏反应症状。
表25过敏反应症状
0正常
7呼吸急促
14步态不稳
1躁动
8排尿
15跳跃
2竖毛
9排粪
16喘息
3颤抖
10流泪
17痉挛
4搔鼻
11呼吸困难
18旋转
5喷嚏
12哮鸣音
19潮式呼吸
6咳嗽
13紫癜
20死亡
*摘自《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》
2.5数据计算与统计分析
使用EXCEL软件统计存活动物过敏反应级数，结果用均值±标准差形式表示，根据表3判断各组过敏反应性质。
表26全身致敏性评价标准
*摘自《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》
试验结果：NK：PSA(w/w)1:0组、1:2组、1:4组的过敏反应归属于4级、4级、4级，动物过敏反应极强阳性，而NK：PSA(w/w)1:8、1:16、1：32过敏反应分别归属于3级、2级、3级；NK：HA(w/w)1:5、1:10过敏反应归属于2级、1级。说明NK-PSA与NK-HA复合物能显著降低动物的过敏反应。
死亡率：NK：PSA(w/w)的配比为1:0、1:2、1:4时，动物死亡率为100％；比例为1:8时，动物死亡率为33.3％，1:32时动物死亡率为50％。令人惊喜地是，NK：PSA(w/w)为1：16，NK：HA(w/w)为1:5、1:10时，这三组动物的死亡率为0％，即全部存活。
激发到死亡的时间：NK：PSA(w/w)1:0、1:2时动物迅速死亡(<5min)；1:4和1:8组动物较快死亡(8、10分钟)，与1:0组有显著性差异(p<0.05)；1:32组动物存活时间较长(约为20min)，与1:0组有极显著性差异(p<0.001)。
实施例25不同分子量PSA-NK静电复合物降低过敏性
按照NK：PSA(w/w)1：10进行研究。方法同实施例23，结果见表27。
表27不同分子量PSA-NK过敏性结果
聚合度/分子量
过敏反应情况
2(644.50道尔顿)
过敏反应极强阳性—记为4级
3(957.73道尔顿)
过敏反应极强阳性—记为4级
4(1270.97道尔顿)
3级
5(1584.21道尔顿)
3级
6(1897.45道尔顿)
2级
10(3000道尔顿)
2级
16(5000道尔顿)
2级
11.0kDa
2级
22.7kDa
3级
30kDa
3级
39.0kDa
3级
60kDa～80kDa、
4级
100kDa～200kDa
4级
很显然，PSA分子量过小、过大均不能降低纳豆激酶的过敏性。聚合度4(分子量约为1200道尔顿)～39.0kDa范围内，NK的过敏性极大降低。
实施例26不同分子量透明质酸(HA)降低NK过敏性
不同分子量HA，包括380、760、1140、1520、1900、2280、2660、3040、3420、6276、8000、2万、4.4万、6.1万、9.8万、20万。由于20万分子量的溶液黏度非常大，因此，不参与研究(以后仅仅进行10万分子量以下的研究)。按照NK：HA(w/w)1：10进行研究。方法同实施例23，结果见表28.
表28不同分子量HA-NK过敏性结果
聚合度/分子量
过敏反应情况
380
3级
760
3级
1140
3级
1520
3级
1900
3级
2280
3
2660
2
3040
2
3420
2
6276
1
PSA-HA组合
1
8000
1
2万
1
4.4万
1
6.1万
2
9.8万
2
备注：PSA-HA组合的配比为1:1(w/w)，PSA的分子量为30kDa，HA的分子量为6276。
很显然，HA降低NK过敏性的能力强于PSA，所有的分子量(380、760、1140、1520、1900、2280、2660、3040、3420、6276、8000、2万、4.4万、6.1万、9.8万)均能降低NK的过敏性，而且HA可以增加PSA降低NK过敏性的能力(见表27，PSA组为3级，组合之后，过敏性为1级)。
实施例27不同HA分子量降低NK的死亡率
按照1：10的比例配制不同分子量的HA与NK的复合物，进行毒性研究。
NK-HA注射液的配制：精密移取NK纯化液1000μL于西林瓶中，加入50μL NaH2PO4溶液(pH6.0)，涡旋2min，再加入HA溶液(NK与HA的质量比为1：10)，涡旋2min，然后再加入灭菌注射用水，混匀，并用50％葡萄糖注射液调节等渗，涡旋2min，即得。
以0.1mL/10g小鼠的给药体积(NK的给药剂量为120kIU/kg)静脉注射给药，考察注射液的毒性，记录给药后小鼠的存活时间、生存状态及存活小鼠尾部的状态，结果见表29。
表29不同分子量HA-NK急性毒性结果
很显然，所有分子量(380、760、1140、1520、1900、2280、2660、3040、3420、6276、8000、2万、4.4万、6.1万、9.8万)的HA均能够减少小鼠的死亡率。
实施例28抗血栓药效研究
将健康雄性Wistar大鼠20只，称重后随机分4组(PSA、HA、NK-PSA(质量比1：10，PSA分子量为30kDa)、NK-HA(质量比1：10，HA分子量为8kDa))，每组5只。
抗栓率的计算将大鼠以3.5％水合氯醛进行腹腔麻醉(1mL·100g-1)，手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.0cm×3.0cm的塑料薄片，用浸渍有50μL FeC13溶液(10％，w/v)的滤纸条(1.0cm×1.5cm)覆盖双侧颈总动脉。20min后，静脉注射不同注射液(NK剂量为3000IU/kg)。60min后，取下滤纸条，剪下变色区域用生理盐水洗净，滤纸吸干水分后测量其长度，并用分析天平精密称重，计算抗栓率，结果见30。
单位长度血栓的重量记为相对栓重(mg·cm-1)，并以下述公式计算
抗栓率％＝(对照组平均相对栓重-给药组平均相对栓重)/对照组平均相对栓重×100％
表30不同给药组抗栓率结果
结果表明，与对照组(PSA、HA)相比，各种NK制剂(NK-PSA、NK-HA)均有显著的抗栓效果。
实施例29体外溶解陈旧性血块(模拟陈旧性血栓)
取小鼠、大鼠和家兔的新鲜血液，分别装于医用采样管中(添加青霉素(100IU/mL)和链霉素(100μg/mL))进行凝固和保存，置于室温72h，制备血块(模拟陈旧性血栓)。
将制备好的血凝块切割成均匀大小(0.1-0.2g)，并用生理盐水将其表面冲洗干净，吸干表面水分后精密称重，放于已编号的10mL西林瓶中。向瓶中分别加入1mLNK酶活度为2000IU/mL制剂(实施例27的制剂)，37℃恒温孵育10h，观察如溶解情况。结果表明，小鼠、大鼠和家兔的血块全部溶解。